Manipulação do efeito de Warburg em células de mamífero em...

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIEcircNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

Manipulaccedilatildeo do efeito de Warburg em ceacutelulas de mamiacutefero em cultura

implicaccedilotildees para o metabolismo energeacutetico

Miguel Ricardo Guerreiro

MESTRADO EM BIOLOGIA MOLECULAR E GENEacuteTICA

2011






Dissertaccedilatildeo de mestrado orientada por

Doutora Ana Sofia Coroadinha (Instituto de Tecnologia Quiacutemica e Bioloacutegica Instituto de

Biologia Experimental e Tecnoloacutegica Oeiras)

Doutora Maria Filomena Caeiro (Departamento de Biologia Vegetal Faculdade de Ciecircncias

da Universidade de Lisboa Lisboa)



2011

i

i AGRADECIMENTOS

Quero prestar os meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que directa ou

indirectamente contribuiacuteram para o desenvolvimento deste trabalho Em particular

agrave Doutora Paula Alves pela oportunidade de realizar a minha dissertaccedilatildeo na Unidade

de Tecnologia de Ceacutelulas Animais (UTCA) e agrave Doutora Ana Sofia Coroadinha pela

oportunidade de integrar a equipa de Biotecnologia Molecular e Desenvolvimento de Linhas

Celulares e pela orientaccedilatildeo e disponibilidade

agrave Ana Filipa Rodrigues pela orientaccedilatildeo teacutecnica e cientiacutefica pela boa disposiccedilatildeo e

compreensatildeo e pelo incansaacutevel auxiacutelio no trabalho laboratorial e na elaboraccedilatildeo da presente

dissertaccedilatildeo

agrave Doutora Maria Filomena Caeiro pela orientaccedilatildeo e disposiccedilatildeo a ajudar prontamente

A todos os professores do meu percurso acadeacutemico pelas boas memoacuterias e ensinamentos que

me preparam da melhor forma possiacutevel para esta difiacutecil mas proveitosa jornada

ao Doutor Rui Gardner e agrave Telma Lopes do Laboratoacuterio de Citometria de Fluxo do

Instituto Gulbenkian de Ciecircncia pela ajuda teacutecnica necessaacuteria ao prosseguimento do

presente trabalho

a todos os colegas da UTCA por me terem recebido da melhor forma e por me terem

ajudado sempre que precisava Em particular agrave Vanessa Bandeira Heacutelio Tomaacutes Paulo

Fernandes e Doutora Rute Castro por todo o apoio e disponibilidade

a todos os meus familiares em particular aos meus pais e agrave minha irmatilde por sempre

terem acreditado em mim e pelo seu apoio nos momentos difiacuteceis

a todos os meus amigos por todo o apoio e momentos de diversatildeo e descontracccedilatildeo

A todos o meu muito obrigado

ii

ii RESUMO

A maioria das linhas celulares de mamiacutefero usadas na produccedilatildeo de biofaacutermacos

complexos apresenta um elevado consumo de glucose e acumulaccedilatildeo de quantidades

significativas de lactato ndash fenoacutetipo lactogeacutenico associado ao efeito de Warburg ndash reduzindo a

produtividade e qualidade do biofaacutermaco Este trabalho teve como objectivo a manipulaccedilatildeo

deste fenoacutetipo procurando reduzir a acumulaccedilatildeo de lactato e aumentar a eficiecircncia do

metabolismo energeacutetico com consequente aumento da produtividade e qualidade de

partiacuteculas virais e anticorpos As linhas celulares 293 FLEX GFP (produtora de retroviacuterus)

MDCK E1 (produtora de adenoviacuterus) e RPE A6 (produtora de anticorpos monoclonais) foram

silenciadas para o factor 1 indutiacutevel por hipoxia (HIF1) e cinases 1 e 3 da piruvato

desidrogenase (PDK13) os principais efectores deste fenoacutetipo

Nas ceacutelulas RPE A6 o silenciamento de HIF1 originou ceacutelulas com baixa capacidade

proliferativa sugerindo a reversatildeo da imortalizaccedilatildeo e entrada em senescecircncia Sem alteraccedilotildees

aparentes no crescimento celular nas ceacutelulas 293 FLEX GFP observou-se uma diminuiccedilatildeo

das taxas de consumo de glucose e de produccedilatildeo de lactato aliada a aumentos notaacuteveis na

produtividade celular (ateacute 182x em partiacuteculas totais e ateacute 216x em partiacuteculas infecciosas) e

sua qualidade o silenciamento adicional de PDK13 potenciou estes efeitos destacando-se o

aumento adicional (28x) da qualidade do produto final Nas ceacutelulas MDCK E1 natildeo se

obtiveram reduccedilotildees no consumo de glucose e produccedilatildeo de lactato e os aumentos na produccedilatildeo

viral e sua qualidade foram moderados Adicionalmente observou-se nas ceacutelulas silenciadas

aumento de poder redutor em 293 FLEX GFP e dos niacuteveis de ATP em MDCK E1 suportando

a reduccedilatildeo do fenoacutetipo lactogeacutenico e aumento de eficiecircncia do metabolismo energeacutetico

Estes resultados evidenciam a manipulaccedilatildeo do fenoacutetipo lactogeacutenico associado ao

efeito de Warburg como potencial ferramenta de engenharia metaboacutelica visando o aumento da

produtividade de biofaacutermacos complexos em cultura de ceacutelulas de mamiacutefero

Palavras-chave efeito de Warburg factor 1 indutiacutevel por hipoxia (HIF1) complexo

da piruvato desidrogenase (PDH) metabolismo energeacutetico produtividade celular

iii

iii ABSTRACT

The majority of mammalian cell lines used in the production of complex

biopharmaceuticals present high rates of glucose consumption accumulating significant

amounts of lactate ndash lactogenic phenotype associated to the Warburg effect ndash which results in

the reduction of cellular productivity and in final product quality The goal of this work was

the manipulation of this phenotype aiming at the reduction of lactate accumulation and the

improvement of energy metabolism efficiency to increase viral particles and antibodies

productivity and quality 293 FLEX GFP (retrovirus producer) MDCK E1 (adenovirus

producer) and RPE A6 (monoclonal antibodies producer) cell lines were silenced for hypoxia-

inducible factor 1 (HIF1) and pyruvate dehydrogenase 1 and 3 (PDK13) the major molecular

effectors of this phenotype

The silencing of HIF1 in RPE A6 cells resulted in cells with low proliferative capacity

suggesting the reversion of immortality and entry into senescence Without relevant impact in

cellular growth the 293 FLEX GFP cells showed a reduction in glucose uptake and lactate

production rates along with a significant increase of cellular productivities (up to 182x in

total and up to 216x in infectious particles) and its quality further silencing of PDK13

potentiated the effects of HIF1 silencing with special focus in the additional increase of final

product quality (28x) In MDCK E1 cells no reduction of glucose uptake and lactate

production rates was observed and viral productivity and its quality increased moderately

Additionally it was observed an increase in intracellular reducting power in 293 FLEX GFP

cells and in ATP levels in MDCK E1 cells further supporting the reduction of lactogenic

phenotype and the improvement of energy metabolism

These results highlight the manipulation of lactogenic phenotype associated to the

Warburg effect as a potential metabolic engineering tool for the improvement of complex

biopharmaceuticals production in cultured mammalian cell lines

Keywords Warburg effect hypoxia inducible factor 1 (HIF1) pyruvate

dehydrogenase complex (PDH) energetic metabolism cellular productivity

iv

iv LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviatura Descriccedilatildeo

cDNA ADN complementar (do Inglecircs complementary DNA)

DNA Aacutecido desoxirribonucleico (do Inglecircs Deoxyribonucleic Acid)

ERO Espeacutecies reactivas de oxigeacutenio

GFP Proteiacutena fluorescente verde (do Inglecircs Green Fluorescent Protein)

HIF1 Factor 1 indutiacutevel por hipoxia (do Inglecircs Hypoxia Inducible Factor 1)

LDH Lactato desidrogenase (do Inglecircs Lactate Dehydrogenase)

mRNA ARN mensageiro (do Inglecircs messenger RNA)

ntshRNA non-target short hairpin RNA

PCR Reacccedilatildeo em cadeia da polimerase (do Inglecircs Polymerase chain reaction)

PDH Complexo da piruvato desidrogenase (do Inglecircs Pyruvate

Dehydrogenase Complex)

PDHE1α Subunidade α do componente E1 do complexo piruvato desidrogenase

(do Inglecircs E1 alpha subunit of pyruvate dehydrogenase complex)

PDK Cinase da piruvato desidrogenase (do Inglecircs Pyruvate Dehydrogenase

Kinase)

PDP Fosfatase da piruvato desidrogenase (do Inglecircs Pyruvate dehydrogenase

phosphatase)

PI Partiacuteculas infecciosas

PT Partiacuteculas totais

qRT-PCR PCR quantitativo por transcriccedilatildeo reversa (do Inglecircs Quantitative reverse

transcription polymerase chain reaction)

RFP Proteiacutena fluorescente vermelha (do Inglecircs Red Fluorescent Protein)

RNA Aacutecido ribonucleico (do Inglecircs Ribonucleic Acid)

shRNA short hairpin RNA

TCA Ciclo dos Aacutecidos Tricarboxiacutelicos (do Inglecircs Tricarboxylic Acid Cycle)

v

V IacuteNDICE

i AGRADECIMENTOS i

ii RESUMO ii

iii ABSTRACT iii

iv LISTA DE ABREVIATURAS iv

1 INTRODUCcedilAtildeO 1

11 Cultura de ceacutelulas de mamiacutefero e o fenoacutetipo lactogeacutenico 1

12 Imortalizaccedilatildeo celular e o efeito de Warburg 2

13 Impacto do efeito de Warburg em biotecnologia 4

14 Objectivos principais 5

2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 6

21 Linhas celulares e meios de cultura 6

22 Produccedilatildeo de plasmiacutedeos e vectores lentivirais 6

23 Transduccedilatildeo celular selecccedilatildeo e clonagem 7

24 Estudos de crescimento e anaacutelise de metabolitos 7

25 Extracccedilatildeo de RNA total e qRT-PCR 8

26 Produccedilatildeo e titulaccedilatildeo de vectores retrovirais8

27 Produccedilatildeo e titulaccedilatildeo de vectores adenovirais 8

28 Determinaccedilatildeo da actividade da lactato desidrogenase9

29 Western Blot 9

210 Quantificaccedilatildeo de fosfatos de adenosina e nucleoacutetidos de piridina 10

211 Quantificaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio 10

212 Coloraccedilatildeo para detecccedilatildeo de actividade da β-galactosidade 10

213 Caacutelculos 10

3 RESULTADOS 11

31 Silenciamento de HIF1 11

vi

32 Silenciamento simultacircneo de HIF1 PDK1 e PDK3 15

4 DISCUSSAtildeO E CONCLUSAtildeO 24

5 PERSPECTIVAS FUTURAS 29

6 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 30

7 ANEXOS 34

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Cultura de ceacutelulas de mamiacutefero e o fenoacutetipo lactogeacutenico

Nos uacuteltimos anos tem-se verificado uma crescente procura de biofaacutermacos complexos

como proteiacutenas recombinantes e partiacuteculas derivadas de viacuterus quer para fins terapecircuticos quer

para fins de diagnoacutesticos in vivo O potencial dos biofaacutermacos derivados de viacuterus em

particular tem vindo a aumentar devido agraves suas diversas aplicaccedilotildees profilaacuteticas terapecircuticas e

cliacutenicas como a vacinaccedilatildeo o tratamento do cancro e a terapia geacutenica 1 Actualmente o

sistema preferencial para a manufacturaccedilatildeo destes produtos biofarmacecircuticos complexos eacute as

ceacutelulas de mamiacutefero usadas para a produccedilatildeo de mais de metade dos biofaacutermacos existentes

no mercado Tal predomiacutenio deve-se agrave sua semelhanccedila com as ceacutelulas humanas no folding de

proteiacutenas e nas modificaccedilotildees poacutes-traducionais como a glicosilaccedilatildeo aumentando a eficiecircncia

terapecircutica e diminuindo o potencial imunogeacutenico do produto final 23

As ceacutelulas de mamiacutefero em cultura agrave semelhanccedila de ceacutelulas transformadas possuem

um metabolismo energeacutetico desregulado consumindo elevadas quantidades de glucose e

acumulando quantidades significativas de lactato com reduzida entrada de carbono derivado

da glicoacutelise no Ciclo dos Aacutecidos Tricarboxiacutelicos (TCA) 4 Do ponto de vista da cultura de

ceacutelulas para produccedilatildeo de biofaacutermacos este fenoacutetipo lactogeacutenico tem simultaneamente um

efeito negativo no crescimento e viabilidade celular e na produtividade e qualidade do

biofaacutermaco Este fenoacutemeno eacute ainda mais importante no caso das partiacuteculas derivadas de viacuterus

para terapia geacutenica jaacute que a sua infecciosidade eacute fortemente influenciada por variaccedilotildees no pH

do meio de cultura 5 Diversas estrateacutegias tecircm sido testadas de forma a reduzir os efeitos

nocivos da acumulaccedilatildeo de lactato no meio de cultura fornecimento de glucose de forma

controlada 67

suplementaccedilatildeo do meio de cultura com substratos alternativos agrave glucose 8

remoccedilatildeo dos metabolitos toacutexicos 9 desenvolvimento de meios de cultura com base na anaacutelise

dos fluxos metaboacutelicos permitindo adaptar os seus constituintes agraves necessidades metaboacutelicas

das ceacutelulas 1011

introduccedilatildeo da enzima piruvato carboxilase nas ceacutelulas 12-14

diminuiccedilatildeo da

expressatildeo da lactato desidrogenase atraveacutes da disrupccedilatildeo do gene Ldha por recombinaccedilatildeo

homoacuteloga 15

ou atraveacutes de RNA de interferecircncia 16

ou introduccedilatildeo de um transportador para a

frutose constituindo uma alternativa ao consumo de glucose 17

No entanto estas estrateacutegias

tecircm um sucesso limitado devido aos efeitos compensatoacuterios causados pela apertada regulaccedilatildeo

homeostaacutetica intracelular que natildeo satildeo facilmente alteraacuteveis

2

12 Imortalizaccedilatildeo celular e o efeito de Warburg

Nos anos 20 Otto Warburg observou que as ceacutelulas canceriacutegenas comparativamente

agraves ceacutelulas normais apresentavam elevadas taxas de consumo de glucose secretando a maior

parte do carbono derivado da glucose sob a forma de lactato em vez de o oxidar

completamente 1819

ndash um cenaacuterio que ficou conhecido como efeito de Warburg Estudos

recentes sobre o metabolismo energeacutetico de ceacutelulas canceriacutegenas sugerem que este resulta de

alteraccedilotildees geneacuteticas que ocorrem no processo de tumorigeacutenese principalmente durante a

imortalizaccedilatildeo e transformaccedilatildeo celulares e que levam agrave desregulaccedilatildeo do metabolismo

energeacutetico central e ao aumento da actividade glicoliacutetica 20

De facto existem diversas vias de

sinalizaccedilatildeo comuns ao controlo da proliferaccedilatildeo e do metabolismo energeacutetico que levam agrave

induccedilatildeo deste cenaacuterio como a activaccedilatildeo de oncogenes (MYC) e enzimas glicoliacuteticas ou a

supressatildeo do gene supressor de tumores P53 2021

Interessantemente muitas das vias de

imortalizaccedilatildeo activadas no processo de tumorigeacutenese satildeo tambeacutem recrutadas durante o

estabelecimento de uma linha celular e por isso tendem a exibir caracteriacutesticas metaboacutelicas

associadas ao efeito de Warburg 20

O principal efector molecular do efeito de Warburg eacute o factor 1 indutiacutevel por hipoxia

(HIF1) um factor de transcriccedilatildeo heterodimeacuterico constituiacutedo por uma subunidade β expressa

constitutivamente e uma subunidade α cuja expressatildeo estaacute dependente do oxigeacutenio Apesar

de ser expressa em condiccedilotildees de baixa disponibilidade de oxigeacutenio (hipoxia) a expressatildeo

constitutiva da subunidade α pode ocorrer em normoxia como resultado de alteraccedilotildees nos

sistemas de sinalizaccedilatildeo para degradaccedilatildeo proteica provocadas durante o processo de

imortalizaccedilatildeo celular De facto a sua sobre-expressatildeo eacute caracteriacutestica comum a muitas ceacutelulas

canceriacutegenas 2223

O factor de transcriccedilatildeo HIF1 eacute responsaacutevel pela coordenaccedilatildeo da alteraccedilatildeo

do metabolismo para glicoacutelise com formaccedilatildeo de lactato com consequente aumento do

consumo de glucose e acumulaccedilatildeo de lactato jaacute que promove a expressatildeo de vaacuterios

componentes do metabolismo energeacutetico nomeadamente transportadores de glucose (GLUT-

1) enzimas da via glicoliacutetica e de lactato desidrogenase (Figura 1) 2425

Para aleacutem do papel do HIF1 na promoccedilatildeo da glicoacutelise com formaccedilatildeo de lactato

estudos recentes revelaram uma significativa influecircncia na respiraccedilatildeo mitocondrial Nos

organismos aeroacutebios o TCA possui um papel fundamental no metabolismo central das

ceacutelulas constituindo a via de produccedilatildeo de energia mais eficiente e fornecendo o poder redutor

e intermediaacuterios necessaacuterios para as reacccedilotildees de biossiacutentese Normalmente a glucose eacute

convertida em piruvato no citoplasma o qual eacute posteriormente canalizado para o TCA ao

niacutevel mitocondrial onde eacute oxidado a dioacutexido de carbono e aacutegua A canalizaccedilatildeo do piruvato

3

para o TCA implica a sua conversatildeo em acetil-CoA numa reacccedilatildeo catalisada pelo complexo

multi-enzimaacutetico piruvato desidrogenase (PDH) Sendo esta uma das reacccedilotildees mais

importantes do metabolismo celular estaacute sujeita a um elevado niacutevel de regulaccedilatildeo Como tal o

complexo PDH eacute regulado por um ciclo reversiacutevel de fosforilaccedilatildeo caracterizado pela

fosforilaccedilatildeo (inactivaccedilatildeo) e desfosforilaccedilatildeo (activaccedilatildeo) da subunidade α do componente E1

(PDHE1α) promovida por cinases (PDK) e fosfatases (PDP) respectivamente Na PDHE1α

de mamiacuteferos existem trecircs locais de fosforilaccedilatildeo (Ser232

Ser293

e Ser300

) que podem ser

fosforilados por quatro isoenzimas (PDK1-4) sendo a PDK1 a uacutenica que consegue fosforilar

todos os trecircs locais 2627

Interessantemente a sobre-expressatildeo de PDK1 e PDK3 eacute promovida

por HIF1 levando assim agrave fosforilaccedilatildeo de PDHE1α e inibiccedilatildeo do complexo PDH (Figura 1)

Consequentemente a entrada do carbono derivado da via glicoliacutetica no TCA ocorre em menor

extensatildeo e aumenta a conversatildeo de piruvato a lactato resultando no fenoacutetipo lactogeacutenico

associado ao efeito de Warburg e na desregulaccedilatildeo do metabolismo energeacutetico 2428

Figura 1 Vias do metabolismo energeacutetico reguladas pelo factor de transcriccedilatildeo HIF1 A sobre-expressatildeo de

vaacuterias enzimas da via glicoliacutetica e da enzima lactato desidrogenase (LDH) eacute promovida pelo factor 1 indutiacutevel

por hipoxia (HIF1) levando ao aumento do consumo de glucose e agrave acumulaccedilatildeo de lactato A entrada do

carbono derivado da glicoacutelise no Ciclo dos Aacutecidos Tricarboxiacutelicos (TCA) eacute realizada ao niacutevel do complexo

piruvato desidrogenase (PDH) sendo este regulado atraveacutes de um ciclo reversiacutevel de fosforilaccedilatildeo HIF1 promove

a expressatildeo das cinases da piruvato desidrogenase (PDK1-4) resultando na fosforilaccedilatildeo e consequente inibiccedilatildeo

do complexo PDH Esquema adaptado de Kondoh (2008) 20

Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P

13 Biphosphoglycerate

3 - Phosphoglycerate


Phosphoenopyruvate Pyruvate

Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase

phosphoglucose isomerase

phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4

13 Impacto do efeito de Warburg em biotecnologia

A desregulaccedilatildeo do metabolismo energeacutetico em ceacutelulas de mamiacutefero em cultura agrave

semelhanccedila das ceacutelulas canceriacutegenas tem sido alvo de diversas hipoacuteteses explicativas A

glicoacutelise com formaccedilatildeo de lactato tira partido de um nutriente abundante a glucose pelo que

um elevado fluxo glicoliacutetico pode gerar energia mais rapidamente do que a respiraccedilatildeo

mitocondrial Como o fluxo glicoliacutetico pode superar o da oxidaccedilatildeo de piruvato pelo complexo

PDH eacute necessaacuterio um mecanismo para evitar a acumulaccedilatildeo de piruvato pelo que ocorre a

sobre-expressatildeo de lactato desidrogenase para a conversatildeo do piruvato a lactato 24

Adicionalmente ceacutelulas em contiacutenua proliferaccedilatildeo e com elevado consumo de nutrientes

teriam previsivelmente uma maior respiraccedilatildeo mitocondrial e consequente produccedilatildeo de

espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ERO) Como tal a diminuiccedilatildeo da respiraccedilatildeo mitocondrial

devido ao bloqueio do TCA ao niacutevel do complexo PDH pode estar associada a um aumento

da protecccedilatildeo ao stress oxidativo De facto a acumulaccedilatildeo de ERO e consequentes danos em

macromoleacuteculas a niacutevel intracelular foi envolvida no processo de senescecircncia celular 20

Como tal as alteraccedilotildees metaboacutelicas associadas ao efeito de Warburg poderatildeo natildeo soacute ter um

papel ao niacutevel de obtenccedilatildeo de energia mas tambeacutem de manutenccedilatildeo do estado proliferativo

por bypass da senescecircncia [revisto em Vander Heiden et al (2009) 29

] Esta adaptaccedilatildeo

metaboacutelica das ceacutelulas de mamiacutefero em cultura eacute no entanto desvantajosa do ponto de vista

da sua aplicaccedilatildeo biotecnoloacutegica na produccedilatildeo de biofaacutermacos complexos A acumulaccedilatildeo de

metabolitos toacutexicos como o lactato tem um efeito negativo no crescimento e viabilidade

celulares e na produtividade e qualidade do produto final Adicionalmente o bloqueio do

TCA reduz a disponibilidade de poder redutor e de intermediaacuterios necessaacuterios agraves reacccedilotildees de

biossiacutentese e indispensaacuteveis ao estabelecimento de sistemas de expressatildeo de elevada

produtividade e qualidade Como tal a manipulaccedilatildeo do efeito de Warburg em ceacutelulas de

mamiacutefero em cultura adquire grande relevacircncia no contexto biotecnoloacutegico

A linha celular RPE A6 eacute uma linha celular humana recombinante usada como sistema

de expressatildeo estaacutevel de anticorpos monoclonais humanos Para aleacutem dos referidos impactos

da acumulaccedilatildeo de lactato no crescimento e viabilidade celular a alteraccedilatildeo do pH poderaacute

induzir a agregaccedilatildeo proteica e um deficiente padratildeo de glicosilaccedilatildeo 30

diminuindo a

produtividade e qualidade do produto final e assim dificultando a sua aplicaccedilatildeo terapecircutica A

acumulaccedilatildeo de quantidades significativas de lactato tem igualmente um impacto negativo

sobre o crescimento de ceacutelulas MDCK E1 usadas na produccedilatildeo transiente de partiacuteculas

adenovirais e sobre a produtividade e qualidade dos vectores virais A linha celular 293

FLEX GFP eacute uma linha celular humana utilizada para a produccedilatildeo estaacutevel de vectores

5

retrovirais recombinantes Estes vectores apresentam-se como uma ferramenta de elevada

eficiecircncia quer na transferecircncia de genes nos protocolos de terapia geacutenica quer na

apresentaccedilatildeo de epitopos em vacinaccedilatildeo 31

No entanto a sua produccedilatildeo em larga escala tem

sido dificultada pelas baixas produtividades de viacuterus infecciosos (na ordem das 106-10

7

partiacuteculas infecciosas por mL de cultura) perda acentuada da infecciosidade agrave temperatura de

cultura (t12 asymp 8h 37ordm C) e elevado grau de contaminaccedilatildeo das preparaccedilotildees virais com partiacuteculas

natildeo infecciosas (apenas 1 em cada 100 partiacuteculas eacute infecciosa) 3233

Como as aplicaccedilotildees em

terapia geacutenica humana dependendo do protocolo cliacutenico e da doenccedila requerem entre 107 e

1014

partiacuteculas infecciosas 34

com um elevado niacutevel de purificaccedilatildeo eacute imprescindiacutevel o

desenvolvimento de processos robustos aliados a ceacutelulas de elevada produtividade para a

manufacturaccedilatildeo destas partiacuteculas virais Adicionalmente 30 a 40 da partiacutecula retroviral eacute

constituiacuteda por liacutepidos (viacuterus com invoacutelucro lipiacutedico) 35

Como a siacutentese lipiacutedica requer

grandes quantidades de poder redutor alteraccedilotildees a niacutevel da sua disponibilidade intracelular

teratildeo previsivelmente impacto na estabilidade do vector eou produtividade das ceacutelulas

produtoras

14 Objectivos principais

O presente trabalho teve como objectivo a manipulaccedilatildeo do fenoacutetipo lactogeacutenico

associado ao efeito de Warburg procurando simultaneamente reduzir a acumulaccedilatildeo de lactato

e aumentar a eficiecircncia do metabolismo energeacutetico com o consequente aumento da

produtividade celular e qualidade do biofaacutermaco Para tal recorreu-se agrave tecnologia de RNA de

interferecircncia via transduccedilatildeo com vectores lentivirais para o silenciamento de HIF1 PDK1 e

PDK3 os efectores do fenoacutetipo lactogeacutenico associado ao efeito de Warburg Estudos de

silenciamento de PDK1 36

e PDK3 28

utilizando a tecnologia de RNA de interferecircncia jaacute

demonstraram a viabilidade da reversatildeo do fenoacutetipo lactogeacutenico associado ao efeito de

Warburg sem que tal aparentemente afectasse o crescimento celular No entanto a

manipulaccedilatildeo efectuada neste trabalho ndash silenciamento sucessivo de HIF1 PDK1 e PDK3 ndash

nunca foi estudada

As linhas celulares 293 FLEX GFP MDCK E1 e RPE A6 foram escolhidas pela sua

importacircncia a niacutevel da produccedilatildeo de biofaacutermacos complexos tornando este projecto natildeo soacute

cientificamente atraente como tecnologicamente relevante

6

2 MATERIAIS E MEacuteTODOS

21 Linhas celulares e meios de cultura

293 FLEX GFP eacute uma linha celular humana derivada de HEK293 (ATCC CRL-1573)

produtora de vectores retrovirais recombinantes baseados no viacuterus da leucemia murina

(Murine Leukemia Virus MLV) pseudotipadas com o invoacutelucro lipiacutedico do viacuterus da leucemia

do macaco gibatildeo (Gibbon Ape Leukemia Virus GaLV) e contendo um transgene codificante

para a proteiacutena fluorescente verde (Green Fluorescent Protein GFP) estabelecidas como

descrito em Coroadinha et al (2006) 37

RPE A6 eacute uma linha celular humana imortalizada

pela telomerase produtora de anticorpos monoclonais humanos por transfecccedilatildeo estaacutevel das

ceacutelulas hTERT RPE-1 (ATCC CRL-4000) MDCK E1 eacute uma linha celular canina derivada de

MDCK (ECCAC Nr 841211903) usada para produccedilatildeo de vectores adenovirais e estabelecida

como descrito em Santiago et al (em preparaccedilatildeo) 38

Estas linhas celulares foram usadas para

o estabelecimento de populaccedilotildees silenciadas respectivos clones e controlos atraveacutes de

transduccedilatildeo por infecccedilatildeo com vectores lentivirais A linha celular 293T (ATCC CRL-11268)

foi usada para produccedilatildeo de vectores lentivirais e a linha celular Te671 (ATCC CCL-136) para

titulaccedilatildeo de partiacuteculas retrovirais infecciosas Todas as linhas celulares foram mantidas em

meio de cultura DMEM (Gibco Paisley Reino Unido) suplementado com 10 (vv) de

Foetal Bovine Serum (FBS) (Gibco) a 37ordmC e atmosfera huacutemida com 5 de CO2

22 Produccedilatildeo de plasmiacutedeos e vectores lentivirais

A construccedilatildeo short hairpin RNA (shRNA) para o silenciamento de HIF1

TRCN000000309 e o controlo non-target (ntshRNA) (Anexo 1) satildeo baseados no plasmiacutedeo

pLKO1-puro 39

e contecircm um gene de resistecircncia agrave puromicina tendo sido adquiridos agrave

bdquoSigma Missionreg RNAi‟ (Sigma St Louis MO EUA) Foram produzidos vectores lentivirais

para cada um dos shRNA em sistema transiente por co-transfecccedilatildeo com pSPAX2 e pMD2G

[gentilmente cedidos por Didier Trono do Swiss Federal Institute of Technology atraveacutes do

repositoacuterio de plasmiacutedeos da Addgene (Cambridge MA EUA)] que fornecem as funccedilotildees de

empacotamento e invoacutelucro lipiacutedico respectivamente Para o silenciamento de PDK1 e PDK3

e correspondente controlo ntshRNA foram adquiridos agrave bdquoSigma Missionreg RNAi‟ vectores

lentivirais custom-made semelhantes aos anteriores mas contendo um gene que codifica a

proteiacutena fluorescente vermelha (Red Fluorescent Protein RFP) As sequecircncias usadas natildeo se

7

encontram validadas tendo sido desenhadas simultaneamente para uma zona de homologia

entre os genes PDK1 e PDK3 e entre os genomas humano e canino (Anexo 1)

23 Transduccedilatildeo celular selecccedilatildeo e clonagem

Para o estabelecimento de populaccedilotildees shRNA (shHIF1 e ntshRNA) as ceacutelulas 293

FLEX GFP MDCK E1 e RPE A6 foram inoculadas em placas de 6 poccedilos a uma densidade de

1x105 ceacutelulascm

2 24 horas depois o meio de cultura foi substituiacutedo por 600 microl de

sobrenadante lentiviral preparado em meio de cultura contendo 80 μgmL de polibreno

(Sigma Steinheim Alemanha) e diluiacutedo de forma a atingir uma baixa multiplicidade de

infecccedilatildeo (01) 48 horas apoacutes a infecccedilatildeo as ceacutelulas foram colocadas sob pressatildeo selectiva do

antibioacutetico puromicina a 15 μgmL (MDCK E1 e 293 FLEX GFP) ou 30 microgmL (RPE A6) e

mantidas em cultura durante 21 dias substituindo-se o meio de cultura a cada 3 dias As

populaccedilotildees shHIF1 foram posteriormente clonadas em placas de 96 poccedilos inoculadas a uma

densidade de 05 ceacutelulaspoccedilo tendo-se isolado cerca de 30 clones para cada uma delas Para

o silenciamento de PDK1 e PDK3 os clones shHIF1 escolhidos para continuar o estudo

foram transduzidos como acima descrito usando uma multiplicidade de infecccedilatildeo superior

`anteriormente usada (lt1) As populaccedilotildees ntshRNA foram igualmente transduzidas com um

segundo vector ntshRNA (Anexo 1) A selecccedilatildeo de ceacutelulas duplamente transduzidas foi

efectuada por citometria de fluxo acoplada a sorteamento no sistema bdquoMoFlo High-Speed Cell

Sorter‟ (Dako Cytomation Glostrup Dinamarca) tirando partido da fluorescecircncia da RFP As

ceacutelulas sorteadas foram mantidas posteriormente em cultura sob pressatildeo selectiva do

antibioacutetico puromicina

24 Estudos de crescimento e anaacutelise de metabolitos

Inocularam-se tissue-flasks de 25 cm2 a uma densidade de 1x10

4 ceacutelulascm

2 (MDCK

E1) e de 4x104 ceacutelulascm

2 (293 FLEX GFP) em meio DMEM (Gibco) suplementado com

10 (vv) FBS (Gibco) Para os estudos com ceacutelulas duplamente transduzidas usou-se

adicionalmente um suplemento antioxidante a 01 (vv) (Sigma) Durante 7 dias ao longo

da curva de crescimento foram sendo retiradas amostras de sobrenadante que foram

clarificadas por filtraccedilatildeo a 045 microm e guardadas a -85ordmC ateacute posterior anaacutelise A concentraccedilatildeo

e viabilidade celulares foram determinadas pelo meacutetodo de exclusatildeo do azul de tripano

(Gibco) As concentraccedilotildees de glucose e lactato foram determinadas usando o sistema bdquoYSI

7100 Multiparameter Bioanalytical System‟ (YSI Life Sciences Yellow Springs OH EUA)

8

25 Extracccedilatildeo de RNA total e qRT-PCR

Para quantificar os niacuteveis de expressatildeo geacutenica o RNA total celular foi isolado usando

o bdquoRNeasy Mini Kit‟ (Qiagen Valencia CA EUA) de acordo com as instruccedilotildees do

fabricante A transcriccedilatildeo reversa do RNA total foi efectuada segundo o protocolo de siacutentese

de cDNA do bdquoTranscriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit‟ (Roche Applied Science

Manheim Alemanha) usando 2 microg de RNA total e primers oligo dT O qRT-PCR foi

realizado em triplicados no termociclador bdquoLightCyclerreg 480 Real-Time PCR System‟ (Roche

Applied Science) segundo as instruccedilotildees do kit bdquoLightCyclerreg 480 SYBR Green I Master‟

(Roche Applied Science) O sinal de PCR foi definido segundo o Meacutetodo da Segunda

Derivada Maacutexima 40

e a expressatildeo geacutenica foi quantificada relativamente agrave expressatildeo do gene

housekeeping RPL22 segundo o meacutetodo 2-ΔCt

41

As sequecircncias dos primers usados neste

estudo (Anexo 2) foram desenhadas para locais de homologia entre ceacutelulas humanas e caninas

recorrendo aos softwares BLAST 42

e Primer3 43

26 Produccedilatildeo e titulaccedilatildeo de vectores retrovirais

Para a titulaccedilatildeo de partiacuteculas retrovirais infecciosas ceacutelulas Te671 foram inoculadas a

uma densidade de 5x104 ceacutelulascm

2 em placas de 24 poccedilos Apoacutes 24 horas o meio foi

removido e as ceacutelulas foram infectadas em duplicados com 150 microl de sobrenadante viral

(recolhido durante os estudos de crescimento) previamente sujeito a diluiccedilotildees em seacuterie em

meio de cultura contendo 80 microgmL de polibreno (Sigma) 48 horas apoacutes a infecccedilatildeo a

quantidade de ceacutelulas fluorescentes foi determinada por citometria de fluxo (CyFlow Space

Partec Alemanha) e o tiacutetulo viral calculado de acordo com a Equaccedilatildeo 1

(Equaccedilatildeo 1)

Para a titulaccedilatildeo de partiacuteculas retrovirais totais seguiu-se o protocolo descrito em

Carmo et al (2004) 44

com as seguintes modificaccedilotildees bdquoTranscriptor High Fidelity cDNA

Synthesis Kit‟ (Roche Applied Science) para a siacutentese de cDNA e primer reverso para a GFP

(Anexo 2) Para o qRT-PCR o mesmo sistema acima descrito foi usado utilizando o par de

primers para a GFP Diluiccedilotildees sucessivas do plasmiacutedeo pGFP foram usadas para a construccedilatildeo

da curva-padratildeo

27 Produccedilatildeo e titulaccedilatildeo de vectores adenovirais

Para a produccedilatildeo e titulaccedilatildeo de vectores adenovirais seguiram-se os protocolos

descritos em Altaras et al (2005) 45

e Kamen amp Henry (2004) 46

Resumidamente aquando

9

dos estudos de crescimento ceacutelulas MDCK E1 com confluecircncia de 80 foram transduzidas

com um stock de Canine adenoviacuterus type 2 (CAV-2) contendo o transgene da GFP a uma

multiplicidade de infecccedilatildeo de 5 em meio suplementado com 1 (vv) de aminoaacutecidos natildeo

essenciais (Sigma) Apoacutes 40 horas foram recolhidas as fracccedilotildees extra (recolha do

sobrenadante) e intracelular [lise celular provocada por uma soluccedilatildeo de Triton X-100 a 01

(vv) em Tris-HCl 10 mM pH 8] dos vectores adenovirais produzidos procedendo-se agrave sua

clarificaccedilatildeo por centrifugaccedilatildeo (10 minutos 3000 g) Para a titulaccedilatildeo de partiacuteculas infecciosas

foram inoculadas ceacutelulas MDCK E1 a uma densidade de 2x104 ceacutelulascm

2 em placas de 24

poccedilos e 24 horas depois o meio de cultura foi substituiacutedo por diluiccedilotildees sucessivas dos viacuterus

recolhidos em duplicados A percentagem de ceacutelulas fluorescentes foi determinada 24 horas

apoacutes a infecccedilatildeo Para a titulaccedilatildeo de partiacuteculas adenovirais totais o DNA viral foi extraiacutedo

usando o bdquoRoche High Pure Viral DNA Kit‟ (Roche Applied Science) O qPCR foi realizado

como descrito para a titulaccedilatildeo de partiacuteculas retrovirais totais A produtividade especiacutefica de

partiacuteculas totais e infecciosas foi calculada tendo em conta o nuacutemero de partiacuteculas produzidas

e o nuacutemero de ceacutelulas no periacuteodo de produccedilatildeo

28 Determinaccedilatildeo da actividade da lactato desidrogenase

Para a determinaccedilatildeo da actividade da enzima lactato desidrogenase extractos celulares

a uma densidade de 2x106 ceacutelulasmL recolhidas ao longo das curvas de crescimento foram

preparados previamente em tampatildeo bdquoM-PER Mammalian Protein Extraction Reagent‟ (Pierce

Rockford IL EUA) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A actividade intracelular

enzimaacutetica foi determinada atraveacutes da monitorizaccedilatildeo espectrofotomeacutetrica a 340 nm da taxa de

oxidaccedilatildeo de NADH a NAD+ acoplada agrave reduccedilatildeo de piruvato a lactato

29 Western Blot

A expressatildeo proteica foi detectada por Western Blotting apoacutes separaccedilatildeo em gel de

poliacrilamida NuPage a 4-12 (wv) (Invitrogen Paisley Reino Unido) com running buffer

MOPS (conc 1x Invitrogen) das amostras desnaturadas a 72ordm C durante 10 minutos Cada

poccedilo foi carregado com igual quantidade de proteiacutena e as amostras correram durante 90

minutos a voltagem constante de 125 V tendo sido posteriormente transferidas durante 90

minutos para membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) Estas foram reveladas com os

anticorpos listados no Anexo 3 detectadas com os respectivos anticorpos secundaacuterios

conjugados com a peroxidase de raacutebano (HRP) (diluiccedilatildeo 15000) e reveladas com bdquoAmersham

ECL Plustrade Western Blotting Detection Reagents‟ (GE Healthcare Piscataway NJ EUA)

10

210 Quantificaccedilatildeo de fosfatos de adenosina e nucleoacutetidos de piridina

As razotildees ADPATP foram determinadas atraveacutes do bdquoEnzyLighttrade

ADPATP Ratio

Assay Kit‟ (BioAssay Systems Hayward CA EUA) de acordo com as instruccedilotildees do

fabricante As razotildees NAD+NADH e NADP

+NADPH foram determinadas recorrendo ao

bdquoEnzyChromtrade NADNADH Assay Kit‟ (BioAssay Systems) e bdquoEnzyChromtrade

NADP+NADPH Assay Kit‟ (BioAssay Systems) Foram seguidas as instruccedilotildees do fabricante

211 Quantificaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio

Para determinar a carga intracelular de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ERO)

quantificou-se a velocidade de formaccedilatildeo de um produto fluorescente resultante da oxidaccedilatildeo

da sonda H2DCFDA (Invitrogen) Para tal placas de 96 poccedilos foram inoculadas agrave densidade

celular acima descrita para os estudos de crescimento 48 horas depois adicionou-se uma

soluccedilatildeo de Saponina (Sigma) a uma concentraccedilatildeo final de 004 mgmL e incubou-se a 37ordmC

Apoacutes 30 minutos adicionou-se a sonda a uma concentraccedilatildeo final de 10 microM A formaccedilatildeo de

fluorescecircncia foi seguida durante 250 minutos a 485528 nm (emissatildeoexcitaccedilatildeo) A

velocidade de formaccedilatildeo de fluorescecircncia uma medida directa da quantidade de ERO foi

calculada por regressatildeo linear pelo meacutetodo de ajuste dos miacutenimos quadrados da curva de

fluorescecircncia vs tempo

212 Coloraccedilatildeo para detecccedilatildeo de actividade da β-galactosidade

Para averiguar a expressatildeo da enzima β-galactosidade inocularam-se placas de 6

poccedilos com as densidades acima descritas para os estudos de crescimento A meio da fase

exponencial da curva de crescimento as ceacutelulas foram fixadas e coradas como descrito em

Sambrook amp Russell (2001) 47

213 Caacutelculos

Para determinar as taxas especiacuteficas de crescimento celular produccedilatildeoacumulaccedilatildeo de

metabolitos e de partiacuteculas virais foi considerada a equaccedilatildeo de Boltzmann (Equaccedilatildeo 2)


onde P representa os diferentes paracircmetros quer seja concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis

concentraccedilatildeo de metabolitos PI ou PT C representa a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis t

representa o tempo de cultura e microp eacute a taxa especiacutefica celular de cada paracircmetro em estudo O

intervalo de confianccedila considerado foi de 95

11

3 RESULTADOS

31 Silenciamento de HIF1

No presente trabalho foi usado o sistema bdquoSigma Missionreg RNAi‟ ndash construccedilatildeo

humana ndash para o silenciamento de genes em linhas celulares humanas e caninas A eficiecircncia

de silenciamento do sistema em ceacutelulas caninas foi previamente testada e confirmada com um

gene repoacuterter (turboGFP) (dados natildeo apresentados)

Para a primeira fase de manipulaccedilatildeo do efeito de Warburg as linhas celulares 293

FLEX GFP MDCK E1 e RPE A6 foram infectadas com vectores lentivirais transportando um

hairpin de silenciamento de HIF1 seleccionadas e clonadas por diluiccedilatildeo limitante Foram

isolados cerca de 30 clones por linha celular

O silenciamento de HIF1 induziu diferentes respostas nas linhas celulares em estudo

nos clones MDCK E1 e 293 FLEX GFP natildeo foram notadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas

contrariamente a maioria dos clones RPE A6 apresentou alteraccedilotildees severas a niacutevel

morfoloacutegico (aumento das dimensotildees celulares e da razatildeo citoplasmanuacutecleo) (Figura 2A-C) e

do crescimento celular Alguns destes clones perderam totalmente a capacidade proliferativa

Estas alteraccedilotildees sugeriram um cenaacuterio de senescecircncia induzida pelo silenciamento de HIF1 48

Deste modo procedeu-se agrave detecccedilatildeo de actividade da enzima β-galactosidade descrita como

um biomarcador de ceacutelulas em senescecircncia 49

(Figura 2D-F) Na linha celular parental natildeo se

observou coloraccedilatildeo indicativa da actividade da β-galactosidase enquanto nos clones

silenciados para HIF1 se obteve uma elevada coloraccedilatildeo Estes resultados sugeriram que na

linha celular RPE A6 o silenciamento de HIF1 poderaacute ter induzido a entrada das ceacutelulas num

estado de senescecircncia Como tal natildeo se prosseguiu os estudos com esta linha celular

Para a continuaccedilatildeo dos estudos de caracterizaccedilatildeo do efeito do silenciamento de HIF1

foram escolhidos os clones FLEX shHIF121 FLEX shHIF125 MDCK shHIF115 e

MDCK shHIF116 com base numa anaacutelise integrada da reduccedilatildeo dos niacuteveis de lactato

desidrogenase quantificaccedilatildeo da expressatildeo de HIF1 e screening preliminar do tiacutetulo viral

(dados natildeo apresentados) Para estes clones analisaram-se as curvas de crescimento e o

metabolismo energeacutetico central (Figura 3 e Tabela 1) os niacuteveis de lactato desidrogenase

(Figura 4) e efeitos do silenciamento de HIF1 na expressatildeo geacutenica de PDHE1α LDH (A e B)

e PDK (1 e 3) (Figura 5)

12

Linha celular parental Clones silenciados

Figura 2 Impacto do silenciamento de HIF1 em ceacutelulas RPE A6 Alteraccedilotildees morfoloacutegicas observadas na

linha celular parental (A) e nos clones RPE shHIF118 (B) e RPE shHIF122 (C) Detecccedilatildeo de actividade de β-

galactosidade um biomarcador de senescecircncia em RPE A6 (D) RPE shHIF13 (E) e RPE shHIF124 (F) A

barra da escala corresponde a 300 microm

Os clones silenciados para HIF1 analisados apresentaram perfis bem como taxas

especiacuteficas de crescimento idecircnticas agraves respectivas linhas celulares parentais Em termos

metaboacutelicos tambeacutem natildeo ocorreram alteraccedilotildees consideraacuteveis nas taxas de consumo de

glucose e de produccedilatildeo de lactato (Figura 3 e Tabela 1)

Figura 3 Curvas de crescimento celular Ceacutelulas 293 FLEX GFP (A) e de MDCK E1 (B) a cada ponto da

curva de crescimento estaacute associado um erro de 10 decorrente do meacutetodo de contagem celular

00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)

Tempo de cultura (h)

293 FLEX GFP FLEX shHIF121 FLEX shHIF125

00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)


MDCK E1 MDCK shHIF115 MDCK shHIF116

A B C

D E F

A B

13

Tabela 1 Taxas especiacuteficas de crescimento celular e metabolismo energeacutetico central

μcrescimento

(h-1

)

γglucose

(micromol106ceacutelulash)

γlactato


293 FLEX GFP 0019 plusmn 0002 012 plusmn 002 019 plusmn 003 16 plusmn 04

FLEX shHIF121 0018 plusmn 0002 013 plusmn 001 022 plusmn 002 17 plusmn 03


MDCK E1 0026 plusmn 0005 030 plusmn 008 055 plusmn 011 18 plusmn 09

MDCK shHIF115 0028 plusmn 0004 036 plusmn 005 065 plusmn 004 18 plusmn 04


Os erros na μcrescimento γglucose e γlactato correspondem ao erro calculado por regressatildeo linear segundo o meacutetodo dos

miacutenimos quadrados os erros no γlactatoγglucose correspondem agrave propagaccedilatildeo de erro (μcrescimento) taxa especiacutefica de

crescimento (γglucose) taxa de consumo de glucose (γlactato) taxa de produccedilatildeo de lactato

De forma a averiguar se o silenciamento de HIF1 induziu alteraccedilotildees nos niacuteveis de

lactato desidrogenase quantificou-se a actividade intracelular da enzima (Figura 4) Nos

clones FLEX natildeo se observaram alteraccedilotildees relevantes Por outro lado nos clones MDCK

observaram-se reduccedilotildees de actividade entre os 30 e 40

Figura 4 Actividade intracelular da enzima lactato desidrogenase Actividade enzimaacutetica nas ceacutelulas 293

FLEX GFP (A) e MDCK E1 (B) normalizada para as respectivas linhas celulares parentais barras de erro

correspondem ao erro calculado por regressatildeo linear segundo o meacutetodo dos miacutenimos quadrados

Em termos de expressatildeo geacutenica (Figura 5) os clones FLEX shHIF121 e FLEX

shHIF125 apresentaram uma diminuiccedilatildeo da expressatildeo de HIF1 de 628 e 500

respectivamente Para os restantes genes analisados natildeo se observaram alteraccedilotildees

significativas na sua expressatildeo Nos clones MDCK shHIF115 e MDCK shHIF116

observou-se uma diminuiccedilatildeo da expressatildeo de HIF1 (191 e 522 respectivamente) de

00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12

MDCK E1 MDCK shHIF115

MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14

LDHA (385 e 176 respectivamente) e de PDK1 (640 e 544 respectivamente) A

expressatildeo geacutenica de LDHA observada para as ceacutelulas 293 FLEX GFP e MDCK E1 estaacute de

acordo com a quantificaccedilatildeo de actividade intracelular da enzima (Figura 4)

Figura 5 Expressatildeo geacutenica apoacutes silenciamento de HIF1 Ceacutelulas 293 FLEX GFP (A) e MDCK E1 (B) a

quantificaccedilatildeo da expressatildeo foi feita por qRT-PCR relativamente ao gene housekeeping RPL22 e normalizada

para as respectivas linhas celulares parentais as barras de erro correspondem ao desvio-padratildeo n = 3 p lt 005

dado por um teste t bilateral para amostras natildeo emparelhadas entre 3 replicados (HIF1) factor 1 indutiacutevel por

hipoxia (PDHE1α) subunidade α do componente E1 do complexo piruvato desidrogenase (LDHA e LDHB)

lactato desidrogenase A e B (PDK1 e PDK3) cinase 1 e 3 da piruvato desidrogenase

Um dos principais objectivos do presente estudo foi avaliar o impacto da manipulaccedilatildeo

do efeito de Warburg na produtividade celular Neste sentido quantificou-se a produccedilatildeo de

partiacuteculas virais totais e infecciosas (Figura 6) O silenciamento de HIF1 ainda que moderado

(maacuteximo de 628 de acordo com a Figura 5) resultou em alteraccedilotildees notaacuteveis na

produtividade das ceacutelulas 293 FLEX GFP com especial destaque para o clone FLEX

shHIF121 em que a taxa de produccedilatildeo de partiacuteculas totais aumentou 68x e a taxa de

partiacuteculas infecciosas aumentou 212x comparativamente agrave linha celular parental Tambeacutem

nos clones MDCK silenciados para HIF1 se observou um aumento da produtividade viral

ainda que em menor extensatildeo particularmente o clone MDCK shHIF115 em que a

produtividade especiacutefica de partiacuteculas totais aumentou 15x e a de partiacuteculas infecciosas

aumentou 20x A anaacutelise das razotildees PIPT (Tabela 2) demonstrou ainda que para ambas as

linhas celulares o silenciamento de HIF1 resultou numa produccedilatildeo viral de qualidade superior

isto eacute com um maior nuacutemero de partiacuteculas infecciosas por nuacutemero de partiacuteculas totais

00

05

10

15

20

HIF1 PDHE1α LDHA LDHB PDK1 PDK3

Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da

293 FLEX GFP FLEX shHIF121 FLEX shHIF125A B

15

Figura 6 Produtividade viral apoacutes o silenciamento de HIF1 Produtividade especiacutefica em ceacutelulas 293 FLEX

GFP (A) e ceacutelulas MDCK E1 (B) as barras de erro das produtividades especiacuteficas de partiacuteculas retrovirais totais

e de partiacuteculas adenovirais (totais e infecciosas) correspondem ao desvio-padratildeo n = 3 e n = 2 respectivamente

as barras de erro da produtividade especiacutefica de partiacuteculas retrovirais infecciosas correspondem ao erro calculado

por regressatildeo linear segundo o meacutetodo dos miacutenimos quadrados (βPT) produtividade especiacutefica de partiacuteculas

virais totais (βPI) produtividade especiacutefica de partiacuteculas virais infecciosas

Tabela 2 Qualidade das produccedilotildees virais razatildeo PIPT

293 FLEX GFP 1145 plusmn 25 MDCK E1 1217 plusmn 63

FLEX shHIF121 144 plusmn 8 MDCK shHIF115 1159 plusmn 51


(PIPT) razatildeo partiacuteculas infecciosaspartiacuteculas totais o erro corresponde agrave propagaccedilatildeo de erro

32 Silenciamento simultacircneo de HIF1 PDK1 e PDK3

Apoacutes uma primeira fase de manipulaccedilatildeo do efeito de Warburg por silenciamento de

HIF1 com a obtenccedilatildeo de clones com elevados niacuteveis de produtividade viral prosseguiu-se

para a segunda fase deste trabalho envolvendo o silenciamento de PDK1 e PDK3 Os clones

FLEX shHIF121 e MDCK shHIF115 foram entatildeo transduzidos com vectores lentivirais

transportando hairpins de silenciamento para PDK1 e PDK3 Neste estudo foram introduzidos

dois controlos ndash controlos non-target (ntshRNA) ndash em que o hairpin natildeo tem qualquer alvo

conhecido no genoma activando no entanto a via do RNA de interferecircncia Estes controlos

tecircm sido descritos como os melhores controlos negativos em estudos que recorram agrave

tecnologia de RNA de interferecircncia permitindo a distinccedilatildeo entre os efeitos fisioloacutegicos

induzidos pela activaccedilatildeo da via do RNA de interferecircncia e os induzidos pelo silenciamento

0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)

Partiacuteculas Totais Partiacuteculas Infecciosas

0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)

Partiacuteculas Totais Partiacuteculas InfecciosasA B

16

geacutenico 5051

Ceacutelulas 293 FLEX GFP e MDCK E1 foram transduzidas com um hairpin non-

target (populaccedilotildees 1xntshRNA) e apoacutes selecccedilatildeo estas populaccedilotildees foram novamente

transduzidas com outro hairpin non-target (populaccedilotildees 2xntshRNA) As populaccedilotildees

duplamente transduzidas foram seleccionadas por citometria de fluxo acoplada a sorteamento

celular Parte destas populaccedilotildees foram clonadas directamente por sorteamento e outra parte

foi mantida como populaccedilatildeo Por questotildees de limitaccedilatildeo de tempo o trabalho descrito nesta

dissertaccedilatildeo engloba apenas os resultados relativos agraves populaccedilotildees

Avaliou-se o impacto da activaccedilatildeo da via do RNA de interferecircncia (populaccedilotildees

ntshRNA) do silenciamento de HIF1 e do silenciamento duplo HIF1+PDK13 no

crescimento celular natildeo tendo sido observadas diferenccedilas significativas (Tabela 3)

Metabolicamente as ceacutelulas FLEX shHIF121 e as duplamente silenciadas apresentaram

reduccedilotildees evidentes das taxas de consumo de glucose e de produccedilatildeo de lactato sem no

entanto existir alteraccedilatildeo nas razotildees lactatoglucose (Figura 7 e Tabela 4) Nas populaccedilotildees

FLEX ntshRNA em particular a populaccedilatildeo duplamente transduzida foram observadas

alteraccedilotildees na morfologia celular e visiacutevel aumento na concentraccedilatildeo de lactato no meio de

cultura observaccedilotildees confirmadas pela obtenccedilatildeo de maiores taxas de produccedilatildeo de lactato As

ceacutelulas MDCK silenciadas pelo contraacuterio apresentaram um ligeiro aumento nas taxas de

consumo de glucose e de produccedilatildeo de lactato ainda que sem alteraccedilatildeo na razatildeo

lactatoglucose

Tabela 3 Taxas de crescimento celular

μcrescimento (h-1

) μcrescimento (h-1

)


FLEX 1xntshRNA 0021 plusmn 0002 MDCK 1xntshRNA 0029 plusmn 0002



FLEX shHIF121

+shPDK13 0024 plusmn 0001

MDCK shHIF115


Os erros correspondem ao erro calculado por regressatildeo linear segundo o meacutetodo dos miacutenimos quadrados

(μcrescimento) taxa de crescimento celular

17

Figura 7 Impacto nas taxas de consumo de glucose e de produccedilatildeo de lactato Ceacutelulas 293 FLEX GFP (A) e

MDCK E1 (B) as barras de erro correspondem ao erro calculado por regressatildeo linear segundo o meacutetodo dos

miacutenimos quadrados (γmetaboacutelica) taxa de consumo de glucose ou taxa de produccedilatildeo de lactato conforme o caso

Tabela 4 Metabolismo energeacutetico central razotildees γlactatoγglucose





FLEX shHIF121+shPDK13 15 plusmn 01 MDCK shHIF115+shPDK13 15 plusmn 02

Os erros correspondem agrave propagaccedilatildeo de erro (γglucose) taxa de consumo de glucose (γlactato) taxa de produccedilatildeo de

lactato

De forma a averiguar o impacto do silenciamento de PDK1 e PDK3 nos niacuteveis de

lactato desidrogenase quantificou-se a actividade intracelular da enzima (Figura 8)

Verificou-se uma reduccedilatildeo de actividade total da enzima lactato desidrogenase nas ceacutelulas 293

FLEX GFP silenciadas No entanto nas ceacutelulas MDCK E1 natildeo foram observadas diferenccedilas

na actividade enzimaacutetica

Figura 8 Impacto na actividade intracelular da lactato desidrogenase Actividade enzimaacutetica nas ceacutelulas

293 FLEX GFP (A) e MDCK E1 (B) normalizada para as respectivas linhas celulares parentais barras de erro


00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)

Consumo de glucose Produccedilatildeo de lactato

00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

Tempo de cultura asymp64h Tempo de cultura asymp118h

00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18

Nesta segunda fase quantificaram-se igualmente os niacuteveis de expressatildeo geacutenica de

HIF1 PDHE1α LDH (A e B) e PDK (1 e 3) (Figura 9A-B) Contrariamente aos resultados

anteriormente obtidos (Figura 5) o clone FLEX shHIF121 revelou alteraccedilotildees para aleacutem das

observadas no HIF1 nomeadamente a diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes da LDHA (reduccedilatildeo

de 308) e PDK1 (reduccedilatildeo de 289) relativamente agrave linha celular parental em linha com o

que acontecera anteriormente nos clones MDCK silenciados para HIF1 Na populaccedilatildeo

duplamente silenciada observou-se uma diminuiccedilatildeo significativa da expressatildeo de PDK1

(reduccedilatildeo de 630) e de PDK3 (reduccedilatildeo de 427) relativamente agrave linha celular parental No

clone MDCK shHIF115 os resultados anteriormente obtidos foram validados na populaccedilatildeo

duplamente silenciada observou-se uma diminuiccedilatildeo significativa de PDK1 (reduccedilatildeo de

841) e de PDK3 (reduccedilatildeo de 218) relativamente agrave linha celular parental A expressatildeo

geacutenica nos controlos ntshRNA foi idecircntica agrave das respectivas linhas celulares parentais

excepccedilatildeo feita agrave quantificaccedilatildeo de HIF1 na populaccedilatildeo MDCK 1xntshRNA que poderaacute dever-

se a um erro de execuccedilatildeo da teacutecnica jaacute que tal resultado natildeo eacute reprodutiacutevel na populaccedilatildeo

MDCK 2xntshRNA

Para aleacutem das alteraccedilotildees em termos de expressatildeo geacutenica analisaram-se os efeitos na

quantidade intracelular das respectivas proteiacutenas (Figura 9C) Natildeo foi possiacutevel detectar

diferenccedilas nos niacuteveis proteicos de HIF1 possivelmente porque a teacutecnica natildeo tem

sensibilidade suficiente para detectar pequenas variaccedilotildees de expressatildeo num factor de

transcriccedilatildeo que per se eacute transcrito em pequenas quantidades Devido agrave elevada quantidade de

proteiacutena carregada que provoca a saturaccedilatildeo do sinal e impossibilita a detecccedilatildeo de pequenas

variaccedilotildees tambeacutem natildeo se conseguiram observar alteraccedilotildees na quantidade proteica da

subunidade α do componente E1 do complexo piruvato desidrogenase e na enzima lactato

desidrogenase No entanto reduccedilotildees evidentes de actividade intracelular da lactato

desidrogenase jaacute tinham sido observadas (Figuras 4 e 8) De salientar ainda as reduccedilotildees

evidentes na quantidade proteica de PDK1 e PDK3 nas ceacutelulas silenciadas particularmente as

duplamente silenciadas

19

Figura 9 Expressatildeo geacutenica e proteica apoacutes silenciamento de HIF1 e PDK1 e PDK3 Quantificaccedilatildeo da

expressatildeo geacutenica por qRT-PCR em ceacutelulas 293 FLEX GFP (A) e MDCK E1 (B) a quantificaccedilatildeo da expressatildeo

foi realizada relativamente ao gene housekeeping RPL22 e normalizada para as respectivas linhas celulares

parentais as barras de erro correspondem ao desvio-padratildeo n = 3 p lt 005 dado por um teste t bilateral para

amostras natildeo emparelhadas entre 3 replicados (C) Western Blot para detecccedilatildeo da expressatildeo proteica cada poccedilo

foi carregado com a mesma quantidade de proteiacutena e os anticorpos utilizados encontram-se listados no Anexo 3

(HIF1) factor 1 indutiacutevel por hipoxia (PDHE1α) subunidade α do componente E1 do complexo piruvato

desidrogenase (LDHA e LDHB) lactato desidrogenase A e B (PDK1 e PDK3) cinase 1 e 3 da piruvato

desidrogenase (loading control) β-actina

00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a

293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA FLEX 2xntshRNA

FLEX shHIF121 FLEX shHIF121+shPDK13

00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a

MDCK E1 MDCK 1xntshRNA MDCK 2xntshRNA

MDCK shHIF115 MDCK shHIF115+shPDK13

HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20

Para avaliar o impacto desta manipulaccedilatildeo adicional do efeito de Warburg na

produtividade celular quantificou-se a produccedilatildeo de partiacuteculas totais e partiacuteculas infecciosas

(Figura 10) Nas ceacutelulas 293 FLEX GFP as duas populaccedilotildees controlo ntshRNA apresentaram

uma produccedilatildeo viral muito reduzida comparativamente agrave linha celular parental No clone

FLEX shHIF121 agrave semelhanccedila dos resultados anteriormente obtidos (Figura 6) observou-se

um notaacutevel aumento da produtividade A populaccedilatildeo duplamente silenciada apesar dos

silenciamentos moderados de PDK1 e PDK3 (Figura 9) apresentou aumentos tambeacutem eles

notaacuteveis na produccedilatildeo viral 59x na taxa de produccedilatildeo de partiacuteculas totais e 185x na taxa de

partiacuteculas infecciosas relativamente agrave linha celular parental Nas ceacutelulas MDCK E1 e ao

contraacuterio do observado para as 293 FLEX GFP as duas populaccedilotildees controlo ntshRNA

apresentaram aumentos na produccedilatildeo viral No clone MDCK shHIF115 natildeo se observou um

aumento da produtividade de partiacuteculas totais como anteriormente (Figura 6) no entanto a

produtividade especiacutefica de partiacuteculas infecciosas foi 35x superior relativamente agrave linha

celular parental A populaccedilatildeo duplamente silenciada apesar de um ligeiro decreacutescimo na

produccedilatildeo de partiacuteculas totais apresentou um aumento da produccedilatildeo de partiacuteculas infecciosas

de 22x relativamente agrave linha celular parental

A anaacutelise das razotildees PIPT (Tabela 5) confirmou que o silenciamento de HIF1

resultou num aumento de qualidade da produccedilatildeo viral para ambas as linhas celulares No

entanto apenas para as ceacutelulas 293 FLEX GFP o segundo silenciamento (shPDK13) resultou

num melhoramento adicional notaacutevel relativamente ao obtido com o silenciamento de HIF1

(aumento de 28x na razatildeo PIPT)

Figura 10 Produtividade viral apoacutes o silenciamento de HIF1 e PDK1 e PDK3 Produtividade especiacutefica em

ceacutelulas 293 FLEX GFP (A) e ceacutelulas MDCK E1 (B) as barras de erro das produtividades especiacuteficas de partiacuteculas retrovirais totais e de partiacuteculas adenovirais (totais e infecciosas) correspondem ao desvio-padratildeo n =

3 e n = 2 respectivamente as barras de erro da produtividade especiacutefica de partiacuteculas retrovirais infecciosas

correspondem ao erro calculado por regressatildeo linear segundo o meacutetodo dos miacutenimos quadrados (βPT)

produtividade especiacutefica de partiacuteculas virais totais (βPI) produtividade especiacutefica de partiacuteculas virais infecciosas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21


293 FLEX GFP 1 123 plusmn 15 MDCK E1 1 286 plusmn 22

FLEX 1xntshRNA 1 1248 plusmn 434 MDCK 1xntshRNA 1 126 plusmn 30


FLEX shHIF121 1 108 plusmn 33 MDCK shHIF115 1 88 plusmn 6

FLEX

shHIF121+shPDK13 1 39 plusmn 9

MDCK



Observou-se que as populaccedilotildees controlo ntshRNA apresentavam uma intensidade de

fluorescecircncia reduzida enquanto as ceacutelulas silenciadas apresentavam uma intensidade de

fluorescecircncia muito acentuada comparativamente agrave linha celular parental (Anexo 4) Sendo a

fluorescecircncia conferida pela expressatildeo do transgene viral avaliou-se o impacto das

manipulaccedilotildees efectuadas na expressatildeo deste e das outras duas construccedilotildees virais (gag-pol e

env GaLV) (Figura 11) As populaccedilotildees controlo ntshRNA apresentaram uma reduccedilatildeo muito

acentuada na expressatildeo dos genes gag-pol e do transgene sem que a expressatildeo de env GaLV

fosse afectada de forma relevante Contrariamente o clone FLEX shHIF121 apresentou um

aumento notaacutevel da expressatildeo de gag-pol (174x) e de transgene (139x) e em menor escala

do env GaLV (22x) comparativamente agrave linha celular parental Estes aumentos foram

igualmente observados na populaccedilatildeo duplamente silenciada e vatildeo de encontro aos

anteriormente obtidos para as produccedilotildees virais (Figura 10) Semelhante anaacutelise para o

componente E1 da linha celular MDCK E1 natildeo foi realizada por limitaccedilatildeo de tempo

Figura 11 Expressatildeo de genes virais em ceacutelulas 293 FLEX GFP A quantificaccedilatildeo da expressatildeo foi realizada

por qRT-PCR relativamente ao gene housekeeping RPL22 e normalizada para a linha celular parental as barras

de erro correspondem ao desvio-padratildeo n = 3 (gag-pol e transgene) n = 2 (env GaLV) p lt 005 dado por um

teste t bilateral para amostras natildeo emparelhadas entre 3 ou 2 replicados

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

gag-pol transgene env GaLV

Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22

O fenoacutetipo de glicoacutelise com formaccedilatildeo de lactato foi sugerido por Kondoh et al (2005)

52 como um mecanismo de protecccedilatildeo contra o stress oxidativo devido agrave diminuiccedilatildeo de fluxo

atraveacutes da cadeia respiratoacuteria Para avaliar um possiacutevel cenaacuterio de stress oxidativo nas ceacutelulas

silenciadas quantificou-se as espeacutecies reactivas de oxigeacutenio intracelularmente (Figura 12)

Interessantemente quer o clone FLEX shHIF121 como a populaccedilatildeo duplamente silenciada

apresentaram valores ligeiramente inferiores agrave linha celular parental e controlos ntshRNA

Nas ceacutelulas MDCK natildeo foram observadas alteraccedilotildees

Figura 12 Detecccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ERO) Taxa de detecccedilatildeo de ERO em ceacutelulas 293

FLEX GFP (A) e ceacutelulas MDCK E1 (B) as barras de erro correspondem ao desvio-padratildeo n = 12 p lt 005

dado por um teste t bilateral para amostras natildeo emparelhadas entre 12 replicados

De forma a determinar se os silenciamentos efectuados induziram um desbloqueio do

TCA e consequente melhoria do estado energeacutetico ndash razatildeo ADPATP ndash e do poder redutor

disponiacutevel ndash razotildees NAD+NADH e NADP

+NADPH ndash quantificaram-se os fosfatos de

adenosina e os nucleoacutetidos de piridina intracelularmente Nas ceacutelulas 293 FLEX GFP natildeo

foram observadas diferenccedilas nas razotildees ADPATP entre a linha celular parental controlos

ntshRNA e ceacutelulas silenciadas (Figura 13) Nas ceacutelulas MDCK E1 observou-se uma reduccedilatildeo

da razatildeo ADPATP de 604 no clone silenciado para HIF1 e de 661 na populaccedilatildeo

duplamente silenciada relativamente agrave linha celular parental indicativo de uma maior

disponibilidade intracelular de ATP

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

Figura 13 Estado energeacutetico intracelular Quantificaccedilatildeo dos fosfatos de adenosina e respectivas razotildees

ADPATP em ceacutelulas 293 FLEX GFP (A) e ceacutelulas MDCK E1 (B) as barras de erro correspondem ao desvio-

padratildeo n = 3 p lt 005 dado por um teste t bilateral para amostras natildeo emparelhadas entre 3 replicados

Na quantificaccedilatildeo de nucleoacutetidos de piridina (Figura 14) observou-se uma diminuiccedilatildeo

da razatildeo NAD+NADH de 387 e 149 no clone FLEX shHIF121 e na populaccedilatildeo

duplamente silenciada respectivamente sugerindo um aumento do poder redutor disponiacutevel

intracelularmente Pelo contraacuterio nas ceacutelulas MDCK silenciadas observou-se um ligeiro

aumento da razatildeo NAD+NADH

A quantificaccedilatildeo de NADP+ e NADPH em ceacutelulas 293 FLEX GFP e MDCK E1

resultou em valores inferiores ao limite de detecccedilatildeo do meacutetodo ainda que tenha sido usado

quer o nuacutemero de ceacutelulas recomendado pelas instruccedilotildees de utilizaccedilatildeo do kit quer cerca de dez

vezes mais Por limitaccedilotildees de tempo natildeo foi possiacutevel repetir o ensaio de forma a incluir esses

dados na presente dissertaccedilatildeo

Figura 14 Poder redutor disponiacutevel intracelularmente Quantificaccedilatildeo dos nucleoacutetidos de piridina e

respectivas razotildees NAD+NADH em ceacutelulas 293 FLEX GFP (A) e ceacutelulas MDCK E1 (B) as barras de erro

correspondem ao desvio-padratildeo n = 3 p lt 005 dado por um teste t bilateral para amostras natildeo emparelhadas

entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24

4 DISCUSSAtildeO E CONCLUSAtildeO

A crescente procura de biofaacutermacos complexos produzidos em ceacutelulas animais requer

o desenvolvimento de processos robustos aliados a ceacutelulas de elevada produtividade Poreacutem a

maioria das linhas celulares de mamiacutefero possuem um metabolismo energeacutetico desregulado

consumindo elevadas quantidades de glucose e acumulando quantidades significativas de

lactato 4 com a consequente reduccedilatildeo na produtividade tempo uacutetil de cultura e qualidade do

produto final Este trabalho teve por objectivo a manipulaccedilatildeo do fenoacutetipo lactogeacutenico

associado ao efeito de Warburg em ceacutelulas de mamiacutefero em cultura procurando

simultaneamente reduzir a acumulaccedilatildeo de lactato e aumentar a eficiecircncia do metabolismo

energeacutetico com o consequente aumento da produtividade celular A tecnologia de RNA de

interferecircncia via transduccedilatildeo com vectores lentivirais foi escolhida como uma ferramenta

raacutepida e versaacutetil para o silenciamento de HIF1 PDK1 e PDK3 os principais efectores do

fenoacutetipo lactogeacutenico associado ao efeito de Warburg

As linhas celulares 293 FLEX GFP (produtora de retroviacuterus) MDCK E1 (produtora de

adenoviacuterus) e RPE A6 (produtora de anticorpos monoclonais) foram numa primeira fase

transduzidas com vectores lentivirais transportando um hairpin de silenciamento de HIF1

Este processo foi realizado a uma baixa multiplicidade de infecccedilatildeo (01) para minimizar a

activaccedilatildeo da via de interferatildeo uma resposta celular de defesa contra infecccedilatildeo de viacuterus de

RNA que leva a uma inibiccedilatildeo natildeo especiacutefica da traduccedilatildeo e agrave possiacutevel apoptose celular 53

Apoacutes o silenciamento de HIF1 as alteraccedilotildees morfoloacutegicas de crescimento celular e a

detecccedilatildeo de actividade da β-galactosidase na maioria dos clones RPE A6 (Figura 2) sugeriram

a induccedilatildeo de um cenaacuterio de senescecircncia 4849

Esta linha celular foi imortalizada por

transfecccedilatildeo com a subunidade cataliacutetica da telomerase humana (hTERT) o HIF1 foi descrito

como tendo um papel criacutetico na actividade desta enzima 54-57

Assim os resultados obtidos

parecem sugerir que o seu silenciamento levou agrave inactivaccedilatildeo da telomerase reversatildeo da

imortalizaccedilatildeo e consequente entrada em senescecircncia replicativa Nas restantes linhas celulares

estas alteraccedilotildees natildeo foram observadas as ceacutelulas MDCK natildeo possuem actividade

telomeraacutesica detectaacutevel 58

as ceacutelulas derivadas de 293 apesar de possuiacuterem actividade

telomeraacutesica 59

natildeo aparentaram sofrer alteraccedilotildees decorrentes do silenciamento de HIF1

Sem que houvesse alteraccedilotildees de relevacircncia no crescimento celular nas ceacutelulas 293

FLEX GFP silenciadas foram observadas diminuiccedilotildees no consumo de glucose e na produccedilatildeo

de lactato especialmente apoacutes o silenciamento adicional de PDK1 e PDK3 acopladas agrave

25

diminuiccedilatildeo de actividade da enzima lactato desidrogenase (Figuras 4 7 e 8 e Tabelas 1 e 4)

Estes resultados estatildeo de acordo com a quantificaccedilatildeo da expressatildeo geacutenica onde foram

observadas reduccedilotildees na expressatildeo dos genes HIF1 LDHA PDK1 e PDK3 e com os

resultados de Western Blot onde se observaram reduccedilotildees evidentes de PDK1 e PDK3 (Figura

9) Nas ceacutelulas MDCK E1 silenciadas apesar de se terem observado diminuiccedilotildees na

expressatildeo dos genes atraacutes referidos bem como na quantidade de proteiacutena por eles codificada

tal natildeo teve repercussatildeo no fenoacutetipo jaacute que natildeo se observaram reduccedilotildees nas taxas de consumo

e produccedilatildeo de glucose e lactato respectivamente (Tabela 1 e Figura 7) As diferenccedilas nos

resultados obtidos entre a primeira fase de caracterizaccedilatildeo (silenciamento de HIF1) e a

segunda (silenciamento de HIF1 PDK1 e PDK3) como ao niacutevel da expressatildeo geacutenica ou de

actividade da lactato desidrogenase poderatildeo ser explicadas natildeo soacute como decorrentes das

diferentes condiccedilotildees de cultura como de erros inerentes agraves proacuteprias teacutecnicas Adicionalmente

podem tambeacutem dever-se ao padratildeo oscilatoacuterio do silenciamento via RNA de interferecircncia

durante o crescimento celular 60

Os resultados acima descritos suportam a reduccedilatildeo do fenoacutetipo lactogeacutenico associado

ao efeito de Warburg com base no silenciamento sucessivo de HIF1 PDK1 e PDK3 O

impacto desta reduccedilatildeo na produtividade celular foi adicionalmente avaliado O silenciamento

de HIF1 levou natildeo soacute ao aumento da produtividade viral como tambeacutem da sua qualidade

avaliada pela razatildeo PIPT Este efeito foi particularmente notaacutevel no clone FLEX shHIF121

ndash com aumento ateacute 212x na produtividade de partiacuteculas infecciosas ndash e em menor escala no

clone MDCK shHIF115 ndash com um aumento ateacute 35x na produtividade de partiacuteculas

infecciosas (Figuras 6 e 10 e Tabelas 2 e 5) O silenciamento adicional de PDK1 e PDK3

nestes clones ainda que natildeo se traduzindo num aumento de tiacutetulo viral infeccioso

relativamente aos correspondentes clones silenciados para HIF1 levou agrave obtenccedilatildeo de

produccedilotildees virais de qualidade superior De salientar que os resultados observados para a

populaccedilatildeo duplamente silenciada reflectem valores meacutedios resultantes da heterogeneidade

fenotiacutepica pelo que eacute de esperar que alguns dos clones desta populaccedilatildeo apresentem um

fenoacutetipo superior Estes resultados demonstram que a manipulaccedilatildeo do efeito de Warburg em

particular nas ceacutelulas 293 FLEX GFP resultou natildeo soacute na obtenccedilatildeo de ceacutelulas mais produtivas

mas tambeacutem mais eficientes na medida em que para o mesmo nuacutemero de partiacuteculas totais

produzidas corresponde uma maior fracccedilatildeo de partiacuteculas infecciosas Uma maior eficiecircncia de

produccedilatildeo nestas ceacutelulas foi de resto anteriormente descrita como decorrente de condiccedilotildees

nutricionais oacuteptimas capazes de alterar o seu estado metaboacutelico 33

Neste sentido avaliou-se o

potencial de desbloqueio do TCA induzido pelo silenciamento de HIF1 PDK1 e PDK3 e

26

consequente melhoria no estado energeacutetico e do poder redutor disponiacutevel intracelularmente

Os resultados obtidos (Figuras 13 e 14) sugerem um aumento dos niacuteveis de ATP nas ceacutelulas

MDCK E1 e aumento de poder redutor nas ceacutelulas 293 FLEX GFP Como a produccedilatildeo de ATP

estaacute acoplada ao fluxo de prototildees doados pelo NADH ao niacutevel da cadeia respiratoacuteria

mitocondrial entatildeo eacute expectaacutevel que o aumento dos niacuteveis de ATP nas ceacutelulas MDCK E1

resulte de um maior poder redutor disponiacutevel intracelularmente de igual forma eacute expectaacutevel

que o aumento do poder redutor nas ceacutelulas 293 FLEX GFP resulte em niacuteveis superiores de

produccedilatildeo de ATP O facto de natildeo terem sido observadas alteraccedilotildees relevantes nas razotildees

ADPATP nas ceacutelulas 293 FLEX GFP e NAD+NADH nas ceacutelulas MDCK E1 pode dever-se a

um maior consumo ndash associado a uma maior disponibilidade ndash mantendo-se as razotildees

inalteradas De resto o aumento consideraacutevel de partiacuteculas totais principalmente nas ceacutelulas

293 FLEX GFP (Figuras 6 e 10) estaraacute necessariamente associado a um maior consumo de

ATP e disponibilidade de poder redutor suportando esta hipoacutetese

O aumento do fluxo metaboacutelico atraveacutes do TCA e da cadeia respiratoacuteria sugerido

pelos resultados anteriores colocam a hipoacutetese de uma maior sobrecarga oxidativa 52

Os

resultados obtidos (Figura 12) mostraram que esse efeito natildeo se fez sentir De facto um

aumento dos niacuteveis intracelulares de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ERO) pode facilmente

culminar na morte celular pelo que eacute razoaacutevel aceitar que as ceacutelulas sobreviventes agraves

manipulaccedilotildees induzidas representam apenas eventos onde o desequiliacutebrio na carga oxidativa

natildeo ocorreu em extensatildeo apreciaacutevel Interessantemente no clone FLEX shHIF121 e na

respectiva populaccedilatildeo duplamente silenciada observou-se uma ligeira diminuiccedilatildeo das ERO

quantificadas relativamente agrave linha celular parental e aos controlos ntshRNA Estes

resultados colocam a hipoacutetese de que para as ceacutelulas sobreviventes um silenciamento

moderado de HIF1 PDK1 e PDK3 acoplado a um pequeno aumento da sobrecarga oxidativa

possam induzir um cenaacuterio de preacute-condicionamento descrito para outros sistemas celulares 61

em que um pequeno ldquoinsultordquo oxidativo activa sistemas de protecccedilatildeo resultando em ceacutelulas

mais resistentes ao stress oxidativo

Os resultados obtidos decorrentes do silenciamento moderado de HIF1 PDK1 e

PDK3 mostram que a manipulaccedilatildeo do efeito de Warburg resultou numa reduccedilatildeo do efeito

lactogeacutenico e sugerem um aumento da eficiecircncia do metabolismo energeacutetico por desbloqueio

do TCA ao niacutevel do complexo piruvato desidrogenase Niacuteveis de silenciamento superiores aos

obtidos poderiam resultar num fenoacutetipo de qualidade superior No entanto um elevado

silenciamento destes genes poderaacute estar associado a uma desvantagem proliferativa HIF1

controla ateacute 5 do genoma 62

pelo que um elevado silenciamento deste factor de transcriccedilatildeo

27

poderaacute levar agrave desregulaccedilatildeo de outras vias onde estaacute envolvido e consequentemente da

homeostasia celular um silenciamento total de PDK1 e PDK3 poderaacute desregular o sistema no

sentido oposto ou seja a super-activaccedilatildeo do complexo piruvato desidrogenase Tal facto

poderaacute natildeo soacute explicar o enriquecimento em ceacutelulas com maior vantagem proliferativa (menor

silenciamento) decorrente do alargado periacuteodo temporal desde a transduccedilatildeo com vectores

lentivirais selecccedilatildeo da populaccedilatildeo e subsequente clonagem como tambeacutem a obtenccedilatildeo de

apenas dois clones duplamente silenciados dos cerca de 200 clones isolados e mantidos em

paralelo agrave realizaccedilatildeo do presente estudo

Durante este trabalho notaram-se alteraccedilotildees na intensidade de fluorescecircncia de ceacutelulas

293 FLEX GFP transduzidas relativamente agrave linha celular parental (Anexo 4) Sendo a

fluorescecircncia resultado da expressatildeo de uma de trecircs construccedilotildees virais introduzidas nesta

linha celular ndash transgene ndash avaliou-se o impacto das manipulaccedilotildees efectuadas nas respectivas

expressotildees geacutenicas (Figura 11) Os resultados obtidos sugeriram um efeito toacutexico em ceacutelulas

293 FLEX GFP do hairpin usado nos controlos ntshRNA o que corrobora a reduccedilatildeo draacutestica

observada na produccedilatildeo viral (Figura 10) No entanto nas populaccedilotildees controlo MDCK E1 natildeo

se observou o mesmo efeito pelo que estudos posteriores seratildeo necessaacuterios para tentar

compreender este efeito antagoacutenico Pelo contraacuterio os elevados aumentos da expressatildeo de

gag-pol do transgene e em menor escala de env GaLV observados no clone FLEX

shHIF121 sugerem um cenaacuterio de alteraccedilatildeo transcricional no qual a expressatildeo das trecircs

construccedilotildees retrovirais usadas para estabelecer esta linha celular deixou de estar sob o efeito

inibitoacuterio do factor de transcriccedilatildeo HIF1 De facto e apesar de ser uma condiccedilatildeo necessaacuteria

mas natildeo suficiente existem elementos de resposta agrave hipoxia via HIF1 63

nas trecircs construccedilotildees

suportando a sugestatildeo de que a sua expressatildeo se encontra sob influecircncia de HIF1 Estes

resultados podem explicar em parte os elevados aumentos da produccedilatildeo viral nas ceacutelulas

silenciadas No entanto o aumento de 28x na qualidade da produccedilatildeo viral na populaccedilatildeo

duplamente silenciada (Tabela 5) natildeo pode ser explicado como resultado do efeito

transcricional jaacute que os niacuteveis de expressatildeo dos genes virais satildeo idecircnticos aos do clone

silenciado para HIF1 Assim este aumento deveraacute estar relacionado com a reduccedilatildeo adicional

na acumulaccedilatildeo de lactato e com um aumento de eficiecircncia na assemblagem de partiacuteculas

virais como resultado da reduccedilatildeo do fenoacutetipo lactogeacutenico e do aumento de eficiecircncia do

metabolismo energeacutetico Um estudo detalhado da estabilidade das partiacuteculas virais permitiraacute

avaliar tambeacutem o impacto da manipulaccedilatildeo do efeito de Warburg na qualidade intriacutenseca das

mesmas

28

Globalmente os resultados obtidos neste trabalho em particular para a linha celular

293 FLEX GFP demonstram que o silenciamento sucessivo de HIF1 PDK1 e PDK3 permite

a manipulaccedilatildeo do fenoacutetipo lactogeacutenico associado ao efeito de Warburg com evidentes

reduccedilotildees no consumo de glucose e de acumulaccedilatildeo de lactato Apesar de natildeo ter sido possiacutevel

observar alteraccedilotildees na razatildeo complexo PDH fosforiladoPDH natildeo fosforilado (Figura 9C) os

notaacuteveis aumentos de produccedilatildeo viral e da sua qualidade sugerem que a manipulaccedilatildeo efectuada

desbloqueou o TCA com o consequente aumento de eficiecircncia do metabolismo energeacutetico e

da produtividade celular A obtenccedilatildeo destas ceacutelulas de fenoacutetipo superior agrave linha celular

parental evidencia a manipulaccedilatildeo do efeito de Warburg como uma potencial ferramenta de

engenharia metaboacutelica com vista ao aumento da produtividade de biofaacutermacos complexos em

ceacutelulas de mamiacutefero em cultura De facto durante a execuccedilatildeo do trabalho descrito nesta

dissertaccedilatildeo Zhou et al (2011) 64

obtiveram aumentos consideraacuteveis na produccedilatildeo de

anticorpos monoclonais em ceacutelulas Chinese Hamster Ovary (CHO) pela reduccedilatildeo da expressatildeo

de Ldh e Pdk1-3

29

5 PERSPECTIVAS FUTURAS

Apesar dos resultados obtidos durante o presente estudo suportarem a hipoacutetese de que

a manipulaccedilatildeo de HIF1 PDK1 e PDK3 poderaacute conduzir a um metabolismo mais eficiente

resultados ainda mais expressivos poderatildeo advir da caracterizaccedilatildeo dos clones duplamente

silenciados jaacute que a anaacutelise aqui efectuada incidiu sobre a populaccedilatildeo duplamente silenciada

Os clones de fenoacutetipo superior seratildeo bons candidatos para a realizaccedilatildeo de um estudo de

Anaacutelise de Fluxos Metaboacutelicos acoplado a substratos marcados o que permitiraacute confirmar em

definitivo se as manipulaccedilotildees geneacuteticas efectuadas induziram um aumento do fluxo

metaboacutelico atraveacutes do TCA como consequecircncia do desbloqueio ao niacutevel do complexo

piruvato desidrogenase Adicionalmente estes clones seratildeo caracterizados pela teacutecnica de

microarrays para avaliar o impacto global na expressatildeo geacutenica

A integraccedilatildeo dos dados do transcriptoma e metaboloma constituiraacute uma poderosa

ferramenta natildeo soacute do ponto de vista tecnoloacutegico podendo ser extensiacutevel agrave manipulaccedilatildeo de

outras linhas celulares de mamiacutefero utilizadas na produccedilatildeo de biofaacutermacos complexos como

tambeacutem de um ponto de vista fundamental na medida em que forneceraacute uma perspectiva

global e integrada do efeito de Warburg e da sua manipulaccedilatildeo na fisiologia e metabolismo

celulares

30

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34

7 ANEXOS

Anexo 1 Mapas dos vectores lsquoSigma Mission

reg RNAi shRNArsquo Mapa do vector shHIF1 e primeiro ntshRNA

(A) e shPDK13 e segundo ntshRNA (B) Os hairpins satildeo clonados a montante do promotor humano U6 para o

silenciamento de PDK13 foram usados 3 vectores lentivirais cada um transportando um hairpin diferente

(CTGTCACCAGCCAGAATGTTC TAGGCGTCTGTGTGATTTGTA E GTGATTGAATACAAGGAGAGC)

e que hibridam totalmente com o mRNA de PDK1 e com os primeiros 19 pares de base de PDK3

Anexo 2 Lista de primers usados no presente estudo

Gene Sequecircncia directa Sequecircncia reversa

HIF1 GAAACCTACTGCAGGGTGAA GTAATGAGCCACCAGTGTCC

PDHE1α TTCGTGGTTTCTGTCACTTG CCTGTAAGCTCTGCGAGAAT

LDHA TTGAAGGGAGAGATGATGGA CGTTACGCTGGACCAAATTA

LDHB GAAAAACTTGGCATTCATCC GAGAAACACCTGCCACATTC

PDK1 GGTGTGATTGAATACAAGGAG CTTCCTTTGCCTTTTCCAC

PDK3 TGAAAATAAGAGCCCTGAGGA ATCACTCCTTGTGCCATTGT

RPL22 CTGCCAATTTTGAGCAGTTT CTTTGCTGTTAGCAACTACGC

Gfp CAGAAGAACGGCATCAAGGT CTGGGTGCTCAGGTAGTGG

env GaLV GGACCAAAATAGCGAATGGA GGTGAACTGTACGCCTGGAT

gag-pol GTCCACTATCGCCAGTTGCT CTGGGTCCTCAGGGTCATAA

Todas as sequecircncias estatildeo indicadas no sentido 5‟ndash3‟ e foram desenhadas para locais de homologia entre ceacutelulas

humanas e caninas recorrendo aos softwares BLAST 42 e Primer3 43

A B

35

Anexo 3 Lista de anticorpos usados em Western Blot

Anticorpo ClonalidadeModelo Fabricante Diluiccedilatildeo

α-HIF1 Monoclonal Ratinho Abcam 1500

α-PDHE1α Policlonal Coelho Abcam 11000

α-PDHE1α (fosf S293) Policlonal Coelho Abcam 11000

α-LDH Monoclonal Ratinho Abcam 11000

α-PDK1 Policlonal Coelho Novus Biologicals 12000

α-PDK3 Monoclonal Ratinho Abcam 11000

α-βactina Monoclonal Ratinho Abcam 12000

Anexo 4 Intensidade de fluorescecircncia em ceacutelulas 293 FLEX GFP detectada por citometria de fluxo

Ceacutelulas 293 foram usadas como controlo negativo de fluorescecircncia

0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s

Intensidade da fluorescecircncia (log10)

293 293 FLEX GFP FLEX 1xntshRNA

FLEX 2xntshRNA FLEX shHIF121 FLEX shHIF121+shPDK13

01 1 10 100






Dissertaccedilatildeo de mestrado orientada por

Doutora Ana Sofia Coroadinha (Instituto de Tecnologia Quiacutemica e Bioloacutegica Instituto de

Biologia Experimental e Tecnoloacutegica Oeiras)

Doutora Maria Filomena Caeiro (Departamento de Biologia Vegetal Faculdade de Ciecircncias

da Universidade de Lisboa Lisboa)



2011

i

i AGRADECIMENTOS















presente trabalho








ii

ii RESUMO



























iii

iii ABSTRACT



























iv

















Kinase)


phosphatase)









v

V IacuteNDICE

i AGRADECIMENTOS i

ii RESUMO ii

iii ABSTRACT iii
















29 Western Blot 9





3 RESULTADOS 11


vi





7 ANEXOS 34

1























controlada 67








homoacuteloga 15







2





completamente 1819


































3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

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H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

i

i AGRADECIMENTOS















presente trabalho








ii

ii RESUMO



























iii

iii ABSTRACT



























iv

















Kinase)


phosphatase)









v

V IacuteNDICE

i AGRADECIMENTOS i

ii RESUMO ii

iii ABSTRACT iii
















29 Western Blot 9





3 RESULTADOS 11


vi





7 ANEXOS 34

1























controlada 67








homoacuteloga 15







2





completamente 1819


































3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


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Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

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gen

ase

A B

14























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05

10

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pre

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o r

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tiv

a

no

rma

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da


00

05

10

15

20


Ex

pre

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o r

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tiv

a

no

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liza

da


15























0

20

40

60

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100

120

0

1

2

3

4

5

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293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

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ceacutelu

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h)

βP

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PT

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)


16

geacutenico 5051



















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μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

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1xntshRNA

MDCK

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MDCK

shHIF115

MDCK

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+shPDK13

γm

eta

boacute

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(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

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10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

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da d

a

lact

ato

des

idro

gen

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00

02

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14

16

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1xntshRNA

MDCK

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MDCK

shHIF115

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shHIF115

+siPDIK13

Act

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orm

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da d

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des

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gen

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A B

A B

18















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pre

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o r

ela

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a



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PDHE1α

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20



























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20

30

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90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

βP

I(1

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PI

ceacutelu

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h)

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0

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MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

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+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

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PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

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22





















0000

0001

0002

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0004

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

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det

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0001

0002

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23

















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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

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0

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MDCK

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+shPDK13

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

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+shPDK13

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A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

ii

ii RESUMO



























iii

iii ABSTRACT



























iv

















Kinase)


phosphatase)









v

V IacuteNDICE

i AGRADECIMENTOS i

ii RESUMO ii

iii ABSTRACT iii
















29 Western Blot 9





3 RESULTADOS 11


vi





7 ANEXOS 34

1























controlada 67








homoacuteloga 15







2





completamente 1819


































3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

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35

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0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

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(10

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)



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Den

sid

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)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

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FLEX shHIF121

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15























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120

0

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293 FLEX

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FLEX

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FLEX

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βP

T(1

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PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

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boacute

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00

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FLEX

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A B

A B

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PDK1

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PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























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20

30

40

50

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70

80

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0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

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+shPDK13

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h)

βP

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h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

iii

iii ABSTRACT



























iv

















Kinase)


phosphatase)









v

V IacuteNDICE

i AGRADECIMENTOS i

ii RESUMO ii

iii ABSTRACT iii
















29 Western Blot 9





3 RESULTADOS 11


vi





7 ANEXOS 34

1























controlada 67








homoacuteloga 15







2





completamente 1819


































3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

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10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

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PI

ceacutelu

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βP

T(1

05

PT

ceacutel

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)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

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Ex

pre

ssatilde

o r

ela

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a n

orm

ali

zad

a



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PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

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h)


0

1

2

3

4

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6

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8

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10

0

1

2

3

4

5

6

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9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

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10

12

14

16

18


Ex

pre

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ali

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a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

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MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

shHIF115

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+shPDK13

Taxa

de

det

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o d

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(min

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23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

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00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

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00

05

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20

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MDCK

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+shPDK13

NA

D+N

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H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

iv

















Kinase)


phosphatase)









v

V IacuteNDICE

i AGRADECIMENTOS i

ii RESUMO ii

iii ABSTRACT iii
















29 Western Blot 9





3 RESULTADOS 11


vi





7 ANEXOS 34

1























controlada 67








homoacuteloga 15







2





completamente 1819


































3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

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++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

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0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

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lar

(10

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las

mL

)



00

02

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06

08

10

12

14

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20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

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las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

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10

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FLEX shHIF121

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Act

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orm

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15























0

20

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100

120

0

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293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

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I(1

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h)

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h)


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14

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βP

T(1

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PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

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05

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

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boacute

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00

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1xntshRNA

MDCK

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00

02

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293 FLEX

GFP

FLEX

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FLEX

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FLEX

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FLEX

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00

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MDCK E1 MDCK

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A B

A B

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HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

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100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

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h)

βP

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0

1

2

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5

6

7

8

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0

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6

7

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10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

v

V IacuteNDICE

i AGRADECIMENTOS i

ii RESUMO ii

iii ABSTRACT iii
















29 Western Blot 9





3 RESULTADOS 11


vi





7 ANEXOS 34

1























controlada 67








homoacuteloga 15







2





completamente 1819


































3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

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10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

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10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

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ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

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Ex

pre

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o r

ela

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a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

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h)


0

1

2

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0

1

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9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

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12

14

16

18


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pre

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a n

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ali

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a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

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MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

shHIF115

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shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

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(min

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23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

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7

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

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MDCK

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+shPDK13

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00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

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00

05

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MDCK

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+shPDK13

NA

D+N

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H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

vi





7 ANEXOS 34

1























controlada 67








homoacuteloga 15







2





completamente 1819


































3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

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0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

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10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

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des

idro

gen

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00

02

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293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

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h)

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14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

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βP

I(1

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βP

T(1

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PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

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05

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07

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

γm

eta

boacute

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(microm

ol

10

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lula

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h)


00

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MDCK E1 MDCK

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00

02

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

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Act

ivid

ad

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orm

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da d

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lact

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16

MDCK E1 MDCK

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+siPDIK13

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A B

A B

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Ex

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PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

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0

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2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

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MDCK E1 MDCK

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MDCK

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βP

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Iceacute

lula

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βP

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ula

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21






FLEX


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a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

1























controlada 67








homoacuteloga 15







2





completamente 1819


































3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

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MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

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+shPDK13

Taxa

de

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o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

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00

05

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20

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MDCK E1 MDCK

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MDCK

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MDCK

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+shPDK13

NA

D+N

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H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

2





completamente 1819


































3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

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10

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0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

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ecelu

lar

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)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

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γlactato























00

02

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10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

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orm

ali

zad

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a

lact

ato

des

idro

gen

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00

02

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12


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Act

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A B

14























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15























0

20

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0

1

2

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4

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293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

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la ∙

h)

βP

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h)


0

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PT

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)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

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(microm

ol

10

6ceacute

lula

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h)


00

02

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12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

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+shPDK13

γm

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boacute

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(microm

ol

10

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h)


00

02

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10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

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MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

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Act

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A B

A B

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a



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20

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30


Ex

pre

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a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

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20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

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la ∙

h)

βP

T(P

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h)


0

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MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

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+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

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a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

3








Ser293

e Ser300

) que podem ser















Glucose

Glucose 6P

Fuctose 6P

Glyceraldehyde-3P

Fuctose 16 BP

Dihydroxyacetone-P





Cytoplasm

Extracellular space

hexokinase


phosphofructokinase

GAPDH

phosphoglycerate

kinase

phosphoglucomutase

enolase

Pyruvate kinase

Pyruvate

Acetyl-CoATCA

PDH

PDH

P

PDF

LDH

Lactate

PDK

PDK2

PDK1 PDK3PDK4

aldolase

+

+

+

+

+

++

+

+

HIF1

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

4































diminuindo a






5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

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15

20


Ex

pre

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no

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liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

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la ∙

h)


0

2

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14

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10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

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10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

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+siPDIK13

Act

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orm

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da d

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lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

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20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

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a n

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ali

zad

a



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05

10

15

20

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30


Ex

pre

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o r

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zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

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h)


0

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MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

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Ex

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22





















0000

0001

0002

0003

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

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(m

in-1

)

0000

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0002

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MDCK E1 MDCK

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MDCK

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MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

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00

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MDCK E1 MDCK

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MDCK

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MDCK

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+shPDK13

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D+N

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H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

5






7






1014









produtoras









e PDK3 28





nunca foi estudada




6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

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la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

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10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

6
























pLKO1-puro 39










7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

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14

16

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20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

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ecelu

lar

(10

6ceacutelu

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)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

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10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

shHIF115

MDCK

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+shPDK13

γm

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boacute

lica

(microm

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10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

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10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

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12

14

16

MDCK E1 MDCK

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MDCK

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MDCK

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MDCK

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+siPDIK13

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ato

des

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ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

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o r

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ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

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PI

ceacutelu

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h)

βP

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0

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10

MDCK E1 MDCK

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MDCK

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+shPDK13

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Iceacute

lula

)

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PT

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ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

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12

14

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22





















0000

0001

0002

0003

0004

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0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

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de

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o d

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(m

in-1

)

0000

0001

0002

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MDCK E1 MDCK

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MDCK

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+shPDK13

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ecccedilatilde

o d

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(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

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MDCK

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+shPDK13

AD

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00

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20

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30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

NA

D+N

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00

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+shPDK13

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D+N

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H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

7

























4 ceacutelulascm

2 (MDCK










8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

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10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

8













41




e Primer3 43























9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

9









2 em placas de 24















29 Western Blot










10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

10



ADPATP Ratio






















213 Caacutelculos








11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

11

3 RESULTADOS































12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

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10

12

14

16

18

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0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

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MDCK shHIF116

Act

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zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

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o r

ela

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a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

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o r

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no

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da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

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la ∙

h)


0

2

4

6

8

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12

14

0

2

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6

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10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

12












00

05

10

15

20

25

30

35

40

45

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168

Den

sid

ad

ecelu

lar

(10

6ceacutelu

las

mL

)



A B C

D E F

A B

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

13


μcrescimento

(h-1

)

γglucose


γlactato























00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX GFP

FLEX shHIF121

FLEX shHIF125

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

00

02

04

06

08

10

12


MDCK shHIF116

Act

ivid

ad

e n

orm

ali

zad

a d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase

A B

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

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10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

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e n

orm

aliza

da d

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lact

ato

des

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ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

Iceacute

lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

14























00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a

no

rma

liza

da


15























0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

eacutelu

la ∙

h)


0

2

4

6

8

10

12

14

0

2

4

6

8

10

12

14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF116

βP

I(1

03

PI

ceacutelu

la)

βP

T(1

05

PT

ceacutel

ula

)


16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

ssatilde

o r

ela

tiv

a n

orm

ali

zad

a



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PDK1

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PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

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h)

βP

T(P

Tc

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h)


0

1

2

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0

1

2

3

4

5

6

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9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

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lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

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10

12

14

16

18


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o r

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orm

ali

zad

a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

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0

5

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15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

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MDCK

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MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

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00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

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MDCK

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+shPDK13

NA

D+N

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H

A B

A B

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Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

15























0

20

40

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0

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293 FLEX

GFP

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF125

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14

MDCK E1 MDCK

shHIF115

MDCK

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βP

I(1

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βP

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16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





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MDCK shHIF115




17











lactato









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01

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

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eta

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(microm

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h)


00

02

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10

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16

18

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MDCK

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MDCK

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+shPDK13

γm

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boacute

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(microm

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10

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h)


00

02

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10

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

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lact

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des

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00

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A B

A B

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PDK1

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PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

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20



























0

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20

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0

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2

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9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

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h)

βP

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MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

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+shPDK13

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3P

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)

βP

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05

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ula

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21






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22





















0000

0001

0002

0003

0004

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

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(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

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+shPDK13

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ecccedilatilde

o d

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(min

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23

















entre 3 replicados

0

1

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FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

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MDCK E1 MDCK

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FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

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A B

A B

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25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

16

geacutenico 5051



















lactatoglucose


μcrescimento (h-1


)





FLEX shHIF121


MDCK shHIF115




17











lactato









00

01

02

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

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00

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FLEX

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FLEX

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FLEX

shHIF121

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A B

A B

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30


Ex

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a



HIF1

PDK1

PDK3

PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

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20

30

40

50

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70

80

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0

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2

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GFP

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FLEX

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FLEX

shHIF121

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I(1

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PI

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MDCK E1 MDCK

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Iceacute

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21






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22





















0000

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GFP

FLEX

1xntshRNA

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FLEX

shHIF121

FLEX

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det

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(m

in-1

)

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o d

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(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

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PA

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0

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25

30

35

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MDCK E1 MDCK

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MDCK

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MDCK

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MDCK

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+shPDK13

AD

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10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

00

05

10

15

20

25

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

NA

D+N

AD

H

A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

17











lactato









00

01

02

03

04

05

06

07

08

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

14

16

18

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

γm

eta

boacute

lica

(microm

ol

10

6ceacute

lula

s ∙

h)


00

02

04

06

08

10

12

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


00

02

04

06

08

10

12

14

16

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+siPDIK13

Act

ivid

ad

e n

orm

aliza

da d

a

lact

ato

des

idro

gen

ase


A B

A B

18















MDCK 2xntshRNA













19










00

05

10

15

20


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o r

ela

tiv

a n

orm

ali

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a



00

05

10

15

20

25

30


Ex

pre

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o r

ela

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a n

orm

ali

zad

a



HIF1

PDK1

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PDHE1α fosforilado

PDHE1α

LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

βP

I(1

0-3

PI

ceacutelu

la ∙

h)

βP

T(P

Tc

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la ∙

h)


0

1

2

3

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7

8

9

10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

βP

I(10

3P

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lula

)

βP

T (1

05

PT

ceacutel

ula

)


21






FLEX


MDCK




















0

2

4

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18


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a n

orm

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a



22





















0000

0001

0002

0003

0004

0005

0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

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MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

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Taxa

de

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ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

AD

PA

TP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

2XntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

+shPDK13

AD

PA

TP

00

05

10

15

20

25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

NA

D+N

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00

05

10

15

20

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D+N

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A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

500

600

0 64 128 192

Ev

ento

s




01 1 10 100

18















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19










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20

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PDK1

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PDHE1α fosforilado

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LDH

Loading control

A

B

C

20



























0

10

20

30

40

50

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80

90

100

0

1

2

3

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6

7

8

9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF21

+shPDK13

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PI

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h)

βP

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1xntshRNA

MDCK

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MDCK

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+shPDK13

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18


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22





















0000

0001

0002

0003

0004

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0006

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

+shPDK13

Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

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RO

(m

in-1

)

0000

0001

0002

0003

0004

0005

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1xntshRNA

MDCK

2xntshRNA

MDCK

shHIF115

MDCK

shHIF115

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Taxa

de

det

ecccedilatilde

o d

e E

RO

(min

-1)A B

23

















entre 3 replicados

0

1

2

3

4

5

6

7

8

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

shHIF121

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0

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20

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30

35

40

MDCK E1 MDCK

1xntshRNA

MDCK

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MDCK

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MDCK

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+shPDK13

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25

30

35

40

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

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FLEX

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FLEX

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A B

A B

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25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

100

200

300

400

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0 64 128 192

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19










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A

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0

1

2

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9

10

293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

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+shPDK13

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la ∙

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βP

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h)


0

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1xntshRNA

MDCK

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MDCK

shHIF115

MDCK

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+shPDK13

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lula

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ula

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21






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22





















0000

0001

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293 FLEX

GFP

FLEX

1xntshRNA

FLEX

2xntshRNA

FLEX

shHIF121

FLEX

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(m

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0001

0002

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23

















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0

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FLEX

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FLEX

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1xntshRNA

FLEX

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FLEX

shHIF121

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A B

A B

24





































25




































26
















Os





















27


































mesmas

28















de Ldh e Pdk1-3

29

















celulares

30



(2000)








Physiology 166 152-69 (1996)














117-124 (1996)



590 (1996)













31








536 (1925)


1923-8 (2008)










11-20 (2008)


15 621-7 (2008)





157-64 (2009)


















32



138 57-66 (2008)



(2008)
















132 365-86 (2000)













of America 92 9363-7 (1995)






65 177-85 (2005)



33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








34

7 ANEXOS





















A B

35












0

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Ev

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0

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01 1 10 100

33






America 107 13842-7 (2010)


Cells Science 279 349-352 (1998)



202 (1999)





cancer Science 266 2011-2015 (1994)






107 375-84 (2008)








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7 ANEXOS





















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Manipulação do efeito de Warburg em células de mamífero em...

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