Manobra de recrutamento progressivo melhora a mecânica...
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1 Andréia Ferreira da Silva Manobra de recrutamento progressivo melhora a mecânica pulmonar e a oxigenação limitando os danos ao epitélio alveolar em modelo experimental de lesão pulmonar aguda Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro Departamento de Clínica Médica Pós-graduação (nível mestrado)- Setor Clínica Médica - Área de concentração: Ciências Pneumológicas Orientadores Profa. Patricia Rieken Macedo Rocco Prof. Marcus Barreto Conde Março 2008
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Andréia Ferreira da Silva
Manobra de recrutamento progressivo melhora a mecânica pulmonar e a oxigenação limitando os danos ao epitélio
alveolar em modelo experimental de lesão pulmonar aguda
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro Departamento de Clínica Médica
Pós-graduação (nível mestrado)- Setor Clínica Médica - Área de concentração: Ciências Pneumológicas
Orientadores Profa. Patricia Rieken Macedo Rocco Prof. Marcus Barreto Conde Março 2008
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1. Mecânica Respiratória . 2. Síndrome do Desconforto Respiratório do Adulto - fisiopatologia. 3. Complacência pulmonar. 4. Microscopia eletrônica . 5. Apoptose. 6. Ratos Wistar. 7. Ciências Pneumonológicas – Tese. I. Rocco, Patricia Rieken Macedo. II. Conde, Marcus Barreto. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica. IV. Título.
Silva, Andréia Ferreira
Manobra de recrutamento progressivo melhora a mecânica pulmonar e a oxigenação limitando os danos ao epitélio alveolar em modelo experimental de lesão pulmonar aguda / Andréia Ferreira da Silva. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2008.
xii, 80 f. : il. ; 31 cm. Orientadores: Patricia Rieken Macedo Rocco e Marcus Barreto Conde
Dissertação (mestrado) – UFRJ/Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, 2008.
Referências bibliográficas: f. 67-80
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MANOBRA DE RECRUTAMENTO PROGRESSIVO MELHORA A MECÂNICA PULMONAR E OXIGENAÇÃO LIMITANDO OS DANOS AO
EPITÉLIO ALVEOLAR EM MODELO EXPERIMENTAL DE LESÃO PULMONAR AGUDA
ANDRÉIA FERREIRA DA SILVA
ORIENTADORES: PATRICIA RIEKEN MACEDO ROCCO
MARCUS BARRETO CONDE
Dissertação submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro visando à obtenção do grau de Mestre em Ciências: Clínica Médica
APROVADA POR:
Prof. Neio Boechat Prof. Adjunto UFRJ
Prof. Hugo Castro Faria Neto Prof. Adjunto Fiocruz
Profa. Fernanda Mello Prof. Adjunto UFRJ
Rio de Janeiro
Março 2008
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O presente estudo foi realizado no Laboratório de Investigação Pulmonar do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro
na vigência de auxílios concedidos pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à
pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e tecnológico (CNPq) e Programa de Apoio a Núcleos de
Excelência (PRONEX-FAPERJ).
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Dedicatória
Ao meu marido, Alexandre, pelo amor incondicional dedicado ao longo desses anos, compreensão, palavras de consolo na hora certa, incentivo nos momentos difíceis, quando tudo parecia impossível.
Aos meus pais, pelo exemplo de serenidade e coragem.
A minha querida sobrinha Giovanna e minha irmã Elaine, pelo sorriso na hora certa, pelos gestos de amor.
A minha querida sogra Laís, pelos seus ensinamentos, força e amor.
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Agradecimentos
Ao longo dos últimos anos durante a elaboração deste trabalho, pude conviver e conhecer pessoas que foram fundamentais, tanto na elaboração dessa dissertação de mestrado como na minha vida pessoal. Gostaria de expressar meu sincero agradecimento.
- À Professora Patricia Rocco, pelo seu brilhantismo, competência, orientação e atenção a mim dispensada. Pelo exemplo de pesquisadora dedicada, incansável e responsável, acima de tudo, por ter me ensinado o que é ser um pesquisador.
- Ao Professor Marcus Conde, por sua competência. Obrigada pela disponibilidade, atenção e por acreditar em mim, o que possibilitou que eu percorresse esse caminho.
- Aos Professores Vera Capellozi e. Marcelo Moralles pela colaboração na realização das análises histológicas e moleculares.
- Às pessoas que tornaram esse sonho uma realidade: Raquel Santos, Viviane Santiago, Gisele Oliveira e Débora Ornellas, por tornar agradável cada etapa da realização do projeto.
- Às amigas e conselheiras de todos os momentos: 1) Thaís Escorsim, que com sua alegria e disponibilidade me ajudou, amparou e acolheu, 2) Liliane Nardelli, que com seu dinamismo e positivismo me mostrou novos horizontes, 3) Mariana Genuíno e Gisele Oliveira, por suas palavras de incentivo e coragem em qualquer momento e pela certeza de que, ao final, tudo vai acabar bem e 4) Débora Xisto que aprendi a admirar e confiar.
- As amigas Caroline Pássaro, Cristiane Nascimento e Alba Fermades, por me introduzirem no mundo da pesquisa, me ensinar uma, duas, três... vezes, sempre prontas para ajudar.
- Obrigada por fazerem parte desta longa jornada, por estarem ao meu lado, pelo carinho, afeto e gesto de amor. São anos que ficaram marcados na minha vida e, jamais esquecerei. O meu muito obrigado preenchido com muito amor.
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Resumo
MANOBRA DE RECRUTAMENTO PROGRESSIVO MELHORA A MECÂNICA PULMONAR E OXIGENAÇÃO, LIMITANDO OS DANOS AO EPITÉLIO ALVEOLAR EM MODELO EXPERIMENTAL DE LESÃO PULMONAR AGUDA. Andréia Ferreira da Silva. Orientadores: Patricia Rieken Macêdo Rocco e Marcus Barreto Conde. Resumo da dissertação de mestrado submetido à Faculdade de Medicina - Departamento de Clínica Médica - Pós-graduação - Setor Clínica Médica - Área de concentração: Ciências Pneumológicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências. INTRODUÇÃO: As manobras do recrutamento (MRs) vêm sendo propostas na Lesão Pulmonar Aguda (LPA)/Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo(SDRA) para abrir as unidades alveolares colapsadas, melhorando a troca gasosa e a mecânica pulmonar. Entretanto, essas manobras podem acarretar estresse mecânico ao parênquima pulmonar. OBJETIVO: Comparar a MR realizada com insuflação contínua (CPAP) com uma nova estratégia onde se insufla o pulmão progressivamente (STEP). MÉTODOS: Trinta e seis ratos Wistar (250-300 g) foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos (n=36). No grupo do controle (C) injetou-se salina (0,1 mL) intraperitonealmente (i.p.) e no grupo LPA, injetou-se paraquat (15 mg/kg, i.p.). Após 24 horas, os ratos foram sedados, anestesiados e paralisados. A MR foi realizada com CPAP 40 cmH2O por 40s ou “STEP” (aumento progressivo de 5 cmH2O de pressão inspiratória a cada 2 minutos, de 25 a 45 cmH2O, com PEEP fixo de 15 cmH2O). Os animais foram ventilados por 1 hora com VT = 6 mL/kg e PEEP = 5 cmH2O. A mecânica e a histologia pulmonares, a pressão parcial arterial de oxigênio (PaO2), a apoptose de células do pulmão, rim, fígado e intestino e a expressão do RNAm para procolágeno do tipo III (PCIII) foram analisados. RESULTADOS: A elastância estática do pulmão foi reduzida no grupo LPA após ambas MR, sendo mais significativa após “STEP” (p<0,001) A PaO2 se elevou mais após “STEP” do que CPAP (p<0,05). A fração de área de colapso foi menor no grupo recrutado por “STEP” em comparação com CPAP no grupo LPA (p<0,05). O grupo de CPAP apresentou extensa lesão do epitélio alveolar e do endotélio capilar, aumento do número de células apoptóticas no rim, fígado, intestino e pulmão e incremento na expressão do RNAm para procolágeno do tipo III. CONCLUSÃO: A MR por “STEP” em comparação com CPAP melhorou a mecânica pulmonar e oxigenação, reduziu o número de células apoptóticas no pulmão e em órgãos a distância e a expressão RNAm para PCIII. Palavras chaves: elastância, morfometria, apoptose, microscopia eletrônica. Rio de Janeiro Março de 2008
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Abstract STEPWISE RECRUITMENT MANEUVER IMPROVES LUNG MECHANICS AND OXYGENATION, WITH LIMITED DAMAGE TO ALVEOLAR EPITHELIUM EXPERIMENTAL MODEL IN ACUTE LUNG INJURY. Andréia Ferreira da Silva. Orientadores: Patricia Rieken Macêdo Rocco e Marcus Barreto Conde. Resumo da dissertação de mestrado submetido à Faculdade de Medicina - Departamento de Clínica Médica - Pós-graduação - Setor Clínica Médica - Área de concentração: Ciências Pneumológicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências. INTRODUCTION: Recruitment maneuvers (RMs) have been proposed as an adjunct therapy for mechanical ventilation in Acute Lung Injury/Acute Respiratory Distress Syndrome patients. RMs opened the collapsed alveoli improving oxygenation and lung mechanics. However, RMs may include alveolar stress. AIM: To compare RM with CPAP with new strategy with progressive lung inflation. METHODS: Thirty-six Wistar rats (250-300 g) were randomly divided into two groups (n=36). In control (C) group, saline (0,1 mL) was intraperitoneally injected, while ALI animals received paraquat (15 mg/kg, i.p.). Twenty-four hours after the injection, rats were sedated, anesthetized, and paralyzed. Recruitment was done by using 40 cmH2O CPAP for 40 s or by the stepwise maneuver (STEP, Inspiratory pressure levels progressively increasing in 2-minutes steps of 5 cmH2O from 25 to 45 cmH2O, with a fixed PEEP of 15 cm H2O). Rats were then ventilated with tidal volume of 6 mL/kg and PEEP = 5 cm H2O for 1 hour. RESULTS: Lung static elastance improved after CPAP and STEP in ALI group but reduced more after STEP than CPAP (p<0.001) PaO2 increased more after STEP (than CPAP (p<0.05).In addition, the fraction of area of alveolar collapse was lower after STEP compared to CPAP (p<0.05). After RM, CPAP group showed extensive injury of alveolar epithelium, capillary endothelium, increased level of apoptosis in lung, kidney, villi and liver, and mRNA expression of PC III. CONCLUSION: Stepwise in compare to CPAP improved lung mechanics and oxygenation reduced the rate of apoptosis in distal organs and the expression of PC III in lung tissue. Keywords: Elastance; Morphometry; apoptosis, electron microscopy Rio de Janeiro Março 2008
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ÍNDICE
Folha de rosto ..................................................................................................... i Folha de aprovação ............................................................................................. ii Ficha catalográfica ............................................................................................... ii Agências financiadoras ....................................................................................... iii Dedicatória ........................................................................................................... iv Agradecimentos ................................................................................................... v Resumo ................................................................................................................ vi Abstract ................................................................................................................ vii Sumário ................................................................................................................. viii Índice de figuras .................................................................................................... ix Índice de tabelas e quadros................................................................................... x Abreviaturas ......................................................................................................... xi 1. Introdução ........................................................................................................ 1
1.1 Ventilação mecânica ............................................................................ 1.2 Barotrauma............................................................................................1.3 Volutrauma............................................................................................ 1.4 Estratégia ventilatória protetora........................................................... 1.5 Manobra de recrutamento alveolar.....................................................
1.5.1 Manobra de recrutamento alveolar (Estudo experimentais)......................................................................
1.5.2 Manobra de recrutamento alveolar (Estudos clínicos)......
3 5 7 9 12 13 15
2. Justificativa......................................................................................................... 21 3. Objetivos............................................................................................................ 22 3.1 Objetivo geral....................................................................................... 22 3.2 Objetivo específico............................................................................... 22 4. Materiais e eétodos........................................................................................... 23 4.1 Metodologia de estudo.......................................................................... 23 4.2 Amostra do estudo................................................................................ 23 4.3 Protocolo de estudo.............................................................................. 25 4.4 Preparo dos animais............................................................................. 26 4.5 Estudo da mecânica pulmonar............................................................. 30 4.6 Gasometria arterial................................................................................ 34 4.7 Microscopia óptica................................................................................. 35 4.7.1 Fixação e preparo das lâminas................................................. 35 4.7.2 Análise histológica e morfométrica............................................ 4.8 Microscopia eletrônica de transmissão.......................................................... 4.9 Detecção e quantificação de célula apoptóticas............................................. 4.10 Quantificação da expressão de RNAm para procolágeno tipo III................
4.10.1 Extração de RNAtotal de tecido pulmonar................................ 4.10.2 Transcrição reversa (RT)......................................................... 4.10.3 Reação em cadeia da polimerase (RCP, polymerase chain reaction PCR).......................................................................................
36 36 38 40 40 41 42
5.0 Análise Estatística............................................................................................ 45 6 Resultados ......................................................................................................... 46 6.1 Mecânica pulmonar............................................................................... 46 6.2 Análise histologica e morfometrica do parênquima pulmonar............. 6.3 Pressão parcial de O2 no sangue arterial............................................. 6.4 Microscopia eletrônica
50 52 52
10
6.5 Análise da apoptose de órgãos 6.6 RNAm para procolágeno Tipo III...................................................
55 58
7. Discussão .......................................................................................................... 59 8.Conclusões.......................................................................................................... 67 9. Referências bibliográficas................................................................................. 68
11
FIGURAS Figura1. Representação esquemática do diâmetro das unidades
alveolares 11Figura 2. Manobra de recrutamento com CPAP 15Figura 3. Manobra de recrutamento com PEEP progressiva 18Figura 4. Representação esquemática das manobras de recrutamento
com CPAP e STEP 24Figura 5. Figura 6. Figura 7.
Figura 8. Figura 9.
Figura 10.
Figura 11. Figura 12.
Protocolo experimental Posicionamento do cateter esofagiano Manobra de oclusão para posicionamento do cateter esofagiano Método de oclusão ao final da inspiração Representação esquemática da montagem experimental Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para quantificação dos parâmetros morfométricos Mecânica pulmonar: elastância estática Mecânica pulmonar: pressões resistivas e viscoelástica
25
272833
364849
Figura 13. Morfometria do Parênquima pulmonar 50Figura 14. Fotomicrografias do parênquima pulmonar 51Figura 15. Fotomicrografias eletrônica do parênquima pulmonar 51Figura 16. Fotomicrografias representativa do parênquima pulmonar para
quantificação de células apoptóticas 63
Figura 17. Fotomicrografias representativa do intestino, fígado e rim: para quantificação de células apoptóticas
58
Figura 18. Expressão de RNAm para procolágeno tipo III 58
12
Quadros e Tabelas Quadro 1. Critérios clínicos para definição de Lesão Pulmonar Aguda
(LPA) e Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) 2
Quadro 2. Estudos clínicos avaliando estratégias ventilatórias protetoras em SDRA/LPA.
10
Quadro 3. Manobras de recrutamento alveolar (Estudos experimentais) 13Quadro 4. Manobras de recrutamento alveolar (Estudos clínicos) 14Quadro 5. Primers utilizados nas reações de RT-PCR 43Quadro 6. Descrição das condições das reações de RT-PCR
44
Tabela 1. Valores de fluxo aéreo, volume corrente, pressões de pico e platô nos grupos controle e lesão pulmonar aguda.
47
Tabela 2. Pressão parcial arterial de oxigênio 52Tabela 3. Análise semi-quantitativa da microscopia eletrônica 53Tabela 4. Análise semi-quantitativa do índice de apoptose celular 55
13
Abreviaturas
CPAP: continuous positive airway pressure CL: Complacência do Pulmão CXC: Quimiocinas CXCR2: Receptores de Quimiocinas SMOS: Síndrome da Disfunção de Múltiplos Órgãos FC: Freqüência cardíaca FiO2: Fração Inspirada de Oxigênio FMOS: Falência de múltiplos órgãos e sistemas FR: Freqüência Respiratória GAPDH : Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase IRPM: Incursões Respiratórias por Minuto IL: Interleucina IL-1ra: Receptores Agonistas de Interleucina-1 IRV: Ventilação Mecânica com Relação Inspiração: Expiração Invertida LPA: Lesão Pulmonar Aguda MR: Manobra de Recrutamento MEC: Matriz Extracelular NF-κβ: Fator de Transcrição Nuclear PII: Pneumócito do tipo II PAF: Fator de Ativação Plaquetária PaO2: Pressão Parcial Arterial de Oxigênio PCIII: Procolágeno tipo III PCV: Ventilação Controlada a Pressão PEEP: positive expiratory end pressure (pressão positiva expiratória
final) PIC: Pressão Intracraniana PIP: Pressão de Pico Inspiratório Pplat: Pressao de Platô R/D: Recrutamento/Desrecrutamento RT-PCR: Transcrição Reversa e Reação em Cadeia da Polimerase SDRA: Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo STEP: Pressurização Progressiva TNF-α: Fator de Necrose Tumoral α VILI: Lesão Pulmonar Induzida pelo Ventilador VM: Ventilação Mecânica VT: Volume Corrente ZEEP: Zero de Pressão Positiva Expiratória
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1. Introdução
As primeiras descrições de síndrome do desconforto respiratório agudo
(SDRA) foram relatadas em 12 pacientes com falência respiratória aguda, cianose
refratária à administração de oxigênio, redução da complacência pulmonar e
infiltrado pulmonar bilateral observado na radiografia de tórax (Ashbaugh e cols.,
1967). Desde então, várias investigações vêm sendo desenvolvidas acerca da
patogênese da lesão pulmonar aguda e da terapia adequada para a SDRA, porém a
mortalidade perdura alta (40% a 60 %) a despeito dos grandes avanços técnico-
científicos (Suchyta e cols., 1992; Zilberberg & Epstein, 1998; Rubenfeld, 2003;
Rocco & Zin, 2005, Villar e cols., 2007). A SDRA é uma síndrome de etiologia
multifatorial causada por agressão direta ao epitélio alveolar ou indireta ao endotélio
capilar (Bernard e cols., 1994) e se caracteriza histologicamente pela presença de
dano alveolar difuso (DAD) (Mendez & Hubmayr, 2005).
Na conferência de consenso entre as Sociedades Americana e Européia de
Pneumologia e Terapia Intensiva foram estabelecidos critérios clínicos, radiológicos
e fisiológicos para o diagnóstico de SDRA (Bernard e cols., 1994), com base nos
seguintes critérios:
1. Quadro de insuficiência respiratória de instalação aguda;
2. Infiltrado pulmonar bilateral à radiografia de tórax;
3. Relação pressão parcial arterial de oxigênio (PaO2)/fração inspirada de
oxigênio (FiO2) menor ou igual do que 200, independentemente do nível de PEEP
utilizado;
15
4. Pressão capilar pulmonar ≤18 mmHg. Os quadros mais leves,
caracterizados por uma relação PaO2/FiO2 entre 200 e 300, seriam denominados de
lesão pulmonar aguda (Quadro 1).
Quadro 1-Critérios clínicos para definição de lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). Início Oxigenação Rx tórax Pressão capilar
pulmonar
LPA Agudo PaO2/FiO2 ≤300 Infiltrado bilateral ≤18 mmHg
SDRA Agudo PaO2/FiO2 ≤200 Infiltrado bilateral ≤18 mmHg
Rx: telerradiografia; PaO2; pressão parcial de oxigênio; FiO2: fração inspiratória de oxigênio; mmHg: milímetros de mercúrio
Classicamente, a SDRA é dividida em três fases: (1) fase aguda ou
exsudativa, (2) fase proliferativa e (3) fase fibrótica (Meduri, 1991;1995; Udobi e
cols., 2003). A fase exsudativa é caracterizada por edema intersticial e alveolar,
hemorragia alveolar, deposição de fibrina, infiltração neutrofílica, lesões de células
do epitélio alveolar e endotélio capilar, promovendo aumento da permeabilidade
alvéolo capilar (Barbas e cols.,1996; Ware & Matthay, 2000; Souza e cols., 2003;
Mendez & Hubmayr, 2005). Essas alterações são induzidas por uma interação
complexa de mediadores pró e anti-inflamatórios (Meduri e cols., 1991; 1995; Ware
& Matthay, 2000; Udobi e cols., 2003; Souza e cols., 2003; Mendez & Hubmayr,
2005). Durante a fase proliferativa há organização do exsudato intra-alveolar e
intersticial (Fein & Calang-Colucci, 2000; Souza e cols., 2003; Mendez & Hubmayr,
2005) e proliferação dos pneumócitos do tipo II (PII) que recobrirão a membrana
basal desnuda. Simultaneamente, os fibroblastos e os miofibroblastos migram
através dos hiatos da membrana transformando o exsudato intra-alveolar em tecido
de granulação denso e fibroso, em função da deposição de colágeno. Desta forma,
ocorre o espessamento gradual do septo alveolar (Wallace & Donnelly, 2002;
Mendez & Hubmay, 2005). Já na fase fibrótica, é observada deposição de colágeno
16
nos espaços alveolar e intersticial e desenvolvimento de microcistos (Souza e cols.,
2003; Rocco e cols., 2004). Inicialmente, há deposição de colágeno tipo III, que é
mais flexível e suscetível à quebra; porém, mais tardiamente, essas fibras são
remodeladas, e se transformam em fibras colágenas tipo I, mais grossas e
resistentes, tornando o pulmão mais rígido (Dos Santos e cols., 2006; Pelosi e cols.,
2007). Deve ser ressaltado que a descrição das três fases é didática, já que a fase
exudativa ocorre em paralelo com a fibroproliferativa (Rocco e cols., 2001; 2004; Dos
Santos e cols., 2006).
1.1 Ventilação Mecânica
A ventilação mecânica, ao longo dos últimos 40-50 anos, tornou-se uma
indispensável modalidade terapêutica na falência respiratória aguda uma vez que a
mortalidade, sem esta intervenção terapêutica, se aproxima dos 100%. Os objetivos
fundamentais da ventilação mecânica nos pacientes com SDRA são: 1) diminuir a
concentração de oxigênio suplementar, procurando evitar a toxicidade pelo oxigênio
em altas concentrações, bem como manter uma pressão arterial de oxigênio
adequada; 2) evitar volutrauma, 3) minimizar a demanda metabólica da ventilação,
enquanto mantém um equilíbrio gasoso adequado (Udobi e cols.,2003) e 4)
promover repouso da musculatura respiratória (Slutsky & Tremblay, 1998; Chiumello
e cols., 1999; Ranieri e cols.,1999; Frank & Matthay, 2003; Mendez & Hubmayr;
2005, Yilmaz e cols., 2007).
A partir de 1974, foi reconhecido que a ventilação mecânica com altas
pressões de insuflação pulmonar poderia ser responsável por danos ultraestruturais
pulmonares (Webb & Tierney, 1974). No entanto, nas últimas duas décadas tornou-
se evidente que a ventilação mecânica pode exacerbar ou iniciar uma lesão
17
pulmonar aguda, denominada Lesão Pulmonar Associada à Ventilação Mecânica
(LPAV) ou Lesão Pulmonar Induzida pela Ventilação Mecânica (LPIV),
respectivamente (Ohta e cols., 1998; Ranieri e cols., 1999; Frank & Matthay, 2003;
Pinhu e cols., 2003; Mendez & Hubmayr, 2005, Nardelli e cols., 2007).
Várias investigações com diversas espécies animais têm mostrado que a
ventilação mecânica pode produzir lesão pulmonar com características funcionais e
histológicas similares àquelas observada na SDRA (Tsuno e cols., 1990; Parker e
cols., 1993; Slutsky & Tremblay, 1998; Whitehead & Slutsky, 2002). Pacientes com
SDRA freqüentemente apresentam vários fatores de risco que, além de aumentarem
a suscetibilidade dos pulmões à lesão pulmonar por ventilação mecânica, também
prejudicam a capacidade do pulmão em se reparar. Nesse contexto, Tsuno e
colaboradores, em 1990, observaram que quando pulmões de porcos foram
ventilados por 22 h com pressão de insuflação pulmonar (PIP) de 40 cmH2O ocorria
dano alveolar difuso com membrana hialina, hemorragia alveolar e infiltração
neutrofílica; alterações essas similares às observadas na fase precoce da SDRA.
Em outro grupo de porcos ventilados mecanicamente de modo convencional durante
03 dias, a avaliação histológica dos pulmões evidenciou colapso alveolar,
proliferação de fibroblastos e de pneumócitos tipo II; achados estes compatíveis com
os observados nas fases mais avançadas da SDRA (Tsuno e cols.,1990; Dreyfuss &
Saumon, 1998). Além disso, a atelectasia das regiões dos pulmões ditas
dependentes em relação a força da gravidade e a distribuição não uniforme do
edema alveolar ocasionam redução funcional do volume pulmonar (em média 25%
do normal) e predispõem o pulmão a um estresse induzido pela hiperdistensão
alveolar (estresse tensil) e pelo colapso e abertura cíclicos das unidades alveolares
[estresse de cisalhamento (shear stress)] (Dos Santos & Slutsky, 2006). Portanto,
18
essa distribuição heterogênea da ventilação pulmonar na SDRA pode ser prejudicial
e predispor a LPAV/LPIV (Slutsky & Tremblay, 1998; Pugin e cols., 1999; Ranieri e
cols., 1999; Gattinoni e cols., 2001; Frank & Matthay, 2003).
1.2 Barotrauma
Durante anos, LPIV foi sinônimo de barotrauma, ou seja, uma lesão induzida
pela ventilação mecânica com altas pressões. No entanto, barotrauma se caracteriza
apenas por fuga de ar causada por ruptura da parede dos espaços aéreos, com
manifestações radiológicas que incluem pneumotórax, pneumomediastino e
enfisema cirúrgico. Recentemente, a possibilidade da ocorrência de alterações
morfológicas e fisiológicas mais sutis foi reconhecida e os principais determinantes
da LPIV foram reconhecidos (Dreyfuss e cols., 1998).
Diversos mecanismos parecem ser responsáveis pela LPIV, incluindo
rupturas do epitélio e endotélio alveolares (Dreyfuss e cols., 1998), hiperdistensão
alveolar (Dreyfuss e cols., 1998), colapso e reabertura cíclicos dos espaços aéreos
(Muscedere e cols., 1994), alterações no surfactante endógeno (John e cols., 1982),
processo inflamatório com infiltração neutrofílica (Kawano e cols., 1987), aumento
dos níveis de citocinas (Parker e cols., 1993; Tremblay e cols., 1997; Von Bethmann,
1998; Vlahakis e cols., 1999), alterações hemodinâmicas (Parker e cols.,1993) e
aumento da expressão de RNAm para proteínas da matriz extracelular (Berg e cols.,
1997; Garcia e cols., 2004; Farias e cols., 2005).
O epitélio pulmonar forma uma barreira ao transporte de proteínas entre o
interstício pulmonar e os espaços aéreos, porém rupturas epiteliais e edema alveolar
podem ocorrer na ventilação mecânica com alta PIP. Outro parâmetro importante
quanto à formação do edema alveolar é o tempo de ventilação mecânica associado
19
ao porte do animal estudado. Enquanto em ratos, a ventilação mecânica com alta
PIP por mais de dois minutos é suficiente para induzir formação de edema pulmonar,
em animais de maior porte, como coelhos e ovelhas, o tempo necessário para tal
alteração é bem maior. Isso tem fundamental importância quando se extrapola os
achados dos estudos com animais para os humanos (John e cols., 1980; Kolobow e
cols., 1987; Dreyfuss e cols., 1992; Whitehead & Slutsky, 2002).
Webb e Tierney em 1974 observaram que pulmões ventilados com PIP de 14
cmH2O durante 1 hora não apresentavam alterações histológicas, enquanto que
aqueles ventilados com 30 cmH2O desenvolviam edema perivascular. Reforçando,
os animais ventilados com PIP de 45 cmH2O sem Pressão Positiva ao Final da
Expiração (PEEP de positive end expiratory pressure) evoluíam com hipóxia grave,
edema perivascular e alveolar e morriam antes do término dos experimentos. (Webb
& Tierney, 1974). Ademais, Parker e colaboradores (1984) mostraram aumento
imediato do coeficiente de filtração capilar em pulmões isolados de cachorros
ventilados com PIP acima de 30 cmH2O. O edema pulmonar foi caracteristicamente
protéico, sugerindo, pelo menos em parte, que havia aumento da permeabilidade da
barreira alvéolo-capilar (Whitehead & Slutsky, 2002).
Em contraste com a evidência do aumento da permeabilidade da membrana
alvéolo-capilar, pouco se sabe sobre a contribuição do aumento da pressão
hidrostática na formação do edema pulmonar durante a ventilação mecânica.
Estudos em gambás mostraram que a ventilação com altos volumes correntes (VC
ou VT, de tidal volume) causava discreto aumento na pressão microvascular
pulmonar. No entanto, as diferenças regionais de perfusão pulmonar e atelectasias
podem gerar altas forças de filtração em algumas áreas. Logo, em pulmões lesados,
20
pequenos incrementos na pressão transmural podem acarretar formação de edema
pulmonar (Whitehead & Slutsky, 2002).
1.3 Volutrauma
As evidências experimentais subseqüentes indicaram que o grau de
insuflação pulmonar seria também um fator relacionado a LPIV (Dreyfuss e
cols.,1988; Carlton e cols.,1990). O fato dos tocadores de trompete apresentarem
pressões nas vias aéreas de até 150 cmH2O sem desenvolverem barotrauma
(Bouhuys, 1969), sugeriu que a pressão por si só provavelmente não devia ser um
fator determinante de LPIV. A contribuição relativa da pressão nas vias aéreas e do
volume corrente na lesão pulmonar, foi avaliada primeiramente em ratos sadios
ventilados com limitação do movimento tóraco-abdominal por uma “faixa elástica”.
Altas pressões nas vias aéreas (PIP = 45 cmH2O), com volume corrente baixo não
produziram lesão pulmonar. No entanto, animais ventilados sem restrições torácicas
ou abdominais, com alto volume corrente, atingiram altas pressões positivas
desenvolvendo lesão pulmonar grave. Portanto, o termo volutrauma nessa situação
seria mais adequado do que barotrauma (Dreyfuss e cols., 1988; Hernandez e cols.,
1989; Carlton e cols., 1990; Whitehead & Slutsky, 2002).
Em pulmões com complacência normal, a ventilação mecânica com alta PIP
gera grandes variações de volume pulmonar. Estudos revelaram que em pulmões
normais e principalmente naqueles com baixa complacência pulmonar, a ventilação
com altos volumes correntes pode acarretar hiperdistensão dos espaços aéreos
ventilados, acarretando LPIV (Dreyfuss e cols., 1988). Esses achados foram
confirmados por Hernandez e colaboradores que estudaram o efeito da ventilação
com três pressões de pico diferentes (15, 30 e 45 cmH2O) com e sem restrição do
movimento torácico. Eles observaram aumento de 31% no coeficiente de filtração
21
capilar após ventilação com 30 cmH2O e de 430% após ventilação com 45 cmH2O
sem restrição volumétrica. A restrição volumétrica preveniu este aumento no
coeficiente de filtração, mesmo na maior PIP (Hernandez e cols., 1989). Esses
trabalhos sugeriram que, mesmo em pulmões normais, o VT alto, e não a PIP alta, é
fundamental na fisiopatologia do edema induzido pela ventilação mecânica.
O grau de distensão alveolar é determinado pelo gradiente de pressão
através da parede alveolar, pela pressão transpulmonar, correspondente à diferença
entre a pressão de retração elástica pulmonar (estimada clinicamente pela pressão
de platô) e pela pressão pleural. A pressão transpulmonar é aplicada à pleura
visceral e deve ser transmitida para todas as regiões pulmonares, através do
esqueleto fibroso pulmonar, que consiste em dois componentes: as fibras axiais,
ancoradas ao hilo, dispostas ao longo das vias aéreas de maior diâmetro até os
ductos alveolares; e o sistema de fibras periféricas, ancoradas à pleura visceral e
dispostas centripetamente até os ácinos. Esses dois sistemas são conectados nos
alvéolos através dos septos alveolares.
Numa estrutura monodimensional, o estresse pode ser definido como a força
por unidade de área que se desenvolve em reação a uma força aplicada
externamente de mesma intensidade, mas com sentido oposto. Essa força interna
pode ser delimitada por três componentes, um plano (estresse normal) e dois
tangenciais (estresse de cisalhamento). A deformação de uma estrutura, em
decorrência de uma força externa aplicada sobre a mesma, é denominada de strain,
que é a relação entre o comprimento final da estrutura após a deformação e o seu
comprimento inicial. Durante a ventilação mecânica, o estresse e o strain são
parâmetros em constante variação, determinados pela pressão transpulmonar e pelo
VT (Gattinoni e cols., 2003).
22
1.4 Estratégia ventilatória protetora
Recente consenso enfatiza a importância de limitar a pressão de platô e
controlar os fatores responsáveis pelo aumento da distensão alveolar para
determinada pressão alveolar, como por exemplo, o volume corrente (Whitehead &
Slutsky, 2002). Um determinado volume corrente acarreta diferentes pressões de
platô, dependendo da complacência pulmonar (CL). Desse modo, a pressão
transpulmonar associa-se tanto ao VT normalizado pelo peso corporal quanto à
pressão de platô, cujo limite seguro corresponde a 32 cmH2O (Gattinoni e cols.,
2003). Logo, as estratégias ventilatórias protetoras na SDRA ressaltam a
importância de se ventilar os pacientes com baixos volumes correntes (Amato e
cols., 1998; Brochard e cols., 1998; Stewart e cols., 1998; Brower e cols.,1999, The
Acute Respiratory Distress Syndrome Network, 2000; Schultz e cols., 2007) (Quadro
2).
23
Quadro 2 – Estudos clínicos avaliando estratégias ventilatórias protetoras na SDRA/LPA
Ventilação n PaO2/FiO2VT
(mL/kg) PEEP
(cmH2O) PIP
(cmH2O) Mortalidade
(%) Amato
Convencional
Protetor
24
29
134±67
112±51
12
<6
8,7±0,4
16,4±0,4
36,8±0,9
30,1±0,7
72
38
Stewart
Convencional
Protetor
60
60
145±72
123±47
10,7±1,4
7,0±0,7
7,2±3,3
11,6±3,0
26,8±6,7
22,3±5,4
47
50
Brochard
Convencional
Protetor
58
58
155±68
144±61
10,3±2,3
7,1±1,3
10,7±2,3
13,6±2,9
31,7±6,6
25,7±5,0
38
47
Brower
Convencional
Protetor
26
26
150±69
129±51
10,2±0,1
24,9±0,8
30,6±0,8
11,6±3,0
30,6±0,8
24,9±0,8
46
50
ARDSNET
Convencional
Protetor
429
432
134±58
138±64
11,8±0,8
6,2±0,9
8,6±3,6
13±3,6
35±8
40±10
40
31
PIP: pressão de pico inspiratória. Adaptado de Kopp, 2003.
Como observado no Quadro 2, os cinco estudos buscaram evitar a
hiperdistensão das regiões pulmonares não dependentes, nos grupos das
respectivas estratégias protetoras, através da limitação das pressões inspiratórias.
Desta forma, as estratégias ventilatórias empregadas nos cinco estudos
minimizaram o estiramento excessivo sofrido por essas regiões pulmonares. A
limitação das pressões inspiratórias protegeu o pulmão do estiramento excessivo
(Figura 1).
24
Figura 1 - Representação esquemática do diametro das unidades alveolares.
Pouco Aerada
Inspiração
Ventilada
Expiração
Colapso alveolar
(A) Note a presença de hiperdistensão ao final da inspiração, (B) Presença de unidades aeradas e não aeradas, (C) Região alvéolo-dependente, colapsada que sofre repetida abertura e fechamento cíclicos, induzindo dano tecidual. Adaptado de Lapinsky & Mehta (2005).
1.5 Manobras de recrutamento alveolar
O recrutamento é um processo fisiológico dinâmico que está relacionado à
reabertura das unidades alveolares após redução do volume nos alvéolos. Que
podem ocorrer nas seguintes situações: modificações na PEEP, no volume corrente
e na FiO2, repetidas aspirações traqueais bem, como sedação e paralisia dos
músculos respiratórios (Maggiore e cols., 2003).
O uso de manobras de recrutamento na SDRA/LPA é controverso para alguns
autores, a manobra de recrutamento não deve ser realizada já que pode acarretar
hiperdistensão nas regiões pulmonares não-dependentes, devendo deixar o pulmão
“em repouso” (Ware e Matthay, 2000; Gattinoni e cols., 2006). Entretanto, para
outros, o recrutamento de unidades alveolares colapsadas, acarreta uma distribuição
mais homogênea da pressão aplicada na via aérea, evitando o estresse induzido
pelo colapso e reabertura cíclicos dos ductos, alvéolos e vias aéreas distais.
25
(Lachman e cols.,1982; Kacmareck e cols.,2001; Borges e cols., 2006). Logo, não
basta deixar o pulmão “repouso”, é necessário “recrutar pulmão e mantê-lo aberto”
(Lachman; 2002)
1.5.1 - Manobras de recrutamento alveolar (estudos experimentais)
Estudos experimentais têm demonstrado que as manobras de recrutamento
são capazes aumentar a quantidade tecido recrutado ao final de expiração,
favorecendo a ventilação pulmonar total, reduzindo por sua vez, a possibilidade de
lesão pulmonar induzida pela da ventilação mecânica.
Bond e colaboradores (1994) observaram melhora na complacência pulmonar
e oxigenação durante ventilação com alta freqüência após MRs. Van der Kloot e cols
estudaram os efeitos da MRs na oxigenação e volume pulmonar em três modelos de
LPA: lavagem com salina, acido oléico e pneumonia. A melhora da oxigenação foi
observada após aplicação das MRs somente no grupo com depleção de surfactante.
Se por um lado as MRs melhoram a mecânica pulmonar e a troca gasosa, por outro
lado podem induzir ou intensificar o estresse pulmonar (Tusman e cols., 1999;2005;
Farias e cols., 2005; Suki e cols., 2005). Nesse contexto, os autores constataram
aumento da expressão de RNAm para pró-colágeno tipo III após manobra de
recrutamento com CPAP 40 cmH2O por 40 segundos em ratos com lesão pulmonar
aguda ventilados por 1 hora com ZEEP. Entretanto, a adição da PEEP de 5 cmH2O
seguida da MR minimizou o estresse alveolar, provavelmente por reduzir o estresse
de cisalhamento (Farias e cols., 2005).
26
Quadro 3 – Manobras de recrutamento alveolar
Métodos
Modelos de LPA
Referências
CPAP= 30-60 cmH2O por 15-60 s
Lavagem com salina, ácido oléico, pneumonia e paraquat em animais.
Bond e cols., 1994; Rimensberger e cols., 1999; Van der Kloot e cols.,2000; Cakar e cols., 2000; Farias e cols.,2005
Modo pressão controlada: PIP= 60 cmH2O PEEP= 40 cmH2O por 2 min
Lavagem salina em animais
Fujino e cols., 2001; Takeuchi e cols., 2002
Modo volume controlado: FR= 20 irpm VT= de 20 ml/kg
Animais saudáveis anestesiados Lu e cols., 2002
PIP: pressão de pico inspiratória; VT: volume corrente; FR: freqüência respiratória; CPAP: pressão positiva contiuna na via aérea; PEEP: pressão positiva ao final da expiração.
Embora ainda não exista um consenso de como, quando e quem recrutar,
evidências recentes ainda mostram benefícios em se utilizar as MR na LPA/SDRA.
(Lachman e cols.,2002; Amato e cols., 1998; Pelosi e cols., 1999; Kacmareck e
cols.,2001; Borges e cols., 2006; Gattinoni 2006; Constantin e cols., 2007; Talmor e
cols., 2007)
1.5.2 – Manobra de recrutamento alveolar (estudos clínicos)
Várias manobras de recrutamento vêm sendo usadas em humanos (Quadro
3).
27
Quadro 4 – Manobras de recrutamento alveolar
Técnica Descrição Autor
Alta pressão sustentada
Modo CPAP CPAP= 35-50 cmH2O Tempo= 20-40 segundos
Amato e cols., 1998 Lapinsky e cols.,2005
“Suspiros” intermitentes
3 ciclos de “suspiros” por minuto Pplat= 45 cmH2O Tempo=1 hora
Pelosi e cols., 1999
Elevação da pressão inspiratória
Modo pressão controlada/PEEP Manter PEEP e Aumentar PIP = 40-60 cmH2O Tempo= 30-120 segundos
Bein e cols.,2002 Maggiori e cols., 2003 Gattinoni e cols., 2006
Elevação intermitente da PEEP
PEEP a cada 2 minutos Etapas: 25, 30, 35, 40, 45 cmH2O. Entre cada etapa ventilação com PEEP= 25 cmH2O por 1 minuto ΔPressão=15cmH2O
Borges e cols., 2006
Elevação intermitente da PEEP e pressão de pico inspiratória
Fase aumento progressivo = 20 min.PIP/PEEP=10/0,15/5, 20/10, 25/15 e 45/20 Fase redução progressiva = 20 min. PIP/PEEP=25/15, 20/10, 15/5 e 10/0
Maisch e cols., 2008
PIP: pressão de pico inspiratória; ΔPressão (Pplat – PEEP); CPAP: pressão positiva contiuna na via aérea; PEEP: pressão positiva ao final da expiração; Pplat: pressão de platô.
Amato e colaboradores demonstraram que a estratégia ventilatória protetora
associada à manobra de recrutamento alveolar com pressão positiva contínua nas
vias aéreas CPAP de 35 – 40 cmH2O (Figura 2) por 40 segundos com uso de alto
PEEP e volume corrente de 6 mL/kg reduziu a mortalidade (Amato e cols., 1998).
Talmor e cols., em seu estudo, submeteram 26 pacientes com SDRA a MR
(CPAP 40 cmH2O por 30 segundos) e observaram melhora na PaO2/FiO2 e
nenhuma mudança significativa nos níveis de citocinas (interleucina [IL] - 1, IL-6, IL-
28
8, IL-10, TNF-α) medidos em 5 e 60 minutos após a RM em comparação aos níveis
da linha de base (Talmor e cols., 2007).
Figura 2 – Manobra de recrutamento com CPAP.
Pressão (cmH2O)
40
30
20
10
5
Tempo (s) 0 10 20 30 40 50 60
Representação esquemática da manobra de recrutamento com pressão positiva contínua na via aérea (CPAP) 40 cmH2O por 40 segundos.
Pelosi e colaboradores observaram que suspiros intermitentes (três suspiros
consecutivos por minuto com pressão platô em 45 cmH2O) acarretavam aumento da
PaO2/FiO2; no entanto esses efeitos retornaram ao basal 30 minutos após a
interrupção do método (Pelosi e cols., 1999).
Maggiore e colaboradores estudaram os efeitos protetores da MR com
aumento da Pressão Inspiratória para 40 cmH2O após desconecção do tubo
endotraqueal seguido de aspiração traqueal em pacientes com LPA. Eles
observaram que o derecrutamento induzido pela aspiração pode ser evitado após a
MR (Maggiore e cols., 2003).
29
Bein e colaboradores analisaram as consequências da MR na medida da com
Pressão Intracraniana (PIC).Para tal aumentaram progressivamente a pressão pico
até atingir 60 cmH2O por 30 s e constataram uma melhora na oxigenação arterial,
porém um aumento significativo da PIC, com deterioração da hemodinâmica
cerebral, não recomendando a técnica em pacientes com lesão craniana (Bein e
cols., 2002).
Recentemente, surgiram novas formas de manobras de recrutamento, sendo
que a maioria dos centros tem dado preferência ao uso de técnicas com
pressurizações progressivas, quer por aumento da pressão inspiratória quer por
aumento da PEEP (Tusman e cols., 1999; Tusman e col., 2004; Borges e cols.,2006;
Sprung e cols., 2006).
Whalen e colaboradores utilizaram MR com aumento progressivo da PEEP
(PEEP=10 cmH2O por 3 ciclos respiratórios,15 cmH2O -3 ciclos respiratórios e 20
cmH2O -10 ciclos respiratórios) totalizando 2 minutos de MR, durante cirurgia
laparoscópica bariátrica e constataram melhora da oxigenação e da complacência
pulmonar, porém após 30 minutos de extubação esses efeitos benéficos não se
mantiveram (Whalen e cols., 2006).
Borges e colaboradores descreveram a manobra de recrutamento com
pressurização progressiva em pacientes com SDRA, elevando-se progressivamente
a PEEP (25, 30, 35, 40 e 45 cmH2O) até que se alcançasse uma pressão de platô
em torno de 60 cmH2O (Figura 3). Para tal, inicialmente, os pacientes foram
ventilados com PEEP de 10 cmH2O, volume corrente de 6 mL/kg e, a seguir, era
iniciada a manobra de recrutamento progressiva até recrutamento total (definido por
PaO2 mais PaCO2 ≥ 400 com FiO2 100%). Os níveis de PaO2 + PaCO2 aumentaram
de 179 mmHg para 487 mmHg, sendo que, após 6 horas, os níveis de PaO2 + PCO2
30
se mantiveram em 521 mmHg (Borges e cols., 2002; De Matos e cols., 2004; Barbas
e cols., 2005; Borges e cols., 2006), entretanto não foram constatadas queda na
taxa de mortalidade destes pacientes.
Gattionini e colaboradores (2006) realizaram estudo prospectivo em pacientes
com SDRA submetidos à MR (insuflacão sustentada dos pulmões com pressões
elevadas por 2 minutos, PEEP de 5 cmH2O, pressão inspiratória de 45 cmH2O, FR
10 irpm e tempo inspiratório de 3 segundos) e correlacionaram o percentual de
pulmão recrutável, avaliado através da análise da tomografia computadorizada com
parâmetros fisiológicos e clínicos. Os autores concluíram que a percentagem de
unidades alveolares potenciamente recrutáveis variou bastante em função da
população estudada, mostrando que dependendo da característica da lesão, o
pulmão pode ou não ser recrutado. Porém, esse estudo apresentou uma importante
limitação, a aplicação da MR na fase tardia da lesão. Já Borges e colaboradores
propuseram uma MR com maior tempo de duração, atingindo Pplatô de 60 cmH2O,
sendo a MR aplicada na fase precoce da LPA/SDRA. Essa MR propiciou um efeito
benéfico em 90% dos pacientes no que concerne a melhora da troca gasosa
(Borges e cols., 2006). Entretanto, perdura controverso o tipo de manobra de
recrutamento a ser empregado, assim como o momento em que ela deverá ser
aplicada.
31
Figura 3 – Manobra de Recrutamento Alveolar com PEEP Progressiva
ΔP
P Plat= pressão de platô; PEEP= pressão expiratória positiva final; ΔPressão (Pplat – PEEP) fixo em 15 cmH2O.
Constantin e colaboradores avaliaram o impacto da manobra de recrutamento
(PEEP de 10 cmH2O sobre o ponto de inflexão inferior da curva pressão x volume
por um período de 15 minutos e Pressão de Pico limitada 50 cmH2O) em pacientes
com SDRA na depuração do líquido alveolar. Os autores constataram uma melhora
na oxigenação arterial e na depuração do líquido alveolar resultando na resolução
do edema (Constantin e cols., 2007).
Maisch e colaboradores em 2008 submeteram 20 pacientes (pulmões
saudáveis) a MR com steps de: PiP/PEEP- 10/0,15/5, 20/10, 25/15 e 45/20 por um
período de 20 minutos e uma fase redução progressiva com duração de 20 minutos
da PiP/PEEP –25/15,20/10,15/5 e 10/0 submetidos à cirurgia maxilofacial e
constataram maior complacência e oxigenação e menor espaço morto quando a
PEEP adicionada foi em torno de 10 cmH2O (em pulmões saudáveis).
32
Embora ainda não exista um consenso de como recrutar, evidências recentes
ainda mostram uma grande variedade de MRs com os seus prós e contras na
LPA/SDRA. (Lachman e cols.,1982; Amato e cols., 1998; Pelosi e cols., 1999;
Kacmareck e cols.,2001; Borges e cols., 2006; Gattinoni 2006; Constantin e cols.,
2007; Talmor e cols., 2007).
33
2.0 – Justificativa
Desde a primeira descrição da SDRA, em 1967, e do primeiro relato do
tratamento desta síndrome com ventilação mecânica, em 1971, a única intervenção
terapêutica que demonstrou redução na taxa de mortalidade na LPA/SDRA foi a
estratégia ventilatória protetora, que limita a pressão nas vias aéreas e o volume
corrente oferecido aos pulmões, prevenindo o dano alveolar difuso (Amato e cols.,
1998; The Acute Respiratory Distress Syndrome Network, 2000). No entanto, apesar
da redução do volume corrente diminuir a mortalidade, por outro lado, o
conseqüente colapso alveolar acarreta estresse de cisalhamento, induzindo a lesão
pulmonar associada à ventilação mecânica (LPAV) (Muscedere e cols.,1994).Com o
intuito de minimizar o risco de LPAV, diferentes técnicas de recrutamento alveolar
vêm sendo utilizadas (CPAP, suspiro, PEEP progressivo). Entretanto, essas técnicas
têm mostrado efeito benéfico transitório (Grasso e cols., 2002), hiperdistensão
alveolar (Borges e cols., 2006), aumento do estresse pulmonar e depressão
circulatória (Terragni e cols., 2007). Em função disso, a avaliação de novas técnicas
de recrutamento alveolar que proporcionem benefícios duradouros e que não
estejam associados a elevado estresse celular tem grande relevância.
34
3.0 Objetivos
3.1 Objetivo geral
Analisar as conseqüências morfo-funcionais e moleculares da manobra de
recrutamento alveolar através da elevação progressiva da pressão inspiratória em
comparação à manobra convencional de recrutamento alveolar com a utilização de
CPAP em modelo experimental de lesão pulmonar aguda.
3.2 Objetivos Específicos
1. Comparar os parâmetros mecânicos, de histologia pulmonar (microscopias
óptica e eletrônica) e de oxigenação.
2. Descrever a expressão de células apoptóticas no pulmão, fígado, rim e
intestino.
3. Quantificar a expressão de RNAm para pró-colágeno tipo III no tecido
pulmonar.
35
4.0 Materiais e Métodos
4.1. Metodologia de estudo
Estudo experimental laboratorial utilizando ratos Wistar, pesando de 250-300
gramas.
4.2. Amostra de estudo
Ratos Wistar machos (n=36) provenientes do biotério do Laboratório de
Investigação Pulmonar do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro foram estudados e ditribuídos nos seguintes
grupos experimentais:
Grupo Controle (C) (n =6)
Os animais foram ventilados com VT de 6 mL/kg, freqüência respiratória de 80
irpm e relação inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de oxigênio de 0,21 e
PEEP 5 cmH2O por 1 hora no respirador para pequenos animais (Samay VR15,
Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai).
Grupo C-CPAP (n =6)
Os animais foram recrutados com CPAP 40 cmH2O por 40 segundos no
Ventilador Inter 3 (Intermed, São Paulo, Brasil) e ventilados com VT 6 mL/kg,
freqüência respiratória de 80 irpm, relação inspiração-expiração de 1:2, fração
inspirada de oxigênio de 0,21 e PEEP 5 cmH2O por 1 hora no respirador (Samay
VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai) , (Figura 4).
36
Grupo C-STEP (n =6)
Os animais foram recrutados com aumento da pressão de pico inspiratória
(PiP). Inicialmente, a pressão inspiratória foi ajustada em 25 cmH2O e a PEEP fixada
em 15 cmH2O, permanecendo neste valor por quatro minutos. A seguir, a PiP foi
aumentada em 5 cmH2O (PiP=30 cmH2O), mantendo-se nesse nível por dois
minutos e retornando para 25 cmH2O, onde foi mantida por mais 2 minutos. A PiP foi
elevada progressivamente até 45 cmH2O no repirador Inter 3, (Intermed, São Paulo,
Brasil). Posteriormente, os ratos foram ventilados com VT de 6 mL/kg, a freqüência
respiratória de 80 irpm e relação inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de
oxigênio de 0,21 e de PEEP 5 cmH2O por 1 hora no respirador para pequenos
animais (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai), (Figura
4).
Grupo Lesão Pulmonar Aguda (LPA) (n =6)
Para induzir LPA, injetou-se paraquat intraperitonealmente (15 mg/kg). Após
24 horas, os animais foram sedados, anestesiados e ventilados com VT 6 mL/kg, a
freqüência respiratória de 80 irpm, relação inspiração-expiração de 1:2, fração
inspirada de oxigênio 0,21 e PEEP 5 cmH2O por 1 hora no respirador para
pequenos animais (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo,
Uruguai).
37
Grupo LPA-CPAP (n =6)
Os animais com LPA induzida por paraquat (15 mg/kg i.p.) foram recrutados
com CPAP 40 cmH2O por 40 segundos no Respirador Inter 3 (Intermed, São Paulo,
Brasil) e ventilados com VT 6 mL/kg, freqüência respiratória de 80 irpm, relação
inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de oxigênio de 0,21 e de PEEP 5
cmH2O por 1 hora no respirador para pequenos animais (Samay VR15, Universidad
de la Republica, Montevideo, Uruguai), (Figura 4).
Grupo LPA-STEP (n = 6)
Os animais com LPA induzida por paraquat (15 mg/kg i.p.) foram recrutados
com aumento da pressão de pico inspiratória (PiP). Inicialmente a pressão
inspiratória foi ajustada em 25 cmH2O e a PEEP fixada em 15 cmH2O,
permanecendo neste valor por quatro minutos. A seguir, a PiP foi aumentada em 5
cmH2O (PiP= 30 cmH2O), mantendo-se nesse nível por dois minutos e retornando
para 25 cmH2O, onde foi mantida por mais 2 minutos. A PiP foi elevada
progressivamente até 45 cmH2O no respirador Inter 3, (Intermed, São Paulo, Brasil).
Posteriormente, os ratos foram ventilados com VT de 6 mL/kg, a freqüência
respiratória de 80 irpm e relação inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de
oxigênio 0,21 e PEEP 5 cmH2O por 1 hora no no respirador para pequenos animais
(Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai), (Figura 4). Foi
acrescentado um grupo controle e LPA não ventilado para análise de microscopia
óptica.
38
Figura 4 – Representação esquemática das manobras de recrutamento com CPAP e por “STEP”.
CPAP: pressão positiva contínua na via áerea; STEP: recrutamento progressivo; PIP: pressão pico inspiratória; PEEP: pressão positiva ao final da expiração. 4.3. Protocolo do Estudo Figura 5 – Protocolo Experimental
Protocolo
Anestesiados, paralisados e ventilados mecanicamente VT = 6 mL/kg, V’ = 6 mL/s, FR = 80 irpm, I:E = 1:2, FiO2 = 0,21 PEEP = 5
Análise dos gases
5 min
Mecânica (Basal)
Randomizacão
Histologia pulmonar.
apoptose de células
epiteliais do pulmão, rim,
fígado,Intestino.
5 min
1 h
Mecânica (Posterior)
Análise dos gases
4.4 Preparo dos animais
39
Os ratos foram sedados com diazepam (5 mg i.p.), anestesiados com
tiopental sódico (20 mg/kg i.p.). Depois de anestesiados, os animais foram colocados
em uma pequena mesa cirúrgica, em decúbito dorsal, sendo seus membros fixados
com esparadrapo. Os membros superiores foram mantidos estendidos a 90 graus
em relação ao corpo e os membros inferiores abduzidos em diagonal. Após o
posicionamento cirúrgico, foi realizada uma pequena incisão longitudinal medial de
aproximadamente 2 cm de extensão na face ventral do pescoço dos animais
seguida de divulsão dos tecidos até a exposição completa do terço inicial da
traquéia. A seguir, pela traqueostomia, uma cânula de polietileno (PE 240,
Intramedic®, Clay-Adams Inc., Nova York, EUA) com 1,5 mm diâmetro interno (DI) e
7,5 cm de comprimento foi introduzida na traquéia, sendo esta fixada na porção
proximal por meio de fios de algodão.
A cânula traqueal do animal foi conectada a um pneumotacógrafo para
pequenos animais, como descrito por Mortola e Noworaj (1983), para medida de
fluxo aéreo (V’). O pneumotacógrafo utilizado consiste de uma cânula metálica com
duas saídas laterais com as seguintes características: diâmetro interno = 1,5 mm,
comprimento = 4,2 cm e distância entre as saídas laterais = 2,1 cm. O gradiente de
pressão através do pneumotacógrafo foi determinado utilizando-se um transdutor
diferencial de pressão (UT-PDP, SCIREQ, Montreal, Canadá). Essa forma de medir
fluxo aéreo, além de bem simples, é adequada, visto que, em animais de pequeno
porte, os fluxos baixos e as dimensões traqueais reduzidas são responsáveis pela
existência de fluxo laminar e, portanto, o fluxo aéreo pode ser medido de acordo com
a lei de Poiseuille, onde a diferença de pressão entre as saídas laterais do
pneumotacógrafo é proporcional ao V’. Através de outra saída lateral, a via aérea foi
a um transdutor diferencial de pressão (UT-PDP, SCIREQ, Montreal, Canada) para
40
medida da pressão traqueal (Ptr). A inexistência de mudanças abruptas no diâmetro
do circuito (da traquéia até a extremidade da tubulação) evitou erros de medida de
resistência ao fluxo (Loring e cols. 1979; Chang & Mortola, 1981). O volume (VT)
mobilizado foi obtido por integração digital do sinal de fluxo.
No esôfago dos animais foi introduzido um cateter de polietileno (PE 240) de
20 cm de comprimento e 1,7 mm de diâmetro interno, com pequenos orifícios em
sua extremidade distal, preenchido com água deionizada. O cateter foi introduzido
até o estômago e retrocedido lentamente até atingir o terço inferior do esôfago
(Figura 6).
Figure 6 - Posicionamento do cateter esofagiano.
Esôfago
Posição do Cateter
1/3 Inferior
Coração Mediastino
Sua extremidade proximal foi então conectada a um transdutor diferencial de
pressão (UT-PDP, SCIREQ, Montreal, Canada) para medida da pressão esofagiana
(Pes), já que as variações da pressão no terço inferior do esôfago refletem as
variações da pressão intrapleural (Ppl) e, portanto, da pressão da parede torácica
(Pw) (Millic-Emili e cols., 1964a, 1964b). A medida da pressão esofagiana foi
realizada para decompor o sistema respiratório em pulmão e parede torácica. O
41
correto posicionamento do cateter esofagiano foi determinado pela “manobra de
oclusão” conforme proposto por Baydur e colaboradores, em 1982 (Baydur e cols.,
1982). A “manobra de oclusão” consiste na oclusão das vias aéreas ao término de
uma expiração espontânea, as quais são mantidas fechadas por um ciclo
respiratório, registrando-se e comparando-se as variações das pressões traqueal e
esofagiana durante o esforço inspiratório subseqüente. Nessas condições, a
diferença entre as variações da pressão traqueal (ΔPtr) e da pressão esofagiana
(ΔPes) não deve exceder 5%. O cateter esofagiano foi lavado periodicamente com
água deionizada, para evitar que a presença de secreções na luz do cateter (Figura
7).
Figura 7 – Manbra de oclusão para posicionamento do cateter esofagiano.
Traçados de volume (V), pressão transpulmonar (PL), pressão esofagiana (Pes) e pressão traqueal (Ptr) durante a “Manobra de oclusão”. A variação de Pes não deve ser superior a 5% da Ptr.
A calibração dos transdutores de pressão foi realizada com o auxílio de um
tubo em "U" contendo água destilada. A aferição foi realizada antes de cada
experimento para assegurar a confiabilidade do registro.
O espaço morto da montagem foi de 0,2 mL. Para computá-lo, pesou-se o
conjunto de equipamentos utilizados entre a via aérea do animal e o ventilador
42
(cânula traqueal, tubo em “T”, pneumotacógrafo e conexões de borracha) vazio e
cheio de água. A diferença de peso permitiu saber o volume de água e, portanto, o
volume do espaço morto do sistema. Para fechar as saídas do conjunto e enchê-lo
de água foi usada massa de modelar, que foi também pesada, junto com os demais
equipamentos.
4.5 Estudo da mecânica respiratória
Para este estudo, os animais tiveram sua musculatura paralisada após a
administração de brometo de pancurônio (2 mg/kg i.v.) e a ventilação artificial foi
instituída por um ventilador mecânico para pequenos animais (Samay VR15,
Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai) acoplado à outra extremidade do
pneumotacógrafo. Os animais foram ventilados com volume corrente de 6 ml/kg,
fluxo aéreo de 6 mL/s e freqüência respiratória de 80 irpm.
A mecânica respiratória foi avaliada pelo método de oclusão ao final da
inspiração após insuflação com fluxo constante (Bates e cols., 1985, 1988, 1989;
Kochi e cols., 1988a, 1988b), que permite analisar separadamente os componentes
elástico, viscoso e viscoelástico e/ou inomogêneo do sistema respiratório, pulmão e
parede torácica (Figura 8).
43
Figura 8 – Método de oclusão ao final da inspiração
Representação esquemática dos traçados de fluxo, volume, pressão traqueal e pressão esofagiana em função do tempo, obtidos a partir da oclusão da via aérea ao final da inspiração. Pmáx = pressão máxima alcançada; Pi = ponto de inflexão; Pel = pressão de retração elástica e VT = volume corrente.
Após a oclusão das vias aéreas ao final da inspiração, ocorre queda súbita da
pressão traqueal (Ptr) até um ponto (ponto de inflexão, Pi) a partir do qual o
decaimento da pressão assume caráter mais lento, atingindo um platô em sua
porção terminal. Esta fase de platô corresponde à pressão de retração elástica do
sistema respiratório (Pel) (Figura 8). A diferença de pressão (ΔP1) que caracteriza a
queda rápida inicial, representada pela diferença entre a pressão máxima inicial
(Pmáx) ou pressão de pico (Ppico) e o ponto a partir do qual a queda se torna mais
lenta (Pi), corresponde ao componente viscoso do sistema respiratório, ou seja,
reflete a pressão necessária para vencer a combinação das resistências da parede
torácica e pulmões em animais normais (Bates e cols., 1988, 1989; Kochi e cols.,
1988a, 1988b). A segunda variação de pressão (ΔP2), representada pela queda
lenta, do Pi ao platô [pressão de retração elástica (Pel) ou pressão de platô (Pplat)],
reflete a pressão dissipada para vencer o componente viscoelástico (“stress
relaxation”) e/ou inomogêneo (“pendelluft”) do tecido pulmonar e parede torácica
(Bates e cols., 1988; D’Angelo e cols., 1989 e Kochi e cols., 1988a, 1988b). As
44
pressões transpulmonares (ΔP1,L; ΔP2,L e Pel,L) foram calculadas a partir da
diferença entre os valores da parede torácica e do sistema respiratório. A soma de
ΔP1 e ΔP2 fornece a variação total de pressão (ΔPtot,L). As elastâncias estáticas do
sistema respiratório, pulmões e parede torácica (Est,L) foi calculada dividindo-se
Pel,L , pelo volume corrente (VT).
Para a realização da oclusão, o aparelho utiliza uma válvula com tempo de
fechamento definido (10 ms). Como este fechamento não é absolutamente
instantâneo, o volume nunca cai a zero imediatamente após a oclusão, propiciando,
assim, a existência de um pequeno fluxo. Este fluxo foi responsável pelo aumento do
volume pulmonar e, conseqüentemente, de Pi e Pel. Por isso, foi feita correção de
acordo com Kochi e colaboradores (Kocki e cols., 1988a).
As seguintes fórmulas foram utilizadas na análise da mecânica respiratória:
ΔP1 = Pmax-Pi
ΔP2= Pi-Pel
ΔPtot=ΔP1+ΔP2
Est = Pel/V
onde: ΔP1 = variação de pressão relativa ao componente viscoso ΔP2 = variação de pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo
ΔPtot = variação de pressão total; Pmáx = pressão máxima atingida. Pi = pressão no ponto de inflexão; Pel = pressão de retração elástica. Est = elastância estática; VT = volume corrente;
Foram registrados 15 ciclos pelo método de oclusão ao final da inspiração
(Bates e cols., 1985, 1988, 1989; Kochi e cols., 1988a, 1988b), em cada animal. As
respostas de freqüências dos sistemas de registro da Ptr e Pes foram estáveis até
20 Hz. Em seguida, os sinais foram condicionados no SCIREQ com freqüência de
corte estabelecida de 100 Hz, convertidos os sinais digitais por um conversor
45
analógico-digital de 12-bitz (DT-2801A, Data Translation, Malboro, EUA), e
amostrados a uma freqüência de 200 Hz. Os sinais foram armazenados em
microcomputador, utilizando-se o software LABDAT (RHT-InfoData, Montreal,
Canadá) e gravados em disquetes magnéticos para posterior análise (off line), que
foi realizada pelo programa ANADAT (RHT-InfoData, Montreal, Canadá) (Figura 9).
A resistência total do equipamento (Req), incluindo a cânula traqueal, foi
aferida previamente através da aplicação de diferentes fluxos de ar ao sistema (até
fluxos de 26 mL/s; bem acima da faixa de fluxo utilizada no presente experimento),
com concomitante registro das variações de pressão (ΔP). Uma vez que Req =
ΔP/V’, a resistência do equipamento corresponde ao coeficiente angular da curva
ΔPxV’. A pressão resistiva do equipamento (= Req.V’) foi subtraída das pressões
resistivas do sistema respiratório e pulmões de tal forma que os resultados
representam as propriedades mecânicas intrínsecas. A Req encontrada nos
experimentos, constante na faixa de fluxos usados, foi de 0,12 cmH2O. mL-1.s.
46
Figura 9 - Representação esquemática da montagem do experimento
1112
13
1 – Cilindro de ar comprimido; 2 – Rotâmero de agulha; 3 – Ventilador controlado a volume com fluxo inspiratório constante com duas válvulas solenóides; 4 – Pneumotacógrafo; 5 – Peça T para medida de pressão nas vias aéreas; 6 – Cânula traqueal; 7 – Mesa Cirúrgica; 8 – Transdutor de pressão esofagiana; 9 – Transdutor de pressão traqueal; 10 – Transdutor diferencial de pressão para medida de fluxo; 11 – Placa analógico-digital de 12 bits; 12 – Microcomputador; 13 – Ventilador Mecânico Inter 3
47
4.6 Gasometria arterial A artéria femoral direita dos animais foi puncionada com uma seringa de
insulina (BD 1cc com agulha curta), coletando-se 0,1 mL de sangue, após um
período de 5 minutos de ventilação mecânica no modo ventilatório inicial , isto é,
com VT de 6 mL/Kg, V= 6 mL/s, FR: 80 irpm, relação I:E= 1:2 e FiO2 de 0,21 (antes).
Adicionalmente, outra coleta de sangue foi realizada ao término do
experimento, ou seja, 1 hora após as diferentes manobras de recrutamento (depois).
O sangue arterial coletado foi depositado em cartucho especifico (Biosensor
EG7+®, Abbot Laboratories), que foram introduzidos no analisador de gases i-
STAT® [Abbott Point-of-care (POC), Illinois, EUA], para determinação dos
parâmetros da gasometrial arterial.
4.7. Microscopia óptica
4.7.1 Fixação e preparo das lâminas
Os pulmões foram ocluídos ao final da expiração com linha de algodão. O
pulmão direito foi congelado através de imersão em nitrogênio líquido, por
aproximadamente 3 minutos e, posteriormente, mantidos em solução Carnoy (etanol
60%, clorofórmio 30% e ácido acético 10%, por volume) a –70o C por 24 h. Após
este período, o material foi desidratado progressivamente através de imersão em
soluções com concentração crescente de etanol, como discriminado abaixo:
• MC-1: Etanol 70%, clorofórmio 22,5% e ácido acético 7,5%, a – 20o C durante
1 h;
• MC-2: Etanol 80%, clorofórmio 15% e ácido acético 5%, a – 20o C durante 1
h;
48
• MC-3: Etanol 90%, clorofórmio 7,5% e ácido acético 2,5%, a – 20o C durante
1 h;
• Etanol 100%, sendo mantidos a – 20o C por 1 h.
Posteriormente, os pulmões foram mantidos a – 4o C por 24 h. Após a
fixação, o material foi embebido em parafina, sendo realizados cortes histológicos
com 3 μm de espessura. As lâminas contendo os cortes pulmonares foram coradas
com hematoxilina e eosina (HE).
4.7.2 Análise histológica e morfométrica
As lâminas contendo os cortes pulmonares foram analisadas por microscopia
óptica (Olympus BX51; Tóquio, Japão) segundo seus aspectos qualitativos e
quantitativos. Para a análise descritiva, toda a superfície da lâmina foi observada em
aumento de 100 e 400x.
A análise quantitativa foi realizada através da técnica convencional de
contagem de pontos (“point-couting”) (Gundersen e cols.,1988), utilizando um
retículo acoplado a ocular do microscópio contendo um sistema de referência de 100
pontos e 50 linhas dispostos em paralelo (Figura 10). Em um aumento de 200x
foram avaliados dez campos aleatórios e não coincidentes por lâmina. Quantificou-
se a fração de área ocupada por alvéolos normais, colapsados e hiperinsuflados
(Weibel, 1990).
49
Figura 10 - Representação esquemática do retículo com 100 pontos e 50 linhas.
4.8 Microscopia eletrônica de transmissão
Para a análise da microscopia eletrônica foram retirados três fragmentos do
parênquima pulmonar do pulmão esquerdo (2x2x2mm). Os fragmentos foram
colocados em glutaraldeído com tampão fosfato preparado a 2%, por 2 h, sendo
posteriormente colocados em sacarose. Os fragmentos permaneceram em solução
de sacarose até o processamento, constituída de 4,5 g de NaCl e 8,9 g de sacarose
diluídos em 500 mL de água destilada. A seguir, os fragmentos foram imersos em
solução de tetróxido de ósmio (0,405 a 1% de água, contendo 106 ou 133 mg de
sacarose por mL) por 2 h. Após a lavagem em água bidestilada, as preparações
foram colocadas na geladeira em solução aquosa 0,5% de acetato de uranila
contendo 106 a 133 mg de sacarose, por um tempo médio que variou de 2 a 24 h. O
processo é continuado, efetuando-se a desidratação em concentrações crescentes
de álcool etílico, progredindo gradativamente até álcool absoluto, sendo então
passado em óxido de propileno por 15 minutos (2 vezes). Iniciando a fase de
embebição, as amostras foram colocadas em misturas de partes iguais de óxido de
propileno e resina. Os frascos contendo os fragmentos foram colocados para girar (1
50
rotação a cada 4 minutos, por 1 hora). Posteriormente, as peças foram colocadas
por 16 h em resina, com a seguinte composição: 10 mL de araldite (Cy-205), 8 mL
de endurecedor DDSA (anidrido de ácido doxecenil succínico), 0,5 mL de acelerador
(N-benzil dimetilamina) e 0,1 mL de plastificante (dibutilftaltato). Ao término de 16 h,
as amostras foram colocadas em moldes de silicone com nova resina, para
polimerização em estufa a 60o C, por 5 dias. Concluída a polimerização, os
espécimes foram aparados e cortes semifinos foram obtidos com o ultramicrótomo
Porter Blum MT2. Tais cortes, com 0,5 μm de espessura foram montados em
lâminas de vidro e corados com uma mistura de azul de metileno a 1% e azur II, em
partes iguais e a quente. Nesses cortes, foram selecionadas áreas representativas
das lesões. Para o estudo ultraestrutural, cortes ultrafinos com espessura em torno
de 90 milimicrômetros foram contrastadas pelo acetato de uranila a 2% durante 30
minutos e, finalmente, por citrato de chumbo por 10 minutos. A observação dos
cortes e as eletromicrografias foram realizadas em microscópio eletrônicas JEOL
(Jeol 1010, Japão).
Um escore semi-quantitativo de gravidade foi usado para mensuração da
apoptose, necrose PI, necrose PII, membrana basa desnudada, colapso alveolar,
lesão epitelial e presença de membrana hialina. Utilizando-se zero quando não foi
contado nenhuma alteração, 1 (0-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) e 4 (76-100%) em
10 campos microscópicos não-coincidentes.
51
4.9 – Dectecção e quantificação de células apoptóticas
Pequenos fragmentos (2x2x2mm) foram cortados do pulmão esquerdo,
fígado, rim e do intestino e armazenados em formalina à 10%. Os blocos foram
cortados longitudinalmente 4-μm (pulmão e rim) ou 2-μm (fígado) com micrótomo e
corados com hematoxilina-eosina.
A expressão de Fas-L foi avaliada por coloração imunohistoquímica
utilizando-se a técnica do complexo imunoperoxidase avidina-biotina, usando
anticorpo policlonal anti-Fas-L (Clone FSL01; same as 5D1) (Neo Markers,
Westinghouse, CA); diluição 1:20 que reconhece a região N-terminal intracelular do
Fas-L humano. A coloração citoplasmática acastanhada caracterizou a expressão
Fas-L.
Para detecção in situ de apoptose, ao nível de uma única célula, foi usado o
método TUNEL (terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick
end-labeling method) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha). Este método
envolve a adição de trifosfato de deoxiuridina (dUTP) marcado com fluorescência
nos fragmentos terminais do DNA por ação catalítica do TdT (Gavrieli e cols. 1992;
Wijsman e cols., 1993). Todos os experimentos foram realizados várias vezes de
modo que, os resultados para várias amostras de tecidos, incluindo a próstata do
rato, pudessem ser padronizados. Cortes histológicos feitos a partir de blocos de
parafina (4 a 6 μm) foram depositados em lâminas. A seguir, os cortes foram
desparafinados em solução xilol e rehidratados com diluições decrescentes de
etanol em água. Os cortes foram lavados quatro vezes com água destilada por 2
minutos e imersos em tampão TdT (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha).
Então, TdT (0,3 U por microlitro) e marcação fluorescente dUTP em tampão TdT
foram adicionados aos cortes e as amostras foram incubadas em atmosfera úmida a
52
37°C durante 60 minutos. Para controles negativos, TdT foi eliminado da mistura
reativa. Os cortes foram, então, incubados com anticorpo específico para
fluorescência conjugado a peroxidase. Os corantes foram visualizados com um
substrato no qual núcleos com fragmentação do DNA se coram de marrom. A reação
foi determinada pela lavagem dos cortes em tampão salina fosfato. Os núcleos sem
fragmentação do DNA foram corados de azul como resultado da contra-coloração
com hematoxilina. Controles positivos consistiram da glândula prostática do rato
após castração. Três cortes de cada amostra foram examinados. Os cortes foram
inicialmente examinados através de microscopia óptica em pequeno aumento
(X100), permitindo a avaliação da área de superfície ocupada por células
apoptóticas. A seguir, vários campos por seção de regiões com células apoptóticas
foram examinados em um aumento de (X400) para se discriminar núcleos alveolares
com fragmentação e massas de cromatina condensadas. Células alveolares, que
estavam com boa forma, arredondadas e células eosinofílicas foram diferenciadas
morfologicamente de outras células não-epiteliais através de microscopia óptica
utilizando-se maior aumento. Em adição à técnica de marcação de fragmentos
terminais do DNA, cortes adjacentes foram corados com hematoxilina e eosina para
quantificação da apoptose.
A microscopia óptica foi usada para quantificar apoptose de células epiteliais
no pulmão, vilos entéricos, fígado e rim (detecção in situ e imunocoloração),
necrose, degeneração de gordura e vacuolar. Um sistema semi-quantitativo foi
usado para mensuração do grau de apoptose. Um escore semi-quantitativo de 5
pontos, baseado na gravidade, foi usado. Os achados apoptóticos foram graduados
como negativo = 0 (parênquima pulmonar normal), mínimo = 1 (0-25%), moderado =
2 (26-50%), alto = 3 (51-75%) e grave = 4 (76-100%) de estruturas do parênquima
53
alteradas em 10 campos microscópicos não-coincidentes (aumento 400X) (Imai,
2003; Nagata, 1997).
4.10. Quantificação da expressão de RNAm para prócolágeno tipo III
Após a coleta dos dados, tira de tecido pulmonar foi retirada da periferia do
pulmão esquerdo, congeladas em nitrogênio líquido, armazenadas em “criotubo” no
freezer a −70°C até o seu processamento. A expressão de RNAm para pró-colágeno
tipo III foi quantificada pelo método da transcrição reversa e reação em cadeia da
polimerase (RT-PCR).
4.10.1 Extração de RNA total de tecido pulmonar
As amostras de tecido pulmonar foram homogeneizadas em Trizol® Reagent
(Gibco BRL - Life Technologies, Rockville, MD, EUA). O Trizol®Reagent é uma
solução monofásica de fenol e de guanidina isotilcianato, correspondendo a uma
variação do método desenvolvido por Chomczynski e Sacchi em 1987. Após a
extração, realizada de acordo com as instruções do fabricante, o RNA precipitado foi
solubilizado em 20 µL de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). A
concentração das amostras de RNA-total foi determinada por espectrofotometria no
comprimento de onda de 260 nanômetros. A integridade das amostras foi verificada
através de eletroforese em gel de agarose 1% contendo 0,5 μg/mL de brometo de
etídeo. O gel foi submerso em tampão TAE 1X e a eletroforese realizada a 100 Volts
por aproximadamente 45 minutos.
54
4.10.2 Transcrição reversa (RT)
Para a síntese do ácido desoxirribonucléico complementar (DNAc), 1 μg de
RNA-total extraído do pulmão dos animais foi incubado com 0,5 μg/mL de oligo
dT12-18 (Gibco BRL - Life Technologies, Rockville, MD, EUA) a 94°C por 5 minutos,
para se obter a primeira fita de DNAc. A transcrição reversa das amostras foi
realizada em um volume total de 25 μL, contendo 10 mM de deoxi-nucleotídeo
trifosfato (dNTPs) (Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA), 0,1 M de
dithiothereitol (DTT) (Gibco BRL - Life Technologies, Rockville, MD, EUA), 5X First
Strand Buffer (Gibco BRL - Life Technologies, Rockville, MD, EUA), 3U de inibidor de
RNAase (RNAsin) e 2,5U de MMLV-RT (Moloney-murine-leukemia-vírus-reverse-
transcriptase) (ou SuperScriptTM II RT) (Gibco BRL - Life Technologies, Rockville,
MD, EUA). Após incubação por 40 minutos a 37°C, será adicionado mais 2,5 U da
enzima MMLV-RT ou SuperScriptTM II RT (Gibco BRL - Life Technologies,
Rockville, MD, EUA) e foi realizada nova incubação a 37°C por 40 minutos. Para
certificarmos a ausência de contaminação ou amplificação de DNA genômico a
transcriptase reversa não foi adicionada em um tubo experimental chamado de RT.O
DNAc obtido foi estocado a -20°C até que fosse realizada a reação de PCR.
4.10.3 Reação em cadeia da polimerase (RCP, polymerase chain reaction PCR)
O DNAc, obtido na etapa anterior, foi utilizado como molde nas reações de
PCR. Para estes experimentos, foram sintetizados oligonucleotídeos iniciadores
(primers) específicos para os genes do prócolágeno III e do gliceraldeído-3-fosfato-
desidrogenase (GAPDH), utilizado como controle positivo em todas as reações.
Estes oligonucleotídeos possuem entre 18 a 30 nucleotídeos e composição de G-C
entre 50-60%, sendo confeccionados com base na seqüência dos genes em estudo
55
já publicados no GeneBank (BATHESDA, MD USA), como pode ser observado na
tabela 2. Para evitar a amplificação inespecífica, os primers sintetizados foram
posicionados em diferentes exons. Desta forma, foi possível distinguir, por tamanho,
os produtos de PCR derivados da amplificação do DNAc dos derivados da
contaminação de DNA genômico. As reações de PCR foram realizadas em um
termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer – Norwalk, EUA).
O Quadro 5 mostra a seqüência e localização dos primers, bem como, o
tamanho dos produtos de amplificação obtidos a partir da reação de RT-PCR.
Quadro 5 – Primers utilizados nas reações de RT-PCR.
A posição do primer e o tamanho esperado dos produtos de amplificação são dados com base na seqüência de DNAc do gene já clonado para rato.
MOLÉCULA SEQÜÊNCIA DO PRIMER
POSIÇÃO
TAMANHO
GAPDH
Sense
Antisense
5’ GTC TTC ACC ACC ATG GAG 3’
5’ CGA TGC CAA AGT TGT CAT 3’
325 - 342
517 - 535
GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase; PCII: procolágeno III; pb: pares de base. Após a transcrição reversa todo o DNAc foi utilizado nas reações de PCR
contendo diferentes pares de primers. Para a amplificação, foram utilizados 25
pmoles de cada oligonucleotídeo, 1,25 mM dNTP (Amershan Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ, EUA), 50mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 9.0, 0.1% Triton
X-100 (Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA) e 2,5 U de Taq DNA
643 pb
211 pb 211 pb
Sense
Antisense
5’ CTG CCA TTG CTG GAG TTG 3’
5’ GAC GCC ATC CTC TAG AAC 3’
903 - 101
1529 - 1546
643 pb
Procolágeno III
56
Polimerase (Gibco BRL - Life Technologies, Rockville, MD, EUA), em um volume
total de 25 μL de reação. O programa utilizado consiste de desnaturação a 94°C, por
45 segundos, anelamento a 54°C tanto para prócolágeno III, quanto para GAPDH,
por 45 segundos, e extensão a 72°C, por 1 minuto, por 36 ciclos. (Quadro 6).
Quadro 6 – Descrição das condições das reações de RT-PCR.
CONDIÇÕES Nº DE
CICLOS
Desnaturação Tempo Ligação Tempo Extensão Tempo
Procolágeno
III (rato)
94ºC
45 seg
54ºC
45 seg
72ºC
60 seg
36
GAPDH
(rato) 94ºC 45 seg 54ºC 45 seg 72ºC 60 seg 36
As temperaturas e tempos, assim como, o número ideal de ciclos utilizados nas várias etapas da reação de RT-PCR para amplificação dos diferentes genes pode ser observado.
Para excluir a possibilidade de contaminação, foram realizados controles
negativos para cada reação. Nestes tubos foi adicionada água ao invés de DNAc.
Após a reação de PCR, 25 µL de cada amostra, correspondente aos vários
grupos experimentais de animais, foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose 1,5 %. Os produtos de amplificação foram identificados de acordo com o
peso molecular esperado.
O gene do GAPDH, que por ser um gene abundantemente expresso em todas
as células sem sofrer variação da sua expressão com os diferentes tratamentos
realizados neste trabalho, serviu como controle interno de todos os experimentos de
RT-PCR. Pares de oligonucleotídeos correspondentes ao GAPDH foram
amplificados juntamente com o gene em estudo para todas as reações de PCR
realizadas.
57
5.0 Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas pelo programa Sigma Stat 3.1
(Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA). A normalidade dos dados (teste de
Kolmogorov-Smirnov com correção de Lilliefors) e a homogeneidade das variâncias
foram testadas (teste de Levene). Para avaliar a diferença entre os dados da
mecânica, morfometria pulmonares e oxigenação dos diferentes grupos foi utilizada
a análise bi-variada, considerando os seguintes fatores: 1) presença ou não de lesão
pulmonar aguda e 2) realização ou não de manobra de recrutamento.
Para avaliar a diferença de células epiteliais de rim, fígado, intestino e pulmão e
microscopia eletrônica foi utilizado Anova on ranks.
Quando múltiplas comparações foram necessárias utilizou-se o Teste Tukey. O
valor de significância estabelecido foi um p < 0,05.
58
6.0 Resultados
6.1 Mecânica pulmonar
Os valores de volume e fluxo utilizados durante o experimento foram similares
em todos os grupos (Tabela 1). A pressão de platô se elevou após 1 hora de
ventilação mecânica no grupo LPA não recrutado (Tabela 1). No grupo controle, as
pressões de pico e de platô reduziram após a manobra de recrutamento com STEP.
No grupo LPA a elastância estática, pressões resistivas e viscoelástica reduziram
após ambas as MR; sendo a queda das pressões de pico e de platô e elastância
significativa no grupo STEP do que CPAP (Figuras 11 e 12).
59
Tabela 1 - Valores de fluxo, volume, pressões de pico e platô nos grupos controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA).
C LPA
Variáveis
NR CPAP STEP NR CPAP STEP
Fluxo
(mL/s) 6,01±0,01 6,02±0,02 6,00±0,01 6,02±0,02 6,00±0,04 6,03±0,03
Antes
Volume
(mL) 1,52±0,02 1,49±0,01 1,48±0,01 1,50±0,01 1,50±0,01 1,50±0,01
Ppico
(cmH2O) 4,16±0,72 4,89±0,86 4,95±1,18 7,85±1,31* 7,00±1,03* 8,12±1,47*
Pplato
(cmH2O) 2,14±0,57 2,47±0,46 2,51±0,99 5,32±1,31* 4,53±0,73* 4,87±1,39*
Variáveis
NR
CPAP
STEP
NR
CPAP
STEP
Fluxo
(mL/s) 6,01±0,01 6,00±0,02 6,01±0,01 6,06±0,04 6,01±0,02 6,00±0,04
Após
Volume
(mL) 1,51±0,02 1,50±0,01 1,50±0,03 1,50±0,02 1,50±0,01 1,51±0,02
Ppico
(cmH2O) 4,91±0,65 4,58±0,65 4,14±1,15 8,12±0,94* 5,30±1,09*,** 4,62±0,65**#
Pplato
(cmH2O) 2,41±0,65 2,39±0,48 2,28±1,07 5,59±0,85* 3,10±1,09*,** 2,34±0,43**#
Os valores correspondem à média de seis animais do grupo controle (C) e lesão pulmonar aguda (LPA) ± erro padrão da média. NR: Não Recrutados; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. Antes: mecânica medida imediatamente antes da manobra de recrutamento. Após: mecânica medida 1 hora após manobra de recrutamento. *Valores significativamente diferente de LPA (p<0,05). **Valores significativamente diferentes do LPA-NR. # Valores significativamente diferentes de LPA-CPAP (p<0,05).
60
Figura 11 - Mecânica pulmonar: elastância estática Es
t,L (c
mH
20.m
l-1)
0
1
2
3
4
5
6
C LPA
NR NRCPAP STEP CPAP STEP
*
****
p<0.001
Antes MR1h após MR
Elastância Estática do Pulmão (Est,L) nos grupos controle (C) e lesão pulmonar aguda (LPA). As barras representam a média de 6 animais + erro padrão da média. Est, L = Elastância estática do pulmão. NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Significativamente diferente de C. **Significativamente diferente do LPA-NR (p<0,05).
61
Figura 12 - Mecânica pulmonar: pressões resistiva e viscoelástica Δ
P,L
(cm
H20
)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
C LPA
NR NRCPAP STEP CPAP STEP
*
****
ΔP1ΔP2
Variação de pressão pulmonar (ΔP, L) nos grupos controle (C) e lesão pulmonar aguda (LPA). As barras representam a média de 6 animais + erro padrão da média. ∆P1= pressão resistiva; ∆P2= pressão viscoelástica/inomogênea. NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Significativamente diferente de C. **Significativamente diferente do LPA-NR (p<0,05).
62
6.2 Análise histológica e morfométrica do parênquima pulmonar
Os animais do grupo lesão pulmonar aguda apresentaram maior fração de
área de colapso alveolar em comparação ao grupo controle (Figuras 13 e 14).
As manobras de recrutamento com CPAP e por STEP reduziram a fração de
área de colapso alveolar, sendo tal redução mais significativa no grupo que foi
recrutado progressivamente (Figuras 13 e 14). Não foi constatada área de
hiperinsuflação em nenhum dos grupos estudados.
Figura13 - Morfometria do parênquima pulmonar
0
20
40
60
80
100
NR CPAP STEPNV
**
NR CPAP STEPNV
C LPA*
# ¶
**
** #
Mor
fom
etria
Pul
mon
ar (%
)
Normal Colapsado
Fração de área de alvéolos normais e colapsados. As barras corresponde à média de 6 animais + erro padrão da média. Animais controle (C) e lesão pulmonar aguda (LPA). NV: Não Ventilado; NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Valores significativamente diferentes entre os grupos C versus LPA. **Valores significativamente diferentes do NV. #Valores significativamente diferentes área colapsada do grupo NR. ¶Valores significativamente diferentes área colapsada do grupo LPA-CPAP versus LPA-STEP (p<0,05).
63
Figura 14 - Fotomicrografias do parênquima pulmonar
100 mm
C-NR
LPA-CPAP
C-CPAP C-STEP CNV
LPA-NV LPA-NR
100 mm 100 mm 100 mm
100 mm 100 mm 100 mm
100 mm
LPA-STEP
Fotomicrografia de parênquima pulmonar (aumento de 200x) corado em H&E de animais controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA). NV: Não Ventilado; NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. Note na ponta da seta áreas de colapso alveolar (seta).
64
6.3 Análise da pressão parcial de oxigênio no sangue arterial
Os animais do grupo lesão pulmonar aguda apresentaram aumento da PaO2
após a ventilação mecânica independentemente do grupo estudado. Entretanto,
esse aumento foi maior no grupo LPA-STEP quando comparado com LPA-CPAP .
Tabela 2 – Pressão parcial arterial de oxigênio
Grupos PaO2 mmHg Antes
PaO2 mmHg Depois
LPA-NR 72 ±0,5 113 ±4,0 LPA-CPAP 64 ±21 115 ±14* LPA-STEP 70 ±0,8 314 ±38*,**
Os valores correspondem à média de 3 animais + erro padrão da média. Lesão Pulmonar Aguda (LPA); NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Valores significativamente diferentes do grupo LPA-NR. **Valores significativamente diferentes do grupo LPA-CPAP (p<0,05). 6.4 Análise da microscopia eletrônica
A microscopia eletrônica evidenciou pnemócitos tipo I e II, endotélio e epitélio
alveolar preservados no grupo controle, mantendo-se a integridade capilar e da
menbrana basal. Após a indução da lesão pulmonar aguda constatou-se apoptose
do pneumocitos do tipo II, desacoplamento da membrana basal e deterioração dos
corpos lamelares. Entretanto, a manobra de recrutamento prgressivo (STEP) induziu
menor número de células apoptóticas e lesão endotelial, e maior preservação da
membrana alvélo-capilar em comparação aos animais recrutados com CPAP ou não
recrutados (Tabela 3 e Figura 15).
65
Tabela 3 – Análise semiquantitativa da microscopia eletrônica no grupo LPA
Variáveis LPA-NR LPA-CPAP LPA-STEP
Apoptose 3,0 (2-4) 1,5 (1-2)* 0,5 (0-1) *#
Necrose PI 3,0 (3-4) 1,5 (1-3)* 1,0 (0-2) *#
Necrose PII 3,5 (2-4) 2,5 (2-3) 1,0 (1-2) *#
Membrana Basal Desnudada 3,0 (2-4) 2,5 (2-3) * 1,0 (1-2) *#
Colapso Alveolar 4,0 (3-4) 1,5 (1-3) * 1,0 (0-2) *#
Lesão Endotelial 2,5 (2-3) 2,0 (2-3) * 1,0 (0-2) *#
Membrana Hialina 2,0 (2-3) 2,0 (1-2) 1,5 (1-2) *#
Valores correspondem à mediana (Min-Max) de 4 animais por grupo. Escore de apoptose no pulmão. LPA: Lesão Pulmonar Aguda; NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. * Valores significativamente diferentes do LPA-NR (p<0,05). #Valores significativamente diferentes de LPA-CPAP (p<0.05).
66
Figure 15 - Fotomicrografia eletrônicas do parênquima pulmonar.
PII
PII PII
C LPA-NR
LPA-CPAP
A
A
My
500 nm 1000nm
1000nm
A
CA
LPA-STEP
500 nm
A
PII
PII
Microscopia eletrônica de animais dos grupos controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA). NR: Não-recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. Note lesão epitelial nos grupos LPA PII e pneumocitos do tipo II.
67
6.5 Análise da apoptose de órgãos Os animais do grupo lesão pulmonar aguda apresentaram aumento na
apoptose das células epiteliais do pulmão, rim, fígado e intestino. A manobra de
recrutamento com CPAP e STEP reduziu o número de células apoptóticas no fígado,
rim e pulmão sendo essa queda mais significativa no grupo LPA-STEP (Tabela 4 e
Figuras 16 e 17).
Tabela 4 – Índice de apoptose celular
Órgãos LPA-NR LPA-CPAP LPA-STEP
Intestino Anti-FasL 3,0 (2-4) 1,5 (1-3)* 1,5 (0-2)*
Fígado Anti-FasL 3,0 (2-4) 1,0 (1-2)* 1,0 (0-1)*
Rim Anti-FasL 3,5 (3-4) 2,0 (1-2)* 0,5 (0-1)*#
Pulmão Anti-FasL 3,0 (2-4) 1,5 (1-2)* 0,5 (0-1)*#
Valores correspondem à mediana (min-max) de 3 animais por grupo. Escore de apoptose no pulmão, intestino, rim e fígado (Sistema Fas/FasL), dos animais do grupo com lesão pulmonar aguda (LPA). NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Valores significativamente diferentes do LPA-NR. #Valores significativamente diferentes do LPA-CPAP (p<0,05).
68
Fotomicrografia representativa do parênquima pulmonar (aumento de x400) nos animais dos grupos controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA). NR = Não Recrutado; CPAP = Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP = manobra de recrutamento com pressurização progressiva. A-D: fixado com técnica de Túnel. E-F: fixado com hematoxilina-eosina.
Figure 16 – Fotomicrografia do parênquima pulmonar para análise de células apoptóticas do pulmão
C-NR LPA-NR LPA-CPAP LPA-STEP
A B C D
E F G H
DCB
H GE F
A
200 µm200 µm
200 µm200 µm200 µm
200 µm200 µm
200 µm
69
Figure 17 – Fotomicrografia representativa de órgãos distais para análise de células apoptóticas.
CLV K
H
H
H H
C- NR
LPA-NR
LPA-CPAP
LPA-STEP
Intestino Fígado Rim
200 µm
Fotomicrografia representativa dos animais dos grupos controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA). NR = Não Recrutado; CPAP = Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP = manobra de recrutamento com pressurização progressiva. Note presença de células epiteliais apoptóticas no intestino, fígado e rim (aumento de x400).
70
6.6 – Análise da expressão de RNAm para procolágeno do tipo III (RT-PCR)
Observa-se aumento estatisticamente significativo da expressão de RNAm para
procolágeno tipo III (PCIII) no grupo LPA em relação ao grupo controle, sendo que no
grupo LPA-NR e LPA- CPAP este aumento foi mais significativo quando comparado
com o grupo LPA-STEP (Figura 18).
Figura 18 – Expressão de RNAm para procolágeno tipo III
L
PCIII
/GA
PDH
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
**
* **
NR NR CPAP CPAPSTEP STEP ___________ C
___________ LPA
← PCIII (643bp)
← GAPDH (211bp)
WM NR CPAP NR CPAP STEP ________________ C LPA
STEP _______________
Expressão de RNAm para procolágeno tipo III. Os dados estão expressos como média + erro padrão de 4 animais dos grupos controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA). NV: Não Ventilado; NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Valores significativamente diferentes do grupo Controle. ** Valores significativamente diferentes do grupo LPA-CPAP.
71
7.0 Discussão
O uso de modelos animais possibilitou o entendimento da patogênese da
LPA/SDRA com etiologias distintas e permitiu avanços importantes no
desenvolvimento e no aprimoramento de abordagens terapêuticas (Rocco e cols.,
2004). Neste contexto, optamos por utilizar ratos Wistar, já que nossos experimentos
exigiam um número considerável de animais, além de ser possível mimetizar as
características da LPA/SDRA humana nessa espécie. O modelo experimental em
ratos permite uma avaliação adequada dos parâmetros ventilatórios e histológicos
pulmonares, sendo que o modelo experimental ideal da LPA/SDRA é aquele que
reproduz a etiologia bem como as fases fisiopatológicas que caracterizam a
síndrome.
No presente estudo foi utilizado modelo experimental de lesão pulmonar
aguda induzido por paraquat. O paraquat é um herbicida que se acumula
predominantemente no pulmão induzindo lesão ao epitélio alveolar principalmente o
pneumócito do tipo II. Conseqüentemente, o paraquat acarreta edema intersticial e
alveolar, hemorragia intra-alveolar, inflamação com recrutamento de neutrófilos,
além da formação de membrana hialina (Smith e cols.,1974; Delaval & Cillespie
1985; Rocco e cols., 2001; 2004; Contador e cols., 2003). Portanto, é um modelo
experimental de dano alveolar difuso que mimetiza as alterações histológicas
presentes na lesão pulmonar aguda. Ademais, o paraquat é fácil de ser
administrado, tem efeito rápido e apresenta baixo custo. Nesse trabalho utilizamos
paraquat na dose de 15 mg/kg, que é suficiente para induzir lesão pulmonar aguda
com 100% de sobrevida nas primeiras 24 horas (Rocco e cols., 2001). Constatamos
modificações da mecânica pulmonar (elastância, pressões resistivas e
viscoelásticas) no presente modelo de LPA, provavelmente em função da disfunção
72
endógena do surfactante que propicia modificações nas propriedades tenso-ativas,
colapso alveolar e conseqüente infiltração neutrofílica (John e cols., 1982; Ware &
Mathay, 2000; Aird 2003). A grande maioria dos modelos de lesão pulmonar aguda
em animais utiliza técnicas de depleção de surfactante através de lavagem salina ou
injeção de ácido oléico (Bond e cols., 1994; Rimensberger e cols., 1999; Cakar e
cols., 2000; Van der Kloot e cols., 2000) para entender os efeitos benéficos das
manobras de recrutamento. Se por um lado esses modelos são fáceis e rápidos de
serem desenvolvidos, eles acarretam principalmente colapso alveolar por diminuição
do surfactante endógeno, não apresentando características histológicas de dano
alveolar difuso. A fisiopatologia da LPA é mais complexa, caracterizada por edema
intersticial e alveolar, hemorragia alveolar, deposição de fibrina, infiltração
neutrofílica, lesões de células do epitélio alveolar e endotélio capilar, promovendo
aumento da permeabilidade alvéolo capilar (Barbas e cols.,1996; Ware & Matthay,
2000; Souza e cols., 2003; Mendez & Hubmayr, 2005). Nesse contexto, a grande
maioria dos estudos que analisou a resposta da manobra de recrutamento e utilizou
o modelo de lavagem com salina sofreu crítica, já que tal modelo não expressa as
características fisiopatológicas da SDRA/LPA humana (Fujino e cols., 2001;
Takeuchi e cols., 2002).
A manobra de recrutamento (MR) é um processo fisiológico dinâmico que
está relacionado à reabertura das unidades alveolares após redução do volume nos
alvéolos, que ocorrem em função de: baixos níveis de PEEP, diminuição do volume
corrente, alta FiO2, repetidas aspirações traqueais bem como sedação e paralisia
dos músculos respiratórios. As MRs vêm sendo utilizadas com o objetivo de reverter
e/ou prevenir o colapso de vias aéreas distais, ductos e/ou unidades alveolares.
Atualmente, a MR mais comumente utilizada é o CPAP (pressão positiva continua na
73
via aérea), com pressão de insuflação que varia entre 30 – 40 cmH2O por 30 – 60
segundos. Essa manobra promove aumento da capacidade residual funcional,
elevando a pressão intra-alveolar ao final da expiração, permitindo, assim, melhora
nas trocas gasosas sem provocar intensa instabilidade hemodinâmica e depressão
circulatória (Bond e cols., 1994; Tusmane cols., 1999; Rimensberger e cols., 1999;
Van der Kloot e cols., 2000; Cakar col., 2000; Amato e cols., 1998; Maggiore e
cols., 2003; Tusman e cols., 2004; Farias e cols., 2005; Lapinsky e cols., 2005). No
presente estudo constatamos melhora dos parâmetros da mecânica pulmonar
(Figura 11 e 12) e da oxigenação (Tabela 2), similarmente aos observados em
outros modelos experimentais e clínicos (Bond e cols., 1994; Rimensberger e cols.,
1999; Van der Kloot e cols., 2000; Cakar e cols., 2000; Amato e cols., 1998; Yi e
cols., 2005). Ademais, observamos discreta melhora do colapso alveolar, porém não
houve redução no índice de apoptose de células epiteliais no pulmão, rim, fígado e
intestino, provavelmente em função do estresse de cisalhamento decorrente do
colapso alveolar (Dos Santos & Slutsky, 2006). A MR com CPAP também induziu
modificações ultraestruturais no parênquima pulmonar como: deterioração dos
corpos lamelares dos pneumócitos tipo II, ruptura da membrana basal e aumento no
número de miofibroblastos (Figura 15). Logo, a MR com CPAP além de perpetuar o
processo inflamatório acarretou desacoplamento da membrana basal em função do
estresse determinado pelas altas pressões de insuflação, mantendo elevada a
expressão de procolágeno tipo III (Terragni e cols., 2007), (Figura 18).
Com intuito de propiciar uma abertura de unidades alveolares mais
homogênea, sem induzir hiperdistensão e colapso alveolar, e, concomitantemente,
melhorar a oxigenação e a mecânica pulmonar (Terragni e cols., 2007; Pelosi e
cols., 1999; Borges e cols., 2006; Maisch e cols., 2008) idealizamos a manobra de
74
recrutamento com aumento progressivo da pressão inspiratória (STEP). Acreditamos
que esse aumento paulatino da pressão inspiratória até 45 cmH2O durante a MR
permitiria com que alvéolos colapsados se abrissem sem induzir imediata
hiperdistensão e conseqüente estresse tensil nas unidades alveolares de alta
complacência e grande constante de tempo. Ademais, o STEP durante 20 minutos
propiciaria com que os alvéolos com menor complacência se abrissem lentamente.
Um nível de PEEP em 15 cmH2O foi associada a MR com STEP com o intuito de
evitar o desrecrutamento promovendo estabilização das unidades alveolares
(Albaiceta e cols., 2005; Erlandsson e cols., 2006), reduzindo o estresse de
cisalhamento associado ao colapso. Esse nível de PEEP foi previamente estudado
em outros estudos experimentais (Marini e cols.,2007; Carvalhos e cols., 2007;
Rouby e cols., 2007) e clínicos. Nesse contexto, o ARDSNET constatou que o nível
médio de PEEP utilizado para obter uma boa oxigenação nos pacientes com SDRA
foi de 15 cmH2O (ARDSNET 2000; Kallet e cols., 2005). Malboisson e colaboradores
também constataram através de análise com tomografia computadorizada, que a
aplicação de PEEP de 15 cmH2O em pacientes com SDRA, acarretava aumento na
CRF, da PaO2 e redução do shunt intrapulmonar (Malboisson e cols.,2005). Poucos
artigos analisaram as conseqüências de altos níveis de PEEP (entre 20 e 50 cmH2O)
e, apesar de terem constatado recrutamento efetivo, altos níveis de PEEP acarretam
efeitos prejudiciais tais como: hiperdistensão, podendo ocasionar até barotrauma, e
distúrbios hemodinâmicos com queda do débito cardíaco (sendo necessário o uso
de drogas vasoativas e reposição de fluidos (Borges e cols., 2006; Toh e cols.,
2007).
A MR com STEP acarretou melhora na elastância, pressões resistivas e
viscoelásticas pulmonares (Tabela 1 e Figuras 11 e 12) quando comparados com o
75
grupo LPA-NR e CPAP (p<0,001). Esse efeito benéfico pode ser atribuído a redução
das áreas de colapso após MR com STEP (Figuras 13 e 14). Complementarmente,
não foi observado desacoplamento ou ruptura da membrana alvéolo-capilar quando
o recrutamento foi realizado com STEP, sugerindo que o aumento paulatino da
pressão inspiratória propicia redução da atelectasia e preservação da membrana
alvéolo-capilar (Figura 15). Logo, a MR por STEP acarretou melhora dos parâmetros
morfo-funcionais sem conseqüências deletérias locais e sistêmicas.
Após MR com CPAP ou STEP utilizou-se estratégia ventilatória protetora (VT
= 6 ml/kg) e PEEP de 5 cmH2O. Esse nível de PEEP foi previamente estudado por
Farias e colaboradores que constataram que a manobra de CPAP seguida de ZEEP
induzia aumento da expressão de procolágeno tipo III, e quando mantido a PEEP de
5 cmH2O não mostrou modificação do PCIII. Entretanto, não podemos descartar se o
efeito na melhora histológica seria maior caso a PEEP utilizada fosse mais elevada.
Interessante ressaltar que além das modificações respiratórias foi constatado
aumento no índice de apoptose de células epiteliais de pulmão, rim, fígado e
intestino tanto no grupo LPA como LPA-CPAP. Essas alterações podem ser
atribuídas: 1) dano alveolar difuso acarretando lesão pulmonar e em órgãos a
distância, 2) o grupo LPA foi ventilado com 6 ml/kg que induz colapso alveolar
induzindo estresse de cisalhamento (Hammerschmidt e cols., 2004), 3) a MR com
CPAP acarreta estresse tensil em função do rápido aumento da pressão num tempo
curto e estresse de cisalhamento por não abrir todas as unidades alveolares
perpetuando áreas de colapso alveolar. Logo, a associação de estresses tensil e/ou
de cisalhamento induziria reação inflamatória e conseqüente indução de apoptose
em células epiteliais do pulmão e de órgãos a distância (Tremblay & Slutsky, 1998;
Dos Santos e cols., 2006). Nesse contexto, estudos clínicos e experimentais
76
demonstraram que estratégias ventilatórias lesivas podem iniciar ou perpetuar uma
resposta inflamatória local e sistêmica, que, por sua vez, pode contribuir
significativamente para falência de múltiplos órgãos e sistemas (FMOS) (Tremblay &
Slutsky, 1998; Ranieri e cols., 1999; Imai e col., 2003; Galiatsou- e cols., 2007).
Logo, mediadores inflamatórios originados do pulmão cruzam a barreira alvéolo-
capilar danificada e acessam a circulação, onde eles exercem os efeitos
potencialmente deletérios. (Imai e cols., 1994; Takata e cols., 1997; Imai e cols.,
1999; 2003, Matute-Belo e cols. 1999, 2001, Martin e cols., 2005, Galiatsou e cols.,
2007). Imai e colaboradores constataram que a ventilação lesiva acarretava
apoptose do epitélio alveolar e de órgãos a distância em função do estresse
biomecânico. Quando aplicado à manobra de recrutamento STEP, observou-se uma
distribuição alveolar mais homogenea, com menor porcentagem de alvéolos
colapsados, evitando assim o estresse de cisalhamento e o estresse tensil
(Hammerschmidt e cols., 2004, Galiatsou e cols., 2007).
O estresse induzido pela ventilação com pressão positiva, a abertura e colapso
cíclicos, dos alvéolos, e uma PEEP inadequada, perpetua este processo ciclo a
ciclo. Assim, o mecanismo de estresse tem inúmeros efeitos, como: lesão epitelial e
endotelial, lesão celular inflamatória e liberação de citocinas (Dos Santos e Slutsky,
2000, 2006; Ranieri e cols., 1999). Essas modificações decorrem do mecanismo de
mecanotransdução que representa a conversão de estímulos mecânicos em
alterações bioquímicas e biomoleculares (Dos Santos & Slutsky, 2000; Garcia e
cols., 2005;2006; Dos Santos & Slutsky, 2006). Forças mecânicas são percebidas
pelas células (sensor mecânico) e convertidas em sinais bioquímicos e biológicos
que causam mudanças na expressão gênica e no metabolismo da célula (Dos
Santos & Slutsky, 2000; Garcia e cols., 2005; 2006; Fredberg & Kamm, 2006). A
77
ação sinérgica dos estresses de cisalhamento e tensil pode regular a expressão de
RNAm para procolágeno do tipo III no tecido pulmonar nos grupos LPA e LPA-
CPAP. O presente estudo evidenciou baixa expressão de RNAm para procolágeno
do tipo III provavelmente em função das baixas pressões transpulmonares atingidas
na MR com STEP, melhora da oxigenação e menor estresse ao parênquima
pulmonar (Suki e cols., 2005), (Figura 18). Nesse contexto, Carvalho e cols., 2007
em um estudo experimental observou aumento da expressão de PC III na região
não-dependente com estratégia ventilatória que promoviam hiperdistensão alveolar
(alto VT associado à baixa PEEP), no presente estudo não observamos alvéolos
hiperinsuflados no grupo LPA-CPAP e STEP, entretanto, observamos um
parênquima pulmonar mais heterogêneo no grupo LPA-CPAP, diferentemente do
grupo STEP (Figura 14), podendo assim justificar o aumento no PCIII no grupo LPA-
CPAP (Deheinzelin e cols., 1997; Carvalho e cols., 2007).
Limitações
Vale ressaltar que cada paciente tem sua particularidade em relação a cada
tratamento e que a extrapolação desse estudo experimental para humana requer
ainda uma segunda fase de análise, não permitindo que a estratégia de
recrutamento progressiva seja diretamente extrapolada ao cenário clínico. O estudo
atual tem diversas limitações: 1) os modelos experimentais de lesão pulmonar aguda
foram induzidos pela injeção intraperitoneal de paraquat. Assim, nós não sabemos
se estes resultados podem ser reproduzidos em outros modelos experimentais de
LPA; 2) tempo limitado da avaliação, apenas 1 hora após MR com estratégia
ventilatória protetora. Logo, talvez esse efeito benéfico da MR por STEP não
perduraria após 1 hora; 3) o uso de somente um tipo de MR (CPAP de 40 cmH2O
78
por 40 segundos) para ser comparada, apesar de ser a mais freqüentemente
utilizada na prática clínica.
79
8.0 Conclusão
A estratégia de recrutamento com aumento progressivo das pressões
inspiratórias induziu níveis de pressões transpulmonares suficientes para abrir as
unidades alveolares colapsadas evitando o estresse de cisalhamento e sem causar
hiperdistensão alveolar. Tal fato acarretou redução da expressão de procolágeno
tipo III e redução nos níveis de apoptose no pulmão, fígado, rim e intestino. Portanto,
a MR com STEP pode reduzir a extensão da lesão pulmonar aguda em modelo
animal de LPA no que tange os parâmetros morfo-funcionais, moleculares e de
oxigenação.
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