Manual de Bancada PDF Unificado Elisa Set2010

Anti HBc Ref. 414

Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos totais contra o antígeno core do vírus da hepatite B (anti-HBc) em soro ou plasma. ELISA - Competição PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM

A Solução de Lavagem deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 mL da Solução de Lavagem concentrada (no 3) a 450 mL de água. Estável 2 semanas entre 2 – 8 °C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo:

Nº Tiras requeridas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Solução Lavagem Concentrada (mL)

4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44

Água purificada (mL)

36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396

PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do uso)

O reagente Cromógeno (no 5) congela a temperatura ≤18 °C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20 - 25 °C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,28 mL do Cromógeno (no 5) diretamente no frasco de Tampão Substrato (no 4) que contém 14 mL e homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tampão Substrato (mL)

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22

VALIDAÇÃO DO ENSAIO

As absorbâncias devem ser consideradas após subtração do branco de substrato. O não cumprimento de qualquer destes critérios INVALIDA o ensaio analítico.

Branco do Substrato Absorbância ≤ 0,100

Controle Negativo Cada replicata não deve variar mais que 20% da média das quatro replicatas. A média das absorbâncias deve ser ≥ 0,600.

Controle Positivo A média das absorbâncias deve ser ≤ 0,100

RESULTADOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo e do Controle Positivo. Somar as duas médias e multiplicar o resultado por 0,4. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = ( x CN + x CP) X 0,4

2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off.

3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva < 0,90 Não Reativa ou Negativa ≥ 1,10 Inconclusiva ≥ 0,90 e < 1,10

1

2

Anti HBc PROCEDIMENTO

1 Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato.

2

Transferir 0,05 mL do Controle Positivo (2 replicatas), Controle Negativo (4 replicatas) e amostras aos poços correspondentes.

3 Adicionar 0,05 mL de Conjugado (no 2) em todos os poços, exceto ao poço reservado para o Branco de Substrato.

4 Cobrir a placa com uma folha adesiva, agitar delicadamente e incubar a 37 °C por 60 minutos.

5

Retirar e descartar a folha adesiva.

Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 mL) com a Solução de Lavagem diluída.

Repetir o processo de aspiração e lavagem mais 3 vezes, perfazendo um total de 4 ciclos de lavagem.

Manter a solução de lavagem nos poços por pelo menos 15 segundos antes de cada ciclo de aspiração.

Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido

6 Adicionar 0,1 mL da Solução Substrato-Cromógeno diluída em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato.

7 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20 - 25 ºC) e ao abrigo da luz.

8 Adicionar 0,1 mL da Solução de Parada (no 8) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e os mesmos intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno.

9 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos. Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de 620 - 630 nm.

ORIENTAÇÕES

Ler as instruções de uso do produto.

Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de iniciar o ensaio.

Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso.

Realizar as leituras no prazo máximo de 30 minutos após a adição da Solução Substrato-Cromógeno.

Caso a leitora não permita o ajuste do zero com o Branco do Substrato, é necessário subtrair seu valor das absorbâncias das amostras e controles.

Anti HBc IgM Ref. 415 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos IgM contra o antígeno core do vírus da hepatite B (anti-HBc IgM) em soro ou plasma.

ELISA – Imunocaptura PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM

A Solução de Lavagem Concentrada (no 5) deve ser diluída 1:25 com água deionizada. Adicionar 40 mL da Solução de Lavagem Concentrada a 960 mL de água. Estável 1 semana entre 2 – 8 °C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37


168 240 312 384 456 528 600 672 744 816 888

PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do Uso)

O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:50 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 0,24 mL do Conjugado Concentrado a 11,76 mL do Diluente de Conjugado. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Diluente Conjugado (mL)

0,98 1,96 2,94 3,92 4,90 5,88 6,86 7,84 8,82 9,80 10,78

Conjugado Concentrado (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22

DILUIÇÃO DAS AMOSTRAS

As amostras devem ser diluídas 1/4000 antes de iniciar o ensaio. Colocar 0,99 mL de Diluente de Amostras (no 4) em um tubo. Adicionar 0,01 mL de amostra e homogeneizar bem. Em outro tubo adicionar 0,39 mL de Diluente de Amostras (no 4). Adicionar 0,01 mL da diluição do 1º tubo. Homogeneizar bem. O fator de diluição no 2º tubo será 1/4000.

NÃO DILUIR O CALIBRADOR E OS CONTROLES. ELES ESTÃO PRONTOS PARA USO. VALIDAÇÃO DO ENSAIO


Branco do substrato Absorbância ≤ 0,150

Calibrador

A absorbância de cada replicata deve ser < 0,120. Se uma replicata se encontrar fora deste intervalo, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora deste intervalo, o teste deve ser repetido. A média das absorbâncias deve ser < 0,120.

Controle Negativo Absorbância < 0,120 Controle Positivo Absorbância entre 0,500 e 2,500 C. Positivo – C. Negativo > 0,450

RESULTADOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador e somar 0,200. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador + 0,200


3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva ≥ 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva ≥ 0,90 e < 1,10

Anti HBc IgM PROCEDIMENTO

1

Deixar um poço vazio para o Branco do Substrato.

2 Adicionar 0,1 mL do Controle Positivo e Controle Negativo (1 replicata de cada), Calibrador (3 replicatas) e as amostras diluídas aos poços correspondentes. O Calibrador e os Controles estão prontos para uso.


4





Após a última lavagem, golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar o excesso de líquido.

5 Adicionar 0,1 mL do Conjugado diluído a cada poço, exceto ao poço reservado ao Branco de Substrato. Evitar a formação de bolhas.

6 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar 60 minutos à 37 ºC.

7 Ao final da incubação, retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo 4.

8 Adicionar 0,1 mL da Solução Substrato-Cromógeno (no 6) em todos os poços, inclusive no poço reservado para o Branco de Substrato.

9 Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente ( 20 a 25 °C) e ao abrigo da luz.

10 Parar a reação adicionando 0,1 mL da Solução de Parada (no 10) em cada poço, respeitando a mesma sequencia e intervalos de tempo observados na adição da Solução Substrato-Cromógeno.


ORIENTAÇÕES






Anti HBe Ref. 417 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos específicos contra o antígeno “e” do vírus da hepatite B (anti-HBe) em soro ou plasma.

ELISA - Competição PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM

A Solução de Lavagem Concentrada (no 6) deve ser diluída 1:25 com água deionizada. Adicionar 40 mL da Solução de Lavagem Concentrada a 960 mL de água. Estável 1 semana entre 2 - 8 °C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33


72 144 216 288 360 432 504 576 648 720 792

PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do Uso)

O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:50 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 0,24 mL do Conjugado Concentrado a 11,76 mL do Diluente de Conjugado. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Diluente Conjugado (mL)

0,98 1,96 2,94 3,92 4,90 5,88 6,86 7,84 8,82 9,80 10,78

Conjugado Concentrado (mL) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22




Calibrador A absorbância de cada replicata deve estar entre 0,500 e 2,500. Se uma replicata se encontrar fora deste intervalo, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora deste intervalo, o teste deve ser repetido.

Controle Negativo Absorbância entre 0,500 e 2,500. Controle Positivo Absorbância entre 0,050 e 0,300. C. Negativo – C. Positivo > 0,250

RESULTADOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador e multiplicar por 0,5. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador x 0,5


3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva < 0,90 Não Reativa ou Negativa ≥ 1,10 Inconclusiva ≥ 0,90 e < 1,10

Anti HBe PROCEDIMENTO 1


2

Transferir 0,05 mL do de Tampão de Incubação (no 4) a todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de Substrato.

3 Adicionar 0,05 mL do Controle Positivo e Controle Negativo (1 replicata de cada), Calibrador (3 replicatas) e amostras aos poços correspondentes.

4

Adicionar 0,05 mL de Solução Neutralizante (no 5) a todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco do Substrato.


6

Retirar e descartar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos poços e enchê-los completamente (± 0,350 mL) com a Solução de Lavagem diluída.




7

Adicionar 0,1 mL do Conjugado diluído a cada poço, exceto ao poço reservado ao Branco do Substrato. Evitar a formação de bolhas.

8 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar 60 minutos à 37 ºC.


10

Adicionar 0,1 mL da Solução Substrato-Cromógeno (no 7) em todos os poços, inclusive no poço reservado para o Branco de Substrato.

11 Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente ( 20 a 25 °C) e ao abrigo da luz.

12

Parar a reação adicionando 0,1 mL da Solução de Parada (no 11) em cada poço, respeitando a mesma sequencia e intervalos de tempo observados na adição da Solução Substrato-Cromógeno.


ORIENTAÇÕES






Anti HBs Ref. 413 Sistema para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos específicos contra o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (anti-HBs) em soro ou plasma.

ELISA – Sanduíche (Ag-Ac-Ag) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM

A Solução de Lavagem Concentrada (no 3) deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 mL da Solução de Lavagem Concentrada a 450 mL de água. Estável 2 semanas entre 2 – 8 °C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44


36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396

PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do Uso)

O reagente Cromógeno (no 5) congela a temperatura ≤18 °C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20 - 25 °C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Adicionar 0,28 mL do Cromógeno (no 5) diretamente ao frasco de Tampão Substrato (no 4) que contém 14 mL e homogeneizar bem. A solução para uso é rósea e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22

VALIDAÇÃO DO ENSAIO (O ensaio será considerado válido apenas se cumprir os critérios abaixo):


Branco do Substrato Absorbância ≤ 0,100 Controle Negativo Absorbância < 0,100

Calibrador Positivo Baixo Absorbância > 0,070 Deve também ser maior que o dobro da média do Controle Negativo.

Calibrador Positivo Alto Absorbância entre 0,800 e 2,100 RESULTADOS QUALITATIVOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = média Calibrador Positivo Baixo


3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva ≥ 1,10 Não Reativa ou Negativa < 0,90 Inconclusiva ≥ 0,90 e < 1,10 RESULTADOS QUANTITATIVOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo. A concentração de anti-HBs é Zero.

2- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. A concentração de anti-HBs é de 10 mUI/mL.

3- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Alto. A concentração de anti-HBs é de 100 mUI/mL.

4- Representar em uma folha de papel milimetrado, as médias das absorbâncias dos calibradores e controle na ordenada (eixo y) contra suas respectivas concentrações em mUI/mL na abscissa (eixo x).

5- Traçar uma linha passando pelos 3 pontos.

6- Utilizando o gráfico é possível encontrar as concentrações das amostras a partir de suas absorbâncias.

Para facilitar os cálculos, utilizar a planilha: anti-HBs – RESULTADOS QUANTITATIVOS, disponível em www.labtest.com.br.

http://www.labtest.com.br/

Anti HBs PROCEDIMENTO 1


2

Transferir 0,1 mL do Controle Negativo, Calibrador Positivo Baixo, Calibrador Positivo Alto (2 replicatas de cada) e amostras aos poços correspondentes.


4






5

Adicionar 0,1 mL do Conjugado (no 2) em todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de Substrato.

6 Cobrir a placa com uma folha adesiva e incubar a 37 °C por 30 minutos.

7

Adicionar 0,1 mL da Solução Substrato-Cromógeno diluída em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato.




ORIENTAÇÕES






CHAGAS Ref. 421 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos totais específicos anti-Trypanosoma cruzi em soro ou plasma.

ELISA – Indireto (Ag-Ac-Ac) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM

A Solução de Lavagem Concentrada deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 mL da Solução de Lavagem concentrada (no 5) a 450 mL de água. Estável 2 semanas entre 2 – 8 °C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44


36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396 PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do uso)

O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 3,0 mL de Conjugado Concentrado ao frasco que contém 15 mL de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. Preparar no momento do uso. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Diluente de Conjugado (mL)

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0


0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do Uso)

O reagente Cromógeno (no 7) congela a temperatura ≤18 °C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20 - 25 °C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,28 mL do Cromógeno (no 7) diretamente no frasco de Tampão Substrato (no 4) que contem 14 mL e homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22




Controle Negativo A absorbância de cada replicata deve ser ≤ 0,200. Se uma replicata se encontrar fora dessa margem, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora dessa margem, o teste deverá ser repetido.

Controle Positivo A média das absorbâncias deve ser ≥ 0,600

RESULTADOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo e somar 0,300. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x CN + 0,300



CHAGAS PROCEDIMENTO


2

Transferir 0,2 mL do Controle Positivo (2 replicatas) e Controle Negativo (3 replicatas) aos poços correspondentes. Não diluir os controles, pois estão prontos para uso.

3 Adicionar 0,2 mL de Diluente de Amostras (no 4) aos poços correspondentes.

Adicionar 0,01 mL de amostra em cada poço de amostra.


5






6 Adicionar 0,1 mL do Conjugado diluído em todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de Substrato. Evitar a formação de bolhas.

7 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar a 37 ºC por 30 minutos.

8 Ao final da incubação retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo 5.

9 Adicionar 0,1 mL da Solução substrato-Cromógeno diluído em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato.

10 Incubar 30 minutos à temperatura ambiente (20 a 25 °C) e ao abrigo da luz.

11 Adicionar 0,1 mL da Solução de Parada (no 10) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno.


ORIENTAÇÕES






CMV IgG Ref. 406 Sistema para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos IgG específicos anti-CMV em soro ou plasma.



Nº Tiras requeridas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Solução Lavagem Concentrada (mL) 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Água purificada (mL) 36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396

DILUIÇÃO DO CONJUGADO CONCENTRADO (Preparar no momento do Uso)

Diluir o Conjugado Concentrado (no 2) 1/51 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 0,3 mL de Conjugado Concentrado ao frasco que contém 15 mL de Diluente do Conjugado. Homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo: 2

Nº Tiras requeridas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Diluente do Conjugado (mL) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Conjugado Concentrado (mL) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22


O reagente Cromógeno (no 7) congela a temperatura ≤18 °C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20 - 25 °C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Adicionar 0,28 mL do Cromógeno (no 7) diretamente no frasco de Tampão Substrato (no 6) que contém 14 mL e homogeneizar bem. Preparar 10 minutos antes do Uso. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:

Nº Tiras requeridas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tampão Substrato (mL) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Cromógeno (mL) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22


Preparar diluições 1/101 dos Calibradores (no 8 e 9), Controle Negativo (no 10) e amostras.

Exemplo: Pipetar 1,0 mL do Diluente de Amostras (no 4) em um tubo e adicionar 0,01 mL de soro. Homogeneizar suavemente. ORIENTAÇÕES






CMV IgG VALIDAÇÃO DO ENSAIO


Branco do substrato Absorbância ≤ 0,100 Controle Negativo Absorbância < 0,100 Calibrador Positivo Baixo Absorbância ≥ 0,150 Calibrador Positivo Alto Absorbância ≥ 0,600 Relação Calibrador Positivo Alto / Calibrador Positivo Baixo ≥ 2,0 Relação Controle Negativo / Calibrador Positivo baixo ≤ 0,5

RESULTADOS QUALITATIVOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador Positivo Baixo



RESULTADOS QUANTITATIVOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. A concentração de IgG anti-CMV é de 0,25 UI/mL.

2- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Alto. A concentração de IgG anti-CMV é de 2,5 UI/mL.

3- Representar em folha de papel semi-logaritmico, as médias das absorbâncias dos calibradores na ordenada (eixo y, linear), contra suas respectivas concentrações em UI/mL na abscissa (eixo x, log).

4- traçar uma linha passando pelos 2 pontos.

5- Utilizando o gráfico é possível encontrar as concentrações das amostras a partir de sua absorbância. Para facilitar os cálculos dos resultados quantitativos, utilizar planilha: CMV – IgG – RESULTADOS QUANTITATIVOS, disponível em www.labtest.com.br.


CMV IgG PROCEDIMENTO 1


2

Transferir 0,1 mL do Calibrador Positivo Baixo, Calibrador Positivo Alto e Controle Negativo (2 replicatas de cada) e amostras aos poços correspondentes. Diluir Calibradores, Controle e amostras conforme orientação.


4






5

Adicionar 0,1 mL do Conjugado diluído em todos os poços, exceto no poço reservado ao Branco de Substrato. Evitar a formação de bolhas.

6 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar a 37 °C por 30 minutos.


8





CMV IgM Ref. 407 Sistema para a determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos IgM específicos anti-CMV em soro ou plasma.

ELISA – Sanduíche-Imunocaptura (Ac-Ac-Ag) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM


Nº Tiras requeridas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Solução Lavagem Concentrada (mL) 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Água purificada (mL) 36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396

DILUIÇÃO DO CONJUGADO CONCENTRADO E CONTROLE DE ANTÍGENO (Preparar no momento do Uso)

Diluir o Conjugado Concentrado (no 2) e o Controle de Antígeno (no 3) 1/101 com o Tampão Diluente (no 4). Adicionar 0,12 mL de Conjugado Concentrado mais 0,12 mL do Controle de Antígeno e 12 mL do Tampão Diluente. Homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:

Nº Tiras requeridas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tampão Diluente (mL) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 Conjugado Concentrado (mL) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,12 Controle de Antígeno (mL) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,12


O reagente Cromógeno (no 7) congela a temperatura ≤18 °C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20 - 25 °C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Adicionar 1,2 mL do Cromógeno (no 7) a 10,8 mL do Tampão Substrato (no 6). Homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:

Nº Tiras requeridas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tampão Substrato (mL) 0,9 1,8 2,7 3,6 4,5 5,4 6,3 7,2 8,1 9,0 9,9 Cromógeno (mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1


Preparar diluições 1/101 das amostras. Exemplo: Em um tubo pipetar 1,0 mL do Tampão Diluente (no 4) e adicionar 0,01 mL da amostra. Homogeneizar suavemente. Não diluir os Controles (no 8, 9 e 10) pois estão prontos para uso. ORIENTAÇÕES






CMV IgM VALIDAÇÃO DO ENSAIO



Controle Positivo Baixo A absorbância de cada replicata não deve variar mais do que 25% em relação à média das 4 absorbâncias. A média deve ser entre 0,200 e 0,600.

Relação Controle Positivo Alto/Controle Positivo Baixo > 3,0 Relação Controle Negativo/Controle Positivo Baixo < 0,7


1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Positivo Baixo. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle Positivo Baixo



RESULTADOS SEMI-QUANTITATIVOS

1- Calcular o valor do Cut-off como descrito anteriormente.

2- Calcular a concentração das IgM em Unidades Arbitrárias (UA/mL) dividindo a absorbância da amostra pelo valor do Cut-off e multiplicando o resultado por 10. UA/mL = absorbância da amostra / Cut-off x 10 3- Resultados: Amostra Relação Absorbância / Cut-off Reativa ou Positiva ≥ 11 Não Reativa ou Negativa < 9 Inconclusiva ≥ 9 e < 11

CMV IgM PROCEDIMENTO 1


2

Transferir 0,1 mL do Controle Positivo Alto, Controle Negativo (2 replicatas de cada), Controle Positivo Baixo (4 replicatas) e amostras diluídas aos poços correspondentes.


4






5

Adicionar 0,1 mL do Conjugado diluído em todos os poços, exceto no poço reservado ao Branco de Substrato. Evitar a formação de bolhas.

6 Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar a 37 °C por 60 minutos.


8





HBeAg Ref. 416 Sistema para a determinação qualitativa do antígeno “e” do vírus da hepatite B (HBeAg) em soro ou plasma.

ELISA – Sanduiche (Ac-Ag-Ac) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM

A Solução de Lavagem Concentrada deve ser diluída 1:25 com água deionizada. Adicionar 40 mL da Solução de Lavagem concentrada (no 5) a 960 mL de água. Estável 1 semana entre 2 – 8 °C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33


72 144 216 288 360 432 504 576 648 720 792

PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do uso)

O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:50 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 0,24 mL de Conjugado Concentrado a 11,76 mL de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


0,98 1,96 2,94 3,92 4,90 5,88 6,86 7,84 8,82 9,80 10,78


0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22




Caibrador

A absorbância de cada replicata deve ser < 0,120. Se uma replicata se encontrar fora dessa margem, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora dessa margem, o teste deverá ser repetido.

Controle Negativo Absorbância < 0,120 Controle Positivo Absorbância entre 0,500 e 2,500 Controle Positivo - Controle Negativo > 0,450

RESULTADOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador e somar 0,060. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador + 0,060



HBeAg PROCEDIMENTO


2 Transferir 0,05 mL do Tampão de Incubação (no 4) a todos os poços, exceto ao poço reservado para o Branco de Substrato.

3 Adicionar 0,1 mL do Controle Positivo Alto, Controle Positivo Baixo (1 replicata de cada), Calibrador (3 replicatas) e amostras aos poços correspondentes.


5









9 Adicionar 0,1 mL da Solução substrato-Cromógeno (no 6) em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato.


11 Adicionar 0,1 mL da Solução de Parada (no 10) a todos os poços, respeitando a mesma sequência e intervalos de tempo da adição da solução Substrato-Cromógeno


ORIENTAÇÕES






HBsAg Ref. 412 Sistema para a determinação qualitativa do antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) em soro ou plasma.

ELISA – Sanduiche (Ac-Ag-Ac) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM

A Solução de Lavagem Concentrada deve ser diluída 1:10 com água deionizada. Adicionar 50 mL da Solução de Lavagem Concentrada (no 4) a 450 mL de água. Estável 2 semanas entre 2 – 8 °C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44


36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396 PREPARO DO CONJUGADO (preparar no momento do uso)

O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 0,24 mL de Conjugado Concentrado a 12 mL de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. Preparar no momento do uso. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0


0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (preparar 10 minutos antes do uso)

O reagente Cromógeno (no 6) congela a temperatura ≤18 °C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20 - 25 °C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,28 mL do Cromógeno (no 6) diretamente no frasco de Tampão Substrato (no 5) que contem 14 mL e homogeneizar bem. A solução para uso é rósea e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 VALIDAÇÃO DO ENSAIO



Controle Negativo

A média das absorbâncias deve ser < 0,120 A absorbância de cada replicata deve ser maior do que a média das absorbâncias vezes 0,5. ( x CN x 0,5). Se uma replicata se encontrar fora dessa margem, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se duas replicatas se encontrarem fora dessa margem, o teste deverá ser repetido.

Controle Positivo Absorbância ≥ 0,700 RESULTADOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo e somar 0,040. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle negativo + 0,040



HBsAg PROCEDIMENTO


2 Transferir 0,1 mL do Controle Positivo (1 replicata), Controle Negativo (3 replicatas) e amostras aos poços correspondentes.


4













ORIENTAÇÕES






HCV Ref. 418 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos totais específicos contra o vírus da hepatite C (HCV) em soro ou plasma. ELISA – Indireto (Ag-Ac-Ac) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44


36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396


O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 0,3 mL de Conjugado Concentrado ao frasco que contém 15 mL de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. Preparar no momento do uso. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0


0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do Uso)

O reagente Cromógeno (no 7) congela a temperatura ≤18 °C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20 - 25 °C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,28 mL do Cromógeno (no 7) diretamente no frasco de Tampão Substrato (no 4) que contem 14 mL e homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 VALIDAÇÃO DO ENSAIO (O ensaio será considerado válido apenas se cumprir os critérios abaixo):



Controle Positivo Baixo Cada absorbância não deve variar mais do que 30% em relação à média das absorbâncias. A média das absorbâncias deve ser ≥ 0,200

Controle Positivo Alto Absorbância ≥ 0,800 Relação Controle Positivo Alto / Controle Positivo Baixo > 2,5 Relação Controle Negativo / Controle Positivo Baixo < 0,5

RESULTADOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Positivo Baixo e multiplicar por 0,9. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle Positivo Baixo x 0,90



HCV PROCEDIMENTO


2

Transferir 0,2 mL do Controle Positivo Alto, Controle Positivo Baixo e Controle Negativo (2 replicatas de cada) aos poços correspondentes. Não diluir os controles, pois estão prontos para uso.

3 Adicionar 0,2 mL de Diluente de Amostras (no 4) aos poços correspondentes para as amostras. Adicionar 0,01 mL de amostra em cada poço de amostra.


5









9 Adicionar 0,1 mL da Solução substrato-Cromógeno diluído em todos os poços, inclusive no poço reservado ao Branco de Substrato.



12 Ajustar o zero da leitora com o poço reservado ao Branco de Substrato em 450 nm e medir a absorbância em cada um dos poços no prazo máximo de 30 minutos Recomenda-se realizar leitura bicromática utilizando filtro secundário de 620 - 630 nm.

ORIENTAÇÕES






HIV-1+2 Ref. 419 Sistema para a determinação qualitativa de anticorpos contra HIV-1, HIV-2 e subtipo O em soro ou plasma. ELISA – Sanduiche (Ag-Ac-Ag) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM

A Solução de Lavagem Concentrada deve ser diluída 1:20 com água deionizada. Adicionar 50 mL da Solução de Lavagem Concentrada (no 5) a 950 mL de água. Estável 1 semana entre 2 – 8 °C. Para preparar volumes menores seguir a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44


76 152 228 304 380 456 532 608 684 760 836 PREPARO DO CONJUGADO (Preparar no momento do uso)

O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 0,24 mL de Conjugado Concentrado a 12 mL de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0


0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO-CROMÓGENO (Preparar 10 minutos antes do uso)

O reagente Cromógeno (no 7) congela a temperatura ≤18 °C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20 - 25 °C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,12 mL do Cromógeno (no 7) a 12 mL de Tampão Substrato (no 6) e homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume necessário, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 VALIDAÇÃO DO ENSAIO



Controle Negativo

A média das absorbâncias deve ser < 0,150 A absorbância de cada replicata deve ser maior do que a média das absorbâncias x 0,5 >( x CN x 0,5) e menor ou igual à média das absorbâncias vezes 1,5 (≤ x CN x 1,5). Se uma replicata se encontrar fora dessa margem, deve-se descartá-la e calcular a média com os outros 2 valores. Se 2 replicatas se encontrarem fora dessa margem, o teste deverá ser repetido.

Controle Positivo HIV-1 Absorbância maior ou igual à média do Controle Negativo + 0,700 ≥ ( x CP1 ≥ x CN + 0,700)

Controle Positivo HIV-2 Absorbância maior que o Cut-off. RESULTADOS

1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Negativo e somar 0,250. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle Negativo + 0,250



HIV-1+2 PROCEDIMENTO


2

Transferir 0,1 mL de Diluente de Amostras para todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de Substrato.

3 Adicionar 0,05 mL do Controle Positivo HIV-1 (2 replicatas), Controle Positivo HIV-2 (1 replicata), Controle Negativo (3 replicatas) e amostras aos poços correspondentes.


5













ORIENTAÇÕES






Rubéola IgG Ref. 401 Sistema para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos IgG específicos anti-rubéola em soro ou plasma.




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44


36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396


O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 0,3 mL de Conjugado Concentrado ao frasco que contém 15 mL de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0


0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22


O reagente Cromógeno (no 7) congela a temperatura ≤18 °C. Deixar atingir a temperatura ambiente (20 - 25 °C) para que descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. Preparar 10 minutos antes do uso. Adicionar 0,28 mL do Cromógeno (no 7) ao frasco que contém 14 mL de Tampão Substrato (no 6) e homogeneizar bem. A solução para uso é incolor e deve ser mantida em recipiente vedado e ao abrigo da luz. Descartar caso se torne azul. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume necessário, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22


Preparar diluições 1:101 do Calibrador Positivo Baixo, Calibrador Positivo Alto, Controle Negativo e Amostras com o Diluente de Amostras (no 4).

Exemplo: Em um tubo colocar 1 mL de Diluente de Amostras e adicionar 0,01 mL de soro. Homogeneizar suavemente.

Rubéola IgG - Ref. 401 VALIDAÇÃO DO ENSAIO


Branco do Substrato Absorbância ≤ 0,100 Controle Negativo Absorbância < 0,100 Calibrador Positivo Alto Absorbância ≥ 0,600 Calibrador Positivo Baixo Absorbância ≥ 0,150 Relação Calibrador Positivo Alto / Calibrador Positivo Baixo ≥ 2,0 Relação Controle Negativo / Calibrador Positivo Baixo ≤ 0,5


1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador Positivo Baixo 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off.



1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. A concentração de IgG anti-rubéola do Calibrador Positivo Baixo é de 10 UI/mL. 2- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Alto. A concentração de IgG anti-rubéola do Calibrador Positivo Alto é de 200 UI/mL. 3- Representar em coordenadas linear-log, em folha de papel semi-logarítmico, as médias das absorbâncias dos calibradores na ordenada (eixo y, linear) contra suas respectivas concentrações em UI/mL na abscissa (eixo x, log). 4- Traçar uma linha passando pelos 2 pontos. 5- Utilizando o gráfico com a reta obtida, encontra-se a concentração das amostras a partir de suas absorbâncias. 6- Para facilitar os cálculos dos resultados quantitativos, utilizar planilha: RUBÉOLA – IgG – RESULTADOS QUANTITATIVOS, disponível em www.labtest.com.br.

ORIENTAÇÕES







Rubéola IgG PROCEDIMENTO 1


2

Transferir 0,1 mL do Controle Negativo, Calibrador Positivo Baixo e Calibrador Positivo alto (2 replicatas de cada) e amostra aos poços correspondentes. Ver item Diluição de Amostras.


4













Rubéola IgM Ref. 402 Sistema para a determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos IgM específicos anti-rubéola em soro ou plasma. ELISA – Sanduíche-Imunocaptura (Ac-Ac-Ag) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44


36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22


Preparar diluições 1:101 das Amostras com o Diluente de Amostras (no 4). Exemplo: Em um tubo colocar 1 mL de Diluente de Amostras e adicionar 0,01 mL de soro. Homogeneizar suavemente. NÃO DILUIR OS CONTROLES (no 7,8 e 9), POIS ESTÃO PRONTOS PARA USO.

Rubéola IgM - Ref. 402 VALIDAÇÃO DO ENSAIO



Controle Positivo Baixo Cada absorbância não deve variar mais que 30%em relação à média das 3 replicatas. A média das absorbâncias deve ser ≥ 0,120

Controle Positivo Alto Absorbância ≥ 0,600 Relação Controle Positivo Alto / Controle Positivo Baixo ≥ 2,5 Relação Controle Negativo / Controle Positivo Baixo ≤ 0,5


1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Positivo Baixo e multiplicar por 0,8. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle Positivo Baixo x 0,8 2-Dividir a absorbância de cada amostra pelo Cut-off.



1- Calcular o Cut-off como descrito anteriormente.

2- Calcular a concentração das IgM em Unidades Arbitrárias (UA/mL) dividindo a absorbância da amostra pelo valor do Cut-off e multiplicando o resultado por 10. UA/mL = absorbância da amostra / Cut-off x 10 3- Resultados: Amostra Resultado em UA/mL Reativa ou Positiva ≥ 11 Não Reativa ou Negativa < 9 Inconclusiva ≥ 9 e < 11

ORIENTAÇÕES






Rubéola IgM PROCEDIMENTO

1


2

Transferir 0,1 mL do Controle Negativo e Controle Positivo Alto (2 replicatas), Controle Positivo Baixo (3 replicatas) e amostras diluídas aos poços correspondentes.


4






5 Adicionar 0,1 mL do Conjugado (no 2) em todos os poços, exceto ao poço reservado ao Branco de Substrato. Evitar a formação de bolhas.







TOXO-IgG Ref. 408 Sistema para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos IgG específicos anti-toxoplasma em soro ou plasma.




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44


36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396


O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente de Conjugado (no 3). Adicionar 0,3 mL de Conjugado Concentrado ao frasco que contém 15 mL de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0


0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22


Preparar diluições 1:101 do Calibrador Positivo Baixo, Calibrador Positivo Alto, Controle Negativo e Amostras com o Diluente de Amostras (no 4). Exemplo: Em um tubo colocar 1 mL de Diluente de Amostras e adicionar 0,01 mL de soro. Homogeneizar suavemente.

TOXO-IgG Ref. 408 VALIDAÇÃO DO ENSAIO


Branco do Substrato Absorbância ≤ 0,100 Controle Negativo Absorbância < 0,100 Calibrador Positivo Alto Absorbância ≥ 0,600 Calibrador Positivo Baixo Absorbância ≥ 0,150 Relação Calibrador Positivo Alto / Calibrador Positivo Baixo ≥ 2,5 Relação Controle Negativo / Calibrador Positivo Baixo ≤ 0,5


1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Calibrador Positivo Baixo




1- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Baixo. A concentração de IgG anti-toxoplasma do Calibrador Positivo Baixo é de 10 UI/mL.

2- Calcular a média das absorbâncias do Calibrador Positivo Alto. A concentração de IgG anti-toxoplasma do Calibrador Positivo Alto é de 200 UI/mL.

3- Representar em coordenadas linear-log, em folha de papel semi-logarítmico, as médias das absorbâncias dos calibradores na ordenada (eixo y, linear) contra suas respectivas concentrações em UI/mL na abscissa (eixo x, log).

4- Traçar uma linha passando pelos 2 pontos.

5- Utilizando o gráfico com a reta obtida, encontra-se as concentrações das amostras a partir de suas absorbâncias. Para facilitar os cálculos dos resultados quantitativos, utilizar planilha: TOXO – IgG – RESULTADOS QUANTITATIVOS, disponível em www.labtest.com.br. ORIENTAÇÕES







TOXO-IgG PROCEDIMENTO

1


2

Transferir 0,1 mL do Controle Negativo, Calibrador Positivo Baixo e Calibrador Positivo alto (2 replicatas de cada) e amostra aos poços correspondentes. Ver item Diluição de Amostras.


4













TOXO-IgM Ref. 409 Sistema para determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos IgM específicos anti-toxoplasma em soro ou plasma. ELISA – Sanduíche-Imunocaptura (Ac-Ac-Ag) PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44

Água deionizada (mL)

36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 396


O Conjugado Concentrado (no 2) deve ser diluído 1:51 com o Diluente do Conjugado (no 3). Adicionar 0,3 mL de Conjugado Concentrado ao frasco que contém 15 mL de Diluente de Conjugado e homogeneizar suavemente. No caso de não utilizar uma placa completa, preparar o volume de solução necessária, de acordo com a tabela abaixo:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0


0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

Cromógeno (mL)

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22


Preparar diluições 1:101 das Amostras com o Diluente de Amostras (no 4). Exemplo: Em um tubo colocar 1 mL de Diluente de Amostras e adicionar 0,01 mL de soro. Homogeneizar suavemente. NÃO DILUIR OS CONTROLES (no 7,8 e 9), POIS ESTÃO PRONTOS PARA USO.

TOXO-IgM Ref. 409 VALIDAÇÃO DO ENSAIO



Controle Positivo Baixo Cada absorbância não deve variar mais que 30%em relação à média das 3 replicatas. A média das absorbâncias deve ser ≥ 0,200

Controle Positivo Alto Absorbância ≥ 0,600 Relação Controle Positivo Alto / Controle Positivo Baixo ≥ 1,5 Relação Controle Negativo / Controle Positivo Baixo ≤ 0,5


1- Calcular a média das absorbâncias do Controle Positivo Baixo. O valor que se obtém é o Cut-off do ensaio. Cut-off = x Controle Positivo Baixo




1- Calcular o Cut-off como descrito anteriormente.

2- Calcular a concentração das IgM em Unidades Arbitrárias (UA/mL) dividindo a absorbância da amostra pelo alor do Cut-off e multiplicando o resultado por 10. v

UA/mL = absorbância da amostra / Cut-off x 10 3- Resultados: Amostra Resultado em UA/mL Reativa ou Positiva ≥ 11 Não Reativa ou Negativa < 9 Inconclusiva ≥ 9 e < 11

ORIENTAÇÕES






TOXO-IgM PROCEDIMENTO

1


2

Transferir 0,1 mL do Controle Negativo e Controle Positivo Alto (2 replicatas), Controle Positivo Baixo (3 replicatas) e amostras diluídas aos poços correspondentes.


4













Manual de Bancada PDF Unificado Elisa Set2010

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