Manual Diagnostico Laboratorial Malaria 2ed

7/25/2019 Manual Diagnostico Laboratorial Malaria 2ed

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Ministrio da SadeSecretaria de Vigilncia em Sade

Manual de Diagnstico

Laboratorial da Malria

Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

2aedio

BRASLIA/ DF2009


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2009 Ministrio da Sade.odos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desdeque citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial.A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra de responsabi-lidade da rea tcnica.

A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser acessada na ntegra na Biblio-teca Virtual em Sade do Ministrio da Sade: http://www.saude.gov.br/bvs

Srie A. Normas e Manuais cnicos

iragem: 2aedio 2009 10.000 exemplares

Elaborao, distribuio e informaes:

MINISRIO DA SADE

Secretaria de Vigilncia em SadeEsplanada dos Ministrios, bloco G,Edifcio Sede, 1 andar, sala 134CEP: 70058-900, Braslia - DFE-mail: [email protected] page: www.saude.gov.br/svs

Elaborao:

Departamento de Vigilncia Epidemiolgica

Diretoria cnica de GestoProduo:Ncleo de Comunicao

Impresso no Brasil / Printed in Brazil

Ficha Catalogrfica

Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade.Manual de diagnstico laboratorial da malria / Ministrio da Sade,

Secretaria de Vigilncia em Sade 2. ed. Braslia : Ministrio da Sade, 2009.116 p. (Srie A. Normas e Manuais cnicos)

ISBN xxxxxxxxxx

1. Malria. 2. cnicas e procedimentos de laboratrio. 3. Vigilncia epidemiolgica.I. tulo. II. Srie.

CDU 616.9

Catalogao na fonte Coordenanao Geral de Documentao e Informao Editora MS 2009/0106

tulos para indexao:

Em ingls: Manual of Malaria Laboratory Diagnosis

Em espanhol: Manual de Diagnstico Laboratorial de Malaria


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Sumrio

APRESENTAO 5

CAPTULO1 CONSIDERAESGERAISSOBREAMALRIA 7

1.1 Ciclo biolgico do parasito no homem 10

1.2 Ciclo biolgico do parasito no mosquito 11

1.3 Transmisso da malria 14

1.4 Epidemiologia 14

1.5 Manifestaes clnicas 16

CAPTULO2 FUNDAMENTOSDODIAGNSTICOLABORATORIAL

DAMALRIA 172.1 A importncia do laboratrio no diagnstico da malria 19

2.2 Medidas de biossegurana 19

2.3 O exame microscpico 20

CAPTULO3 A PESQUISADEPLASMDIOPELAMICROSCOPIA 27

3.1 O preparo da gota espessa 29

3.2 O preparo do esfregao delgado 32

CAPTULO4 COLORAODASLMINAS 37

4.1 Preparo de corantes e diluentes 39

4.2 Tcnica de colorao das lminas 40

4.3 Avaliao da qualidade de colorao da gota espessa 42

4.4 Avaliao da qualidade de colorao doesfregao 43

CAPTULO5 CARACTERSTICASDASDIFERENTESESPCIESDEPLASMDIOSENCONTRADOSNOSANGUEPERIFRICO 45

5.1 Plasmodium falciparum 47

5.2 Plasmodium vivax 48

5.3 Plasmodium malariae 49

5.4 Plasmodium ovale 50

CAPTULO6 COLORAODASGRANULAESDESCHFFNER 51

CAPTULO7 MTODOSDEQUANTIFICAODAPARASITEMIA 577.1 Mtodo tradicional de avaliao semiquantitativa

(em cruzes) 59


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7.2 Mtodo de avaliao quantitativa pelacontagem de 100 campos microscpicos 59

7.3 Estimativa da parasitemia a partir daavaliao semiquantitativa 60

7.4 Mtodo de avaliao relativa contagemde leuccitos por campo 60

7.5 Mtodo de avaliao pelo percentual de hemciasparasitadas (utilizado apenas para esfregao delgado) 61

CAPTULO8 REGISTROSDERESULTADOSDOEXAMEMICROSCPICO 63

8.1 Resultados positivos 65

8.2 Resultados negativos 66

CAPTULO9 TESTESRPIDOSPARAODIAGNSTICODEMALRIA 679.1 Testes exclusivos para o diagnstico de P. falciparum 69

9.2 Testes que discriminam o P. falciparumdeoutras espcies 70

9.3 Diagnstico pela deteco do DNA do parasito 70

CAPTULO10 ELEMENTOSFIGURADOSNORMAISDOSANGUE 71

10.1 Eritrcitos ou hemcias (glbulos vermelhos) 73

10.2 Leuccitos (glbulos brancos) 73

10.3 Plaquetas (trombcitos) 73

10.4 Importncia da avaliao dos elementosnormais do sangue 74

REFERNCIAS 75

ANEXOS 79

Anexo A Relao de material para laboratriode malria 81

Anexo B Imagens das diferentes espcies deplasmdios em esfregao e gota espessa 83

Anexo C Doena de Chagas Aguda 104

Anexo D Normas de organizao e funcionamentodo Sistema Nacional de Laboratrios de SadePblica Sislab 108

Anexo E Relao dos Laboratrios Centraisde Sade Pblica Lacen 110

EQUIPETCNICA 116


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Apresentao

Em todo o mundo, a malria continua a ser um dos mais relevantesproblemas de sade pblica e em nosso pas tambm persiste como uma dasprincipais questes, em especial na regio Amaznica, que registra cerca de90% dos casos e onde a transmisso da doena est diretamente relacionadas condies ambientais e socioculturais. Mas na regio extra-amaznicaque a malria apresenta maior letalidade, seja devido ao diagnstico tardio,seja por manejo clnico inadequado dos casos espordicos importados dereas endmicas ou mesmo autctones em poucos estados.

A partir da descentralizao das aes de vigilncia epidemiolgica,preveno, diagnstico e controle da malria, o Ministrio da Sade vem for-talecendo o nvel local mediante o repasse de recursos financeiros e humanos,aumentando a capacidade de os estados e municpios responderem de formaoportuna e eficiente aos desafios enfrentados no controle da doena.

Como parte desse processo e objetivando contribuir na capaci-tao de novos profissionais para o diagnstico da malria, bem como

atualizar os tcnicos de laboratrios da rede de sade j envolvidos com oseu diagnstico, a Secretaria de Vigilncia em Sade (SVS), do Ministrio daSade, apresenta esteManual de diagnstico laboratorial da malria ela-borado pela Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica (CGLAB),em conjunto com a Coordenao Geral do Programa Nacional de Controleda Malria (CGPNCM).

A divulgao desta publicao visa aumentar a efetividade davigilncia epidemiolgica na regio Amaznica e prevenir a ocorrncia da

doena nas reas no-endmicas ou de baixa endemicidade. Em sua leitura,os profissionais encontraro informaes tcnicas sobre a coleta e proces-samento das amostras para diagnstico, alm de um acervo de figuras quefacilitar a identificao do parasito.

Espera-se que sua utilizao, por meio da educao continuada dosprofissionais da rede de sade pblica e privada do Pas, efetivamente contribuapara a reduo da morbimortalidade da malria.

Jarbas Barbosa da Silva JniorSecretrio de Vigilncia em Sade

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CONSIDERAESGERAISSOBREAMALRIA

Captulo

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A malria, mundialmente um dos mais srios problemas de sa-de pblica, uma doena infecciosa causada por protozorios do gneroPlasmodiume transmitida ao homem por fmeas de mosquitos do gnero

Anopheles, produzindofebre, alm de outros sintomas. Quatro espcies deplasmdio podem causar a doena: P. falciparum, P. vivax, P. malariae eP. ovale (essa, de transmisso natural apenas na frica).

A malria, importante doena parasitria h sculos apesar dasaes de controle implantadas h dcadas em muitas partes do mundo , tambm conhecida como impaludismo, febre palustre, maleita e sezo.

Dados da Organizao Mundial da Sade (OMS) mostram que seu

impacto sobre as populaes humanas continua aumentando: ocorre emmais de 90 pases, pondo em risco cerca de 40% da populao mundial estima-se que ocorram de 300 a 500 milhes de novos casos, com mdia deum milho de mortes por ano. Representa, ainda, risco elevado para viajantese migrantes, com casos importados em reas no-endmicas.

Por esses motivos, a OMS recomenda que seu diagnstico precoce etratamento rpido devem ser os primeiros elementos bsicos estabelecidos emqualquer programa de controle.

No Brasil, o maior nmero de casos registrado na regio Amaz-nica, cujas condies ambientais e socioculturais favorecem a expanso desua transmisso.

Em 2003, 407.691 casos da doena foram notificados na Amaz-nia Legal (diviso poltica do territrio nacional que engloba nove esta-dos: Amaznia, Acre, Amap, Maranho, Mato Grosso, Par, Rondnia,Roraima e ocantins). Pela intensidade da transmisso destacaram-se os

estados do Amazonas, Rondnia e Par, responsveis por 50% da totali-dade dos casos de malria no pas, com uma incidncia parasitria anual,respectivamente, de 46,3/1.000 habitantes, 64,4/1.000 habitantes e 17,6/1.000habitantes. Em toda a Amaznia, as infeces causadas pelo P. vivax (79%)prevaleceram sobre as do P. falciparum (21%).

Desde 1993, por recomendao da Conferncia Ministerial de Amsterd(outubro, 1992), o Brasil utiliza a Estratgia Global de Controle Integrado daMalria uma ao conjunta e permanente do governo e da sociedade, dirigi-da para a eliminao ou reduo do risco de adoecer ou morrer de malria.

Essa estratgia objetiva diminuir a morbimortalidade e reduzir as per-das sociais e econmicas provocadas pela malria, mediante o fortalecimen-

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to dos nveis regional e local de ateno sade. Esses objetivos devero seralcanados pelo diagnstico precoce e preciso e tratamento imediato e eficazdos casos. Para tanto, deve-se aproveitar o pessoal tcnico existente na rede de

sade suficientemente treinado e as instalaes disponveis nos servios desade locais (pblicos e privados), de modo que cada unidade seja um pontode vigilncia e atendimento malria.

radicionalmente, o diagnstico da doena feito pela visualizaomicroscpica do plasmdio em exame da gota espessa de sangue, coradapela tcnica de Giemsa ou de Walker. Apesar de a microscopia ser consi-derada o padro-ouro para o diagnstico e monitoramento do tratamentoda malria, essa tcnica exige pessoal treinado e experiente no exame dedistenses sangneas.

Recentemente, novas tcnicas cientficas esto sendo empregadas paradesenvolver diagnsticos simples, eficazes e passveis de realizao fora dolaboratrio, destacando-se os testes imunocromatogrficos rpidos cujaindicao ainda limitada para reas de difcil acesso ou baixa prevalncia.

Sabendo-se que a chave para a reduo da taxa de mortalidade odiagnstico precoce e uma terapia eficaz, espera-se que a utilizao desses

testes possibilite diagnsticos rpidos nas comunidades locais, assegurando otratamento imediato e adequado para prevenir a disseminao da doena.

1.1 Ciclo biolgico do parasito no homem

O ciclo assexuado do plasmdio, denominado esquizognico, inicia-seaps a picada do anofelino, com a inoculao de esporozotos infectantes no ho-mem. A seguir, os esporozotos circulam na corrente sangnea durante alguns

minutos e rapidamente penetram nas clulas do fgado (hepatcitos), dando in-cio ao ciclo pr-eritroctico ou esquizogonia tecidual, que dura seis dias para aespcie P. falciparum, oito dias para a P. vivax e 12 a 15 dias para a P. malariae.Durante esta fase, o P. vivaxe o P. ovaleapresentam desenvolvimento lento dealguns dos seus esporozotos, formando os hipnozotos, formas latentes (dor-mentes) do parasito responsveis pelas recadas da doena meses ou anos aps.

Ao final do ciclo tecidual, os esquizontes rompem o hepatcito,liberando milhares de elementos-filhos na corrente sangnea, chamados

merozotos. Ressalte-se que cada hepatcito rompido libera cerca de 2.000merozotos quando a infeco devida ao P. malariae;10.000, quando de-vida ao P. vivax e 40.000, quando devida ao P. falciparum. Os merozotos

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iro invadir as hemcias, dando incio ao segundo ciclo de reproduoassexuada dos plasmdios: o ciclo sangneo ou eritroctico. O P. malariaes invade hemcias velhas (0,1% do total), o P. vivax invade preferencialmente

as hemcias jovens e o P. falciparum,hemcias em qualquer fase evolutiva.Durante um perodo que varia de 48 a 72 horas, o parasito se desen-

volve no interior da hemcia at provocar a sua ruptura, liberando novosmerozotos que iro invadir novas hemcias. A ruptura e conseqente libe-rao de parasitos na corrente sangnea traduz-se clinicamente pelo inciodo paroxismo malrico, que se repetir com o trmino do novo ciclo (emdois dias, quando a infeco for devida ao P. falciparum ou P. vivax e em trsdias, quando devida ao P. malariae).

Inicialmente, no ciclo sangneo, o parasito sofre uma srie de trans-formaes morfolgicas sem diviso celular at chegar a fase de esqui-zonte, quando se divide e origina novos merozotos que sero lanados nacorrente sangnea, aps a ruptura do eritrcito. Assim, no exame micros-cpico do sangue pode-se observar variada morfologia do parasito trofo-zotos jovens (anis), trofozotos maduros, formas irregulares, esquizontesjovens e esquizontes maduros (Figuras 1 e 2).

Aps um perodo de replicao assexuada, alguns merozotos sediferenciam em gametcitos machos e fmeas, que amadurecem sem divi-so celular e tornam-se infectantes aos mosquitos. A funo desses gamet-citos reprodutiva, isto , garantir a perpetuao da espcie. Eles podem serde dois tipos, diferenciados microscopicamente nos esfregaos sangneos:os microgametcitos (masculinos) e os macrogametcitos (femininos).

1.2 Ciclo biolgico do parasito no mosquito

A reproduo sexuada (esporognica) do parasito da malria ocorre noestmago do mosquito, aps a diferenciao dos gametcitos em gametas e a suafuso, com formao do ovo (zigoto). Este se transforma em uma forma mvel(oocineto) que migra at a parede do intestino mdio do inseto, formando o oo-cisto, no interior do qual se desenvolvero os esporozotos. O tempo requeridopara que se complete o ciclo esporognico nos insetos varia com a espcie dePlasmodium e com a temperatura, situando-se geralmente em torno de 10 a 12

dias. Os esporozotos produzidos nos oocistos so liberados na hemolinfa do in-seto e migram at as glndulas salivares, de onde so transferidos para o sanguedo hospedeiro humano durante o repasto sangneo.


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FIGURA1

CICLOBIOLGICODOPLASMODIUMVIVAX

ESPOROGONIA

OOCISTO

ESTMAGO

OOCINETO

ESPOROZOTO

GLNDULA

SALIVAR

MOSQUITO

ESPOROZOTO

TROFOZOTO

HIPNOZOTO

HOMEM

MACROGAMETCITO MICROGAMETCITO

GAMETOGNE

SE

ESQUIZONTE

MEROZOTO

ESQUIZOGONIAEXO

ERITROCTICA

(FGADO

)

ATIVAO

VARIVEL

A

DORMECIDA

MEROZOTOTROFOZOTO

ESQUIZONTE

FORMASEM

ANEL

TROFOZOTO

ESQUIZONTE

SEGMENTADO

ESQUIZOGONIAERITROCTICA

(SANGUE)

ESQUIZOGONIA

FONTE: DPDx:CDC s Web site for parasitology identification


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FIGURA2

OCICLODEVIDADOPLASMDIO

HOMEM COMGAMETCITOS

NO SANGUE

MACROEMICROGAME-TCITOS SO

INGERIDOSPELO ANOFELINO

UM MICROGA-META

FECUNDA UMMACROGAMETA

MICROGAME-TCITOS NO

ESTMAGO DOMOSQUITO GERAM

VRIOS MICRO-GAMETAS POR

EXFLAGELAO

OVO MVELOU OOCINETO

ENCISTAMENTODO OVO QUE MI-

GRA AT A PAREDEDO INTESTINO

MDIO DO MOS-QUITO: OOCISTO

FORMAO DEESPOROZOTOS

DENTRODO OOCISTO

HEPATCITOSCRESCEM EFORMAM

MILHARES DEMEROZOTOS

ESPOROZOTOSATINGEM

OS HEPATCITOS

ROMPIMENTODO

OOCISTO QUELIBERA

MILHARES DEESPOROZOTOS

QUE SEDISSEMINAM

POR TODO OMOSQUITO

CHEGANDO SGLNDULASSALIVARESDO MESMO

ROMPIMENTO DOHEPATCITO COM

LIBERAO DOSMEROZOTOS

MEROZOTOSPENETRAM NAS

HEMCIASFORMANDO TROFO-

ZOTOS JOVENS

TROFOZOTO

AMEBIDE

FORMAO DE

GAMETCITOS

PARA INFECTAR

OUTRO MOSQUITO

ROSCEA

ESQUIZONTE

ANOFELINO FAZNOVO REPASTOINOCULANDO

O ESPOROZOTOEM NOVO

HOSPEDEIRO

MACROGA-METCITOS

AMADURECEM NOESTMAGO

DO MOSQUITO,GERANDO O

MACROGAMETA

FORMAO DOOVO OU ZIGOTO

ROMPIMENTODA ROSCEALIBERANDO

MEROZOTOSQUE IRO

INVADIR NOVASHEMCIAS


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1.3 Transmisso da malria

O perodo de transmissibilidade natural da malria est ligado

existncia de portadores de gametcitos (reservatrios humanos) e de veto-res. Existem centenas de espcies de anofelinos com potencial de transmitira malria. No Brasil, cerca de cinco espcies so importantes:Anopheles (N)darlingi, A. (N) aquasalis, A. (N) albitarsis, A. (K) cruzi e A. (K) bellator. Costumeiramente, esses insetos evoluem em guas limpas e sombreadas deremansos de rios, crregos, igaraps, lagoas, represas, audes, valetas de irri-gao, alagados e pntanos. Por sua vez, a subespcie Kertesiadesenvolve-seem guas acumuladas pelas bromeliceas, conhecidas no Sul pelo nome de

gravats.A malria pode ser transmitida acidentalmente por transfuso de

sangue (sangue contaminado com plasmdio), pelo compartilhamento deseringas (em usurios de drogas ilcitas) ou por acidente com agulhas e/oulancetas contaminadas. H, ainda, a possibilidade de transmisso neonatal.

1.4 Epidemiologia

A transmisso da malria est condicionada a determinados fato-res que permitem no s o surgimento de novas infeces como tambm aperpetuao do agente causal. Os primeiros so chamados fatores principaisou primrios, cuja presena essencial para a existncia da infeco, consis-tindo da interao dos trs seguintes fatores: o parasito, o hospedeiro huma-no e o vetor. H tambm os fatores secundrios, que atuam favorecendo oudificultando a transmisso.

No Brasil, a grande extenso geogrfica da rea endmica e as con-

dies climticas favorecem o desenvolvimento dos transmissores e agentescausais da malria pelas espcies de P. vivax, P. falciparum e P. malariae(este ltimo com menor freqncia). Especialmente na Amaznia Legal, atransmisso instvel e geralmente focal, alcanando picos principalmenteaps o perodo chuvoso do ano.

A partir das informaes sobre a ocorrncia de malria em deter-minada rea e tempo, possvel, de acordo com o perfil epidemiolgico detransmisso, classificar a regio em rea hiperendmica, mesoendmica ou

hipoendmica. H ainda as reas holoendmicas, onde a transmisso pe-rene e o grau de imunidade da populao alto, permitindo a existncia deportadores assintomticos.

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No Brasil, onde a transmisso da malria no completamente estvel,de acordo com a incidncia parasitria anual (IPA) costuma-se classificar asreas endmicas como de alto risco (IPA>50/1.000 hab.), mdio risco (IPA

entre 10-49/1.000 hab.) e baixo risco (IPA 49,9 (ALTORISCO- 76 MUNICPIOS)


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1.5 Manifestaes clnicas

Os sintomas da malria envolvem a clssica trade febre, calafrio e

dor de cabea. Sintomas gerais como mal-estar, dor muscular, sudorese,nusea e tontura podem preceder ou acompanhar a trade sintomtica.Contudo, esse quadro clssico pode ser alterado pelo uso de drogas profi-lticas ou aquisio de imunidade, e muitos desses sintomas podem ou noestar presentes e at mesmo todos podem estar ausentes. Nos casos compli-cados, podem ainda ocorrer dor abdominal forte, sonolncia e reduo daconscincia podendo levar ao coma nos casos de malria cerebral.

A ausncia de parmetros clnicos especficos que permitam confir-

mar a infeco justifica a necessidade de mtodos laboratoriais para o diag-nstico da malria. Alm disso, a presena da parasitemia no se relacionacom as manifestaes clnicas, isto , no h associao entre pico febril epositividade do exame microscpico.

Embora os ciclos evolutivos das espcies causadoras sejam similares,do ponto de vista patolgico a infeco malrica apresenta diferenciaesque podem determinar as variaes na evoluo clnica da doena. A infec-o de indivduos no imunes pelo P. falciparumpode resultar em formagrave e complicada, caracterizada pelo acometimento e disfuno de vriosrgos ou sistemas: sistema nervoso central, sistema hematopoitico, apare-lho respiratrio, fgado, sistema circulatrio, rins e coagulao sangnea.Assim, todo paciente portador dessa espcie de plasmdio deve merecerateno especial, de modo a receber tratamento imediato, essencial paraprevenir tais complicaes.

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FUNDAMENTOSDODIAGNSTICO

LABORATORIALDAMALRIA

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2.1 A importncia do laboratriono diagnstico da malria

A associao de critrios clnicos e epidemiolgicos muito impor-tante para a suspeio da doena, isto , a presena de sintomatologia geralem paciente procedente de rea sabidamente malargena obrigatoriamenteindica a solicitao do exame laboratorial confirmatrio da infeco.

radicionalmente, o diagnstico confirmatrio da malria feitopelo exame microscpico do sangue, necessitando de material e reagen-tes adequados, bem como de tcnicos bem treinados para sua realizao,objetivando a deteco e diferenciao das espcies de plasmdios.

O exame microscpico do sangue pode ser feito em esfregao delgado(distendido) ou espesso (gota espessa). A gota espessa corada pela tcnica deWalker (azul de metileno e Giemsa) e o esfregao delgado corado pelo Gie-msa, aps fixao com lcool metlico. Alm do baixo custo, ambas permitemidentificar, com facilidade e preciso, a espcie do plasmdio. Esses mtodostambm possibilitam quantificar a intensidade do parasitismo, mediante adeterminao da parasitemia por volume (l ou mm3) de sangue. Na prtica,o mtodo da gota espessa o mais utilizado, uma vez que a concentrao dosangue por campo microscpico favorece o encontro do parasito.

Nos ltimos anos, mtodos alternativos e/ou complementares ao exa-me da gota espessa tm sido disponibilizados. Com alto custo e ainda nocompletamente validados para uso em campo, so mtodos de diagnsticossensveis e especficos e tm a vantagem de serem rpidos e de fcil execuo.

Entre as propostas hoje disponveis para o breve diagnstico damalria, destacam-se os testes imunocromatogrficos cujos principaisprodutos comerciais so posteriormente descritos.

2.2 Medidas de biossegurana

Por ser um procedimento que envolve sangue, o diagnstico labora-torial da malria requer muita ateno s regras de biossegurana. Assim,no ato da coleta de sangue, preparao/colorao das lminas e descarte dematerial contaminado deve-se observar atentamente todas as medidas de

preveno de contaminao individual e coletiva, a saber:a) Lavar as mos antes e aps o contato com o paciente;

b) Usar luvas de ltex descartveis;


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c) Usar jaleco de mangas compridas, com punho elstico;d) Usar recipientes duros para descartveis perfurantes (lancetas e

agulhas usadas) e lminas desprezadas;

e) Usar sacos apropriados para o lixo sanitrio.

2.3 O exame microscpico

2.3.1 Componentes pticos e mecnicos do microscpio

Existem diversos tipos de microscpios, dependendo da funo paraa qual se destinam. Nos programas de controle de endemias o mais utilizado o tipo bacteriolgico, binocular, com sistema de iluminao incorporado

e regulvel.

O microscpio tem uma parte mecnica com os seguintes compo-nentes: brao ou estativa, ao qual esto ligados o mecanismo coaxial e bila-teral de focalizao macro/micromtrica (parafuso de correo diptrica),o revlver ou porta-objetivas, o corpo binocular com ajuste interpupilar, odiafragma-ris, o parafuso do condensador, o parafuso de avano lateral-frontal do carro ou charriot, o porta-filtro, a presilha ou garra de lmina,a platina e a base ou p do equipamento (Figura 4). H uma parte situa-da acima da platina e que corresponde ao sistema para aumento e resolu-o, composta por prismas, lentes oculares e objetivas. Outra parte, abaixoda platina, serve para a iluminao, possuindo fonte de luz incorporada eregulvel ou sistema convencional com espelho.

Geralmente, o microscpio equipado com um ou dois pares de len-tes oculares para ampliao de 10 vezes (10x) e/ou 7x. O corpo binocularpossui prismas que, aps realizado o ajuste da distncia interpupilar, levam

a imagem ao observador.As objetivas formam a imagem dos objetos aumentadas pelas lentes

oculares, adaptadas numa pea circular chamada revlver. So em nme-ro de quatro e proporcionam aumentos de 4x, 10x, 40x e 100x (este ltimonecessita de imerso em leo adequado). A ampliao final da imagem oresultado do produto das ampliaes produzidas pelas oculares e objetivas.Por exemplo, 7x (na ocular) multiplicado por 4x (na objetiva) gera uma am-pliao de 28 vezes.

O aumento total obtido com o microscpio binocular, quando do usoda objetiva de imerso de 100x, pode variar de 500x a 1.500x, dependendodas lentes oculares empregadas e do fator de aumento do corpo binocular.

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Existindo o fator de aumento do corpo binocular, multiplica-se o produtoacima por esse nmero; no existindo, considera-se como sendo de 1x.

A experincia tem demonstrado que a clareza de detalhes ou nitidez damicroscopia pode diminuir quando se ultrapassa o ponto timo de aumentocom a ocular, razo pela qual os programas de diagnstico e controle damalria vm utilizando a lente ocular de 7x para a pesquisa do plasmdio.

O aumento obtido com oculares de 10x, objetiva de 100x e fator de1x (resultando em ampliao de 1000x) o mais utilizado na rotina doslaboratrios das unidades de sade apesar de no ser o mais adequadopara diagnosticar a malria.

A utilizao de objetiva de imerso de 60x recomendvel pois per-mite observar maior nmero de elementos normais do sangue e de parasitospor campo microscpico, sendo muito til para a reviso do diagnsticomicroscpico.

2.3.2 O processo de iluminao do microscpio

O grau de claridade e nitidez do campo microscpico recebe adenominao de resoluo microscpica. A pesquisa do plasmdio exige alto

grau de claridade e nitidez para o reconhecimento dos pequenos parasitos damalria numa gota espessa desemoglobinizada. Em geral, pequenas estrutu-ras e outros microrganismos, aps corados, so facilmente identificveis numfundo de cor contrastante. Para o diagnstico da malria, entretanto, a ilumi-nao deve produzir um fundo de preparao to claro e limpo quanto poss-vel, para que contra o mesmo sejam realados os minsculos corpos de 0,5 a2,0 micra de dimetro, corados de vermelho (ncleo) e azul (citoplasma).

Existem duas formas de iluminao do campo microscpico: a na-tural e a embutida. A iluminao natural, com luz do dia recurso tilpara locais que no dispem de iluminao eltrica , feita atravs de umespelho de dupla face (cncava e plana) situado na base do equipamento;a iluminao embutida feita por aparelho dotado de transformador debaixa voltagem e intensidade varivel (110/220V), cujas lmpadas devem serhalgenas (6V-20 W ou 12V-20W ou 6V- 30W).


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O campo microscpico ou campo de imerso deve es-tar uniformemente iluminado com luz branca, ligeiramente azu-lada. O microscpio, a lmpada e os filtros devem ser dispostos de

modo a obter o mximo de luz possvel que pode ser diminuda vontade do microscopista, com o auxlio do reostato, diafragma-

FIGURA4

MICROSCPIOBINOCULARBACTERIOL-GICO

Correodiptrica e

ajuste daparfocalidade

Revlverou porta-objetivas

Objetivas

Platina

CondensadorABBE

Diafragmade abertura

Porta-filtro

Alavanca de pr-

focalizao automticaAjuste vertical

do condensador

Lentescolimadoras

Lmpada debaixa voltagem

(halognio outungstnio)

Base

Interruptorprincipal

Oculares decampo amplo

Ajuste interpupilar

Cabeote binocularde observao

PrismasEstativa

Garra delmina

Charriot

Controlescoaxiaisdo Charriot

Anel deajuste datenso domovimentomacrom-trico

Controle deslizante paravariao da intensidade de luz

Botomacro-mtrico

Boto micromtrico

FONTE: FAC-SMILEDECATLOGODEEQUIPAMENTOSPTICOS

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ris ou levantando-se ou abaixando-se o condensador. Para se obter o mximode eficincia do condensador quando da utilizao de microscpio de ilumina-o com espelho, usar somente a face plana do mesmo.

As superfcies das lentes oculares expostas ao ar so revestidas por umapelcula azulada anti-reexo, reduzindo ao mximo a disperso da luz, o querequer menos luz do que as lentes no tratadas. As superfcies assim revestidas,quando vistas com luz incidente, podem ser distinguidas pela cor azul-violeta.

2.3.3 Tcnica de utilizao do microscpio

Colocar a lmina entre as presilhas da platina mecnica, verifican-do se ficou firmemente presa barra mvel da mesma.

Ajustar a posio da lmina de modo que uma rea do materialcoincida com o orifcio de iluminao da platina.

Regular o sistema de iluminao do microscpio, fechando um poucoo diafragma-ris ou abaixando o condensador. Regular a intensidadeda luz atravs do reostato ou do balo de vidro, se for o caso.

Colocar a objetiva de 10x na posio e fazer a focalizao com oboto macromtrico at que surjam os leuccitos. Ajustar o foco com

o boto micromtrico. Examinar com a objetiva at encontrar uma rea com maior nmero

de leuccitos, bem corados. Uma vez localizada a rea adequada, colocar uma gota de leo de

imerso no centro da rea iluminada. Girar o revlver, colocando a objetiva de imerso (100x) em posio.

Levantar o condensador e abrir o diafragma-ris. Inclinar a cabea para um lado, para melhor visualizao das obje-

tivas, e usar o boto macromtrico para levantar a platina at que aobjetiva toque de leve o leo de imerso.

Aproximar os olhos das lentes oculares e, com o auxlio do botomacromtrico, focalizar o material at o aparecimento dos leucci-tos, completando a focalizao com o boto micromtrico.

Examinar os campos microscpicos mais corados, movimentando osparafusos de avano frontal e lateral do carro (charriot) com a mo di-reita e o boto micromtrico com a esquerda (Obs: alguns microscpiosso fabricados com esses dispositivos em posio invertida).

Rever os aspectos morfolgicos dos elementos figurados do sangue(leuccitos e plaquetas na gota espessa ou leuccitos, hemcias e pla-


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quetas no esfregao delgado), para avaliar a qualidade da colorao(Anexo B Imagens das diferentes espcies de plasmdios emesfregao e gota espessa). Os espaos entre os leuccitos devem ser

claros, com ligeiro tom azulado. Proceder o exame microscpico do material para deteco dos pa-

rasitos da malria. Quando completar o exame, baixar a platina, retirar a lmina e

registrar o resultado. Colocar a lmina invertida sobre o papel absorvente, para posterior

limpeza sem atrito do material. No usar xilol nem tolueno para aremoo do leo de imerso.

Aps a limpeza do leo de imerso, acondicionar as lminas em pa-pel adequado e arquiv-las em local prprio, para futuras revises.

2.3.4 Cuidados com o microscpio

Ao iniciar o trabalho, limpar as superfcies superiores das lentesoculares e inferiores das objetivas, condensador e espelho (casoexista) com papel macio e absorvente. O p depositado na parte

interna dos tubos do corpo binocular pode ser removido com jatosde ar produzidos por uma pra de borracha.

No usar solventes como lcool, xilol ou tolueno para a limpeza doscomponentes do equipamento. O leo mineral facilmente remo-vido por papel absorvente, passado sobre a lente de imerso.

A parte mecnica pode ser limpa com anela. A lubrificao dossistemas mecnicos (cremalheiras) feita com vaselina, no sendorecomendvel utilizar leo.

No desmontar as objetivas, oculares, corpo binocular e o sistemamacro/micromtrico de focalizao, para no desregular o equipa-mento.

Manter o microscpio sempre limpo e, aps o uso, conserv-lo sobuma capa plstica e/ou na caixa original, sempre com um saco deslica-gel para proteo contra a umidade.

Em reas de elevada umidade, como a Amaznia, a utilizao de

estufas de madeira, dotadas de uma lmpada de 25 watts constan-temente acesa (que garante uma temperatura entre 30C e 60C), mais eficiente que o uso da slica e ideal para impedir o desenvolvi-mento de fungos no sistema tico do microscpio.

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ransportar, sempre, o microscpio pela estativa (brao), comapoio da mo sob a base, e nunca pelos parafusos.

2.3.5 Limpeza e cuidado das lminas

Lminas novas

Retirar as lminas da caixa e coloc-las uma a uma num recipientecom lcool a 70%

Deixar em repouso por 24 horas Enxugar uma a uma, com toalha limpa Fazer pacotes com 10 unidades, identificar as lminas novas e

colocar a data

Obs: Nunca utilizar lmina que aps ter sido seca apresente vestgiosde oxidao.

Lminas usadas

Preparar soluo contendo 4 colheres (de sopa) de gua sanitriacomercial para cada litro de gua

Adicionar cerca de 50g (1 colher de sopa, cheia) de sabo em p acada litro da soluo acima onde sero mergulhadas as lminas

usadas Deixar em repouso por 48 horas

Limpar uma a uma as lminas usadas, utilizando esponja, e coloc-las numa bacia com gua

Enxaguar bastante em gua corrente

Enxugar com toalha limpa

Fazer a seleo: desprezar as quebradas, arranhadas, oxidadas e as

azuladas pelo uso continuado de corantes Fazer pacotes de 10 unidades, identificar os pacotes como lminas

recuperadas e colocar a data


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A PESQUISADEPLASMDIOPELAMICROSCOPIA

Captulo

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A pesquisa de plasmdio pela microscopia pode ser feita tanto nagota espessa de sangue como em esfregao delgado. Dependendo do objeti-vo do trabalho, cada um desses recursos oferece vantagens e desvantagens

(adiante descritas).

3.1 O preparo da gota espessa

A melhor preparao para o diagnstico de malria obtida comamostra de sangue colhida diretamente por puno digital ou venosa semanticoagulante. Aps a coleta, a lmina deve ser mantida em temperaturaambiente para secagem da gota de sangue para tanto, pode-se tambmutilizar estufa de 37oC ou lmpada de 25-40 watts sob placa de vidro.

Na prtica, a secagem pode ser verificada pelo desaparecimento dobrilho da amostra mida. O sangue colhido com anticoagulante no in-dicado para o preparo da gota espessa, por no apresentar boa fixao nalmina, podendo desprender-se no ato da colorao ou durante a lavagem.Em caso de sangue com anticoagulante, a lmina deve ser submetida seca-gem durante um tempo maior, antes da colorao. O tempo decorrido entrea coleta do sangue e a colorao da amostra no deve ultrapassar trs dias,

sob o risco de ter sua qualidade prejudicada, haja vista que aps esse perodoa desemoglobinizao dificultada.

3.1.1 Coleta de sangue e preparo de lminas para o exameda gota espessa

Separar duas lminas limpas, deixando-as em superfcie plana ehorizontal.

Preencher os dados do paciente e do examinador, requeridos no

formulrio. Colocar uma das lminas sobre a superfcie plana e manuse-la

pelas extremidades, evitando tocar as superfcies. De preferncia,a lmina deve estar com etiqueta auto-adesiva para o registro daidentificao; a opo alternativa usar lmina com extremidadeesmerilhada, onde a identificao feita com lpis.

Calar luvas de ltex descartveis.

Limpar vigorosamente a pele do local de puno (parte lateral dosegundo ou terceiro dedo da mo, lbulo da orelha ou, em lactentes, odedo grande do p ou calcanhar) com gaze ou algodo embebido emlcool a 70%; posteriormente, enxugar com gaze ou algodo secos.


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Retirar o estilete (lanceta) do envoltrio estril, segu-rando-o firmemente.

Segurar o dedo a ser puncionado entre o polegar e o

indicador da mo do operador e puncionar o local demaneira firme e leve (Foto 1, abaixo).

Remover a primeira gota de sangue com gaze ou algo-do secos.

FIGURA5

PUNODIGITALPARACOLETADESANGUEPARAPREPARODEGOTAESPESSAOUESFREGAO

FONTE: RPUBLIQUEDMOCRATIQUEDUCONGO/MINISTREDELASANT/PROGRAMMENATIONALDELUTTECONTRELEPALUDISME


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Comprimir o dedo suavemente (como em ordenha) para obter outragota de sangue esfrica sobre a pele seca. Cuidar para no tocar o pon-to de sada do sangue.

Segurar a lmina firmemente pelas bordas da extremidade onde seencontra a etiqueta de identificao. Aproximar a lmina ao dedo dopaciente (pela face onde consta a identificao) at tocar o alto da gotade sangue (evitando o contato com a pele). Se a quantidade de sanguefor insuficiente, pode-se colocar outra gota ao lado da primeira.

Colocar a lmina, com a face para cima, na superfcie de traba-lho. Com o canto e os primeiros 5 mm da borda maior da segundalmina, espalhar o sangue formando um retngulo de tamanho e

espessura adequados: aproximadamente 1,2 cm2.

Limpar o local puncionado com gaze ou algodo embebido emlcool a 70% e, se necessrio, pression-lo.

Secar a lmina (em temperatura ambiente, ar morno, caixa comlmpada ou estufa), cuidando para que o sangue no se fixe porcalor excessivo.

Para iniciar a pr-colorao, esperar at que o sangue esteja total-

mente seco. Caso contrrio, pode haver perda total de material.Para a obteno de resultado satisfatrio na pesquisa de plasmdio

pelo exame da gota espessa, alguns aspectos devem ser enfatizados quandoda confeco da lmina:

IDENTIFICAO


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O sangue deve estar distribudo o mais homogeneamente possvel,para que os elementos sangneos e os parasitos se disponham demaneira uniforme em toda a amostra;

Uma gota espessa adequada deve ter de 1 cm2a 1,5 cm2de superf-cie, o que aproximadamente equivale a 500 a 800 campos micros-cpicos, quando se trabalha com aumento de 700 a 800 vezes. Nes-se caso, encontrada uma mdia de 10 a 20 leuccitos por campo.

3.1.2 Vantagens e desvantagens da gota espessapara a pesquisa de plasmdio

Vantagens:

Por concentrar maior quantidade de sangue desemoglobinizadonuma rea relativamente pequena, a gota espessa aumenta a pro-babilidade de se encontrar parasitos, o que a torna o mtodo deeleio para o diagnstico de malria (e de outros hemoparasitos);

Por ser desemoglobinizada, o processo de colorao mais rpido,permitindo o processamento de grande nmero de amostras;

A distribuio dos parasitos e leuccitos se d ao acaso em toda

a amostra. Portanto, pode-se avaliar a parasitemia contando-se onmero de parasitos em relao a um determinado nmero de leu-ccitos.

Desvantagens:

Requer experincia para a identificao de espcies, uma vez que amorfologia do parasito altera-se durante o processo de desemoglo-binizao;

Requer processamento parcial ou total relativamente rpidodepois de colhida a amostra, para evitar a fixao de hemoglobina,a supercolorao e a descolorao.

3.2 O preparo do esfregao delgado

3.2.1 Coleta e preparo do esfregao delgado (distendido)

rabalhar sobre superfcie plana e horizontal.

Usar duas lminas: uma, para receber a minscula gota de sangue(1l aproximadamente); outra, para espalhar o sangue (preferen-cialmente biselada).

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Calar luvas de ltex descartveis.

Limpar vigorosamente a pele do local de puno (parte lateral dosegundo ou terceiro dedo da mo, lbulo da orelha ou, em lac-

tentes, o dedo grande do p ou calcanhar) com gaze ou algodoembebido em lcool a 70%. Posteriormente, enxugar com gaze oualgodo secos.

Retirar o estilete (lanceta) do envoltrio estril, segurando-ofirmemente.

Segurar o dedo a ser puncionado entre o polegar e o indicador damo esquerda do operador.

Puncionar o local de maneira firme e leve. Remover a primeira gota de sangue com gaze ou algodo secos.

Comprimir o dedo suavemente (como em ordenha) para obteroutra pequena gota de sangue esfrica sobre a pele seca. Cuidarpara no tocar o ponto de sada do sangue.

Com a mo direita, segurar a lmina firmemente pelas bordas daextremidade onde se encontra a etiqueta de identificao. Aproximara lmina ao dedo do paciente (pela face onde consta a identificao)at tocar o alto da gota de sangue (evitando o contato com a pele).

Limpar o local puncionado com gaze ou algodo embebido em l-cool a 70% e, se necessrio, pressionar.

Com a borda estreita da lmina biselada em contato com a gota desangue, formando um ngulo de 50, espalhar o sangue com um mo-vimento rpido para formar uma camada delgada (se possvel, umanica camada de clulas), sem atingir a outra extremidade da lmina.

Deixar secar em temperatura ambiente, na posio horizontal. Fixar com algumas gotas de lcool metlico, de modo a cobrir todo

o esfregao, por 1 minuto.

O sangue tambm pode ser espalhado da seguinte forma:

ocar a gota de sangue com a lmina distensora.

Colocar a extremidade da lmina que contm o sangue em contatocom a extremidade da lmina que receber o esfregao delgado.

Antes que o sangue, por capilaridade, atinja as bordas laterais dalmina distensora (biselada), faz-se o deslocamento rpido, em n-gulo de 50, para formar a camada fina, sem atingir a extremidadeda lmina.


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3.2.2 Vantagens e desvantagens do esfregao delgadopara a pesquisa de plasmdio

Vantagens

Por fixar as hemcias, permite melhor estudo da morfologia do parasi-to e das alteraes caractersticas do eritrcito parasitado, viabilizandoconferir o diagnstico da gota espessa, em situaes de dvida.

Por ser fixado e no submetido desemoglobinizao, a perda deparasitos bem menor que na gota espessa. Essas amostras resistemmais ao atrito quando da remoo do leo de imerso, so mais du-

rveis e conservam por muito tempo a colorao original (enquantoque a gota espessa pode facilmente apresentar alterao tintorial).

Permite a determinao percentual da parasitemia, mediante acontagem de eritrcitos parasitados em 100 hemcias.

Desvantagens

Por ter menos quantidade de sangue, espalhada em uma nicacamada, o esfregao delgado ocupa maior rea da lmina, dificul-

tando o encontro das hemcias parasitadas. Assim, no indicadopara diagnstico inicial, especialmente em pacientes com parasite-mias baixas.

A distribuio de leuccitos e parasitos no se d ao acaso (leuc-citos maiores e estgios mais avanados dos parasitos localizam-senas bordas e final de esfregao). Portanto, precisa-se examinar umarea extensa para detectar todas as formas parasitrias, no esta-belecendo uma boa correlao entre o nmero de parasitos e o de

leuccitos.

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FOTO1

GOTASESPES-SASDESANGUEEMLMINASDEVIDRO,NOCORADAS

FOTO2

ESFREGAOSDESANGUEFIXADOSECORADOSPELOMTODODEGIEMSA


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COLORAODASLMINAS

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4.1 Preparo de corantes e diluentes

Preparo da mistura de azul de metileno fosfatado

Azul de metileno medicinal em p 1,0g

Fosfato de potssio monobsico 1,0g

Fosfato de sdio bibsico 3,0g

Misturar em gral seco.

Preparo da soluo fosfatada de azul de metileno

Pesar 1,0g da mistura acima e dissolver em 250ml de gua destilada.Conservar a soluo em pissetas (frasco plstico de lavagem).

Preparo da mistura de sais fosfatados

Fosfato de potssio monobsico 4,0g

Fosfato de sdio bibsico 6,0g

Misturar em gral seco.

Preparo da gua tamponada a 6/4

Pesar 1,0g da mistura de sais fosfatados, acima descrita, e dissolverem 1.000ml de gua destilada. Conservar a soluo em pissetas.

Preparo da soluo alcolica de Giemsa

Giemsa em p 0,75gGlicerol PA 35ml

lcool metlico PA 65ml

Colocar a soluo num frasco com algumas prolas de vidro e agi-tar vrias vezes ao dia, at obter a homogeneizao. Esta soluo deve serfeita em maior volume e mantida em estoque. Para o uso dirio, a soluoalcolica deve ser colocada em pequeno frasco conta-gotas, evitando-se suaabertura por tempo prolongado.

Obs: Existem, no mercado, solues de Giemsa preparadas, carter

PA.


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Preparo do corante de Wrigth(para colorao dos esfregaos delgados)

Wrigth em p 0,10g

lcool metlico PA 100ml

Colocar o corante num frasco com algumas prolas de vidro e agitarvrias vezes ao dia, at obter a homogeneizao.

4.2 Tcnica de colorao das lminas

4.2.1 Mtodo de Walker para colorao da gota espessaMaterial necessrio: placa de acrlico para colorao; pisseta com

soluo fosfatada de azul de metileno; frasco conta-gotas com soluo alco-lica de Giemsa; pisseta com gua tamponada.

1 fase: Desemoglobinizao pela soluo hipotnica de azul demetileno

Aplicar a soluo de azul de metileno fosfatado sobre a gota espessade sangue, por dois segundos.

Enxaguar a lmina com gua tamponada (sem jato forte).2 fase: Colorao pela soluo de Giemsa

Colocar a lmina com o lado da gota voltada para a superfcie daplaca de colorao.

Preparar uma soluo de Giemsa na proporo de uma gota decorante para 1ml de gua tamponada. Homogeneizar.

Aplicar esta soluo na placa cncava de colorao, sob a lmina

invertida. Deixar corar por 10 minutos. Enxaguar com gua tamponada (sem jato forte). Secar ao calor suave ou sob ventilao.

Neste mtodo no recomendvel imergir a lmina na soluo azul demetileno (pr-colorao) e na gua tamponada (lavagem) em copos, em virtu-de da contaminao destas solues repetidamente usadas por vrios dias, fa-vorecendo a proliferao de bactrias e fungos. Para evitar esta desvantagem,utilizar as solues contidas em pissetas para enxaguar as amostras de sangue.O aumento do consumo compensado com a boa qualidade das preparaes,livre de artefatos e contato com solues contaminadas por sangue.

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4.2.2 Mtodo de Giemsa para colorao da gota espessa

Colocar a lmina com o lado da gota voltada para a superfcie daplaca de colorao.

Preparar uma soluo de Giemsa na proporo de uma gota de corantepara 1ml de gua tamponada. Homogeneizar.

Aplicar esta soluo na placa cncava de colorao, sob a lminainvertida.

Deixar corar por 20 a 30 minutos.

Enxaguar com gua tamponada (sem jato forte).

Secar ao calor suave ou sob ventilao.

4.2.3 Colorao do esfregao pelo mtodo de Giemsa

Fixar o esfregao com lcool metlico por um minuto.

Deixar secar.

Colocar a lmina invertida sobre a placa de colorao.

Despejar a diluio do corante de Giemsa na proporo de umagota do corante para 1ml de gua tamponada.

Deixar corar por 20 a 30 minutos. Enxaguar com jato forte de gua tamponada.

Secar ao calor suave ou sob ventilao.

4.2.4 Colorao do esfregao (distendido) pelo mtodo de Wrigth

Cobrir a lmina com soluo de Wrigth.

Deixar corar por 3 minutos.

Adicionar algumas gotas de gua destilada ou tamponada.

Misturar (borrifar ar com o auxlio de uma pisseta vazia ou prade borracha).

Deixar corar por mais 7 minutos.

Enxaguar com jato forte de gua destilada ou tamponada.

Secar em temperatura ambiente.


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4.3 Avaliao da qualidade de coloraoda gota espessa

4.3.1 Desemoglobinizao

Quando a desemoglobinizao adequada, os elementos figuradosdo sangue e os parasitos, quando presentes, aparecem sobre fundo claro.

4.3.2 Espessura da gota

Cada campo microscpico (imerso em leo) deve apresentar de 10 a20 leuccitos, em mdia.

4.3.3 Colorao propriamente dita

As cores dos elementos normais do sangue devem ser avaliadas deacordo com o seguinte roteiro:

Os restos das hemcias e reticulcitos devem estar corados emazul-claro

As plaquetas devem corar-se de rosa-vivo ao violeta

Os ncleos de leuccitos geralmente coram-se de azul-escuro aovioleta

Os grnulos finos dos neutrfilos coram-se ora em rosa, ora emazul-violeta

Os grnulos grossos dos eosinfilos coram-se em vermelho-cobre

O citoplasma dos linfcitos coram-se em azul-plido

Os moncitos apresentam-se com fino estroma cinza-azulado

No exame da gota espessa, se o fundo estiver bem claro a cromati-na dos parasitos cora-se em vermelho e o citoplasma em azul. O pigmentomalrico, que normalmente no se cora, tambm aparece com nitidez e suacor varia do castanho ao negro, sendo mais visvel nas preparaes descora-das e no sangue examinado a fresco. Apresenta-se como massa fina, difusa ecastanha, ou na forma de pequena massa compacta, arredondada e escura.

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4.4 Avaliao da qualidade de coloraodo esfregao

O exame de esfregao deve ser feito, preferencialmente, na parte maisfina (cauda) do esfregao, onde as hemcias esto dispostas numa s cama-da, com as bordas separadas ou apenas com leve contato e sem superposio,sendo facilmente observada a camada nica de clulas fixadas formandofranjas. A deteco de baixas parasitemias requer o exame de todo o es-fregao.

As seguintes caractersticas devem ser observadas para a avaliaoda qualidade de colorao do esfregao:

A colorao do esfregao depende da espessura da camada dehemcias, bem como do mtodo de colorao.

O esfregao deve apresentar uma pelcula fina e uniforme que noatinge as bordas, com diminuio progressiva da quantidade desangue em direo ao final da lmina, sem alcanar a extremidadeda mesma mas formando franjas.

A cor do esfregao pode variar do cinza-claro ao rosa-plido.

Leuccitos: ncleo azul-escuro ou prpura e o citoplasma dos neu-trfilos, granulaes finas azul e rosa; os eosinfilos apresentam-secom granulaes grosseiras, podendo corar-se em tom rosa-aver-melhado.

Plaquetas: azul ou prpura.

Plasmdios: a cromatina nuclear cora-se em vermelho ou prpu-ra; o citoplasma, em azul-claro, com variaes que dependem daespcie e idade do parasito.

Granulaes de Schffner: rosa ou vermelha. Sua presena, clara-mente definida nas hemcias parasitadas pelo P. vivaxou P. ovale, bom indicador de colorao satisfatria.

Obs: O aparecimento das granulaes de Schffner, bem caracte-rsticas nas hemcias parasitadas pelo P. vivax ou P. ovale,depende do pH da gua tamponada e do tempo de colorao(pH 7,0 a 7,2 e tempo superior a 30 minutos). A visualizao das

granulaes de Schffner maior na periferia da gota espessae camada delgada (esfregao), principalmente nas amostras desangue com anticoagulante.


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CARACTERSTICASDASDIFERENTESESPCIESDEPLASMDIOSENCONTRADOSNOSANGUEPERIFRICO

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Individualmente, os parasitos do gnero Plasmodiumvariam em ta-manho, forma e aparncia, confundindo-se com elementos estranhos, con-taminantes das amostras de sangue, como fungos, bactrias, etc. (Anexo A

Figura 1/1 Elementos que podem confundir o diagnstico de malria).Em alguns casos, no exame da gota espessa as formas de determi-

nada espcie se assemelham muito s de outras (anis, pr-esquizontes egametcitos arredondados). A nica forma que se pode considerar comotpica nesse exame o gametcito de P. falciparum, que apresenta-se em for-ma de banana, crescente ou salsicha. Ainda assim torna-se freqente-mente arredondado (em vista da secagem do sangue ser demorada em climaquente e mido), com aparncia de formas de outras espcies (P. vivaxe P.malariae).

A comparao entre o tamanho das formas evolutivas dos plasm-dios, de acordo com a variao de crescimento de cada espcie e o tama-nho do linfcito pequeno (microlinfcito), cujo dimetro se aproxima dodimetro do glbulo vermelho, pode auxiliar no diagnstico da espcie.

5.1 Plasmodium falciparum

Trofozoto jovem: em forma de pequeno anel ou s vezes aberto,formando vrgulas, regulares, ligadas a uma, duas e at trs pe-quenas massas de cromatina. Ausncia de pigmento malrico.

Trofozoto maduro(forma rara): compacto, com aspecto slido,sem vacolo ou com pequeno vacolo. Colorao mais escuraque o mesmo estgio das outras espcies. Massa nica de pig-mento malrico, cuja cor varia do castanho ao negro.

Esquizonte: redondo e de tamanho variado. Apresenta duas oumais massas de cromatina e massa nica de pigmento malrico.Comumente, no visto em amostra de sangue perifrico. Podeaparecer em infeces graves por esta espcie, assim como empacientes esplenectomizados. Cada esquizonte pode apresentarde 8 a 40 merozotos (cromatinas), usualmente de 16 a 24, assime-tricamente arranjados.

As hemcias parasitadas podem apresentar-se com a superfcieirregular, sem granulaes de Schffner nem aumento do dime-tro. Parasitemias mais altas so comuns nesta espcie. O parasi-tismo mltiplo da hemcia comum nas infeces graves.

Os parasitos invadem hemcias jovens, maduras e velhas.


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O pigmento malrico pode ser encontrado nos leuccitos circu-lantes, sendo sinal de alerta para infeco grave.

O gametcito do P. falciparum, em forma de banana, cres-

cente ou salsicha, considerado tpico dessa espcie. Entre-tanto, pode ficar arredondado quando a secagem da lmina fordemorada por exemplo, nos locais de clima quente e mido ,podendo confundir-se com formas de outras espcies. Os game-tcitos aparecem por volta da segunda semana da parasitemiaassexuada e podem permanecer no sangue perifrico de 5 a 7semanas.

Rotineiramente, as nicas formas parasitrias do P. falciparumen-

contradas na leitura de uma lmina de gota espessa so anis (tro-fozotos jovens e maduros) e gametcitos (em forma de banana).

Nos casos de malria grave, podem ser encontradas todas as formasevolutivas descritas, acompanhadas de esquizontes, geralmentenos casos de elevada parasitemia devida doena por mais deuma semana.

O encontro de parasitos pequenos, mdios e grandes sinal de maisde uma gerao, sendo raras as parasitemias sincrnicas, isto ,

crescimento uniforme de uma nica camada. A coleta de sanguerealizada em diferentes horrios pode acarretar resultados contra-ditrios, positivos ou negativos. Por isso, em alguns casos suspei-tos, recomenda-se a coleta das lminas em diferentes horrios.

5.2 Plasmodium vivax

Trofozoto jovem: em forma de anis pequenos, s vezes abertos,mostrando apenas uma massa de cromatina (raramente duas).

Pode ser confundido com os trofozotos jovens do P. falciparum.Ausncia de pigmento malrico. Os anis podem ser maiores e,nesse caso, apresentam vacolo claramente definido.

Trofozoto maduro: grande, amebide e com vacolo presen-te. Grnulos finos de pigmento malrico escuro no citoplasma,geralmente identificados como formas irregulares.

Esquizonte: grande, redondo e com menos de 12 ncleos (cro-matinas) quando ainda jovem. Grnulos de pigmento fino,

escuro e difuso pelo citoplasma. Quando maduro, apresenta 12a 24 merozotos (cromatinas maiores), irregularmente arranja-dos. Grnulos de pigmento malrico visualizado, s vezes, comopequena massa escura numa parte do citoplasma.

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Gametcito: redondo ou oval, com nica massa de cromatinatriangular ou redonda, tamanho varivel. Pigmento malricofino, difuso e escuro sobre o citoplasma. As formas mais evolu-

das podem ser maiores que o microlinfcito. As hemcias parasitadas geralmente so jovens (reticulcitos) e

apresentam granulaes de Schffner. Seu dimetro pode estaraumentado pelo tamanho do parasito.

No apresenta pigmento malrico fagocitado por leuccitos nosangue perifrico.

No exame da lmina de um paciente com malria causada porP. vivaxso encontradas todas as formas evolutivas dessa espcie:

anis (trofozotos jovens), formas irregulares (trofozotos madu-ros), esquizontes e gametcitos.

5.3 Plasmodium malariae

Trofozoto: pequeno, redondo e compacto. Anis de forma re-gular, com cromatina relativamente grande. Pigmento malricomais evidente nas formas mais compactas. Pode ou no apre-sentar vacolo. Quando maduro, apresenta massa de cromatina

maior e grnulos grossos e escuros de pigmento malrico. Esquizonte: quando jovem, apresenta menos de 8 ncleos, sem

citoplasma evidente. Grnulos de pigmento malrico grossos,sem formao de massa compacta. Quando maduro, tem de 8a 12 merozotos (cromatinas), s vezes em torno de uma massacompacta e escura de pigmento malrico (forma de roscea).Os ncleos podem aparecer bem separados, sem citoplasma eespalhados de modo irregular.

Gametcito: semelhante ao trofozoto maduro. Massa grandede cromatina, forma compacta, regular e bastante pigmentomalrico grosso e escuro.

Hemcia parasitada no aumentada e sem granulaes deSchffner. Invade preferencialmente hemcias velhas.

No exame da lmina de um paciente com malria causada porP. malariae so encontradas todas as formas evolutivas dessaespcie: anis (trofozotos), esquizontes e gametcitos.

No esfregao delgado, o trofozoto maduro apresenta-se comobanda ou faixa equatorial sobre a hemcia.


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5.4 Plasmodium ovale

Trofozoto: quando jovem, pode parecer-se com o trofozoto do

P. vivaxou do P. malariae. Possui anis com citoplasma com-pacto, podendo apresentar vacolo. Quando maduro, apresen-ta-se redondo, com massa de cromatina de tamanho varivel.Pigmento malrico escuro, porm mais claro que o de P. vivaxeP. malariae.

Esquizonte: com aproximadamente 6 a 8 merozotos, distribu-dos irregularmente ou em torno de uma massa compacta e escu-ra de pigmento malrico, em aspecto de roscea, semelhante ao

do P. malariae. Gametcito: redondo ou oval, com nica massa grande de

cromatina. Grnulos de pigmento escuro.

Hemcia parasitada pouco aumentada e com granulaes deSchffner, sendo os grnulos mais espalhados. A presena degranulaes de Schffner distingue esta espcie do P. malariae.A hemcia parasitada ovalada.

No exame da lmina de um paciente com malria causada por P.ovaleso encontradas todas as formas evolutivas dessa espcie:anis (trofozotos), esquizontes e gametcitos.

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COLORAODASGRANULAESDESCHFFNER

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A natureza das granulaes de Schffner ainda desconhecida. Sogrnulos de cor rsea surgidos nas hemcias parasitadas pelo P. vivaxe P.ovale quando coradas pelos corantes de Romanowski, segundo os mtodos

de Giemsa, Walker/Giemsa, Wright, Maygrunwald/Giemsa e Romanowskimodificado.

Observou-se que essas granulaes assemelham-se s do citoplasmados leuccitos polimorfonucleares (neutrfilos). Seu aparecimento, forma,tamanho, quantidade e distribuio nas hemcias parasitadas varia com aqualidade da amostra de sangue, a espcie e o estgio do plasmdio, o pH dodiluente, a qualidade do corante, o mtodo e o tempo de colorao.

O exame da gota espessa e/ou do esfregao revela as granulaes deSchffner nas hemcias parasitadas vistas da periferia at a parte central,ou apenas nas camadas mais finas de hemcias, sendo mais coradas em meioalcalino (pH 7,2) e maior tempo de colorao.

Na maioria das preparaes da gota espessa, as granulaes de Schffnerno aparecem em virtude do pH cido do diluente e menor tempo de colora-o, sendo o P. vivax identificado pelas formas irregulares, pigmento ma-lrico e algumas formas maiores que o microlinfcito. Algumas hemcias

parasitadas por trofozotos jovens podem no apresentar as granulaes deSchffner, mas com P. ovaletodas tm essas granulaes, mais grossas e emmenor nmero quando comparadas s das hemcias dilatadas com P. vivax(que so finas). A identificao do P. ovaletorna-se difcil sem a coloraodas granulaes de Schffner e a visualizao da hemcia parasitada em vir-tude da semelhana de formas evolutivas comparadas com as do P. malariaee algumas do P. vivaxno irregulares.

A colorao das granulaes de Schffner preservada por muitosanos, com ou sem montagem das preparaes com resinas sintticas. Re-centemente, na montagem dessas preparaes vem sendo experimentada aresina Superbonder e a substituio da lamnula de vidro por celofane.

6.1 Camadas

Nas infeces malricas, chamam-se camadas a presena assincrni-ca das populaes de parasitos encontrados no sangue perifrico.

Faz-se necessrio um perodo mnimo de tempo para que a esqui-zogonia se complete. No fgado, ela pode ser retardada por alguns dias; nosangue perifrico, retardada ou antecipada em algumas horas. Em conse-


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qncia dessas variaes, geralmente se registra a presena de parasitos emdiferentes estgios de desenvolvimento no sangue perifrico. Contudo, nemsempre possvel observar todas as diferentes fases quando do exame roti-

neiro da gota espessa, haja vista que, em alguns casos, os parasitos so rarose essa variao no aparece nos campos microscpicos.

Sempre que um nmero suficiente de parasitos completa sua esqui-zogonia ao mesmo tempo ou com diferena de algumas horas, produzem-sesintomas clnicos nos pacientes no-imunes ou semi-imunes. Conforme agerao predominante, os sintomas se apresentam a cada 48 horas nas infec-es por P. falciparum, P. vivaxe P. ovale; ou a cada 72 horas nas infecespelo P. malariae.

A ocorrncia de sintomas de maior intensidade inicia-se com cala-frio, acompanhado de tremor generalizado. Esta fase, acompanhada de fe-bre, cefalia, nuseas e vmitos pelo menos uma vez por dia indica a presen-a de duas ou mais camadas. Por isso, no incio, possvel e no raro que opaciente tenha um acesso dos sintomas clnicos por dia, o que significa queo quadro clssico da infeco est descompassado, em vista da ocorrnciade pelo menos um quadro adicional. Entretanto, essa situao no costuma

perdurar pois, uma vez estabelecida a gerao predominante, os parasitosda(s) outra(s) so suprimidos e, assim, no so suficientemente numerosospara causar sintomas.

O P. vivaxjovem movimenta-se livremente em todo o interior da he-mcia, lanando pseudpodos citoplasmticos que atingem todas as partesda mesma. A cromatina aparece apenas em uma parte do citoplasma, talveza maior. As demais partes podem ser desprezadas; os diminutos fragmentosde citoplasma ligados ao fragmento que contm a cromatina so demasiado

delgados para ser vistos. A confuso freqentemente verificada na identi-ficao do P. vivaxe do P. malariaedeve-se ao fato de que os fragmentosdensos, que contm a cromatina, so tomados pelo parasito inteiro.

Para se verificar o que constitui o parasito inteiro numa gota espessa,faz-se muitas vezes necessrio considerar tudo quanto se encontre dentrode uma rea semelhante ao tamanho do maior leuccito polimorfonuclearobservado em dado momento na mesma amostra de sangue.

A hemcia invadida pelo P. vivax, ao invs de adquirir viscosidadena membrana, apresenta uma srie de granulaes em todo o seu estroma denominadas granulaes de Schffner, tm tamanho, forma e distribui-o regulares. A princpio pequenas, tornam-se maiores e mais evidentes

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conforme o grau de exposio do sangue ao corante. Aps a colorao, as-sumem um tom avermelhado. Ressalte-se que essas granulaes s ocorremnas hemcias parasitadas pelo P. vivaxe P. ovale.

Gametcitos ou grandes mononucleados aparecem no sangue desdeo incio da infeco, com variao apenas de tamanho.

A forma mais evoluda torna-se mais redonda e regular, sendo difcilidentificar o gametcito adulto ou pr-esquizonte. Pode-se observar na gotaespessa, medida em que o P. vivaxamadurece, que a forma torna-se redon-da e regular, compacta e com bastante pigmento malrico, que s vezes seconfunde com P. malariae.

As parasitemias baixas so mais raras do que nos casos por P. falci-parum, sendo mais fcil a deteco em amostras bem coradas pela presenadas granulaes de Schffner. As infeces mistas de P. vivax+ P. falciparumso freqentes com gametcitos de P. falciparum(V + Fg), sendo raras comsomente formas assexuadas de P. falciparum (F + V) e baixa parasitemia dasduas espcies assexuadas associadas.


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MTODOSDE

QUANTIFICAODAPARASITEMIA

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7.1 Mtodo tradicional de avaliaosemiquantitativa (em cruzes)

Critrios

Nmero de campos a examinar: 100.

Nmero inferior a 40 parasitos nos 100 campos examinados: ano-tar o nmero encontrado. Por exemplo: 37 V.

Quando o nmero total de parasitos contados situar-se entre 40 e60 parasitos por 100 campos, registrar: +/2 (meia cruz).

A partir de um parasito por campo, o resultado ser registradocomo uma, duas, trs ou quatro cruzes, conforme o quadro a seguir:

Parasitoscontados

Nmero de camposmicroscpicos

Cruzes

40 a 60 100 +/21 1 +

2 20 1 ++21 200 1 ++++ 200 1 ++++

7.2 Mtodo de avaliao quantitativa pelacontagem de 100 campos microscpicos

Critrios

Nmero de campos a examinar: 100.

Usar ocular de 7,5x ou 10x e 100x na objetiva do microscpio.

Assumir que nessas condies de leitura 100 campos microscpi-cos equivalem a 0,2 microlitros (l) de sangue.

Multiplicar por 5 o nmero de parasitos encontrados nos 100campos examinados.

Registrar o nmero encontrado no clculo acima como a parasite-mia por l de sangue. Assim, o encontro de um nico parasito em100 campos examinados significa 5 parasitos/l de sangue.


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7.3 Estimativa da parasitemia a partirda avaliao semiquantitativa

Critrios Nmero de campos a examinar: 100.

Classificar a parasitemia em cruzes, de acordo com o mtodo tradi-cional de avaliao semiquantitativa, anteriormente mencionado.

Registrar o intervalo de parasitemia por l, conforme o quadroa seguir, lembrando que 100 campos microscpicos equivalem a0,2l de sangue:

Parasitos por campo Cruzes Parasitos p/ mm3

40 a 60/100 +/2 200 - 300

1 + 301 - 500

2 20 ++ 501 10.000

21 200 +++ 10.001 - 100.000

+ 200 ++++ 100.000 ou mais

7.4 Mtodo de avaliao relativa contagemde leuccitos por campo

Critrios

Nmero de campos a examinar: aqueles que levem ao alcance donmero de leuccitos padronizado. Em geral, contam-se 200 leuc-

citos. Contar simultaneamente o nmero de parasitos assexuados, at al-canar 200 leuccitos.

Assumindo uma leucometria padro de 6.000 leuccitos/l desangue para todo paciente com malria, realizar uma regra de trspara obter a parasitemia/l de sangue. Por exemplo:

Se encontrarmos 50 parasitos assexuados contra 200 leuccitos, tere-mos xparasitos para 6.000 leuccitos

50 200

X 6.000

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Ento x = (50 x 6.000) 200 = 1.500 parasitos/l.

7.5 Mtodo de avaliao pelo percentual

de hemcias parasitadas (utilizado apenaspara esfregao delgado)

Critrios

Nmero de campos a examinar: aqueles que levem ao alcance donmero de 500 hemcias (em geral, de 5 a 10 campos).

Contar simultaneamente o nmero de parasitos assexuados, at al-canar 500 hemcias.

Realizar uma regra de trs para obter a parasitemia percentual. Porexemplo:

Se encontrarmos 50 parasitos assexuados contra 500 hemcias tere-mos um percentual de 10% de hemcias parasitadas, ou seja,

50 500

(50 500) x 100 = 0,1 x 100 = 10%

Esse resultado equivale, em um indivduo com 5.000.000 de hem-cias por microlitro de sangue, a uma parasitemia de 500.000 parasitos/l desangue.


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REGISTROSDERESULTADOSDOEXAMEMICROSCPICO

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8.1 Resultados positivos

Os resultados do exame parasitolgico da gota espessa para as dife-

rentes espcies de plasmdios so registrados nos formulrios do Sistema deInformao de Vigilncia Epidemiolgica Sivep/Malria, pelas respectivasiniciais, conforme o quadro a seguir:

Registro Descrio do resultado

V P. vivax

F P. falciparumM P. malariae

Ov P. ovale

F + Fg Formas assexuadas + sexuadas (gametcitos)deP. falciparum

Fg Somente gametcitos

V+Fg Formas deP. vivax + gametcitos deP. falciparum

F+V

F+MV+M Para diferentes combinaes de infeces mistas

Obs: Em caso de infeco mista, registrar em primeiro lugar ainicial da espcie dominante. Exemplo:15.000F-3Fg-500V (+++F 3Fg +V);5.000V-60M (++V 60M)

Quando do encontro de esquizontes e formas assexuadas mais evo-

ludas de P. falciparum, indicativas de malria grave, importante assinalara sua presena, bem como o achado de pigmento malrico fagocitado porleuccitos.

Na rotina, uma infeco mista F+V aquela na qual encontramos apresena simultnea de anis (trofozotos jovens), formas irregulares (trofo-zotos maduros) de P. vivaxe gametcitos (forma de banana) de P. falcipa-rum. Se o exame da lmina de gota espessa revelar grande quantidade de for-mas em anel (trofozotos jovens), associadas a formas irregulares (trofozotosmaduros de P. vivax) em quantidade bem menor, por exemplo, 20.000 anispara 2.000 formas irregulares, mesmo na ausncia do gametcito em formade banana (P. falciparum), deve-se suspeitar de uma infeco mista F+V ecomunicar o fato ao terapeuta, utilizando o formulrio de resultados.


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8.2 Resultados negativos

Como em qualquer exame microscpico, um resultado negativo deve

ser emitido somente aps minucioso exame da lmina. No caso da gotaespessa, para no deixar de detectar baixas parasitemias, bem como paragarantir o diagnstico das infeces mistas, torna-se necessrio examinarmais de 100 campos microscpicos (500 campos seria o ideal), sobretudo seexistir forte suspeita de malria (clnica e epidemiologia favorveis).

O exame de uma gota espessa padro durante 10 minutos suficientepara se checar aproximadamente 500 campos, possibilitando o registro de umresultado negativo com maior segurana. A concluso diagnstica pelo encon-

tro de um nico parasito na preparao deve ser feita com cautela. Recomenda-se concluir o diagnstico somente aps o encontro de dois ou trs parasitos, bemcomo repetir o exame em diferentes horrios, para aumentar sua sensibilidade.

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TESTESRPIDOSPARAODIAGNSTICODEMALRIA

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Apesar do exame da gota espessa apresentar inquestionvel vanta-gem para o diagnstico, uma srie de fatores pode interferir nos resultadosobtidos, entre eles: a habilidade tcnica no preparo da lmina, seu manuseio

e colorao; qualidade tica e iluminao do microscpio; competncia ecuidado por parte do microscopista; grau de parasitemia.

Considerando-se esses fatores, realizar o diagnstico especficode malria torna-se difcil em muitos locais, seja pela precariedade dosservios de sade, seja pela dificuldade de acesso da populao aos cen-tros de diagnstico. Por esta razo, nos ltimos 15 anos mtodos rpidos,prticos e sensveis vm sendo desenvolvidos.

Em 1986, uma protena rica em histidina, denominada Pf-HRP2,foi identificada no P. falciparum. Posteriormente, verificou-se sua presenano plasma de pacientes agudamente infectados com P. falciparum. A par-tir de 1993, houve grande desenvolvimento de testes imunocromatogrfi-cos baseados na captura qualitativa da Pf-HRP2. Sua desvantagem a per-manncia da protena circulante por tempo prolongado, dando resultadopositivo em indivduos j tratados da doena.

Mais recentemente, mtodos de diagnstico rpido da malria foram

desenvolvidos utilizando anticorpos monoclonais e policlonais dirigidoscontra a protena Pf-HRP2 e contra a enzima desidrogenase lctica (pDHL)das quatro espcies de plasmdio. Estes testes tm a vantagem de diferenciaro P. falciparumdas demais espcies, as quais so identificadas como no-P. falciparum.

A pDHL uma enzima intracelular produzida em abundncia pelosparasitos vivos, o que permite diferenciar a fase aguda e a convalescenada infeco. Possui alta sensibilidade e alta especificidade, sendo til paraa triagem e, mesmo, confirmao diagnstica da malria, principalmen-te para turistas que visitam as reas endmicas. Como desvantagem nopermite o diagnstico de uma infeco mista.

Alguns exemplos comerciais desses testes so descritos a seguir.

9.1 Testes exclusivos para o diagnsticodeP. falciparum

ParaCheck-Pfe Malar-Check baseiam-se na deteco, no sanguedo paciente, da protena Pf-HRP2, atravs de anticorpos monoclonais. A reao revelada macroscopicamente em fita de nitrocelulose, por reao enzimtica.


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9.2 Testes que discriminam oP. falciparumde outras espcies

IC-PfPve OptiMal tambm realizados em fita de nitrocelulose,consistem na deteco, por imunocromatografia, de enzima desidrogenaselctica (pDHL) especfica do gnero Plasmodium, e de outra especfica doP. falciparum (Pf-DHL), presente no sangue total do paciente. Estes testespossibilitam diferenciar uma infeco causada pelo P. falciparumde outracausada por uma ou mais espcies no-P. falciparum entretanto no possi-bilitam identificar as espcies causadoras de malria mista.

9.3 Diagnstico pela deteco do DNAdo parasito

Com o desenvolvimento da tecnologia de amplificao do DNA dosplasmdios usando a reao em cadeia da polimerase (PCR), o diagnsticoda malria baseado na deteco de cido nuclico mostrou grande progressoem termos de eficcia. Alm disso, com a extensa utilizao da PCR parao diagnstico de outras doenas, as tcnicas de extrao e purificao deDNA foram aprimoradas e simplificadas. O diagnstico de malria atravs

da PCR ainda restrito aos grandes laboratrios, em virtude do custo eleva-do, reagentes necessrios e alta complexidade tcnica.

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ELEMENTOSFIGURADOSNORMAISDOSANGUE

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10.1 Eritrcitos ou hemcias(glbulos vermelhos)

Dentre os elementos que compem o sangue esto os eritrcitos ouhemcias, que so os glbulos vermelhos, clulas anucleadas que vivem,no mximo, 120 dias. Derivam da clula-tronco da medula ssea e, ao seremliberados no sangue perifrico, contm resqucios de ncleo, sendo chama-dos reticulcitos. Esses elementos possuem policromasia (basofilia pontea-da) e desaparecem entre 1 e 3 dias aps a liberao pela medula.

Durante o procedimento de colorao da gota espessa de sangue paraa pesquisa de plasmdio, os eritrcitos so lisados pela soluo fosfatada

de azul de metileno. Desta forma, aparecem no campo microscpico comoresduos de glbulos vermelhos ligeiramente azulados.

No caso dos reticulcitos, as clulas variam na aparncia, desde umafina camada at densos grnulos azuis de vrios tamanhos, correspondendoao resqucio nuclear da clula.

Em pessoas normais so encontradas de uma a trs dessas formas,podendo apresentar-se em maior nmero em pacientes com reticulocitose

provocada por maior resposta eritropoitica da medula ssea, tais como nosprocessos hemolticos (como na malria) e hiperesplenismo.

10.2 Leuccitos (glbulos brancos)

Os leuccitos ou glbulos brancos so transparentes e muito bri-lhantes, podendo apresentar movimento no seu citoplasma. Em geral,seus ncleos tm a tonalidade azul-violeta carregado. Variam de tama-nho e forma e o citoplasma pode ser claro ou granuloso, de acordo com otipo da clula. Sua vida curta (de 3 a 5 dias) e a aparncia de alguns tipospolimorfonucleares varia desde elementos compactos, perfeitamente defini-dos e bem corados, at grandes clulas, plidas, irregulares e, muitas vezes,deformadas.

10.3 Plaquetas (trombcitos)

As plaquetas sangneas no tm ncleo. So fragmentos do citoplas-

ma de uma espcie de clula gigante da medula ssea, chamada megacaricito.Podem apresentar-se isoladas ou em grupos. So de diferentes densidadesna mesma lmina, bem como de tamanho e forma, mas a cor varia do rosa


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ao violeta (nunca azul) em amostras diferentes. Podem no ser identificadasem sangue secado lentamente ou desfibrinado. Se as lminas forem cora-das aps decorrido muito tempo da coleta, as plaquetas podem adquirir

colorao suficientemente forte para prejudicar a visualizao de pequenosparasitos.

10.4 Importncia da avaliao dos elementosnormais do sangue

Somente quando os elementos normais do sangue surgem em suascores prprias, pode-se esperar que qualquer parasito presente na lmina

tenha tambm suas cores prprias. Assim, se os ncleos dos leuccitos foremmuito vermelhos em certa rea da amostra, improvvel que se veja cor azul nocitoplasma dos parasitos. Por outro lado, se os leuccitos forem muito azuis,no provvel que a cromatina do parasito apresente cor vermelha suficien-te. Contudo, no se deve deixar de considerar que, ocasionalmente, onde acolorao dos elementos celulares plida ou deficiente, os parasitos podemcontinuar se destacando clara e distintamente por algum tempo.

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ANEXOS


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Anexo A Relao de material paralaboratrio de malria

Colheita de lminas

Lminas de vidro, caixa com 50 unidades

Microlancetas descartveis

Luvas de ltex descartveis

Algodo hidrfilo, pacote com 500g

lcool

Caixa porta-lminas

Etiquetas auto-adesivas

Formulrios

ubo para remessa de lminas

Leno de papel absorvente

Limpeza de lminas novas e usadas

lcool comum

Sabo em p

Bacia plstica, capacidade para 5 litros

oalhas para enxugar lminas

Colorao de lminas

Pissetas, 250ml ou 500ml Placa plstica com bordo para colorao

Proveta graduada, 25ml




Prolas de vidro Giemsa em p, 24g

Azul de metileno em p, 24g


82/116

Fosfato monobsico de potssio, 500g

Fosfato de sdio bibsico, 500g

gua destilada

Glicerol PA

lcool metlico PA

Secador para secagem das lminas (madeira)

Frasco escuro, capacidade para 500 ou 1.000ml

Frasco conta-gotas plstico ou de vidro, 20ml/30ml (para soluode Giemsa)

leo de imerso para microscopia

Obs: 1) odos os frascos devem estar devidamente identificados;2) Para o armazenamento de corantes e diluentes, observar

os cuidados necessrios. Ateno especial deve ser dada notocante ao uso da soluo comercial de Giemsa, pois a mesmanem sempre apresenta a concentrao necessria para umaboa colorao.

S V S / MS

| S V S / MS


83/116

M D L M

M D L M

Anexo B Imagens das diferentesespcies de plasmdios

em esfregao e gota espessa

FOTO3

ESFREGAOCORADOPELO

MTODODEGIEMSA P.

FALCIPARUM(HEMCIASNODILATA-

DAS)

FOTO

Manual Diagnostico Laboratorial Malaria 2ed

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