Manual Poa

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Sªo Paulo LOGOMARCA VARELA 3“ ediªo 2007 Neusely da Silva ValØria Christina Amstalden Junqueira Neliane Ferraz de Arruda Silveira Marta Hiromi Taniwaki Rosana Franscisco Siqueira dos Santos Renato Abeilar Romeiro Gomes Margarete Midori Okazaki MANUAL DE MTODOS DE AN`LISE MICROBIOLGICA DE ALIMENTOS cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:50 1

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  • So PauloLOGOMARCAVARELA

    3 edio2007

    Neusely da SilvaValria Christina Amstalden JunqueiraNeliane Ferraz de Arruda Silveira

    Marta Hiromi TaniwakiRosana Franscisco Siqueira dos SantosRenato Abeilar Romeiro GomesMargareteMidori Okazaki

    MANUAL DE MTODOSDE ANLISE MICROBIOLGICA

    DE ALIMENTOS

    cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:501

  • E24 Educao inclusiva e necessidades educacionais especiais /Soraia Freitas, David Rodrigues, Ruy Krebs (orgs.).Santa Maria, Ed. UFSM, 2005.p.

    ISBN:

    1. Educao 2. Educao especial 3. Incluso escolar4. Incluso social 5. Portadores de necessidades especiaisI. Freitas, Soraia Napoleo II. Rodrigues, David III. Krebs,Ruy Jornada

    CDU 376.1/.5

    Direitos reservados Editora da Universidade Federal de Santa Maria

    Prdio da Reitoria 2 andar Campus UniversitrioCamobi 97105-900 Santa Maria RS

    Fone/fax: (055)3220.8610e-mail: [email protected]

    Ficha catalogrfica elaborada porMaristela Eckhardt CRB-10/737Biblioteca Central - UFSM

    Obra financiada pela CAPES, entidade do Governo Brasileiro voltadapara a formao de Recursos Humanos.

    Projeto grfico: Danclar Rossato - (55) 30284824 - e-mail: [email protected]: Danclar RossatoReviso: autorFiguras: autorImpresso: Pallotti - SMTiragem: ????????????????

    cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:502

  • 3Captulo 1. Coleta, transporte e estocagem de amostras para anlise

    1.1. Introduo.................................................................................................................................................Lote ...........................................................................................................................................................Amostra de lote e unidade de amostra .................................................................................................Planos de amostragem de lotes ..............................................................................................................Unidade analtica ....................................................................................................................................

    1.2. Material necessrio ..................................................................................................................................1.3. Coleta de amostras para anlise .............................................................................................................

    1.3.1. Seleo e preparao de frascos para coleta de alimentosacondicionados em embalagens no individuais .......................................................................

    1.3.2. Procedimentos para a coleta de alimentos acondicionados emembalagens no individuais .........................................................................................................

    1.3.3. Coleta de alimentos envolvidos em casos de doenas de origem alimentar (DTAs) ............1.3.4. Coleta de amostras de gua .........................................................................................................

    1.4. Transporte e estocagem de amostras at o momento da anlise .......................................................1.4.1. Transporte e estocagem de alimentos com baixa atividade de gua ......................................1.4.2. Transporte e estocagem de alimentos congelados ....................................................................1.4.3. Transporte e estocagem de alimentos refrigerados ..................................................................1.4.4. Transporte e estocagem de alimentos comercialmente estreis

    em embalagens hermticas .........................................................................................................1.4.5. Transporte e estocagem de amostras de gua ...........................................................................

    1.5. Recepo de amostras para a anlise .....................................................................................................1.6. Referncias ...............................................................................................................................................

    Captulo 2. Preparao de amostras para anlise2.1. Introduo ................................................................................................................................................2.2. Material ncessrio ....................................................................................................................................2.3. Homogeneizao da amostra e retirada da unidade analtica ...........................................................

    2.3.1. Procedimento para a homogeneizao e retirada da unidade analticade produtos lquidos ....................................................................................................................

    2.3.2. Procedimento para a homogeneizao e retirada da unidade analticade produtos slidos ou lquidos concentrados ..........................................................................

    2.3.3. Procedimento para a retirada da unidade analtica pela tcnicado esfregao de superfcie ..........................................................................................................2.3.3.1. Amostragem com swabs ...............................................................................................2.3.3.2. Amostragem com esponjas .............................................................................................

    Sumrio

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  • 42.3.4. Procedimento para a retirada da unidade analtica pela tcnica da lavagem superficial ....2.3.4.1. Procedimento para a lavagem de carcaas de aves .....................................................2.3.4.2. Procedimento para a lavagem de outros alimentos ....................................................2.3.4.3. Procedimento para a lavagem de embalagens ............................................................

    2.3.5. Guarda de contra-amostras ..........................................................................................................2.4. Preparo da 1 diluio da unidade analtica ........................................................................................

    Diluentes para os ensaios de presena/ausncia .................................................................................Diluentes para os ensaios que requeiram tratamento diferenciado da amostra ..............................Diluentes para os ensaios gerais de quantificao ................................................................................Como obter uma diluio inicial 1:10 (10-1) .........................................................................................Como obter uma diluio inicial diferente de 1:10 .............................................................................Procedimento para o preparo da primeira diluio de amostras lquidas ........................................Procedimento para o preparo da primeira diluio de amostras slidasou lquidos concentrados ........................................................................................................................Procedimento para o preparo da primeira diluio de amostras obtidaspor esfregao de superfcie ou por lavagem superficial .....................................................................

    2.5. Diluio decimal seriada da amostra .....................................................................................................Como obter a 2 diluio (10-2) ..............................................................................................................Como obter as diluies subsequentes ..................................................................................................

    2.6. Referncias ...............................................................................................................................................

    Captulo 3. Tcnicas bsicas de contagem demicrorganismos em placas3.1. Introduo ................................................................................................................................................3.2. Plaqueamento em profundidade (pour plate) ................................................................................3.3. Plaqueamento em superfcie (spread plate) ....................................................................................3.4. Plaqueamento em gotas (drop plate) ................................................................................................3.5. Filtrao em membrana ..........................................................................................................................3.6. Contagem das colnias e clculo dos resultados ..................................................................................3.7. Referncias ...............................................................................................................................................

    Captulo 4. Tcnicas bsicas de contagem demicrorganismos pelo NmeroMais Provvel4.1. Introduo ................................................................................................................................................4.2. Teste de diluio mltipla ......................................................................................................................4.3. Teste de diluio nica ...........................................................................................................................4.4. Clculo dos resultados .............................................................................................................................4.5. Referncias ...............................................................................................................................................

    Captulo 5. Tcnicas bsicas de deteco da presena/ausncia demicrorganismos5.1. Introduo ................................................................................................................................................5.2. Material requerido nas anlises ..............................................................................................................5.3. Procedimento ..........................................................................................................................................

    a) Pr enriquecimento ..........................................................................................................................Composio de amostras a seco ........................................................................................................

    b) Enriquecimento seletivo ...................................................................................................................Composio mida de amostras em ensaios com duas etapas de enriquecimento ....................

    c) Plaqueamento diferencial ................................................................................................................c.1) Tcnica de inoculao por estrias de esgotamento para obter culturas puras ...................

    d) Seleo de colnias e repique de culturas para confirmao.......................................................

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  • 5Tcnica de repique de culturas puras a partir de colnias isoladas em placas ...........................e) Testes de confirmao.......................................................................................................................

    e.1) Colorao de Gram (mtodo de Hucker) ..............................................................................e.2) Colorao de esporos (mtodo de Schaeffer-Fulton) ...........................................................e.3) Colorao de esporos (mtodo de Ashby) ..............................................................................e.4) Montagens midas para observao microscpica a fresco ...................................................

    5.4. Referncias ...............................................................................................................................................

    Captulo 6. Contagem total demicrorganismos aerbiosmesfilos e psicrotrficos em placas6.1. Introduo ................................................................................................................................................6.2. Mtodo de contagem total de aerbios mesfilos em placas ..............................................................6.3. Mtodo de contagem total de aerbios mesfilos em Petrifilm ...................................................6.4. Mtodo de contagem total de aerbios psicrotrficos .........................................................................6.5. Referncias ...............................................................................................................................................

    Captulo 7. Contagem de bolores e leveduras7.1. Introduo ................................................................................................................................................7.2. Mtodo de contagem de bolores e leveduras em placas .....................................................................7.3. Mtodo de contagem de fungos psicrotrficos ....................................................................................7.4. Mtodo de contagem de bolores termorresistentes ............................................................................7.5. Referncias ...............................................................................................................................................

    Captulo 8. Contagem de enterobactrias8.1. Introduo ................................................................................................................................................

    Taxonomia ................................................................................................................................................Mtodos de anlise ..................................................................................................................................

    8.2. Mtodo de contagem em placas de VRBG ...........................................................................................8.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) ...........................................................................................8.4. Mtodo do Petrifilm.......................................................................................................................8.5. Referncias ...............................................................................................................................................

    Captulo 9. Contagem de coliformes totais, coliformes termotolerantes eEscherichia coli9.1. Introduo ................................................................................................................................................

    Definio de coliformes totais ................................................................................................................Defnio de coliformes termotolerantes ..............................................................................................E. coli ...............................................................................................................................................Aplicao como indicadores ...................................................................................................................Mtodos de anlise ..................................................................................................................................

    9.2. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) (coliformes totais/termotolerantes/E. coli) .................9.3. Mtodo de plaqueamento em VRB (coliformes totais) ......................................................................9.4. Mtodo do ColiComplete AOAC 992.30 (Coliformes totais/E. coli) ..............................................9.5 Mtodo do Petrifilm (coliformes totais/E. coli) ................................................................................9.6. Referncias ..............................................................................................................................................

    Sumrio

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  • 6Captulo 10. Staphylococcus aureus10.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Principais caractersticas de S. aureus ............................................................................................Mtodos de anlise ................................................................................................................................

    10.2. Mtodo de contagem direta em placas ...............................................................................................10.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) .........................................................................................10.4. Teste de presena/ausncia .................................................................................................................10.5. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 11.Bacillus cereus11.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Grupo B. cereus ...............................................................................................................................B. anthracis .....................................................................................................................................B. thuringiensis ................................................................................................................................B. mycoides ......................................................................................................................................B. pseudomycoides .............................................................................................................................B. weihenstephanensis .......................................................................................................................Principais caractersticas de B. cereus .............................................................................................Mtodos de anlise ................................................................................................................................

    11.2. Mtodo de contagem direta em placas ...............................................................................................11.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) .........................................................................................11.4. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 12. Clostrdios sulfito redutores eClostridium perfringens12.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Principais caractersticas de C. perfringens ......................................................................................Clostrdios sulfito redutores a 46C .....................................................................................................Mtodos de anlise de C. perfringens ..............................................................................................Mtodos de anlise de clostrdios sulfito redutores a 46C ...............................................................

    12.2. Mtodo de plaqueamento direto (C. perfringens) ...............................................................................12.3. Teste de presena/ausncia (C. perfringens) .......................................................................................12.4. Mtodo de contagem em placas (clostrdios sulfito redutores a 46C)...........................................12.5. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 13. Contagem de enterococos13.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Importncia em alimentos ....................................................................................................................Mtodos de anlise ................................................................................................................................

    13.2. Mtodo de contagem em placas ..........................................................................................................13.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) .........................................................................................13.4. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 14 Contagem de bactrias lticas14.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Leuconostoc ......................................................................................................................................Pediococcus .................................................................................................................... ...................Streptocccus .......................................................................................................................................

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  • 7Lactobacillus ....................................................................................................................................Enterococcus ......................................................................................................................................Lactococcus .......................................................................................................................................Carnobacterium ................................................................................................................................Vagococcus .......................................................................................................................................Tetragenococcus ................................................................................................................................Weissella ..........................................................................................................................................Oenococcus .......................................................................................................................................Mtodos de anlise ................................................................................................................................

    14.2. Mtodo de contagem em placas ..........................................................................................................14.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) .........................................................................................14.4. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 15.Campylobacter15.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Taxonomia ..............................................................................................................................................Patogenicidade ......................................................................................................................................Mtodos de anlise ................................................................................................................................

    15.2. Mtodo de presena/ausncia ISO 10272-1 (2006) .........................................................................15.3. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 16. Enterobacter sakazakii16.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Taxonomia ..............................................................................................................................................Caractersticas nutricionais e de crescimento ....................................................................................Epidemiologia ........................................................................................................................................Ecologia ...................................................................................................................................................Mtodos de anlise ................................................................................................................................

    16.2. Mtodo de presena/ausncia ISO/TS 22964 (2006) .....................................................................16.3. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 17.Escherichia coliO157:H717.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Sorotipagem ...........................................................................................................................................Patogenicidade ......................................................................................................................................Sorotipos STEC mais envolvidos em surtos .........................................................................................E. coli O157:H7 em alimentos ...............................................................................................................Taxonomia ..............................................................................................................................................Mtodos de deteco ............................................................................................................................

    17.2. Mtodo BAM/FDA ................................................................................................................................17.3. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 18.Listeria monocytogenes18.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Taxonomia ..............................................................................................................................................Patogenicidade ......................................................................................................................................Mtodos de anlise ................................................................................................................................

    Sumrio

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  • 818.2. Mtodo BAM/FDA ................................................................................................................................18.3. Mtodo MLG/FSIS/USDA ...................................................................................................................18.4. Mtodo de plaqueamento direto .........................................................................................................18.5 Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 19. Salmonella19.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Classificao taxonmica de Salmonella .........................................................................................Classificao sorolgica de Salmonella ............................................................................................Caractersticas bioqumicas de SalmonellaEpidemiologia ........................................................................................................................................Mtodos tradicionais de anlise de Salmonella ...............................................................................Mtodos alternativos de anlise de Salmonella ...............................................................................Composio de amostras para a anlise ...............................................................................................

    19.2. Mtodo ISO 6579 (2002)......................................................................................................................19.3 Mtodo BAM/FDA (2005) ...................................................................................................................19.4. Mtodo MLG/FSIS/USDA ...................................................................................................................19.5. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 20. Vibrios patognicos20.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Taxonomia ..............................................................................................................................................Epidemiologia ........................................................................................................................................V. cholerae .......................................................................................................................................V. parahaemolyticus ..........................................................................................................................V. vulnificus .....................................................................................................................................Mtodos de anlise ................................................................................................................................

    20.2. Mtodo APHA/BAM/FDA (presena/ausncia de Vibrio cholerae) .................................................20.3. Mtodo APHA/BAM/FDA (NMP de Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus) .............................20.4. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 21. Yersinia enterocolitica21.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    Taxonomia ..............................................................................................................................................Epidemiologia ........................................................................................................................................Mtodos de anlise ................................................................................................................................

    21.2. Mtodo APHA de deteco ..................................................................................................................21.3. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 22. Contagem de esporos de bactrias22.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    22.1.1.Taxonomia das bactrias esporognicas importantes em alimentos ....................................Bacillus ................................................................................................................................Clostridium ...........................................................................................................................Sporolactobacillus ...................................................................................................................Desulfotomaculum .................................................................................................................Alicyclobacillus ......................................................................................................................

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  • 9Thermoanaerobacterium .........................................................................................................Paenibacillus .........................................................................................................................Aneurinibacillus ....................................................................................................................Brevibacillus ..........................................................................................................................Virgibacillus ..........................................................................................................................Geobacillus ............................................................................................................................

    22.2. Mtodos de contagem de esporos de termfilos aerbios totais e flat sour .................................22.3. Mtodos de deteco de esporos de termfilos anaerbios no-produtores de H

    2S .....................

    22.4. Mtodos de contagem de esporos de termfilos anaerbios produtores de H2S ..........................

    22.5. Mtodos de contagem de esporos de mesfilos aerbios ..................................................................22.6. Mtodos de contagem de esporos de mesfilos anaerbios .............................................................22.7. Mtodos para deteco ou contagem de Alicyclobacillus ................................................................22.8. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 23. Esterilidade comercial ou causa da deteriorao23.1. Introduo ..............................................................................................................................................

    23.1.1.Parmetros de avaliao da resistncia trmica dos microrganismos ...................................Curva de sobrevivncia e tempo de reduo decimal (valor D) ..........................................Nmero de redues decimais ................................................................................................Curva de destruio trmica e coeficiente de temperatura (valor z) .................................

    23.1.2.Valores D e z de microrganismos de importncia em alimentos ..........................................Clulas vegetativas ......................................................................................................................Esporos de bolores termorresistentes ......................................................................................Esporos de bactrias ...................................................................................................................

    23.1.3.Dimensionamento de processos trmicos ...............................................................................23.1.4.Deteriorao microbiana de alimentos enlatados ..................................................................

    Subprocessamento .....................................................................................................................Vazamento ..................................................................................................................................Deteriorao por termfilos estritos ........................................................................................Multiplicao microbiana antes do tratamento trmico ........................................................Causas no microbianas de deteriorao.................................................................................

    23.2. Teste de esterilidade comercial e determinao da causa dadeteriorao de alimentos de baixa acidez .........................................................................................

    23.3. Teste de esterilidade comercial e determinao da causa da deterioraode alimentos cidos ................................................................................................................................

    23.4. Referncias .............................................................................................................................................

    Captulo 24. Cuidados na preparao de meios de cultura e reagentes para anlisesmicrobiolgicas24.1. Introduo

    24.1.1. Ingredientes utilizados na formulao de meios de cultura .................................................24.1.1.1. gua para o preparo de meios e reagentes ............................................................24.1.1.2. Fontes de nutrientes em meios de cultura .............................................................24.1.1.3. Agentes seletivos .........................................................................................................24.1.1.4. Agentes diferenciais ..................................................................................................24.1.1.5. Agentes redutores ......................................................................................................24.1.1.6. Agentes tamponantes ................................................................................................24.1.1.7. Substratos cromognicos e fluorognicos ...............................................................24.1.1.8. gar .............................................................................................................................

    Sumrio

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  • 10

    24.1.2.Classificao dos meios de cultura ...........................................................................................24.2. Procedimento para a preparao de meios de cultura .....................................................................

    24.2.1.Armazenamento dos insumos para preparo de meios de cultura........................................21.2.2.Pesagem e rehidratao ............................................................................................................24.2.3.Dissoluo e disperso ...............................................................................................................21.2.4.Verificao e ajuste do pH antes da esterilizao ...................................................................24.2.5.Distribuio .................................................................................................................................24.2.6.Esterilizao pelo calor mido ..................................................................................................24.2.7. Esterilizao por filtrao .........................................................................................................24.2.8. Verificao do pH depois da esterilizao ..............................................................................24.2.9. Preparao dos suplementos para meios de cultura .............................................................24.2.10. Estocagem dos meios esterilizados at o momento do uso.................................................24.2.11. Preparao dos meios no momento do uso .........................................................................

    24.3. Referncias

    Captulo 25. Preparao dematerial de laboratrio para anlises microbiolgicas25.1. Descontaminao e descarte de resduos contaminados ..................................................................25.2. Lavagem ..................................................................................................................................................25.3. Acondicionamento ................................................................................................................................25.4. Esterilizao ............................................................................................................................................25.5. Preparo de vidraria nova .......................................................................................................................25.6. Controle de qualidade do material .....................................................................................................25.7. Referncias .............................................................................................................................................Anexo 1. Preparo de meios e reagentes para as anlises ............................................................................Anexo 2. Resoluo RDC No 12 de 02 de janeiro de 2001 .........................................................................Anexo 3. Fatores que afetam o crescimento de microrganismos em alimentos.......................................

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    Apresentao

    Desde sua primeira edio, em 1997, este livro foi preparado para fornecer um manual demtodos em portugus, com a metodologia recomendada pela Agncia Nacional de VigilnciaSanitria (ANVISA), do Ministrio da Sade. So mtodos oficiais da American Public HealthAssociation (APHA), Food and Drug Adminstration (FDA), Food Safety and Inspection Servicedo United States Department of Agriculture (FSIS/USDA), Association of Official AnalyticalChemists (AOAC) e International Organization for Standardization (ISO).

    O texto foi preparado para atender tanto aos profissionais com formao acadmica, quan-to aos tcnicos de laboratrio, sem formao de nvel superior. Acreditamos que esse objetivo foiatingido: omanual oferece ummaterial de contedo profundo, moderno e atualizado, mas apre-sentado de forma didtica, com textos e esquemas que facilitam a compreenso.

    Nessa terceira edio, todos os mtodos foram revistos e atualizados, de acordo com as no-vas edies do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (APHA, 4a Edio,2001), StandardMethods for the Examination ofWater&Wastewater (APHA, 21a edio, 2005), StandardMethods for the Examination of Dairy Products (APHA, 17a edio, 2004), Official Methods of Analysis ofAOAC International (AOAC, 18a edio, 2005), Bacteriological Analytical Manual (FDA, atualizadopor captulos, online), Microbiology Laboratory Guidebook (FSIS/USDA, atualizado por captulos,online) e ltimas edies das normas ISO.

    Foram introduzidos novos captulos, com tcnicas bsicas de microbiologia, que sero degrande valia para pessoal tcnico em formao.

    Foi introduzida, no incio de cada captulo, uma reviso extensiva da literatura, apresentan-do o que h de mais recente sobre o assunto tratado no captulo. Esse material oferece uma baseterica slida, que ser de grande valia para a compreenso da metodologia e interpretao dosresultados.

    Finalmente, foram introduzidas as mudanas de nomenclatura das bactrias relevantes emalimentos, ocorridas at dezembro de 2006. Para bactrias Gram negativas, foi utilizada a classifi-cao e nomenclatura do Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2o Ed (2005). Para bactrias Grampositivas, foi utilizada a classificao e nomenclatura do International Journal of Systematic andEvolucionary Microbiology (revista oficial do International Committee on Systematic Bacteriology),porque ainda no foram publicados os volumes do Bergeys Manual para Gram positivos.

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    DOS AUTORES

    Neusely da Silva Engenheira de Alimentos, com Doutorado em Cincias de Alimentospela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). vice diretora do Laboratrio deMicrobiologia do Instituto de Tecnologia de Alimentos de Campinas (ITAL), rgo de pesquisada Secretaria de Agricultura do Estado de So Paulo. Exerce atividades de pesquisa, desenvolvi-mento e inovao (P&D&I) para o setor de alimentos, com vrios livros e artigos cientficos publi-cado no Brasil e no exterior. Sua rea de concentrao o desenvolvimento, adequao, avalia-o e validao de novos mtodos de anlise microbiolgica de gua e alimentos. Endereo ele-trnico: [email protected].

    Valria Christina Amstalden Junqueira biloga, com Doutorado em Tecnologia de Ali-mentos pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Pesquisadora do Laboratrio deMicrobiologia do ITAL, concentra suas atividades no estudo da deteriorao de alimentos termo-processados e no estudo de bactrias anaerbias patognicas de importncia em gua e alimen-tos, incluindo Clostridium perfringens e Clostridium botulinum. Possui uma ampla experincia deconsultoria a industrias privadas processadoras de alimentos principalmente em produtos conta-minados por microrganismos anaerbios patognicos e deteriorantes. Endereo eletrnico:[email protected].

    Neliane Ferraz de Arruda Silveira biloga com Doutorado em Tecnologia de Alimentospela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), na rea de higiene e legislao de alimen-tos. Pesquisadora do Laboratrio deMicrobiologia do ITAL, concentra suas atividades no contro-le da qualidademicrobiolgica de alimentos, com nfase em pescadomarinhos de gua salgada edoce; frutas e hortalias minimamente processadas, alimentos servidos em refeies coletivas eprodutos crneos. Endereo eletrnico: [email protected].

    Marta Hiromi Taniwaki biloga, com Doutorado na Universidade de New South Wales,em Sydney-Australia. diretora do a Unidade Laboratorial de Referncia em Microbiologia doITAL, onde exerce atividades de pesquisa, desenvolvimento e inovao (P&D&I). Expert emmicologia de alimentos, membro da International Commission on FoodMycology (ICFM), pres-ta consultoria a empresas pblicas e privadas, para o controle de fungos emicotoxinas em alimen-tos. Endereo eletrnico: [email protected].

    Rosana Francisco Siqueira dos Santos biloga, com mestrado em Cincias de Alimentospela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Gerente do Laboratrio deMicrobiologiado ITAL, exerce atividades de pesquisa, desenvolvimento e inovao (P&D&I). Concentra suasatividades no estudo de Enterobacter sakazakii e mtodos para sua deteco. Endereo eletrnico:[email protected].

    Renato Abeilar RomeiroGomes Engenheiro Agrcola, commestrado emEngenharia Agr-cola pela Universidade Federal de Viosa. Diretor do Centro de Informao em Tecnologia deAlimentos (CIAL) do ITAL, concentra suas atividades na divulgao de informaes tecnolgicaspara o setor de alimentos. Endereo eletrnico: [email protected].

    Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos

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    Captulo1

    Coleta, Transporte e Estocagemde Amostras para Anlises

    1.1 INTRODUO

    A maioria das recomendaes contidas nesse captulo so da American Public HealthAssociation (APHA), descritas na 4 Edio do Compendium ofMethods forMicrobiological Examinationof Foods (Downes & Ito, 2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium, foramtambm includas recomendaes da 21 Edio do Standard Methods for the Examination of Waterand Wastewater (Hunt & Rice, 2005), especficas para a anlise de gua, da 17 Edio do StandardMethods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank, 2004), especficas para a anlise deprodutos lcteos e de normas da InternationalOrganization for Standardization (ISO 6887-4:2003,ISO 7218:1996), recomendadas para ensaios realizados commetodologia ISO.

    Alguns termos utilizados ao longo do texto so oriundos da terminologia relacionada com aamostragem de lotes e devem ter seu significado corretamente compreendido:

    LoteLote definido como uma quantidade de alimento de mesma composio e caractersticas

    fsicas, qumicas e sensoriais, produzida e manuseada numa mesma batelada, sob as mesmascondies. Na prtica, lote geralmente a quantidade de alimento produzida dentro de um inter-valo de tempo de funcionamento de uma linha de produo, sem interrupo.

    Amostra de lote e unidade de amostraAmostra de lote uma frao do total produzido, retirada ao acaso, para avaliar as condi-

    es do lote. No caso de alimentos acondicionados em embalagens individuais, composta de nembalagens individuais. No caso de grandes massas de alimentos, no acondicionados em emba-lagens individuais, composta de n alquotas do produto. As embalagens ou alquotas individuaisso chamadas de unidades de amostra e, para a avaliao do lote, so analisadas separadamente.A partir do conjunto de resultados da anlise das n unidades de amostra, possvel inferir ascaractersticas de todo o lote, mas o resultado da anlise de uma nica unidade de amostra nopode ser tomado como representativo do lote.

    Nas anlises de Salmonella, cujo padro em alimentos ausncia em qualquer das unidadesde amostra, comum a prtica de compor (misturar) as unidades de amostra, para realizar umnico ensaio. A presena na amostra composta inaceitvel, independente de quantas ou quaisunidades de amostra estejam contaminadas. Maiores detalhes so apresentados no captulo espe-cfico de Salmonella.Planos de amostragem de lotes

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    Sempre que se tratar da avaliao de lotes ou partidas, a tomada das n unidades de amostradever seguir um plano de amostragem estatstico adequado. Os mais utilizados so os planos deduas ou trs classes estabelecidos pela International Commission onMicrobiological Specificationsfor Foods (ICMSF, 2002), adotados pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA).

    Oplano de duas classes classifica os lotes emduas categorias, aceitvel ou inaceitvel, depen-dendo dos resultados da anlise das n unidades de amostra. So os mais aplicados no caso deensaios de presena/ausncia, como Salmonella, por exemplo, em que ausncia aceitvel e apresena em qualquer das n unidades de amostra inaceitvel.

    O plano de trs classes classifica os lotes em trs categorias, aceitvel, qualidade interme-diria mas aceitvel e inaceitvel. So recomendados para ensaios qualitativos, para os quais opadro no ausncia, mas sim, valores dentro de uma faixa entrem eM. Os parmetros utiliza-dos nesses planos, para a tomada de decises a respeito dos lotes so:

    n: o nmero de unidades de amostras a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote,para serem analisadas individualmente. As n unidades de amostra constituem a amostra re-presentativa do lote. Para ensaios de presena/ausncia, no quantitativos (Salmonella ouListeriamonocytogenes, por exemplo) as unidades de amostra podero ser compostas e realizada umanica anlise, porm, na composio das amostras devem ser consultadas e obedecidas asorientaes dos captulos relacionados aos ensaios especficos em questo.

    m: o padro microbiolgico estabelecido para um dado microrganismo, num dado alimento.Em um plano de trs classes esse valor separa um lote aceitvel de um lote com qualidadeintermediria aceitvel.

    M: um limite tolervel, acima do padro, que pode ser atingido por algumas (c) unidades deamostra, mas no pode ser ultrapassado por nenhuma. Em um plano de duas classes,M sepa-ra o lote aceitvel do inaceitvel. Em um plano de trs classes, separa o lote com qualidadeintermediria aceitvel do lote inaceitvel.

    c: dentre as n unidades de amostra que constituem a amostra representativa do lote, c o nme-ro mximo de unidades que podem ser aceitas com contagens acima do padrom, desde queno acima do limiteM. Nos casos em que o padro microbiolgico ausncia, c igual a zeroe aplica-se o plano de duas classes.

    Unidade analticaA unidade de amostra geralmente contm uma quantidade de produto maior do que a

    necessria para a anlise, porque, ao se coletar uma unidade de amostra, h sempre o cuidado dese tomar quantidades suficientes para estocagem de contra-amostras e preveno de perdas poracidente. Unidade analtica a quantidade de alimento efetivamente utilizada na realizao deum ou mais ensaios da unidade de amostra. O nmero de unidades analticas necessrias para aanlise depende do nmero e tipos de ensaios que sero realizados na mesma unidade de amos-tra, sendo uma para os ensaios gerais de quantificao (contagem total de aerbios mesfilos,contagem de bolores e leveduras, contagem de coliformes totais/fecais/E. coli, contagem deS. aureus, contagem de B. cereus, contagem de C. perfringens), uma para cada ensaio de presena/ausncia (Salmonella, Listeria monocytogenes e todos os outros que requeiram enriquecimento emcaldo especfico) e uma para cada outro ensaio que requeira tratamento diferenciado da amostra(contagem de esporos de bactrias, contagem de bolores termorresistentes e outros).

    Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos

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    1.2 MATERIAL NECESSRIO

    Frascos e utenslios para coleta Frascos ou bolsas plsticas estreis de capacidade variada Esptulas Facas Colheres Tesouras Pinas Caladores Amostradores verticais de tubo duplo Amostradores tipo corer Furadeira eltrica e brocas esterilizadas Caixas de isopor com gelo seco ou sachs de geloreutilizvel em gel

    Reagentes e diluentes Etanol 70% Soluo de hipoclorito de sdio a 100mg/l Soluo 3% ou 10% de tiossulfato de sdio (Na2S2O3) Soluo 15% de EDTA Soluo Tamponada Glicerol Sal

    Equipamentos Freezer com temperatura abaixo de 20oC negativos com termmetro calibrado Refrigerador com temperatura entre 0 e 4oC com termmetro calibrado

    1.3 COLETA DE AMOSTRAS PARA ANLISE

    Sempre que possvel, amostras de alimentos acondicionados em embalagens individuaisdevem ser coletadas e encaminhadas ao laboratrio na sua embalagem comercial original, fecha-da e intacta. Cada embalagem unitria do produto constitui uma unidade de amostra e devem sercoletadas tantas unidades de amostra quantas forem requeridas pelo plano de amostragem. Se aembalagem unitria contiver uma quantidade de alimento insuficiente para as anlises e guardade contra amostras, deve-se coletar vrias embalagens unitrias, como parte de uma mesma uni-dade de amostra. No momento da anlise, deve-se juntar o contedo dessas diversas embalagensem um nico frasco estril, misturando-se bem e retirar a unidade analtica da mistura. Se oproduto no permitir mistura, deve-se tomar, de cada uma das embalagens unitrias, pores depeso aproximadamente igual, para compor a unidade analtica daquela unidade de amostra.

    No caso de alimentos contidos em tanques ou grandes embalagens, impossveis de seremtransportadas ao laboratrio, deve-se transferir pores representativas da massa total para fras-cos ou bolsas de coleta estreis, sob condies asspticas.

    Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises

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    1.3.1 SELEO E PREPARAODE FRASCOS PARA COLETA DE ALIMENTOSACONDICIONADOS EMEMBALAGENSNO INDIVIDUAIS

    a) Utilizar frascos ou bolsas com tampas prova de vazamentos, dematerial no txico, aprovadopara contato com alimentos e, de preferncia, autoclavveis ou pr-esterilizados. No reco-mendvel o uso de frascos de vidro devido ao risco de quebra, contaminao do ambiente decoleta com cacos de vidro e perda do contedo.

    b) Escolher frascos com tamanho adequado para a quantidade de alimento que ser coletada.Para definir a quantidade de amostra a ser coletada, considerar que cada unidade de amostradeve conter, no mnimo, duas vezes o nmero de unidades analticas que sero utilizadas nosensaios, de preferncia, trs a quatro vezes esse valor, para a separao da contra-amostra epreveno de possveis perdas. Levar em conta, ainda, o fato de que os frascos de coleta nodevem ser completamente preenchidos pelo alimento, sendo recomendvel utilizar, no mxi-mo, trs quartos de sua capacidade, para facilitar a posterior homogeneizao da amostra,antes da retirada da(s) unidade(s) analtica(s).

    c) Os frascos e utenslios no pr-esterilizados que sero utilizados na coleta (esptulas, colheres,tesouras, pinas, caladores, etc.) devem, de preferncia, ser esterilizados individualmente emautoclave (121oC/30 minutos) ou em estufa de esterilizao (17010oC/2h). Alguns outrosmtodos que podem ser utilizados como alternativa so a flambagem em chama, a imerso emetanol e combusto do lcool (no elimina esporos) e o tratamento com solues desinfetan-tes. Nesse ltimo caso devem ser usados desinfetantes aprovados para superfcies de contatocom alimentos, aplicados conforme a orientao dos fabricantes e seguidos de 12 enxgescom gua destilada estril, para a remoo dos resduos. Frascos ou bolsas no estreis queapresentem, num teste de lavagem da superfcie interna, contagem demicrorganismos viveismenor do que 1 UFC/ml de capacidade, podem ser utilizados sem esterilizao prvia.

    1.3.2 PROCEDIMENTOS PARA ACOLETADE ALIMENTOS ACONDICIONADOS EMEMBALAGENSNO INDIVIDUAIS

    a) Antes de iniciar a coleta da unidade de amostra, promover uma mistura de toda a massa dealimento, para garantir que a distribuio dos microrganismos seja homognea. Retirar en-to, com utenslios ou instrumentos adequados, a quantidade de produto necessria paracompor a unidade de amostra.

    b) Se no for possvel promover amistura damassa de alimentos antes do incio da amostragem,retirar pores de diferentes partes do contedo, at obter a quantidade de produto adequa-da para compor a unidade de amostra. Evitar a retirada de pores das regies prximas superfcie ou abertura do tanque ou volume.b1) Para coletar amostras de p, em diferentes partes de tanques ou grandes embalagens,

    podem ser utilizados caladores ou amostradores verticais de tubo duplo, com compri-mento suficiente para atingir o centro da massa de alimento. Usar um amostrador est-ril diferente para cada unidade de amostra coletada, ou desinfetar o instrumento entreuma amostragem e outra.

    b2) Para compor uma unidade de amostra com pores de diferentes pontos de alimentosem grandes peas slidas, deve-se usar facas, pinas e frceps estreis para cortar peda-os menores do alimento.

    b3) No caso de grandes blocos de alimentos congelados, como blocos de pescados e frutosdo mar, blocos de ovo lquido, etc., o mais adequado utilizar uma furadeira eltrica

    Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos

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    (comabroca previamente esterilizada) combinada comum funil estril. A broca inseridano funil (cujo dimetro de abertura inferior deve ser apenas ligeiramente maior que odimetro da broca) e encostada no ponto do bloco que se deseja amostrar. Liga-se afuradeira e as raspas congeladas do alimento vo-se dirigindo para a superfcie, sendocoletadas no funil, de onde podem ser transferidas para um frasco de coleta adequado.

    b4) Quando a coleta for feita atravs de torneiras ou tubulaes, limpar a parte externa dasada com etanol 70%, flambar, se omaterial for resistente ao fogo, e deixar escoar umacerta quantidade do produto, antes de iniciar a coleta. Isso vai promover uma lavagemda tubulao e remover os resduos acumulados.

    b5) Para a amostragem de margarina e produtos similares (spreads) a ISO 6887-4 (2003)recomenda remover a camada externa (3 a 5mm) e retirar as unidades de amostra comum amostrador tipo corer, previamente esterilizado. Introduzir o instrumento nadiagonal, sem atingir o fundo, rodar num crculo completo e retirar, trazendo uma por-o cnica do produto.

    c) Lembrar que a superfcie externa dos frascos e bolsas de coleta no estril. Assim, no segu-rar os frascos ou bolsas diretamente acima da massa de alimento, pois podem cair ou introdu-zir contaminantes no produto. Da mesma forma, nunca introduzir um frasco de coleta direta-mente no produto,mas sim, utilizar umutenslio adequado para retirar as unidades de amostra.

    d) Ao retirar o instrumento de coleta cheio com o produto coletado, no manuse-lo sobre osoutros instrumentos pr-esterilizados, pois respingos do alimento podem contaminar os quesero utilizados posteriormente.

    e) Abrir os frascos ou bolsas de coleta apenas o necessrio para introduzir o produto e fecharimediatamente.

    f) No tocar a superfcie interna dos frascos ou bolsas de coleta e suas tampas.g) Alimentos contaminados podem conter microrganismos perigosos para a sade. Essas amos-tras devem ser coletadas por pessoal bem treinado namanipulao demicrorganismos, cientedos cuidados necessrios para sua prpria proteo. Na dvida, tratar cada amostra como seestivesse contaminada.

    1.3.3 COLETA DE ALIMENTOS ENVOLVIDOS EM CASOS DE DOENAS DEORIGEMALIMENTAR (DTAS)Coletar e analisar amostras de todos os alimentos suspeitos, o mais cedo possvel. Entretan-

    to, no adianta coletar amostras de alimentos que tenham sofrido abuso de temperatura ou quej se encontrem em estado de parcial deteriorao. Os resultados dessas anlises sero de poucaou nenhuma utilidade para as concluses da investigao. Se no houver sobras das refeiessuspeitas, pode-se tentar uma das seguintes alternativas: coletar amostras de refeies similares,preparadas posteriormente sob as mesmas condies, coletar amostras dos ingredientes e mat-ria-prima utilizados na preparao das refeies suspeitas e coletar os vasilhames onde as refei-es suspeitas se encontravam acondicionadas.

    1.3.4 COLETADE AMOSTRASDE GUAO Captulo 60 da 4a Edio do Compendium (Kim & Feng, 2001) trata da coleta de gua

    engarrafada, considerada pelo Codex Alimentarius como alimento. Essas amostras devem sercoletadas na embalagem original, lacrada. Em havendo interesse ou necessidade de coletar volumes

    Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises

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  • menores, a partir de embalagens de maior capacidade, deve-se homogeneizar todo o contedo,invertendo a embalagem vrias vezes, desinfetar o bocal cometanol 70%e, em condies asspticas,abrir o lacre com uma faca ou tesoura estril ou flambada. Desprezar o volume inicial e coletar aamostra em um frasco estril adequado.

    Para a coleta de outros tipos de gua, a parte 9000 da 21a Edio do Standard Methods for theExamination of Water and Wastewater (Hunt & Rice, 2005) traz as seguintes orientaes:

    Para coletar amostras de torneiras e tubulaes, limpar a rea externa da sada comuma soluo de hipoclorito de sdio a 100mg/l ou com etanol 70%, flambando, se o materialfor resistente ao fogo. Abrir totalmente a torneira e deixar a gua fluir por 2 a 3 minutos, paralimpar a tubulao. Reduzir o fluxo para coletar a amostra sem respingos para fora do frasco decoleta.

    Para coletar amostras de gua de poo ou cisterna com bomba, bombear a gua por 5 a10min, para estabilizar a temperatura da gua antes da coleta. Se no houver uma bomba, prepa-rar os frascos de coleta com um peso na base e introduzir o frasco diretamente no poo. neces-srio cuidado para no contaminar a amostra com material acumulado na superfcie da gua.

    Para coletar amostras de gua de rios, lagos ou reservatrios, segurar o frasco de coleta pelabase e mergulhar abaixo da superfcie da gua, com a boca para baixo. Direcionar a boca dofrasco para a corrente de gua e elevar ligeiramente, para que a gua fique retida. Se no houvercorrente de gua, empurrar o frasco para frente horizontalmente, no sentido contrrio ao damo.

    Amostras de gua clorada devem ter o cloro residual neutralizado imediatamente aps acoleta, para impedir a continuao do seu efeito bactericida sobre a microbiota presente. Paratanto, adicionar aos frascos de coleta, antes da esterilizao, 0,1ml de uma soluo 3%de tiossulfatode sdio (Na2S2O3), para cada 100ml de amostra que se pretende coletar. Essa quantidade sufi-ciente para neutralizar 5mg de cloro residual por litro de amostra. Nas situaes emque a concen-trao de cloro residual seja superior a 5mg/l, utilizar 0,1ml de uma soluo 10% de tiossulfato desdio, para cada 100ml de amostra que se pretende coletar. Essa quantidade suficiente paraneutralizar 15mg de cloro residual por litro de amostra. Podem tambm ser utilizadas bolsas pls-ticas ou frascos estreis, disponveis comercialmente j contendo o tiossulfato de sdio. Se a amostrafor coletada e enviada ao laboratrio pelo prprio interessado, sem a prvia neutralizao docloro, adicionar a soluo de tiossulfato de sdio estril imediatamente aps a chegada da amos-tra, sob condies asspticas.

    Amostrasdeguacomteor altodemetais (maiorque1,0mg/l), incluindo cobre e zinco, devemser coletadas em frascos com EDTA (cido etilenodiaminotetraactico), agente quelante parareduzir a toxidade dos metais sobre os microrganismos. Isso particularmente importante se ointervalo entre a coleta e a anlise formaior do que quatro horas. Para tanto, adicionar aos frascosde coleta, antes da esterilizao, 0,3ml de uma soluo 15% de EDTA, para cada 100ml de gua aser coletada (372mg/l). Ajustar o pH da soluo em 6,5 antes do uso. As solues de EDTA etiossulfato podem ser adicionadas ao mesmo frasco.

    1.4 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE AMOSTRASAT O MOMENTO DA ANLISE

    Como regra geral, deve-se transportar e estocar amostras de alimentos da mesma formacomo o produto normalmente transportado e estocado na sua comercializao. As orientaesabaixo devem ser observadas para garantir a integridade do produto at o momento das anlises:

    Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos

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  • 1.4.1 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDE ALIMENTOS COM BAIXA ATIVIDADE DE GUAAlimentos desidratados, secos ou concentrados so estveis microbiologicamente, podendo

    ser transportados e estocados temperatura ambiente. Devem, entretanto, ser protegidos contraa umidade.

    1.4.2 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDEALIMENTOSCONGELADOSAmostras de alimentos comercializados na forma congelada devem ser transportadas e

    mantidas congeladas at o momento da anlise, no podendo sofrer descongelamento total ouparcial durante o transporte. O Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda que a tempera-tura de estocagem dessas amostras no seja superior a 20C negativos. A ISO 7218 (1996) reco-menda temperatura abaixo de 18oC negativos, de preferncia 242oC negativos.

    O transporte deve ser feito em caixas de isopor com gelo seco, porm, certos cuidados de-vem ser observados. O produto no deve entrar em contato com o gelo seco porque a absorodo CO2 pode alterar o pH. Se a tampa da embalagem no vedar a entrada de gases e/ou seembalagem for permevel aos gases e/ou se tornar quebradia com o frio, deve-se usar umaembalagem secundria. Geralmente um embrulho em papel grosso suficiente para preveniresse problema.

    Rtulos e etiquetas usados na identificao das amostras devem ser prova dgua, paraprevenir a perda dos dados.

    1.4.3 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDEALIMENTOSREFRIGERADOSAmostras de alimentos comercializados na forma refrigerada devem ser transportados e

    mantidos sob refrigerao desde a coleta at o momento da anlise. O Compendium (Midura &Bryant, 2001) recomenda, como regra geral, estocagem entre 0 e 4,4oC e intervalo mximo de 36horas entre a coleta e a anlise. A ISO 7218 (1996) recomenda estocagem entre 0 e 4oC (0 a 2oCpara amostras altamente perecveis como pescados e midos) e intervalo mximo de 24 horasentre a coleta e a anlise. Na impossibilidade de se proceder anlise no intervalo de tempopreconizado, as amostras devem ser congeladas e mantidas nas mesmas condies descritas paraamostras congeladas.

    O Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda que o transporte seja feito em caixas deisopor com gelo, sendo recomendvel o uso de sachs de gelo reutilizvel em gel, para evitar oacmulo de lquido nas caixas. Na indisponibilidade de gelo em gel, pode ser utilizado gelo co-mum, desde que acondicionado em bolsas plsticas. Caixas bem fechadas, com espao amplopara gelo, suficiente para envolver todos os frascos de amostra, podem manter temperaturas derefrigerao adequadas por at 48 horas, na maioria das situaes. Como regra geral, essas amos-tras no devem ser congeladas, por isso, no recomendvel o uso de gelo seco nas caixas deisopor. Se o tempo de trnsito for prolongado e houver necessidade de usar gelo seco, as embala-gens de amostras no devem entrar em contato direto com as embalagens de gelo seco, paraevitar o congelamento. Rtulos e etiquetas usados na identificao das amostras devem ser aprova dgua, para prevenir a perda dos dados.

    Excees. Para certos produtos ou microrganismos as recomendaes so diferenciadas:a) No captulo especfico para bactrias lcticas o congelamento no recomendado, devido grande susceptibilidade desses microrganismos s injrias pelo congelamento.

    Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises

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    b)No captulo especfico para vibrios patognicos recmenda-se que as amostras sejam estocadassob resfriamento moderado (7-10C) e analisadas o mais rapidamente possvel, porque a tem-peratura tima de manuteno de 15-18C e a maioria das cepas no sobrevive bem a 4C. Ocongelamento das amostras desaconselhado e, em caso de absoluta necessidade, deve serfeito a 80C negativos.

    c) No caso de C. perfringens devem ser analisadas, se possvel, imediatamente, pois a estocagempor poucos dias sob refrigerao ou congelamento pode levar a uma reduo de 3 a 5 cicloslogartmicos na contagem em placas. Na impossibilidade de se proceder anlise imediata, oCompendium (Labbe, 2001) recomenda sejam refrigeradas pelo menor tempo possvel, nodevendo ser congeladas ou mantidas sob refrigerao prolongada. Havendo necessidade deestocagem por mais de 48 horas, tratar as amostras com Soluo Tamponada Glicerol Sal (naquantidade requerida para atingir a concentrao final de 10% na amostra) e estocar entre 55e 60oC negativos. O Bacteriological Analytical Manual (Rhodehamel &Harmon, 2001) recomen-da que sejam analisadas imediatamente ou refrigeradas por nomais de oito horas, tempera-tura prxima de 10oC. Para transporte e estocagem por perodo superior a oito horas, prepararassepticamente a amostra para o congelamento, da seguinte forma: transferir pores de 25gbolsas plsticas, adicionar 25ml da Soluo Tamponada Glicerol Sal, excluir o ar das bolsas emisturar. Para amostras lquidas, misturar pores de 25ml com igual volume da SoluoTamponada Glicerol Sal, em concentrao dupla. Congelar imediatamente, em freezera 20-30C negativos. Para o transporte, transferir as amostras tratadas para frascos no perme-veis ao CO2 (Nalgene ou equivalente) e transportar em caixa de isopor com gelo seco. Manteras amostras congeladas at o momento da anlise, de preferncia por poucos dias.

    d)No captulo especfico para Campylobacter a ISO 10272-1 (2006) destaca a sensibilidade deCampylobacter ao congelamento e secagem, recomendando que as amostras no sejam con-geladas e que sejam protegidas contra a perda de umidade. Indica estocagem 32oC e anliseo mais rpido possvel. O Microbiological Laboratory Guidebook (Ransom & Rose, 1998) destacaque Campylobacter sensvel ao congelamento e morre temperatura ambiente. Durante aestocagem refrigerada (indica 4oC) pode ser sobrepujado pela microbiota psicrotrfica acom-panhante nas amostras, que devem ser analisadas o mais rpido possvel. Se o congelamentofor inevitvel, devem ser usados agentes criopotetores (glicerol ou dimetil sulfxido na concen-trao de 10% em relao quantidade de amostra). Para a estocagem congelada de swabs,indica Caldo Brucella suplementado com10%de polivinil pirrolidina.OBacteriological AnalyticalManual (Hunt et al., 2001) destaca que Campylobacter sensvel ao ar, secagem, baixo pH, aque-cimento, congelamento e estocagem prolongada, podendo sofrer injrias que dificultam adeteco. Clulas velhas ou estressadas gradualmente adquirem forma cocoide e se tornammais difceis de cultivar. Para estocagem prolongada,C. jejuni subsp jejuni pode sobreviver duasa quatro semanas sob refrigerao (4oC), se for garantida baixa tenso de oxignio e proteocontra perda de umidade (exceto no caso de leite cru). Nas mesmas condies, tambm podesobreviver dois a cincomeses a 20oC negativos. Outras espcies, nas mesmas condies, podemsobreviver (mas no se multiplicar) uma a trs semanas a 4oC (exceto no caso de leite cru). Apopulao diminui dois ciclos logartmicos a 20oC negativos, mas os sobreviventes podem serrecuperados aps mais de cinco meses. Uma vez abertos os frascos ou embalagens, a anlisedeve ser feita o mais rpido possvel, porque a introduo de oxignio particularmente dele-tria para as clulas, j debilitadas pela estocagem prolongada.

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    e) No captulo especfico para contagem de aerbios psicrotrficos, recomenda-se que as amos-tras sejam analisadas no intervalo de seis horas, a partir da coleta. A estocagem refrigeradapermite a multiplicao dos psicrotrficos e o tempo de gerao de vrios desses microrganis-mos encontra-se dentro desse intervalo. O congelamento no indicado para essas amostras,porque pode provocar injria ou morte de vrios microrganismos. Se o congelamento forindispensvel considerar na avaliao dos resultados que parte da microbiota pode ter sidoperdida.

    f) Amostras demoluscos e crustceos (ostras, mexilhes, mariscos, camares, etc. devem ser ana-lisadas dentro de no mximo 6 horas aps a coleta, no devendo ser congeladas (Midura &Bryant, 2001).

    g) Amostras de ovo lquido refrigerado devem ser analisadas, se possvel, dentro de 4 horas apsa coleta, no devendo ser congeladas (Ricke et al., 2001).

    h)Amostras de produtos vegetais fermentados ou acidificados no comercialmente estreis de-vem ser estocadas sob refrigerao por no mais do que 24 horas, no devendo ser congeladas(Fleming et al., 2001).

    1.4.4 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDE ALIMENTOS COMERCIALMENTEESTREIS EM EMBALAGENS HERMTICASAlimentos comercialmente estreis comembalagens em condies normais, podem ser trans-

    portados e estocados temperatura ambiente, devendo ser protegidos contra exposio a tempe-raturas superiores a 45oC. Amostras de refrigerantes engarrafados, comercializados temperatu-ra ambiente, tambm podem ser transportados e estocados nessas condies.

    Embalagens estufadas devem ser acondicionadas em bolsas plsticas devido ao perigo devazamento de material de alto risco microbiolgico. O transporte e a estocagem devem ser feitossob refrigerao (0 a 4C) e o intervalo entre a coleta e a anlise deve ser o menor possvel, nodevendo ultrapassar 48h (ISO 7218:1996). Por outro lado, se a anlise destinar-se confirmaode suspeita de deteriorao por bactrias termfilas, a refrigerao contra-indicada, porque asclulas vegetativas desses microrganismos usualmente morrem sob efeito do frio, no sendo co-mum a ocorrncia de esporulao nos produtos enlatados (Denny & Parkinson, 2001).

    1.4.5 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDE AMOSTRAS DE GUAO Captulo 60 da 4a Edio do Compendium (Kim & Feng, 2001) recomenda:

    a) Para gua engarrafada na embalagem original, lacrada, transporte e estocagem temperaturaambiente, sem necessidade de refrigerao.

    b) Para embalagens abertas ou amostras transferidas para outros frascos, transporte e estocagemsob refrigerao (no especifica a temperatura) e intervalo entre coleta e anlise preferencial-mente de 8h, no devendo ultrapassar 24h.Para outros tipos de gua, a parte 9000 da 21a Edio do Standard Methods for the Examination ofWater and Wastewater (Hunt & Rice, 2005) traz a seguinte orientao:

    a) Como regra geral, transporte e estocagem sob refrigerao (menor que 10oC) e intervalo entrecoleta e anlise no superior a 24h.

    b) Para avaliao da conformidade de gua potvel, transporte e estocagem sob refrigerao (menorque10oC)e intervalo entre coleta e anliseno superior a 30h, paraquantificaode coliformes, ou8h, para a quantificao de heterotrficos (contagem total de aerbios mesfilos em placas).

    c) Para a avaliao da conformidade de gua no potvel, transporte e estocagem sob refrigera-o (menor que 10oC) e intervalo entre coleta e anlise no superior a 8h.

    Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises

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    1.5 RECEPO DE AMOSTRAS PARA ANLISE

    Na recepo de amostras para anlise no laboratrio, devem ser observadas as condies daembalagem e as condies em que foi feito o transporte, antes da aceitao do pedido de anlise.Deve ser recusada qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com corpos estra-nhos ou qualquer outro tipo de defeito, bem como amostras transportadas sob condies inade-quadas. Se o interessado estiver encaminhando amostra com embalagem j aberta ou com seloviolado (comum no caso de amostras encaminhadas para responder a reclamaes de consumi-dores, por exemplo), pode-se proceder anlise, dependendo do tipo de embalagem, tipo deproduto e microrganismos investigados, porm, as condies em que a amostra foi recebida de-vem constar da identificao da amostra e do laudo final de anlise.

    1.6 REFERNCIAS

    AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA). Resoluo RDC 12 de 02 de janeiro de 2001 - Regula-mento Tcnico Sobre PadresMicrobiolgicos para Alimentos. DirioOficial daUnio, 10 jan.2001. Seo 1, p. 45-87.

    DENNY, C.B. & PARKINSON, N.G. Canned foods Tests for cause of spoilage. In: DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.),CompendiumofMethods for theMicrobiological Examination of Foods, 4th ed.Washington:AmericanPublicHealthAssociation(APHA), 2001. Chapter 62, p.583-600.

    DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed.Washington:American Public Health Association (APHA), 2001.

    FLEMING, H.P., McFEETERS, R.F. & BREIDT, F. Fermented and acidified vegatables. In: DOWNES, F. P. & ITO, K(eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed.Washington, D.C.: American PublicHealth Association (APHA), 2001. Chapter 51, p.521-532.

    HUNT, J.M., ABEYTA, C. & TRAN, T. Campylobacter. In: U S Food and Drug Administration (FDA), BacteriologicalAnalyticalManual Online, disponvel no site ,acesso em 23/03/06.Chapter 7, revisedMarch 2001.

    HUNT,M.E. &RICE, E.W.Microbiological examination. In: EATON et al. (Eds), StandardMethods for the Examination ofWater & Wastewater, 21st Ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), American WaterWorks Association (AWWA&Water Environment Federation (WEF), 2005. Part 9000, p.9.1-9.169.

    ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods), 2002. Microrganisms im Foods 7.Microbiological Testing in Food SafetyManagement.Kluwer Academic/PlenumPublishers, New York (ISBN0-306-47262-7).

    ISO 6887-4. Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension anddecimal dilutions formicrobiological examination Part 4:Specific rules for the preparation of products other thanmilk andmilk products, and fish and fishery products, 1st ed. The International Organization for Standardization, 2003.

    ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examination, 2nd ed. TheInternationalOrganization for Standardization, 1996.

    ISO 10272-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection and enumeration ofCampylobacter Part 1: DetectionMethod, 1th ed. The International Organization for Standardization, 2006.

    KIM, H. & FENG, P. Bottled water. In: DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.), Compendium of Methods for the MicrobiologicalExamination of Foods, 4th ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 60,p.573-576.

    LABBE, R.G. Clostridium perfringens. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological

    Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos

    cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:5022

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    Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association,Washington, D. C., 2001. Chapter 34, p.325-330.

    MIDURA,T.F.&BRYANT,R.G. Samplingplans, sample collection, shipment, andpreparation for analysis. In:DOWNES,F. P. & ITO, K (eds.),Compendium ofMethods for theMicrobiological Examination of Foods, 4th ed.Washington: AmericanPublic Health Association (APHA), 2001. Chapter 2, p.13-23.

    RANSOM, G.M. & ROSE, B.E. Isolation, identification, and enumeration of Campylobacter jejuni/coli from meat andpoultry products. In:USDA/FSISMicrobiology Laboratory Guidebook 3rd Ed., 1998.Chapter 6, , acesso em 30/03/06.

    RICKE, S.C., BIRKHOLD, S.G. &GAST, R.K. Egg and egg products. In: DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.), CompendiumofMethods for theMicrobiological Examination of Foods, 4th ed.Washington: American PublicHealth Association (APHA),2001. Chapter 46, p.473-481.

    RHODEHAMEL,E.J.&HARMON,S.M.Clostridiumperfringens. In:USFoodandDrugAdministration (FDA),BacteriologicalAnalyticalManual (BAM)Online, , Chapter 16, reviso de janeirode 2001. Acesso em 20/04/2006.

    Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises

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    Captulo 2

    Preparao de Amostras para Anlise

    2.1. INTRODUO

    Amaioria das orientaes contidas nesse captulo so da American PublicHealth Association(APHA), descritas na 4 Edio do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods(Downes & Ito, 2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium, foram tambmincludas recomendaes da 21 Ediodo StandardMethods for the Examination ofWater andWastewater(Eaton et al., 2005), especficas para a anlise de gua, da 17 Edio do Standard Methods for theExamination of Dairy Products (Wehr & Frank, 2004), especficas para a anlise de produtoslcteos e de vrias normas da International Organization for Standardization (6887-1:1999,ISO 6887-2:2003, ISO 6887-3:2003, ISO 6887-4:2003, ISO 7218:1996, ISO 8261:2001, ISO17604:2003), recomendadas para ensaios realizados commetodologia ISO.

    A preparao das amostras para a anlise envolve trs etapas, que so a homogeneizao docontedo e retirada da unidade analtica, a preparao da primeira diluio da unidade analticae a preparao de diluies decimais seriadas, para inoculao nos meios de cultura.

    Antes de iniciar os procedimentos, a ISO 7218 (1996) recomenda-se que sejam observadosos seguintes cuidados para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies asspticas:

    Assegurar-se de que a rea de trabalho est limpa e as portas e janelas fechadas, para evitarcorrentes de ar.

    Desinfetar todas as superfcies de trabalho com um desinfetante adequado (etanol 70%,cloreto de benzalcnio a 500ppm, hipoclorito de sdio ou outro composto de cloro a 200ppm soadequados)

    Assegurar-se de que todo o material necessrio esteja disponvel nas bancadas.Lavar as mos e desinfetar com um desinfetante adequado ao contato com a pele. Se reque-

    rido, colocar luvas, verificando a necessidade ou no de luvas nos captulos especficos de ensaioscom patgenos.

    Trabalhar preferencialmente no interior de capelas de fluxo laminar vertical, para prevenira contaminao da amostra pelo ambiente e do analista pela amostra. Na indisponibilidade deuma capela de fluxo laminar, trabalhar na regio prxima chama de um bico de Bunsen que,em bom funcionamento, deve ter a chama azulada.

    Evitar a formao de aerossis ao abrir tubos e/ou frascos depois de agitar, liberar o conte-do de pipetas ou flambar alas de inoculao.

    Nunca pipetar com a boca, mas sim, usando pipetadores.Depois de usados, acomodar as pipetas e outros utenslios em bandejas de descarte, no

    diretamente sobre as bancadas.

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    Todos os instrumentos e utenslios utilizados na abertura das embalagens e retirada dasunidades analticas (tesouras, pinas, facas, esptulas, etc.) devem ser previamente esterilizados(em autoclave ou estufa de esterilizao) ou mergulhados em etanol 70% e flambados no mo-mento do uso.

    Antes de abrir as embalagens, desinfetar a rea externa com etanol 70%, para remover oscontaminantes presentes. No caso de embalagens flexveis, cortar com uma tesoura estril. Nocaso de embalagens rgidas com tampa rosquevel, desrosquear e remover a tampa assepticamente.No caso de latas com sistema de abertura tipo easy open, abrir assepticamente e remover atampa. No caso de latas sem sistema easy open, usar um abridor de latas estril. No caso de latas,vidros, caixinhas e outras embalagens destinados ao teste de esterilidade comercial, devem serseguidos procedimentos diferenciados, descritos no Captulo especfico. Esses procedimentosobjetivam garantir a integridade da selagem, para anlises posteriores da embalagem, se necessrias.Observareanotarqualqueranormalidadenasembalagensounocontedo interno, comoestufamento,vazamento, odor e/ou aparncia estranha, presena de corpos estranhos, etc.

    2.2.MATERIAL NECESSRIO

    Reagentes e diluentes Etanol 70% Soluo de iodo Cloreto de benzalcnio a 500ppm, hipoclorito de sdio ou outrocomposto de cloro a 200ppm

    gua Peptonada 0,1% (H2Op) Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) gua Salina Peptonada (H2Osp) gua Peptonada Tamponada (BPW) Soluo de Ringer de concentrao Tampo Fosfato Cloreto de Magnsio Soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7,50,2 Soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 8,40,2 Soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com anti espumante e pH ajustado em7,50,2 Soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com anti espumante e pH ajustado em8,40,2 Soluo de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O) 2% Leite em p desnatado dissolvido em Tampo Fosfato (0,1g/100ml) Soluo de tripolifosfato (Na3O10P3) 2% Tergitol-7 Aninico ou Tween 80 Sulfito de potssio (K2SO3) Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 1N estril Soluo de cido clordrico (HCl) 1N estril Soluo alcolica de prpura de bromocresol a 0,04%

    Equipamentos Capela de fluxo laminar vertical Bico de Bunsen Shaker

    Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos

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    Refrigerador com temperatura abaixo de 4oC com termmetro calibrado Banho maria com temperatura regulvel na faixa de 30 a 45C,com termmetro calibrado

    Furadeira eltrica e brocas esterilizadas Balana calibrada Agitador magntico com barras magnticas esterilizadas Liquidificador Homogeneizador peristltico (stomacher) Agitadores tipo vortex

    Instrumentos e utenslios Tesouras Pinas Facas Martelos Esptulas Bagetas de vidro Pipetas de capacidade variada Funis estreis de capacidade variada Swabs e esponjas para amostragem de superfcies Moldes para amostragem de superfcies Bandejas de descarte

    2.3. HOMOGENEIZAO DA AMOSTRA E RETIRADA DAUNIDADE ANALTICA

    Unidade analtica a quantidade de material retirado da amostra para ser utilizado na rea-lizao de um ou mais ensaios. O nmero de unidades analticas que devem ser retiradas e aquantidade de material em cada unidade analtica depende do nmero e tipos de ensaios quesero realizados na mesma amostra. De maneira geral so necessrias:a) Unidades analticas para os ensaios de presena/ausncia com enriquecimento em caldo espe-cfico. requerida uma unidade analtica para cada ensaio (Salmonella, Listeria monocytogenes,Yersinia enterocolitica,Campylobacter sp, Escherichia coliO157:H7,Enterobacter sakazakii,Vibrio cholerae,Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus). A quantidade de material em cada uma dessas unida-des analticas definida nos captulos especficos para esses ensaios.

    b) Unidades analticas para os ensaios com tratamento diferenciado da amostra. requerida umaunidade analtica para cada ensaio (esterilidade comercial, contagem de esporos de bactrias,contagem de bolores termorresistentes e outros). A quantidade de material em cada umadessas unida