ESTUDO DAS INTERAES PATGENO-HOSPEDEIRO, EPIDEMIOLOGIA E CONT

Mapeamento da resistncia do algodoeiro mancha de ramulria (Ramularia areola) e variabilidade do patgeno no Estado do Mato Grosso

Relatrio Final

Perodo: Janeiro de 2005 a julho de 2006

Instituio Executora: Embrapa Algodo/Fundao Centro - Oeste

Data da Elaborao: 28/07/2006

Coordenador: Nelson Dias Suassuna

Campina Grande, 28 de julho de 2006

Apresentao

O presente relatrio versa acerca das atividades desenvolvidas, at a presente data, do projeto Mapeamento da resistncia do algodoeiro mancha de ramulria (Ramularia areola) e variabilidade do patgeno no Estado do Mato Grosso. O cronograma inicialmente proposto foi retardado, por conta de atraso na aprovao e liberao de recursos do mesmo. Outra adequao ao projeto inicial foi a insero de mais uma populao segregante envolvendo os gentipos VH-8 (G. barbadense) e Guazuncho (G. hirsutum). Esses gentipos foram adicionados por j possuirmos RILs em homozigose e serem contrastantes quanto reao doena.

Quanto ao estudo com o fungo Ramularia areola, descrevemos em detalhes um mtodo simples, rpido e de baixo custo para produo massal de esporos visando inoculao artificial. Tambm relatamos os resultados de variabilidade do patgeno com base em marcador molecular.1.0 Introduo

Atualmente, esto identificadas cinqenta espcies de algodo do gnero Gossypium, distribudas nos continentes, sia, frica, Austrlia e Amrica. Seis dessas espcies so alotetraplides (2n=4x=52) e quarenta e quatro diplides (2n=2x=26).

O Algodo cultivado originrio de quatro espcies separadamente domesticadas G. hirsutum, G. barbadense, G. arbreo e G. herbceo (Brubaker et al., 1999a; Brubaker e Wendel, 1994; Percy e Wendel, 1990; Wendel, 1989; Wendel et al., 1992: Wendel et al., 1999). Nestes quatro casos, os povos aborgines descobriram h diversos mil anos que aquelas propriedades originais das fibras do algodo lhes eram teis para cordas, produo de roupas e outras aplicaes.

A melhoria na qualidade da fibra, o deslocamento da cultura para o cerrado, a mecanizao da colheita, o uso de novas tcnicas de plantio e o desenvolvimento de cultivares mais adaptadas, favoreceram a ganhos crescentes de produtividade e a reduo nos custos de produo impulsionando o algodo nacional no mercado externo.

Todavia, o recente aumento nas reas plantadas na regio do cerrado deve-se s boas condies ambientais que esta regio possui para seu cultivo, como relevo, solo e precipitaes. Entretanto, as condies climticas (umidade elevada e temperaturas noturnas amenas) favorecem a incidncia de doenas fngicas no algodoeiro.

As doenas que acometem o algodoeiro limitam a obteno de ndices satisfatrios de produtividade. Uma das doenas mais importantes no cerrado brasileiro a mancha de ramulria, causada pelo fungo Ramularia areola. A mancha de ramulria, at pouco tempo atrs, era considerada uma doena secundria do algodoeiro que surgia no final do ciclo da cultura e auxiliava na desfolha natural da planta (Cia, 1977; Cia e Salgado, 1997). Todavia, com o aumento da rea cultivada, cultivo continuado de algodo e a suscetibilidade das cultivares em uso, a doena passou a surgir mais cedo e causar desfolha precoce, implicando na necessidade de pulverizaes com fungicidas, as quais variam, em mdia, de trs a quatro por safra. Os sintomas da doena so leses esbranquiadas, iniciando-se pelas folhas mais velhas no tero inferior da planta, progredindo para os teros mdios e superior, as quais induzem a desfolha precoce, acarretando perda de rea foliar fotossintetizante e, conseqentemente, reduo da produo de fibra.

O controle qumico vem sendo empregado com sucesso. Entretanto, os custos so elevados e o risco de insucesso dessa medida sempre existe, pois existe a possibilidade do surgimento e aumento da freqncia de isolados do patgeno resistentes aos principais fungicidas em uso.

A resistncia gentica de cultivares preconizada como a medida mais eficaz e econmica de controle da mancha de ramulria. Infelizmente, caractersticas como resistncia a doenas nem sempre so correlacionadas com caractersticas agronmicas de interesse como produtividade, por exemplo. A grande maioria das caractersticas herdveis de importncia econmica, como muitos casos de resistncia doenas, resultam da ao conjunta de vrios genes (herana polignica). A manipulao de caractersticas controladas por vrios genes mais complexa do que caractersticas governadas por um ou poucos genes.

Mapas genticos de marcadores moleculares oferecem a possibilidade de estudar a arquitetura de caractersticas quantitativas, ou seja, mapear e medir a magnitude do efeito dos principais fatores genticos envolvidos no controle dessas caractersticas e, potencialmente, manipular esses fatores em base individual durante os procedimentos de seleo e recombinao gentica.

Marcador qualquer caracterstica genticamente herdvel, que pode ser tanto morfolgica (cor de flor) como obtida pelo DNA. Portanto um loco molecular que possua segregao mendeliana considerado um marcador gentico. A vantagem do DNA sobre marcador morfolgico que o nmero de diferenas em nvel de DNA que pode ser obtido entre dois indivduos imenso, quase infinito, enquanto que o nmero de marcas morfolgicas bem restrito.

Marcadores Moleculares servem como ferramenta para uma srie de estudos genticos, por consistirem em fragmentos de DNA, no so to suscetveis a alteraes no ambiente. Uma metodologia usada no melhoramento gentico a Seleo Assistida por Marcadores. Consiste na seleo de gentipos que contenham os marcadores ligados aos genes que conferem planta resistncia, ao invs de se utilizar avaliao da resistncia da planta em si como critrio para sua seleo. Isto aperfeioa o processo por evitar erros devidos falha ou escape da inoculao natural do do fungo no campo. Para que isto seja vivel necessrio encontrar marcadores moleculares estreitamente ligados aos genes de resistncia.

Inexistem estudos de herana da resistncia mancha de ramulria, todavia, com a expresso contnua da severidade, ao invs de classes discretas, provvel que seja governada por mais de um gene. Cultivares com maior nvel de resistncia (isto , com menor quantidade de sintomas mesmo na presena do patgeno) ou tolerncia (isto , produtivas mesmo na presena do patgeno), que possibilitem reduo de custos devidos a aplicaes de fungicidas e com bom potencial produtivo, so buscadas no programa de melhoramento da Embrapa Algodo

2.0 Objetivos

Obter marcadores microsatlite e AFLP contrastantes entre um gentipo suscetvel e um resistente a mancha de ramulria;

Iniciar estudos acerca da variabilidade do fungo Ramularia areola com base em marcadores moleculares.3.0 Materiais e Mtodos

Este trabalho est sendo realizado na Embrapa-Algodo em Campina Grande PB, nos laboratrios de Biotecnologia e Fitopatologia.

3.1 Obteno de populaes segregantes

Foram realizados cruzamentos entre a cultivar Delta Opal (suscetvel mancha de ramulria) e a linhagem CNPA CO 11612 (resistente), obtendo-se 15 plantas (F1) que foram autofecundadas, de onde obtivemos, 371 plantas F2. O cruzamento inter-especfico (entre Gossypium hirsutum e G. Barbadense) foi realizado com atraso devido florao tardia de G. barbadense.

3.2 Inoculao de R. areola nos gentipos VH8 e guazuncho

Uma segunda populao originada de Gossypium hirsutum (cultivar guazuncho) x G. barbadense (cultivar VH-8) tambm foi envolvida no estudo. Desse cruzamento, dispomos de 140 RILs (Recombinant Inbreed Lines). Essa populao foi gentilmente cedida pelo pesquisador do CIRAD, Marc Giband, o qual participa do referido projeto. Os genitores desse cruzamento foram testados quanto resistncia mancha de ramulria em condies controladas, visando estabelecer a reao de sensibilidade nos parentais VH8 e guazuncho. Procedeu-se inoculao artificial em quatro plantas de cada gentipo em cmara de crescimento (ambiente controlado, com 25 e umidade relativa do ar acima de 85%). Inoculou-se uma suspenso de esporos com concentrao acima de 5 x 105 esporos/mL nas folhas at escorrimento. As plantas foram mantidas na cmara por 2 semanas. O inculo foi preparado a partir de seis isolados do fungo crescidos em erlenmeyers contendo arroz autoclavado (50 g de arroz parbolizado e 30 mL de gua) por 20 dias.

Observou-se uma necrose nos pontos de infeco em VH8, enquanto que ocorreu esporulao de R. areola nas folhas do gentipo guazuncho, determinando-se, portanto, a suscetibilidade da cultivar Guazuncho e a resistncia da cultivar VH-8, resistncia esta, desenvolvida como uma resposta de hipersensibilidade (HR) infeco do patgeno. Esses resultados demonstram que esses gentipos so contrastantes na reao ramulria e podem ser usados como parentais contrastantes na construo do mapa gentico proposto.

3.3 Extrao de DNA vegetal

Amostras de DNA de folhas de cada um dos genitores (Delta Opal, CNPA CO 11612, Guazuncho e VH-8) foram extradas a partir de cerca de 4 cm2 de tecido vegetal oriundo de folhas novas de algodoeiro foram transferidos para tubo de microcentrfuga de 1,5 ml e congelados imediatamente em N2 lquido. O protocolo empregado para extrao de DNA genmico foi o do CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) (Ferreira & Grattapaglia, 1998) com modificaes (Zhang & Stewart, 2000). Depois de congelado, o tecido foi macerado dentro do tubo de microcentrfuga com o auxilio de um pistilo de vidro na presena de N2 lquido. Aps macerao, adicionaram-se 600 l de tampo de extrao com -mercaptoetanol (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,7 M NaCl, 10 mM EDTA, CTAB 1% e -mercaptoetanol 1%) e agitou-se o tubo em vrtex por 30 s. Em seguida, os tubos foram acondicionados em banho-maria a 65o C por 30 min, agitando-os a cada 5 min. Retiraram-se os tubos do banho-maria deixando-os esfriar em temperatura ambiente e, em seguida, adicionaram-se 600 l de CIA (clorofrmio- lcool isoamlico, na proporo de 24:1, respectivamente), e os tubos foram agitados por inverso durante 5 min at obter uma emulso homognea. Os tubos foram centrifugados a 12000 rpm por 5 min a 4o C. Nesta extrao, lipdios, protenas e a maioria dos polissacardeos so retidos na fase orgnica inferior, enquanto DNA, RNA e alguns polissacardeos so retidos na fase aquosa superior. Aps a centrifugao, transferiram-se as fases aquosa para novos tubos previamente marcados, adicionaram-se 60 l de soluo de precipitao (10% CTAB e 1,4 M NaCl), misturou-se por inverso durante 5 min e adicionaram-se 600 l de isopropanol frio (-20o C). Em seguida, os tubos foram centrifugados a 12000 rpm por 5 min a 4 C. O precipitado de DNA foi lavado duas vezes com 500 l de etanol 70%, gelado, centrifugando a cada vez por 5 min. Lavou-se mais uma vez com 300 l de etanol absoluto gelado, centrifugou-se por 5 min e deixou-se secar ao ar por 15 minutos sobre papel toalha. O precipitado foi ressuspendido em 100 l de tampo TE (Tris-EDTA) e a seguir foi mantido por 30 min em temperatura ambiente. As amostras foram armazenadas a -20o C.

A estimativa da concentrao de DNA nas amostras foi realizada em gel de agarose (0,8%) corado com brometo de etdio, por meio de comparao com marcadores de concentraes conhecidas (25, 50 e 100 ng de DNA/L).

3.4 Obteno dos marcadores microssatlites (SSR)

Os marcadores microssatlites foram obtidos pela amplificao do DNA genmico inicialmente dos gentipos Delta opal e CNPACO11612 e, posteriormente, de Guazuncho e VH8, com os primers cujas seqncias foram publicadas por Nguyen et al. (2004) e Liu et al. (2000a e 2000b). A reao PCR foi realizada a pH 8,3 em um volume total de 20uL, contendo 20ng de DNA genmico, 0,8pmol de cada primer, 200umol de dNTP, 50mM de KCl, 10mM de Tris-HCl e uma unidade de Taq DNA polimerase. Foram realizados 30 ciclos de temperatura, sendo cada ciclo composto por 93C por 1 minuto (passo 1), 55oC for 2 minutos (passo 2) e 72C por 3 minutos (passo 3), com uma extenso final de 72C por 7 min. A velocidade de rampa (tempo para passar de uma temperatura para outra) entre os trs passos foi de 42, 36 e 40 segundos, respectivamente. A concentrao de MgCl2 e a temperatura de anelamento do primer foram ajustadas para cada combinao de primer, de acordo com a recomendao de quem os desenvolveu. Aps a reao foi adicionado 5ul de soluo contendo 20% de Ficol, 0,01% de azul de bromofenol e, no caso de eletroforese em poliacrilamida, 60% de formamida. Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 6% contendo 6M de uria, e os gis corados com Nitrato de prata.

Foram realizados testes para deteco de marcadores microssatlites polimrficos com 112 primers microssatlites do CIRAD, entre Delta opal e CNPA CO11612 dos quais 10 se mostraram polimrficos (Tabela 1), representando 8,9% de polimorfismo entre os testados.

Por serem indivduos da mesma espcie (G. hirsutum), D. opal e CNPA CO11612 no apresentaram alto grau de polimorfismo com marcadores microssatlites, j que seriam necessrios cerca de 250 primes polimrficos para gerar o mapa. A partir destes resultados identificamos que o polimorfismo molecular intraespecfico dos gentipos de G. hirsurtum testadas foi baixo, dificultando o mapeamento molecular.

Tabela 1: Primers polimrficos entre os gentipos de Gossypium hirsutum, Delta opal e CNPA CO11612.

LocoCromossomoMigrao da banda (pb) em DOMigrao da banda (pb) em CO11612

Cir 17c1/c10128131

CIR 34c5147146

CIR 63c20156154

CIR 121c209493

CIR 148c12147150

CIR 216c18193192

CIR 249c4188183

CIR 364c5155153

CIR 373c5172/166172

CIR 381c14247252

3.4 Obteno de marcadores AFLP

Os marcadores AFLP foram obtidos a partir de fragmentos gerados da digesto do DNA genmico com enzimas de restrio tipo II, que clivam o DNA em stios especficos. Foram utilizadas duas enzimas, uma de corte raro EcoRI, e outra de corte freqente MseI. Aps a clivagem do DNA, as enzimas deixaram extremidades coesivas o que permitiu a ligao dos adaptadores, que consiste de seqncias de nucleotdeos de fita dupla, permitindo assim a ligao dos iniciadores especficos a essas seqncias, etapa chamada pr-amplificao, posteriormente foram realizadas as amplificaes, com trs bases seletivas, com 11 combinaes de primers. Esta tcnica tambm baseada na amplificao via PCR e os ciclos de denaturao, anelamento e extenso foram diferentes em cada etapa.

Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 6% contendo 6M de uria, e corados com nitrato de prata.

Foi verificado polimorfismo em 8 combinaes de primers, o que representou 81% das combinaes de primers utilizadas. Foram encontradas 21 bandas polimrficas, num total de 394 locos, portanto, o nvel de polimorfismo foi de 5,3%. Esses resultados foram relevantes, pois se verificou com a tcnica AFLP, um maior numero de locos polimrficos identificados entre os gentipos estudados, em uma nica reao PCR, com relao a outros marcadores moleculares como microssatlite.

3.5 Populao segregante

Entre Guazuncho e VH-8, estes primers do CIRAD j se mostraram polimrficos conforme publicado por Lacape (2000). Portanto, esses gentipos foram eleitos para dar continuidade aos trabalhos de mapeamento. As linhagens RILs provenientes do cruzamento entre Guazuncho e VH-8 foram plantadas em casa de vegetao e sero genotipadas (marcadores SSR) e fenotipadas (inoculao artificial do patgeno) na prxima etapa do estudo.3.6 Amostragem dos isolados de R. areola

Foram amostrados quatro municpios no Estado de Mato Grosso: Primavera do Leste, Pedra Preta, Campo Verde e Novo So Joaquim. Em cada municpio foram obtidos at 10 amostras de folhas com sintomas caractersticos da doena. Estas folhas foram enviadas ao Laboratrio de Fitopatologia da Embrapa Algodo e procedeu-se isolamento.

3.7 Isolamento, cultivo in vitro e extrao de DNA do fungo

O isolamento direto de R. areola foi realizado em meio BDA (Batata, Dextrose e gar), contendo estreptomicina (0,5 g.L-1). As colnias resultantes foram repicadas para placas de Petri contendo o meio V8-10%, onde cada colnia foi carimbada nas novas placas diversas vezes. Em cada local onde as colnias foram carimbadas originou-se uma nova colnia, e a partir dessas procedeu-se a extrao de DNA fngico. Obtivemos 34 isolados do patgeno, os quais foram submetidos extrao de DNA, seguindo o mesmo mtodo de extrao descrito para plantas anteriormente, diferindo apenas a quantidade inicial de miclio, que foi em torno de 200 mg.Reaes de PCR (45ciclos - 94 C 6, 35 1, 72 C 2) foram realizadas com cinco pares de primers RAPD em 14 isolados representativos dos locais amostrados. As imagens dos gis de agarose foram capturadas e armazenadas e a presena ou ausncia de todas as bandas foi registrada.

3.8 Quantificao da variabilidade gentica

As subpopulaes amostradas: 1) Pedra Preta (n=4 isolados), 2) Novo So Joaquim (n=4 isolados), 3) Primavera do Leste (n=3 isolados) e 4) Campo Verde (n=3 isolados) foram investigadas para se determinar a estrutura gentica. Dados referentes aos marcadores moleculares (RADP) foram utilizados para clculos de diversidade gentica. As bandas foram interpretadas como dois alelos (presena ou ausncia) em um loco (Peever & Milgroom, 1994, McDonald, 1997). A diversidade gentica de populaes de R. areola foi estimada pelo ndice de diversidade de Nei H (Nei, 1973). A freqncia de alelos para cada loco RADP foi calculada para cada subpopulao e usada para estimar a medida de diversidade gnica de Nei (1973), a qual indica a probabilidade de dois isolados, escolhidos aleatoriamente em uma subpopulao, possurem alelos diferentes. A diversidade gentica mxima 1, enquanto a mnima 0 (zero), indica uma populao geneticamente uniforme, formada por uma linhagem clonal. Tambm foi calculada a estatstica Gst de Wright, coeficiente que mede diferenciao gentica ocasionada por subestruturao de populaes, dada por Gst = (Ht Hs)/Ht, em que Hs a mdia da diversidade gentica das sub-populaes e Ht a estimativa da diversidade gentica de toda populao. As anlises de H, Gst, identidade gentica de Nei e a distncia entre subpopulaes foram realizadas com auxlio do programa TFPGA verso 1.3 (Miller, 1997). Estimativas de fluxo gnico foram calculadas com base na estatstica Gst. Calculou-se tambm o nmero mdio de imigrantes (Nm) que deve ser trocado entre sub-populaes a cada gerao para manter o nvel de similaridade gentica observado.

3.9 Variao gentica dentro e entre subpopulaes

42 locos RADP foram identificados nos isolados estudados, considerando todas as bandas visveis, independente da intensidade. O ndice de diversidade gnica em toda a populao, em todos os locos, variou de 0,0 a 0,489 (mdia de 0,154). Os valores de identidade gentica de Nei foram altos e similares em todas as possveis combinaes envolvendo as quatro subpopulaes: 0,9160 (para a comparao das subpopulaes Pedra Preta e Novo So Joaquim), 0,8327 (Pedra Preta e Primavera do Leste), 0,8515 (Pedra Preta e Campo Verde), 0,9721 (Novo So Joaquim e Primavera do Leste), 0,9765 (Novo So Joaquim e Campo Verde) e 0,9835 (Primavera do Leste e Campo Verde).A frao da variao gentica distribuda entre as subpopulaes - Gst (Nei, 1973) foi em mdia 0,3593, indicando que mais de 35% da diversidade gnica est distribuda entre as quatro subpopulaes. A medida de identidade gentica de Nei para os pares de subpopulaes em todos os locos analisados, sugere baixa diferenciao entre as subpopulaes, confirmando em parte a estatstica Gst. A diversidade gentica dentro de subpopulaes, Hs=0,0942, contribuiu para quase toda a diversidade gentica total, Ht=0,147. O nmero mdio de migrantes foi estimado em 0,8916 indivduos em cada gerao entre as quatro subpopulaes, indicando que a cada ciclo de reproduo do patgeno (cerca de 12 dias) ao menos um esporo alcana outra localidade dentro dos limites geogrficos onde as amostras foram coletadas, o que confirma a alta taxa de migrao desse patgeno, que disperso de maneira eficaz pelo vento. Esse fato corroborado pela alta identidade gentica entre as subpopulaes.A estatstica Gst particularmente alta para inferir acerca da clonalidade dos isolados estudados. Maior nmero de isolados dever ser testado para inferir com maior segurana acerca da distribuio da variao gentica entre subpopulaes. Se a variao existente for alta e estiver distribda entre todas as subpopulaes amostradas ento riscos como quebra de resistncia gentica com base em poucos genes de resistncia ou o surgimento de isolados do patgeno resistentes a fungicidas, principalmente queles com stio de atuao muito especficos, podero surgir em curto espao de tempo.3. 10 Mtodo para produo massal de esporos de Ramularia areolaO fungo Ramularia areola um patgeno hemibiotrfico, o que dificulta o seu cultivo in vitro. Estudos em condies controladas necessitam de informaes sobre isolamento e meios de cultivos que favoream o seu crescimento e esporulao. Foram montados dois ensaios com o objetivo de avaliar a esporulao de dois isolados em funo do tempo de incubao. Uma suspenso de esporos de cada isolado foi preparada a partir do crescimento do patgeno em meio V8 10%. 1mL da suspenso foi transferido para erlenmeyers contendo arroz autoclavado (50g de arroz e 30mL de gua destilada - ensaio 1) ou 300L para placas de Petri contendo 15ml meio V8 10% (ensaio 2). Os ensaios foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x4, sendo dois isolados e quatro pocas de avaliao (7, 21, 28 e 35 dias aps a incubao), com duas repeties. As placas ou erlenmeyers contendo o patgeno foram mantidos em 25C com 12 horas de luz. Para a avaliao foram acrescentados s placas de Petri 10mL da gua destilada e uma gota de Tween, e aos erlemmeyers 100mL de gua e duas gotas de Tween. Alquotas de 100L foram retiradas para estimar a quantidade de esporos com auxlio de hemacitmetro. Houve interao significativa entre isolados e tempo de avaliao em ambos ensaios (P=0,0019 Ensaios 1; P=0,0058 ensaio 2). O isolado Ra062 teve maior esporulao em arroz, enquanto que o isolado Ra042 produziu maior quantidade de esporos em meio V8 10% aos sete dias aps a incubao. Maior quantidade de esporos foi obtida no ensaio usando meio de arroz autoclavado, havendo uma tendncia de crescimento linear na esporulao em funo do tempo para ambos os isolados.

Campina Grande, 28 de julho de 2006__________________________________

Nelson Dias Suassuna

Pesquisador Responsvel

5.0 Referncias Bibliogrficas

CARVALHO, L. P.(1999). O gnero Gossypium e suas espcies cultivadas e silvestres. In: Beltro, N. E. M. (Org.) O agronegcio do algodo no Brasil. Braslia: Embrapa Comunicao para Transferncia de Tecnologia, Captulo VIII, pp. 234-52.

FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D.(1998). Introduo ao uso de marcadores moleculares em anlise gentica. 3 edio. Embrapa, Braslia, 220p.

JIANG, C.;WRIGHT,R.J.;DELMONTE, T.; PATERSON,A.H. (2000a) QTLs analysis of leaf morphology in tetraploid Gossypium (Cotton). Evolution 54(3):pp798-814

Klimber, G.(1961). Basis of the diploid-like meiotic behaviour of polyploid cotton. Nature, v. 191,pp.98-99.

KOHEL, R. J.; YU, J.; PARK, Y.; LAZO, G. R.(2001). Molecular mapping and characterization of traits controlling fiber quality in cotton. Euphytica, n. 121, pp. 163-72,

LANDER, E. S.; GREEN, P.; ABRAHAMSON, J.; BARLOW, A.; DALY, M. J.; LINCON, S. E.; NEWBURG, L. (1987). MapMaker: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics, v. 1, pp. 174-181

LAN, T.H., COOK,C.G., PATERSON, A.H. (1999) Identification of a RAPD markers linked to male fertility restoration gene in cotton (Gossypium hirsutum L.). Journal Agric. Genomics 4 (http://www.cabipublishing.org/gateways/jag/paper299/indexp299.html;verified 11 August 2004)

LEE, M.(1995) DNA markers and plant breeding programs. Advances in Agronomy, v.55, pp.265-344

LIU, S. CANTRELL, R.G.; MACCARTY, J.C.; STEWART, J. M. (2000). Simple sequence repeat-based assessment of genetic diversity in cotton race stock acessions. Crop Science, v.40, pp.1459-1469

LIU, S.; SAHA, S.; BURR, B.; CANTRELL, R.G. (2000) Chromosomal assigment of microsatelite loci in cotton. Journal of Heredity, v.91, n.4, pp.326-332

McDONALD, B. A. The population genetics of fungi: tools and techniques. Phytopathology 87: 448-453. 1997.

MICHELMORE, R.W.; PARAN, I.; KESSELI, R.V. (1991). Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specif genomic regions by using segregating population. Proceedings of National Academy of Science of USA, v.88, pp.9828-9832MILLER, M. P. 1997. Tools for population genetic analysis (TFPGA) 1.3: A windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data.

NEI, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 70: 3321-3323. 1973.

NGUYEN, T. B.; GIBAND, M.; BROTTIER , P.; RISTERUCCI, A. M.; LACAPE, J. M. Wide coverage of the tetraploid cotton genome using newly developed microsatellite markers. Theoretical and Applied Genetics, v.,109, p. 167175, 2004.

PEEVER, T. L., MILGROOM, M. G. Lack of correlation between fitness and resistance to sterol biosynthesis-inhibiting fungicides in Pyrenophora teres. Phytopathology 84: 515-519. 1994.

REINISCH, A. J.; DONG, J.; BRUBAKER, C. L.; STELLY, D. M.; WENDEL, J. F.; PATERSON, A. H. (1994) A detailed RFLP map of cotton, Gossypium hirsutum x G. barbadense: cromossome organization and evolution in a disomic polyploidy genome. Genetics, v. 138, pp. 829-847.

SARANGA,Y.M.;MENZ,C.X.;JIANG,R.J.;WRIGHT,D.;YAKIR; PATERSON,A.H. (2001). Genomicc dissestion of genotype x environment interaction conferring adaptation of cotton to arid conditions. Genome Res11. pp 1988-1995.

SHAPPLEY, Z. W.; JENKINS, J. N; .; MCCARTY JR, J. C.; MEREDITH, W. R. (1998) An AFLP linkage map of upland cotton, Gossypium hirsutum L. Theoretical and Applied Genetics, v. 97, pp. 756-61.

SHAPPLEY, Z. W.; JENKINS, J. N.; ZHU, J.; MCCARTY JR, J. C. (1998) Quantitative trat loci associated with agronomic and fiber traits of upland cotton. Journal of Cotton Science, n.2, pp. 153-63,

STUTERVANT, A.H., (1965) New York: Harper & Row. A History of Genetics. Pp.156

STUTERVANT, A.H.,(1913) The linear arrangement of six-lnked factors in Drosophila as show by their mode of association .Journal of Experimental Zoollogy v.14.pp43-59 (http://www.esp.org/foundations/genetics/classical/gm-65 pdf acessado 15 de Agosto 2002)

ULLOA, M.; CANTRELL, R. G.; PERCY, R. G.; ZEIGER, E.; LU, Z. M. (2000) QTL analysis of stomatal conductance and relationship to lint yeld in an interespecific cotton. Journal of Cotton Science, v. 4, pp. 10-8.

ULLOA, M.; MEREDITH JR., W. R. (2000). Genetic linkage map and QTL analysis of agronomic and fiber quality traits in na intraspecific population. Journal of Cotton Science, n.4, pp. 161-70.

WRIGHT,R.J.; THAXTON,P.M.;ELZIK,K.M.;PATERSON,A.H.(1998) D-subgenome bias of Xen resistance genes in tetraploid Gossypium (cotton) suggests that polyploid formation has created novelavenues for evolution. Genetics 149.pp:1987-1996

ZHANG, J.; STEWART, J. M.(2000). Economical and rapid method for extracting cotton genomic DNA. Journal of Cotton Science, v. 4, pp. 193-201

FACUAL

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