MARCEL MENEZES LYRA DA CUNHA -...

MARCEL MENEZES LYRA DA CUNHA

“MELANINA COMO FATOR DE VIRULÊNCIA EM

Fonsecaea pedrosoi: ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE, SEQÜESTRO DE ÓXIDO

NÍTRICO, RESISTÊNCIA A ANTIFÚNGICOS E A

ESTRESSES AMBIENTAIS”

TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO

RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU

DE DOUTOR EM CIÊNCIAS

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 8

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Ficha catalográfica:

CUNHA, Marcel Menezes Lyra da,

MELANINA COMO FATOR DE VIRULÊNCIA EM Fonsecaea pedrosoi:

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, SEQÜESTRO DE ÓXIDO NÍTRICO,

RESISTÊNCIA A ANTIFÚNGICOS E A ESTRESSES AMBIENTAIS. Rio de

Janeiro, 2008. 104 fls

Tese (Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica)) Universidade Federal do Rio

de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.

Orientadora: Prof. Dra. Sonia Rozental

1. Fonsecaea pedrosoi 2. Melanina 3. Antifúngicos 4. Óxido nítrico

5. Inibidores da via de biossíntese de melanina.

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro

II. Título

Aos meus pais,

minha amada esposa

e minha querida irmã.

Agradecimentos

À professora Dra. Sonia Rozental, por sempre incentivar meu crescimento científico e pessoal, minha gratidão por me guiar no caminho da vida científica.

Aos professores Dra. Celuta Sales Alviano (UFRJ), Dra. Leila Lopes Bezerra (UERJ), Dra. Eleonora Kurtenbach (UFRJ), Dra. Técia Ulisses de Carvalho (UFRJ) e Dr. Andre Luís Souza dos Santos (UFRJ), pelas louváveis contribuições à micologia e ao estudo da biologia celular, e valiosas discussões científicas durante minha formação, motivo pelos quais não hesitei em convidá-los a compor minha banca avaliadora.

À professora Dra. Márcia Attias, insubstituível, pela revisão desta tese.

Aos professores Dr. Ney Vugman (Instituto de Física - UFRJ) e Dr. Marcelo Herbst (UFRRJ), pelas contribuições nos experimentos de EPR.

Ao professor Dr. Celso Nakamura (Universidade Estadual de Maringá, PR) e à mestre Kelly Ishida (LBCF) pelas contribuições no estudo da citotoxicidade dos inibidores da biossíntese de melanina.

Aos professores do IBCCF Dr. Paulo Bisch e Dr. Gilberto Weissmüller, e aos mestres Marlos Moncores e Gustavo Rocha, pelos indispensáveis experimentos em espectroscopia de força atômica.

Ao prof. Dr. Carlos Alberto Achete e à Dra. Lidia Agata de Sena, do INMETRO, pela colaboração na microscopia eletrônica de varredura ambiental.

Ao prof. Dr. Mauro Amorim (NPPN) e ao Sidney Bessa pela colaboração com experimentos de atividade antioxidante e espectrofotometria de UV.

Aos professores, e amigos, Dr. Anderson Franzen (UEZO), Dr. Sergio Seabra (UEZO) e Dr. Kildare Miranda (UFRJ) pelas indispensáveis contribuições a alguns dos experimentos desta tese, mas também ao meu desenvolvimento científico. Um forte abraço ao Eliandro, que também deu muita força nessa parte da jornada.

À Dra. Daniele E. Esquenazi, quem me apresentou à professora Sonia Rozental, e com quem ainda colaboramos.

Ao mestre Marcos Dornelas, pelas contribuições em experimentos que, mesmo não compondo essa tese, nos renderam comunicados científicos relevantes.

Aos amigos do Laboratório de Biologia Celular de Fungos (LBCF), Amanda Costa, Caroline Guerra, Taíssa Vila, Gustavo Andrade e, especialmente, à Luana Borba, a quem espero ter ensinado pelo menos metade do que foi sua contribuição para esta tese.

Ao Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer, do qual é difícil se desvincular, não pelos equipamentos e microscópios, mas pelas pessoas. Um agradecimento especial à prof. Rossiane, prof. Narcisa, prof. Cris Motta, ao grande amigo Lúcio, ao Leandro (e Joana), ao Bosco, Míria (e Leo), Lia, Celso, Érica, Juliany, Loraine, Dani, Thiago, Emile, Tati, Renata, Alan e as queridas Nete e Cazuza.

Ao Laboratório de Dermato-imunologia da UFPA e seus professores Dr. Claudio Salgado, Moises Silva e Dr. Jorge da Silva, pelas amostras cedidas para a realização desta tese, além de colaborações com nosso laboratório, e fundamentais discussões na busca pelo entendimento das micoses.

À Sandra Brito, pelas ajudas conferidas, e futuras ajudas, na parte burocrática da pós-graduação.

À minha querida mulher, melhor amiga e grande amor, Gisele.

À minha família, meus queridos avós, pais, irmã, e minha nova família, com sogros e cunhados.

Aos meus grandes amigos e amigas, da faculdade, do bairro, do colégio e da vida.

Eu, como qualquer cientista, mudaria minha opinião se as evidências permitirem. Preocupo-me sobre o que é verdade, me importo com as evidências, por querer saber o que é verdade. É bem verdade que sôo muito passional às vezes, mas é porque sou um apaixonado pela verdade.

Richard Dawkins

A ciência não tem país, pois conhecimento pertence à humanidade, e é a tocha que ilumina o mundo.

Louis Pasteur

Não só não compreendemos o universo, mas se o explicassem para nós, [hoje] não saberíamos do que estão falando.

Isaac Asimov

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia Celular de Fungos, do Instituto

de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação

da prof. Dra. Sonia Rozental, com recursos cedidos pelo CNPq e pela FAPERJ.

Resumo

Fonsecaea pedrosoi é um fungo patogênico, que produz melanina constitutivamente, e é

o principal agente etiológico da cromoblastomicose. A melanina é considerada um fator de

virulência e para caracterizá-la em F. pedrosoi inibimos sua biossíntese com o uso de 16

µg/mL de triciclazol. Verificamos o paramagnetismo da melanina por ressonância

paramagnética eletrônica, por espectroscopia de força a resistência à pressão que esta confere

ao fungo, e caracterizamos seu perfil de absorbância sob radiação ultravioleta. Em estudos

com antifúngicos verificamos que a inibição da via de biossíntese de melanina em F. pedrosoi

aumenta a susceptibilidade deste a anfotericina B, itraconazol e terbinafina, tanto em cepa

laboratorial, como em isolados recentes de pacientes de cromoblastomicose. A melanina ainda

se mostrou responsável pela resistência ao peróxido de hidrogênio, ao óxido nítrico, a

detergente e a altas concentrações de sal. Determinamos o potencial antioxidante da melanina

em conídios de F. pedrosoi, pela absorbância do radical livre 2,2-difenil-1- picrilidrazila.

Verificamos que a viabilidade do fungo após interação com macrófagos ativados murinos cai

significativamente quando a via de biossíntese da melanina é inibida com triciclazol. O

mecanismo de resistência do fungo se dá pelo seqüestro de radicais oxidativos pela melanina,

já que ensaios de imunomarcação da enzima óxido nítrico sintase induzível determinaram a

presença desta nos macrófagos em interação com o fungo. Experimentos em cultura de

células humanas e murina sugeriram que o triciclazol é pouco tóxico, e que a via de síntese de

melanina em melanócitos murinos não é afetada. Em estudos inéditos por microscopia de

varredura observamos as características celulares da lesão com células escleróticas do fungo

sob tecido epitelial e em prováveis granulomas dérmicos. Nesta tese concluiu-se que a

melanina é um fator de virulência em F. pedrosoi e que a inibição de sua via de biossíntese

restringe a viabilidade do fungo submetido a fatores de estresse ambientais, químicos e

imunológicos.

Abstract

Fonsecaea pedrosoi is a pathogenic fungus, which constitutively produces melanin, and

is the major etiologic agent of chromoblastomycosis. The melanin is considered a factor of

virulence, and to characterize it in F. pedrosoi, its biosynthesis pathway was inhibited with 16

µg/mL of tricyclazole. We evaluated the paramagnetism of melanin by electron spin

resonance, the resistance of the fungus to pressure by atomic force spectroscopy, and

characterized the absorbance profile of melanin by ultraviolet spectroscopy wave scan. In

studies with antifungals we noticed that inhibition of melanin biosynthesis in F. pedrosoi

increases the susceptibility of the fungus to amphotericin B, terbinafine and itraconazole, in

both laboratorial strain and strains recently isolated from patients with chromoblastomycosis.

Melanin was also responsible for resistance to hydrogen peroxide, nitric oxide, detergent and

high salt concentrations. We determined the antioxidant potential of melanin in conidia of F.

pedrosoi, by the extinction of the free radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, and the viability

of the fungus after interaction with activated murine macrophages significantly decreases after

inhibition with tricyclazole due to the scavenger of oxidative radicals, since the enzyme iNOS

was confirmed in this interaction. Experiments with human and murine cell cultures

suggested that tricyclazole has low toxicity to such models, and the melanin synthesis

pathway of murine melanocytes seems unaffected. Also, first-time observations of biopsies on

scanning electron microscope, revealed the characteristics of cellular injury as sclerotic cells

of the fungus in epithelial tissue and dermal granulome-like formations. In this thesis we

concluded that melanin is a virulence factor in F. pedrosoi and its inhibition restricts the

viability of the fungus to stress of environmental, chemical and immune origin.

Lista de abreviaturas e siglas

ANVISA: Agência nacional de vigilância sanitária

CC50: Concentração citotóxica para 50% da população

CD: Meio líquido Czapek-Dox modificado

CDágar: Meio sólido Czapek-Dox modificado com 3% de ágar

CIM: Concentração inibitória mínima

CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute (antigo National Committee for

Clinical Laboratory Standards, NCCLS, EUA)

DHN-melanina: Melanina produzida pela via do dihidroxinaftaleno

DMEM: Meio mínimo Eagle modificado por Dulbeccus

DMSO: Dimetilsulfóxido

DOPA-melanina: Melanina produzida pela via da dihidroxifenilalanina

DPPH: 2,2-difenil-1- picrilidrazila

EGTA: Ácido etileno glicol bis(B-amino etilenoéter) tetracético

EPR: Ressonância paramagnética eletrônica

IBM: Inibidores da via DHN de biossíntese de melanina

IFN-γ: Interferon-γ

iNOS: Óxido nítrico sintase induzível

IUPAC: União Internacional de Química Pura e Aplicada

LPS: Lipopolissacarídeo bacteriano de Escherichia coli

MEV: Microscopia eletrônica de varredura

FM: Fórmula molecular

MOPS: Ácido 3-[N-morfolino] propanosulfônico

PM: Peso molecular

NIH: National Institutes of Health (EUA)

PAF: Fator de agregação de plaquetas

PBS: Solução salina tamponada

PBS-BSA: PBS com 3% de soro-albumina bovina

RPMI-MOPS: Meio RPMI-1640 tamponado com MOPS

SDS: Dodecil sulfato de sódio

SFB: Soro fetal bovino

SNAP: S-nitroso-N-acetilpenicilamina

TLR: Receptores tipo-toll

UFPA: Universidade Federal do Pará

UMC: Unidade de referência em dermatologia sanitária do estado do Pará "Dr. Marcello

Candia”, Marituba, Pará.

UV (- A,B,C): Radiação Ultravioleta A, B ou C

Sumário

INTRODUÇÃO 1

1. O FUNGO PATOGÊNICO FONSECAEA PEDROSOI 1

2. CROMOBLASTOMICOSE 2

3. A INFECÇÃO POR F. PEDROSOI 2

4. O DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA 3

5. CÉLULAS ESCLERÓTICAS 5

6. PATOLOGIA 6

7. FATORES DE VIRULÊNCIA 8

8. TRATAMENTO 12

9. MECANISMOS DE AÇÃO DE ANTIFÚNGICOS – FOCO EM AGENTES UTILIZADOS PARA CROMOBLASTOMICOSE 14

10. CONSIDERAÇÕES SOBRE O ATUAL EMPREGO DE ANTIFÚNGICOS 17

11. MELANINAS 19

12. MELANINA É UM FATOR DE VIRULÊNCIA EM FUNGOS 22

13. INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE DHN-MELANINA (IBM) EM FUNGOS 23

14. RELEVÂNCIA DO ESTUDO DE FUNGOS MELANIZADOS 24

OBJETIVO GERAL: 26

METAS: 26

MATERIAIS E MÉTODOS 27

1. CULTIVO DO FUNGO 27

2. INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE MELANINA (IBM) 28

3. PROTOCOLO DE CULTIVO DOS FUNGOS EM PRESENÇA DE IBM 29

4. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE PIGMENTOS TIPO MELANINA 29

5. RESSONÂNCIA PARAMAGNÉTICA ELETRÔNICA (EPR) 30

6. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORBÂNCIA EM ULTRAVIOLETA 30

7. ESPECTROSCOPIA DE FORÇA 31

8. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS 31

9. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AO TRICICLAZOL 32

10. SUSCEPTIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS EM ASSOCIAÇÃO AO TRICICLAZOL 32

11. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO A ANTIFÚNGICOS 33

12. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO A ALTA TEMPERATURA 36

13. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS CONGELAMENTO E EXPOSIÇÃO A ANTIFÚNGICOS 36

14. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO AO ÓXIDO NÍTRICO 37

15. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS INCUBAÇÃO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO 37

16. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS INCUBAÇÃO COM AGENTES DE ESTRESSE OSMÓTICO E DE MEMBRANA CELULAR 37

17. POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE CONÍDIOS DE F. PEDROSOI 38

18. INTERAÇÃO COM MACRÓFAGOS 39

A. VIABILIDADE DO FUNGO ANTES E APÓS INTERAÇÃO 39

B. DETECÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZÍVEL NOS MACRÓFAGOS EM INTERAÇÃO 40

19. CITOTOXICIDADE DE INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE MELANINA EM MODELOS CELULARES DE MAMÍFEROS 40

A. CULTIVO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS 40

B. ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE 41

C. EFEITO DO TRICICLAZOL NA MELANOGÊNESE DE CÉLULAS B16F10 42

20. ESTATÍSTICAS 42

21. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA 43

RESULTADOS 44

1. INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE MELANINA (IBM) 44

2. RESSONÂNCIA PARAMAGNÉTICA ELETRÔNICA (EPR) 45

3. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORBÂNCIA NO ULTRAVIOLETA 47

4. ESPECTROSCOPIA DE FORÇA 47

5. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS 48

6. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AO TRICICLAZOL 48

7. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO A ANTIFÚNGICOS 49

8. TESTE DE CRESCIMENTO DE ISOLADOS RECENTES DE F. PEDROSOI APÓS EXPOSIÇÃO A ANTIFÚNGICOS 50

9. COMPARAÇÃO DO CRESCIMENTO ENTRE A CEPA LABORATORIAL E ISOLADOS RECENTES DE F. PEDROSOI 51

10. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO À ALTA TEMPERATURA 51

11. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS CONGELAMENTO E EXPOSIÇÃO A ANTIFÚNGICOS 52

12. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO AO ÓXIDO NÍTRICO 53

13. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO AO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO 54

14. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS ESTRESSES OSMÓTICO E DA MEMBRANA CELULAR 55

15. POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE CONÍDIOS DE F. PEDROSOI 56

16. INTERAÇÃO COM MACRÓFAGOS 56

A. VIABILIDADE DO FUNGO ANTES E APÓS INTERAÇÃO 56

B. DETECÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZÍVEL (INOS) NA INTERAÇÃO COM MACRÓFAGOS MURINOS

ATIVADOS 58

17. CITOTOXICIDADE DE INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE MELANINA EM MODELOS CELULARES DE MAMÍFEROS 59

A. ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE 59

B. EFEITO DO TRICICLAZOL NA MELANOGÊNESE DE CÉLULAS B16F10 59

18. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA AMBIENTAL 60

DISCUSSÃO 61

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) 61

F. PEDROSOI E MELANINA 62

CARACTERIZAÇÃO DA MELANINA 63

ANTIFÚNGICOS E MELANINA 68

CALOR, FRIO, ESTRESSES CELULARES E MELANINA 71

MELANINA DE F. PEDROSOI COMO AGENTE ANTIOXIDANTE 72

CONSIDERAÇÕES SOBRE O ÓXIDO NÍTRICO 73

CITOTOXICIDADE DO TRICICLAZOL E DE OUTROS INIBIDORES DA VIA DE BIOSSÍNTESE DA MELANINA 77

CONSIDERAÇÕES PARA O FUTURO 78

CONCLUSÕES 79

BIBLIOGRAFIA 80

ANEXOS 91

1

Marcel Menezes Lyra da Cunha Melanina: fator de virulência em F.pedrosoi

Introdução

1. O FUNGO PATOGÊNICO FONSECAEA PEDROSOI

Existem mais de mais de 70.000 espécies já descritas de fungos em nosso planeta

(HAWKSWORTH, 2001). Fonsecaea pedrosoi é uma das mais de 300 espécies fúngicas

causadoras de doenças no homem (TAYLOR, LATHAM e WOOLHOUSE, 2001).

O solo de áreas tropicais é o habitat natural deste fungo, sendo encontrado em matéria

orgânica em decomposição, vegetais rasteiros como a Mimosa pudica - popularmente

conhecida como dormideira (Figura 1) (SALGADO, DA SILVA, DINIZ et al., 2004), e em

cocos da palmeira Orbignya phalerata (Babaçu) (MARQUES, SILVA CDE, SALDANHA et

al., 2006).

Figura 1: Microscopia eletrônica de varredura de espinho de Mimosa pudica, presença

de F. pedrosoi como filamentos e conídios (setas, detalhe em D) Barras: A: 310 µm, B: 60

µm, C: 19 µm, D: 3 µm (SALGADO, DA SILVA et al., 2004).

2


F. pedrosoi costuma ser encontrado na Índia, Japão e Brasil sendo isolado de lesões de

cromoblastomicose (SILVA, DE SOUZA e ROZENTAL, 1998; KIKUCHI, KONDO,

YAGUCHI et al., 2007; RASUL, HAZARIKA, SHARMA et al., 2007).

2. CROMOBLASTOMICOSE

No Brasil, o professor doutor Olympio da Fonseca Filho, em 1922, definiu com o termo

cromoblastomicose, hoje mundialmente aceito, as micoses subcutâneas causadas por fungos

negros. Este termo é impreciso, como reconhecido pelo próprio prof. Fonseca Filho, por não

se tratar de uma micose causada por leveduras que crescem por brotamento (blastos) e nem

tendo a lesão uma coloração característica, tendo sido “cromo” sugerido pela cor escura das

células fúngicas encontradas na lesão. Em 1936, pelo reconhecimento em estudos na área, o

prof. Fonseca Filho foi homenageado pelo prof. Pablo Negroni, no batismo do gênero do mais

freqüente agente etiológico desta doença: Fonsecaea pedrosoi (FILHO, 1974). Outros fungos

causadores de cromoblastomicose são Phialophora verrucosa, Cladosporium carrionii, e

mais raramente, Rhinocladiella aquaspersa (SILVA, DE SOUZA et al., 1998).

Recentemente, Exophiala jeanselmei e Exophiala spinifera também foram descritos como

agentes de cromoblastomicoses (SANTOS, PALMEIRA, ROZENTAL et al., 2007).

Esta micose tem prevalência mundial e já foi encontrada nas Américas, Ásia, África,

Europa e Oceania (MCGINNIS, 1983; LUPI, TYRING e MCGINNIS, 2005).

3. A INFECÇÃO POR F. PEDROSOI

F. pedrosoi cresce na natureza e em meios de culturas ideais, como Sabouraud,

Butterfield e Czapek-Dox, na forma filamentosa, com hifas e conídios escuros em modo de

conidiogênese definido como “tipo-Cladosporium”, “tipo-Phialophora” e “tipo-

Rhinocladiella” (Figura 2 A, B). Este fungo tem crescimento lento, formando a 25 ºC colônias

3


verde-escuras, aveludadas e de centro elevado, que amadurecem em 14 dias, tendo a

aparência filamentosa mantida mediante cultivo a 25, 30 ou 37 ºC (SANTOS, PALMEIRA et

al., 2007).

Conídios são pequenos propágulos (Figura 2 C), de tamanho aproximado de 3,0 x 1,5

µm, presentes nas extremidades ou em ramificações das hifas, que facilitam a dispersão do

fungo no ambiente e possivelmente vão iniciar a infecção. O fungo acessa a derme através do

rompimento da pele, geralmente causado por cortes com instrumentos agrícolas, ou farpas de

madeira ou espinhos de vegetais (SILVA, DE SOUZA et al., 1998).

Figura 2: F. pedrosoi em meio sólido sabouraud (A), colônia verde-escuro aveludada e

de centro elevado. (B) em microscopía ótica, hifas, conidiogênese tipo-Rhinocladiela e

conídios (imagens: Prof. Dr. Claudio Salgado-UFPA/UMC). (C) conídio em microscopia

eletrônica de varredura, barra=1µm (FRANZEN, CUNHA, BATISTA et al., 2006).

4. O DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA

O rompimento da pele e a introdução do fungo na lesão irão provocar uma resposta do

organismo infectado para o reparo da área lesionada, e reconhecimento do agente (fúngico) na

4


lesão. Células de Langerhans, macrófagos (ou histiócitos) e neutrófilos são células do sistema

imune inato que atuam no reconhecimento, internalização, lise e apresentação de antígenos

dos agentes infecciosos a outras células do sistema imune e irão interagir com o fungo recém

implantado no tecido cutâneo (MURPHY, TRAVERS e WALPORT, 2007; SANTOS,

PALMEIRA et al., 2007).

Macrófagos e neutrófilos são as células do sistema imune proporcionalmente mais

presentes em lesões de cromoblastomicose (ESTERRE e ANDRIANTSIMAHAVANDY,

1993). São denominados fagócitos profissionais pela habilidade de internalizar partículas por

reorganização de seus citoesqueleto e membrana, possuem receptores para glucana e

receptores tipo-toll (TLR) expostos na membrana celular capazes de reconhecer o fungo

(KATAOKA, MUTA, YAMAZAKI et al., 2002). Em estado de ativação, mediante

sinalização decorrente do contado com o fungo ou estruturas deste com esses receptores,

liberam uma diversidade de moléculas causadoras de dano celular, como agentes oxidantes e

enzimas (MURPHY, TRAVERS et al., 2007).

Os fragmentos dos fungos, digeridos e processados pelos macrófagos, neutrófilos ou

ainda, pelas células de Langerhans, poderão ser apresentados a outras células do sistema

imune, como linfócitos, para o recrutamento de mais células do sistema imune, e para a

produção de anticorpos ou citocinas contra este patógeno (MURPHY, TRAVERS et al.,

2007). Tal mecanismo é extremamente eficiente em diversas infecções cutâneas, porém o

fungo F. pedrosoi já foi descrito como resistente ao repertório enzimático e oxidativo dos

macrófagos e neutrófilos, sendo essa resistência atribuída em parte à melanina presente em

sua parede celular e em organelas citoplasmáticas (FARBIARZ, DE CARVALHO,

ALVIANO et al., 1992; ROZENTAL, ALVIANO e DE SOUZA, 1994; CUNHA,

FRANZEN, ALVIANO et al., 2005).

5


5. CÉLULAS ESCLERÓTICAS

Na lesão de cromoblastomicose, raspados da borda desta (Figura 3 A) ou biópsias

revelam a presença de células fúngicas, maiores que os conídios (medindo aproximadamente

4 – 12 µm de diâmetro), com parede celular mais espessa, altamente pigmentada, e com uma

característica septação interna, denominadas escleróticas (Figura 3 B, C) (sclero, do latim

duro) ou muriformes (muri, do latim, muros) (RIPPON, 1988).

Figura 3: (A) Realização de diagnóstico por exame direto em paciente com

cromoblastomicose da UMC. (B) Células esclerótica após exame direto (Foto: prof. Dr.

Cláudio Salgado - UFPA/UMC). Em C: MEV de célula esclerótica cultivada pela adição de

EGTA a meio CD, barra= 1µm (FRANZEN, CUNHA et al., 2006).

Já foi sugerido que esta forma celular pode ter algum papel na inoculação do

hospedeiro, por já ter sido encontrada na natureza associada a vegetais (cactos) (ESTERRE e

QUEIROZ-TELLES, 2006).

Em laboratório a forma esclerótica foi obtida com sucesso pelo cultivo de F. pedrosoi

em meio acrescido do quelante de cálcio ácido etileno-glicol-bis-(β-amino etilenoéter)-

6


tetracético (EGTA), e acidificação do meio para pH 3,5 por uma semana (MENDOZA,

KARUPPAYIL e SZANISZLO, 1993; FRANZEN, CUNHA et al., 2006). Outras substâncias

associadas às mudanças na incorporação de cálcio pela célula, como propranolol e o fator de

agregação de plaquetas (PAF), em meio acidificado, também foram descritas como agentes

promotores do desenvolvimento de células escleróticas preservando a antigenicidade dessas

células (ALVIANO, FARBIARZ, TRAVASSOS et al., 1992; DA SILVA, ALVIANO,

ALVIANO et al., 2002; ALVIANO, KNEIPP, LOPES et al., 2003).

6. PATOLOGIA

As lesões de cromoblastomicose são diferentemente caracterizadas ao longo do curso da

doença. Lesões descritas como iniciais revelam vermelhidão e descamação localizada (Figura

4 A), com a progressão da doença formam-se nódulos granulomatosos (Figura 4 B) em uma

área inflamada, rompida, envolta por tecido com fibrose severa, que morfologicamente

assemelha-se ao ramo de uma couve-flor (Figura 4 C), designação essa típica da lesão de

cromoblastomicose (LOPEZ MARTINEZ e MENDEZ TOVAR, 2007; SANTOS,

PALMEIRA et al., 2007). Quatorze anos é a média de tempo entre a inoculação e o

diagnóstico (MINOTTO, BERNARDI, MALLMANN et al., 2001), levando ao agravamento

dessas lesões, o que parece ser determinante para a limitação de movimentos locomotores do

indivíduo com cromoblastomicose (MCGINNIS, 1983).

As lesões são encontradas nos membros inferiores, em mais de 80% dos casos (SILVA,

DE SOUZA et al., 1998), apesar de já terem sido descritas na face, tronco e membros

superiores (SANTOS, PALMEIRA et al., 2007). Essa freqüência parece estar associada às

atividades profissionais dos indivíduos com cromoblastomicose, trabalhadores rurais de áreas

7


tropicais em contato direto com solo e vegetais e sem histórico da utilização de equipamentos

básicos de proteção individual (SILVA, DE SOUZA et al., 1998).

De forma rara, a cromoblastomicose já foi descrita ocorrendo no olho e no cérebro,

relacionado ao comprometimento imune do indivíduo infectado, o que propiciou a

disseminação do fungo para áreas incomuns (BARTON, MILLER e PFLUGFELDER, 1997;

NOBREGA, ROSEMBERG, ADAMI et al., 2003; SABERI, KASHFI, HAMIDI et al.,

2003). Em 2004, Salgado e colaboradores descreveram um caso grave de cromoblastomicose

cutânea disseminada em paciente com hanseníase, neste caso as lesões acometiam mais da

metade da superfície da pele do paciente (SALGADO, DA SILVA et al., 2004).

Uma complicação comum nas lesões de cromoblastomicose são as infecções bacterianas

secundárias, purulentas e de cheiro desagradável, que dificultam o manejo do paciente em

tratamento (Figura 4 D) (LOPEZ MARTINEZ e MENDEZ TOVAR, 2007; SANTOS,

PALMEIRA et al., 2007).

Figura 4: Diferentes estágios de lesões de cromoblastomicose causadas por F. pedrosoi:

(A) lesão pequena e inicial com vermelhidão e descamação; (B) nódulos granulomatosos; (C)

nódulos e fibrose de tecido adjacente; (D) lesão com contaminação secundária bacteriana

(Fotos: Prof. Dr. Cláudio Salgado - UFPA/ UMC).

8


7. FATORES DE VIRULÊNCIA

Para causar infecção e doença em humanos, F. pedrosoi, a exemplo de outros fungos

patogênicos, deve interagir de forma física e bioquímica com estruturas do hospedeiro,

utilizando um conjunto de características metabólicas e estruturais próprias definidas como

fatores de virulência (virus, em latim, veneno) (CASADEVALL e PIROFSKI, 2003).

As definições de virulência têm sido ampliadas ultimamente, das baseadas no postulado

de Koch, de 1890, que definiam as doenças como sendo causadas exclusivamente por um

microorganismo cultivável, a, introduzida por Falkow (1988), relacionando a capacidade de

um organismo de causar doença a um fator genético determinante, potencialmente isolável

e/ou deletável, o que impediria a doença, denominada de postulado molecular de Koch. Hoje,

porém, a virulência é discutida como um evento de curso temporal, multifatorial, relacionado

a uma ou mais características do patógeno, desde sua quantidade no momento da infecção até

aos genes transcritos, fatores de transcrição expressos e etapas de processamento pós

traducional. Entretanto consideram-se também as características do hospedeiro, como sua

imunidade, doença prévia e sexo. E ainda, as interações decorrentes do curso da infecção, que

podem resultar na eliminação do patógeno, em doença crônica, ou ainda, em comensalismo,

simbiose, cura, ou morte (ODDS, GOW e BROWN, 2001; CASADEVALL e PIROFSKI,

2003; CASADEVALL, 2006).

As tabelas a seguir resumem os potenciais fatores de virulência descritos para F.

pedrosoi e sua provável e sugerida função na infecção (Tabela 1), assim como a participação

desse fungo em relação à resposta imune em modelos de estudo (Tabela 2).

9


Tabela 1: Fatores de virulência em F. pedrosoi

Fator de Virulência

Observação Papel sugerido na infecção Referências

Reprodução

Crescimento lento do fungo, Maturação da colônia em 14 dias

Doença de desenvolvimento longo, crônica

SANTOS et al. 2007

Crescimento a 25, 30 e 37°C Tolerância a temperatura

normal humana

Dimorfismo

Produção de células escleróticas agregadas a 37ºC em meio ácido com

propranolol Resistência à ação

imunológica e cronicidade da doença, revisto por SANTOS

et al. 2007

ALVIANO et al. 1992

Produção de células escleróticas em meio com EGTA

MENDOZA et al. 1993

Produção de células escleróticas a partir de micélio em meio com PAF

ALVIANO et al. 2003

Alta expressão de ectofosfatases em células escleróticas

KNEIPP et al. 2003

Melanina

Extração da melanina e caracterização da composição: presença de

carboidratos, ácidos graxos e proteínas

Confere resistência a parede celular

Superexpressão de melanina em ambiente infeccioso

Capacidade antifagocítica

Resistência a fagócitos,

destruição desses e ligação a ferro

Armazenamento de cálcio e ferro

Proteção ultra-estrutural

Inibição da produção de óxido nítrico

Inibe ligação de compostos antimicrobianos ao fungo

ALVIANO et al. 1991

Microscopia eletrônica revelou vacuolização intracelular e diferenças na parede celular de conídios e células escleróticas tratadas com triciclazol

FRANZEN et al. 2006

Microscopia eletrônica e densitometria revelaram a produção de melanina em organelas e a indução da produção de melanina por soro fetal bovino

FRANZEN et al. 1999

Microscopia eletrônica da interação do fungo com macrófagos murinos ativados mostrou a produção de

melanina na infecção

FARBIARZ et al. 1990

Em interação de macrófagos com fungos tratados com triciclazol, este foi mais susceptível a macrófagos, incapaz da lise destes e com menor afinidade por

ferritina cationizada

CUNHA et al. 2005

Técnicas de microscopia eletrônica mostraram que a melanina é sintetizada em organelas contendo ferro, fósforo e cálcio, e é acumulada na parede celular

FRANZEN et al. 2008

MEV mostrou que fungos após tratamento com enzimas, ácido a 100° C e clorofórmio resulta em partículas

reativas a anticorpo anti-melanina e com mesmo formato do fungo antes do

tratamento

ALVIANO et al. 2004

Níveis baixos de óxido nítrico detectados por colorimetria em

interação do fungo com macrófagos ativados

BOCCA et al. 2006

Ligação de anti-monohexosilceramidas após solubilização de melanina em células escleróticas com NaOH

NIMRICHTER et al. 2005

10


Tabela 1 (continuação):

Fator de Virulência

Observação experimental Papel sugerido na

infecção Referência

Ácido siálico

Modificações ultra-estruturares após tratamento com sialidases

Manutenção de morfologia SOUZA et al. 1986

Interações com vírus, enzimas e lectínas revelaram a presença de sialoconjugados em conídios, hifas, mas não em células

escleróticas Sialidases foram detectadas em micélio e

conídio

Escape do sistema imune (fagócitos)

Exposição de sítios de ligação em células hospedeiras

ALVIANO et al. 2004

Lectínas de superfície

Interação com células com diferentes moléculas de superfície resultaram na

adesão do fungo a células com resíduos de manose e N-acetilglucosamina

Adesão a substrato celular e internalização por células

não-fagocíticas

LIMONGI et al. 1997, LIMONGI et al. 2001

Proteínas cinase Uso de inibidores de proteína-cinases em interação celular resultou na redução da

associação de fungos a células

Invasão de células não- fagocíticas

LIMONGI et al. 2003

Glucosilceramidas

Cromatografia/espectrometria de massa e Imunofluorescência revelaram a produção de glucosilceramidas (GLC) pelo fungo Ocorreu inibição do crescimento do fungo em presença de anticorpos anti-GLC

Potencial alvo de superfície celular para tratamento com

anticorpos

NIMRICHTER et al. 2004

Ectofosfatases

Caracterização bioquímica e microscopia eletrônica com citoquímica sugeriram alta expressão de fosfatases em isolados

recentes do fungo e em células escleróticas

Adesão a células do hospedeiro

ALVIANO et al. 2003, KNEIPP et al. 2003, KNEIPP et al.

2004

EctoATPases Identificação, quantificação e

caracterização de ATPases em conídios, micélio e células escleróticas

Diferenciação celular, nutrição e patogênese

COLLOPY-JUNIOR et al. 2006

Peptidases

Identificação de peptidases diferentes. Caracterização de peptidases de isolados recentes do fungo. Alta expressão de peptidases em isolados recentes.

Degradação de matriz extracelular e

imunoglobulinas, disseminação no hospedeiro

PALMEIRA et al. 2006

11


Tabela 2: Atuação de F. pedrosoi na resposta imune e possível papel do fungo na

infecção.

Observação em modelo experimental Papel sugerido na infecção Referência

Liberação de intermediários reativos de oxigênio em macrófagos na interação com

o fungo in vitro

Fungo resistente a fagócitos e a intermediários reativos de oxigênio

liberado por fagócitos

ROZENTAL et al. 1994

Neutrófilos de rato eliminam conídios em interação in vitro

Peróxido liberado por neutrófilos participam do controle da infecção

ROZENTAL et al. 1996

F. pedrosoi penetra em células tratadas com inibidores de citoesqueleto

Penetração ativa do fungo em tecidos LIMONGI et al. 1997, FARBIARZ et al. 1992

Células escleróticas produzidas em laboratório reconhecidas por anticorpos de

soro de pacientes

Resposta imune com apresentação de antígenos do fungo e produção de

anticorpos

ALVIANO et al. 2004

Fagocitose de conídios e células escleróticas aumentadas por neutrófilos em

associação à melanina do fungo

Fagocitose estimulada pela melanina do fungo

ALVIANO et al. 2004

F. pedrosoi sem ácido siálico é mais fagocitoso por neutrófilos humanos

Estruturas de superfície do fungo evitam fagocitose e lise do fungo

ALVIANO et al. 2004

Níveis menores de citocinas inflamatórias em lesões severas

Resposta majoritariamente inflamatória do hospedeiro resulta em lesões menores

SOUSA et al. 2008

F. pedrosoi estimula a produção de TNF-α e IL-1β. Modulação negativa de CD-80 e

MHC-II

Indução de resposta inflamatória, inibição de ativação linfocitária

HAYAKAWA et al. 2006

Níveis de nitrito baixos em interação de macrófagos e F. pedrosoi

Inibição da síntese de óxido nítrico na infecção

BOCCA et al. 2006

Fagocitose de conídios inibe CD-40 e b7.2 em células de Langerhans

Supressão de ativação de linfócitos B DA SILVA et al. 2007

Pacientes com lesões avançadas apresentam baixos níveis de IFN-γ e altos níveis de IL-

10

Resposta anti-inflamatória do hospedeiro sugere lesões mais extensas

MAZO FAVERO GIMENES et al. 2005

12


8. TRATAMENTO

F. pedrosoi, que é o mais importante agente etiológico da cromoblastomicose, é

também o menos sensível aos antifúngicos sistêmicos (BONIFAZ, PAREDES-SOLIS e

SAUL, 2004). Ainda hoje não foi definido um tratamento-padrão ótimo para a

cromoblastomicose, em classe, concentração de antifúngico e modo de administração

(ESTERRE e QUEIROZ-TELLES, 2006).

A anfotericina B é sugerida apenas como sendo parcialmente eficaz quando

administrada em injeções intralesionais, e não foi destaque nas mais recentes revisões ou

descrições de casos de tratamento (LOPEZ MARTINEZ e MENDEZ TOVAR, 2007).

Restrepo e colaboradores (RESTREPO, GONZALEZ, GOMEZ et al., 1988) sugeriram

que o tratamento com azol por monoterapia de itraconazol é eficaz em um período de

tratamento de 12-24 meses, sendo este administrado em doses diárias de 200 a 400 mg.

Queiroz-Telles e colaboradores (QUEIROZ-TELLES, PURIM, FILLUS et al., 1992) já

descreveram 42% de cura em pacientes tratados com doses de 200 a 400 mg/dia de

itraconazol em uma média de sete meses. Já o cetoconazol não é recomendado para o

tratamento da cromoblastomicose por ter baixa eficiência contra o fungo e alta toxicidade

endócrina e hepática. O itraconazol é amplamente usado hoje em dia, porém esta droga possui

irregular absorção pelo organismo e imprevisíveis níveis plasmáticos, além de ser

metabolizado no fígado, podendo levar a algumas interações medicamentosas (ESTERRE e

QUEIROZ-TELLES, 2006). No tratamento com itraconazol a dosagem pode ser limitante por

reduzir a concentração de potássio no soro, causando supressão adrenal quando administrado

em mais de 600 mg/dia.

13


A terapia combinada de itraconazol com flucitosina já foi descrita como tendo um

considerável sucesso, porém este último antifúngico foi excluído do mercado brasileiro por

determinações da ANVISA em 2006. Além das reações adversas que causava, eram

observadas altas taxas de desenvolvimento de resistência fúngica após breve período de

administração (http://portal.saude.gov.br/portal/-arquivos/pdf/flucitosina.pdf).

A terbinafina costuma ser empregada por apresentar taxas de cura superiores a 80%, em

doses de 250-500 mg/dia, seguida por até dois anos sem reincidência. Este antifúngico tem

baixa toxicidade em relação ao itraconazol e um potencial efeito antifibrótico em lesões

recentes (ESTERRE e QUEIROZ-TELLES, 2006). Contudo, em muitos casos a monoterapia

com itraconazol ou terbinafina é ineficaz e a reincidência da doença a longo prazo nos

pacientes chega a 43% (GUPTA, TABORDA e SANZOVO, 2002). Atualmente, a terapia

combinada de itraconazol com terbinafina, administradas alternadamente por semana, é a

mais indicada, possivelmente por serem antifúngicos com diferentes alvos enzimáticos,

podendo agir sinergicamente (ESTERRE e QUEIROZ-TELLES, 2006).

O custo anual em terapia antifúngica para cromoblastomicose, para administrações orais

de 200mg/dia de itraconazol é de R$ 4.964,16 por paciente. Sendo o tratamento escolhido 250

mg/dia de terbinafina, o valor cai a R$ 2.373,41. Considerando-se o custo anual da terapia

combinada de pulso alternada, com administração de 400 mg/dia/mês de itraconazol e 500

mg/dia/mês de terbinafina, o custo passa a R$ 1.689,15. Os valores dos tratamentos são altos

e inacessíveis a faixa da população mais afetada por essa doença, trabalhadores rurais com

baixa renda (HIRA, YAMADA, TAKAHASHI et al., 2002; BONIFAZ, PAREDES-SOLIS et

al., 2004; GROTO, 2008).

Outras modalidades de tratamento sugeridas e que possuem relativa eficácia são a

criocirúrgia com nitrogênio líquido (CASTRO, PIMENTEL e LACAZ, 2003), o uso de

14


compressas quentes e aplicações de laser de dióxido de carbono (HIRA, YAMADA et al.,

2002), e a combinações dessas técnicas com drogas antifúngicas.

Excisão cirúrgica de lesões pequenas, ou ainda, a amputação de membros com lesões

extensas e debilitantes também costumam ser sugeridos como formas de tratamento

complementares (LOPEZ MARTINEZ e MENDEZ TOVAR, 2007; SANTOS, PALMEIRA

et al., 2007).

No Congresso Brasileiro de Micologia, ocorrido em Recife, PE, em 2007, foi discutida

a relevância de tratamentos cirúrgicos, principalmente os debilitantes, como a amputação.

Concluiu-se que tais métodos devem ser desencorajados por causarem graves limitações ao

paciente.

9. MECANISMOS DE AÇÃO DE ANTIFÚNGICOS – FOCO EM AGENTES UTILIZADOS PARA

CROMOBLASTOMICOSE

Anfotericina B

Este antifúngico é da classe dos polienos, e é extraído do actinomiceto Streptomyces

nodosus. Mesmo não tendo uso direto para a cromoblastomicose é interessante descrever seu

mecanismo de ação por ser um dos mais antigos antifúngicos ainda com uso clínico, e por

ainda ser a terapia de escolha inicial para micoses sistêmicas (INSELMANN, INSELMANN e

HEIDEMANN, 2002). Além de ter sido utilizada como parâmetro comparativo para alguns

dos experimentos desta tese.

A anfotericina B liga-se ao ergosterol, principal esterol de membrana em fungos,

desestabilizando a membrana plasmática da célula fúngica, criando poros e causando

extravasamento do conteúdo celular (Figura 5). Sua seletividade está na diferença

conformacional do alvo, já que o principal esterol em membranas humanas é o colesterol, de

15


conformação sigmóide, em contraste com a conformação cilíndrica do ergosterol

(INSELMANN, INSELMANN et al., 2002; ODDS, BROWN e GOW, 2003).

Figura 5: Modelo de ação da anfotericina B, permebilização celular e extravasamento de

conteúdo eletrolítico citoplasmático (adaptado de www.doctorfungus.com).

Um problema na sua administração é sua alta nefrotoxicidade, causando reações

adversas graves, o que limita a concentração máxima das doses. Novas formulações em

inclusões nanoméricas lipídicas minimizam estas reações por liberarem a anfotericina B nas

proximidades do fungo, pela ação das lipases do próprio fungo (ODDS, BROWN et al.,

2003).

Azóis

Constituem a maior classe de antifúngicos em uso clínico. Os representantes de maior

expoente são o fluconazol, muito utilizado para infecções de Candida spp., cetoconazol, e o

itraconazol. Sua atividade é fungistática e consiste em alterar a permeabilidade da membrana

plasmática por inibir a síntese de ergosterol (Figura 6). Esta inibição se deve ao fato de um

16


átomo de hidrogênio dos azóis se ligar ao ferro do sítio ativo da enzima 14-α-demetilase ,

impedindo a desmetilação do lanosterol na via de síntese do ergosterol (ODDS, BROWN et

al., 2003).

O desenvolvimento de novos azóis tem sido crescente, e nos últimos cinco anos

observamos a aprovação e lançamento de dois novos compostos: voriconazol e posaconazol,

derivados do fluconazol e no itraconazol, respectivamente. O voriconazol já é terapia de

escolha para aspergiloses invasivas em alguns países; o posaconazol foi recentemente

aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA - EUA) e é sugerido para utilização em

micoses invasivas refratárias a outros antifúngicos (SCHEINFELD, 2007).

Figura 6: Mecanismo de ação de inibidores da síntese de ergosterol, azóis (em

vermelho, inibição da 14-α-demetilase) e alilaminas (amarelo, inibição da esqualeno

epoxidase) (adaptado de www.doctorfungus.com).

17


Alilaminas

Este grupo de antifúngicos tem a terbinafina como seu maior representante. A atividade

fungicida se dá pela inibição da enzima esqualeno epoxidase da via de síntese do ergosterol

(Figura 6), acarretando na má formação do ergosterol, com conseqüente desestabilização da

membrana celular do fungo (KONTOYIANNIS e LEWIS, 2002).

10. CONSIDERAÇÕES SOBRE O ATUAL EMPREGO DE ANTIFÚNGICOS

Com a gravidade das infecções causadas por Candida albicans e Aspergillus fumigatus

em indivíduos imunocomprometidos, pacientes transplantados, em pós-operatório, ou sob

utilização de corticoesteróides, a necessidade de novos antifúngicos aumentou

vertiginosamente. Infecções por A. fumigatus vêm ocorrendo com incidência crescente em

formas invasivas, se tornando o maior alvo de preocupação em infecções fúngicas e maior

causa de morte em indivíduos transplantados (SELITRENNIKOFF e NAKATA, 2003). O uso

indiscriminado de fluconazol em candidíases de mucosas acarretou em pressão seletiva, ou

estímulos estressantes (COWEN, 2008), que levaram à resistência do fungo a este agente e ao

aumento de infecções por Candida não-albicans (SELITRENNIKOFF e NAKATA, 2003).

A resistência azóis se dá pela superexpressão de bombas de efluxo na membrana dos

fungos, que atuam expulsando os antifúngicos do interior da célula (GRAYBILL, 1996;

ODDS, BROWN et al., 2003). Em espécies de Aspergillus foi sugerido, que ocorre a

superexpressão da 14-α-demetilase do citocromo p450, resultando em concentrações altas da

enzima alvo dos azóis, tendo, então, pouco ou nenhum efeito sobre o fungo as concentrações

de azóis normalmente aplicadas no tratamento. (OSHEROV, KONTOYIANNIS, ROMANS

et al., 2001).

18


Em 1996, as estratégias para o tratamento contra fungos incluíam a redução da

toxicidade dos polienos, com enclausuramento de anfotericina B em formas lipídicas;

melhoria da farmacodinâmica dos azóis; desenvolvimento de novos antifúngicos que afetam a

síntese de componentes de parede celular (equinocandinas); terapia combinada com

antifúngicos de ação sinérgica; e estimulação do sistema imune do paciente pela

administração de citocinas (GRAYBILL, 1996).

Passados mais de dez anos, pouco mudou em relação às estratégias de tratamento

antifúngico, porém alguns autores apontam a via de biossíntese da parede celular dos fungos,

e de suas moléculas constituintes, alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas

de atividade antifúngica (KONTOYIANNIS e LEWIS, 2002; NIMRICHTER, RODRIGUES,

RODRIGUES et al., 2005).

O desenvolvimento de novos agentes antifúngicos é extremamente demorado, levando,

em média, mais de 20 anos. A estimativa de custo para o desenvolvimento de uma droga

totalmente nova até a sua entrada no mercado é de aproximadamente 802 milhões de dólares

(HOLLINGHAM, 2005). Discute-se hoje que doenças tropicais de caráter endêmico e não

epidêmico, têm sido ignoradas pelas indústrias farmacêuticas, já que a introdução de um novo

tratamento para essas doenças é lenta. Isto se deve à baixa provenção de fomento, privado e

público para a pesquisa e o desenvolvimento de drogas para doenças que costumam afetar

uma parcela economicamente desfavorecida da população mundial.

Devido aos desafios dos tratamentos das infecções fúngicas, alguns autores sugerem,

baseados em testes in vivo e in vitro, que fármacos anteriormente destinados aos tratamentos

de outras enfermidades podem apresentar uma atividade nociva ao crescimento de fungos, e

poderiam ser uma alternativa ao tradicional tratamento com antifúngicos, tendo uso em

terapias combinadas para uma atividade sinérgica com antifúngicos clássicos (AFELTRA e

VERWEIJ, 2003).

19


Inibidores da síntese de melanina já foram sugeridos como potenciais agentes

terapêuticos para infecções por Exophiala dermatitidis (GEIS, WHEELER e SZANISZLO,

1984). A literatura ainda indica que os compostos envolvidos na via de biossíntese e

expressão da melanina são alvos atrativos para novas terapias contra infecções por fungos

melanizados (WANG e CASADEVALL, 1996; NIMRICHTER, RODRIGUES et al., 2005;

SANTOS, PALMEIRA et al., 2007).

11. MELANINAS

Melaninas são compostos ainda hoje enigmáticos para a ciência. Apesar dos extensos

estudos em relação à contribuição da melanina para a patogênese de microorganismos,

estudos sobre pigmentação humana (albinismo, vitiligo) e câncer de pele, não existe descrição

da estrutura ou composição química definida para esse polímero. Fatores que dificultam o

estudo de melanina são a sua baixíssima solubilidade em vários solventes (a exceção de

soluções altamente básicas) e seu alto peso molecular, este ainda não definido para as

melaninas produzidas por fungos. Uma ferramenta analítica que atualmente tem sido usada

pra definir um pigmento como melanina é a espectroscopia por ressonância paramagnética

eletrônica (LANGFELDER, STREIBEL, JAHN et al., 2003; NOSANCHUK e

CASADEVALL, 2003).

Esses pigmentos poliméricos possuem propriedades em comum: (i) são muito estáveis a

extremos de temperatura; (ii) são resistentes a quebras físicas e químicas; (iii) são insolúveis

em água e em muitos solventes orgânicos; e (iv) são de difícil extração do organismo de

origem, sendo necessárias seguidas etapas com solventes orgânicos, enzimas e álcalis para seu

isolamento em laboratório (HENSON, BUTLER e DAY, 1999; NOSANCHUK e

CASADEVALL, 2003). São ainda descritos em melaninas outros atributos interessantes

20


como as propriedades de semicondutor que possuem, assim como sua utilização na fabricação

de protetores solares, cosméticos e corantes (JACOBSON, 2000).

As melaninas são produzidas por vários organismos, de bactérias a seres humanos,

podendo derivar de várias vias metabólicas, precursores, enzimas e intermediários distintos e

aparentemente não relacionados entre as várias espécies dos diferentes domínios da natureza.

Algumas semelhanças nas vias de biossíntese de melanina de diversas espécies parecem

começar por reações de redução e oxidação de substratos aromáticos hidroxilados, como

fenóis e indóis. As reações e substratos envolvidos no processo de formação de melanina

geram um pigmento escuro, geralmente marrom ou preto, mas podendo ter outras colorações

como amarelo e vermelho (JACOBSON, 2000).

Em humanos, a via de síntese da melanina ocorre em organelas denominadas

melanossomos, que estão em células produtoras de melanina encontradas na epiderme, os

melanócitos. Uma fenoloxidase oxida a tirosina a L-dopa, que passará por outras etapas

enzimáticas, até a auto oxidação/polimerização em melanina (DELL'ANGELICA, 2003).

Desde 1960 sabe-se da existência deste pigmento em fungos (WHEELER e BELL,

1988). Suas vias principais de produção são: (i) a via da dihidroxifenilalanina, ou via da

DOPA, por oxidação da L-dopa formando intermediários semelhantes aos da via humana; e

(ii) a via do dihidroxinaftaleno, ou via DHN, tendo sua produção constitutiva a partir do

acetato (acetil-CoA) derivado do metabolismo da glicose (Figura 7). Esta última foi descrita

como a mais freqüentemente encontrada em ascomicetos e deuteromicetos e é o que

caracteriza alguns fungos como sendo negros ou demáceos (KOGEJ, WHEELER,

LANISNIK RIZNER et al., 2004).

21


Figura 7: Esquema proposto para a via de biossíntese de melanina em mamíferos e no

fungo Cryptococcus neoformans (via da DOPA), e para a via da DHN-melanina sugerida para

F. pedrosoi. Adaptado de (LANGFELDER, STREIBEL et al., 2003; LEE, JUNG e KIM,

2003; PLONKA e GRABACKA, 2006; ZHONG, FRASES, WANG et al., 2008)

O citoplasma e a parede celular já foram descritos como local da produção de melanina

em fungos (POLAK, 1990). Contudo, a síntese de melanina em fungos negros que tem sido

22


detectada em organelas especializadas chamadas melanossomos (FRANZEN, DE SOUZA,

FARINA et al., 1999; NOSANCHUK e CASADEVALL, 2003; FRANZEN, CUNHA,

MIRANDA et al., 2008).

Experimentos com C. neoformans, Paracoccidioides brasiliensis e em F. pedrosoi,

mostraram que fungos melanizados, mesmo depois de agressivos tratamentos com enzimas,

detergente, solvente e ácido a alta temperatura, mantiveram uma estrutura externa semelhante

à obtida com esses fungos antes desse tratamento, sendo, por isso, nomeada ghost. Isso

sugeriu que a melanina em fungos, possivelmente, interage com os componentes da parede

celular, mantendo a estrutura externa. Nesses experimentos, as células não melanizadas não

resistiram ao procedimento aplicado, não restando ghosts detectáveis (WANG, AISEN e

CASADEVALL, 1996; JACOBSON, 2000; ALVIANO, FRANZEN, TRAVASSOS et al.,

2004).

12. MELANINA É UM FATOR DE VIRULÊNCIA EM FUNGOS

O interesse na pesquisa da melanina em fungos é grande, devido a sua função protetora

contra agentes radioativos, oxidantes, elementares ou imunes (NOSANCHUK e

CASADEVALL, 2003). Em fungos patogênicos para o ser humano, como C. neoformans,

Aspergillus spp. e Exophiala dermatitidis, a melanina já foi citada como fator de virulência, e

em vários outros fungos patogênicos já foi descrita sua biossíntese, como Sporothrix schenkii,

P. brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis e Candida albicans

(JACOBSON, 2000; LANGFELDER, STREIBEL et al., 2003; MORRIS-JONES,

YOUNGCHIM, GOMEZ et al., 2003; NOSANCHUK e CASADEVALL, 2003).

Nos últimos anos, as revisões sobre melanina a definiram como um fator de virulência

por ser: (I) capaz de conferir resistência ao calor, ao frio, a enzimas, e a solventes orgânicos;

23


(II) de ter função antioxidante; (III) de aumentar a resistência a antifúngicos; e de (IV)

potencializar a invasão a tecidos (GOMEZ e NOSANCHUK, 2003; LANGFELDER,

STREIBEL et al., 2003; NOSANCHUK e CASADEVALL, 2003; 2006; PLONKA e

GRABACKA, 2006).

Sugerimos, em 2005, que a vía de biossíntese da melanina em F. pedrosoi é a DHN.

Foram observadas diferenças na pigmentação do fungo em presença de um inibidor seletivo

da via DHN (triciclazol, descrito em maiores detalhes abaixo) e da manutenção de uma

coloração não nativa da colônia com a inserção do triciclazol e do intermediário da via da

DOPA, L-dopa (CUNHA, FRANZEN et al., 2005).

13. INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE DHN-MELANINA (IBM) EM FUNGOS

Comercialmente conhecido como BIM 750 (Dow Agrosciences, EUA), o triciclazol (5-

metil-1,2,4-triazol-(3,4-β) benzotiazol) tem pouco ou nenhum efeito sobre a viabilidade do

fungo em cultura. O alvo específico deste agrotóxico está na via de biossíntese de DHN-

melanina (ROMERO-MARTINEZ, WHEELER, GUERRERO-PLATA et al., 2000;

BUTLER, GARDINER e DAY, 2005; CUNHA, FRANZEN et al., 2005).

O triciclazol, e outros inibidores da via DHN, como piroquilona e ftalida, são

comercialmente utilizados para prevenir doenças em plantações de arroz causadas por

Pyricularia Oryzae, Colletotrichum lagenarium e Colletotrichum lindemuthianum

(HENSON, BUTLER et al., 1999; MARES, ROMAGNOLI, ANDREOTTI et al., 2004).

Estes compostos atuam dentro do fungo como inibidores específicos de redutases, produzindo

o mesmo efeito de uma mutação direcionada aos genes que expressam essas enzimas. A

inibição gera o acúmulo de flaviolina, um subproduto do metabolismo de 1,3,6,8-

tetrahidroxinaftaleno. Outra etapa da via que também parece ser afetada é a redução de 1,3,8-

24


trihidroxinaftaleno a vermelona, possivelmente levando ao acúmulo de subprodutos, como 2-

hidroxijuglona. Esses subprodutos da interrupção da via de biossíntese da melanina

provavelmente são os compostos que conferem a coloração das colônias tratadas com esses

inibidores. (KURAHASHI, 2001; LANGFELDER, STREIBEL et al., 2003)

Outros compostos capazes de inibir seletivamente a via DHN-melanina são os

inibidores de desidratase, a exemplo da carpropamida, desenvolvidos na década de 90. Estes

atuam inibindo competitivamente a scitalona-desidratase e a vermelona-desidratase, etapas

destacadas na figura 8 (KURAHASHI, 2001).

Figura 8: Via de síntese da DHN-melanina e alvos de atuação dos inibidores de redutase

e de desidratase (KURAHASHI, 2001).

14. RELEVÂNCIA DO ESTUDO DE FUNGOS MELANIZADOS

O estudo da melanina, assim como o de interações celulares com fungos melanizados,

apresenta informações significativas sobre as infecções fúngicas e oferece modelos do

ambiente fungo-hospedeiro.

Em F. pedrosoi já foram descritas: a resistência do fungo à maquinaria enzimática da

fusão fagossoma-lisossoma em macrófagos residentes de camundongo (FARBIARZ, DE

25


CARVALHO, ALVIANO et al., 1990); a inibição da fagocitose pela presença de melanina na

parede do fungo (FARBIARZ, DE CARVALHO et al., 1992); o efeito fungistático da ação de

macrófagos ativados e a ação fungicida resultante da produção de mieloperoxidase em

neutrófilos de rato (ROZENTAL, ALVIANO et al., 1994); e o aumento da susceptibilidade

deste a macrófagos ativados de camundongo, quando a via de biossíntese de melanina é

inibida pelo uso do triciclazol (CUNHA, FRANZEN et al., 2005).

Assim, as informações relacionadas à formação da melanina, sua caracterização como

fator de virulência e sua importância frente a antifúngicos merecem destaque, pois podem

tornar compreensíveis alguns fatores da dificuldade de tratamento e cronicidade característica

desta infecção, contribuindo no desenvolvimento de um tratamento mais eficaz, rápido,

seguro e barato para a cromoblastomicose.

26


Objetivo Geral:

Compreender a função e as propriedades da melanina no fungo patogênico F. pedrosoi.

Metas:

1. Caracterizar os pigmentos isolados do fungo F. pedrosoi em condições de produção

normal de melanina (controle) e após a inibição da via de síntese de melanina pelo

triciclazol, por espectroscopia de ultravioleta e ressonância paramagnética eletrônica.

2. Medir a constante elástica e a deformação mediante pressão no fungo tratado ou não com

triciclazol por espectroscopia de força atômica.

3. Avaliar a susceptibilidade e o crescimento de F. pedrosoi em presença de triciclazol e dos

antifúngicos anfotericina B, itraconazol e terbinafina.

4. Avaliar a toxicidade de inibidores de biossíntese de DHN-melanina em sistemas de

predição de toxicidade em mamíferos.

5. Aferir o crescimento de F. pedrosoi em presença de triciclazol e dos agentes de estresse:

óxido nítrico, peróxido de hidrogênio, SDS e cloreto de sódio.

6. Avaliar a atividade antioxidante do fungo.

7. Identificar a atividade da enzima óxido nítrico sintase induzível em macrófagos murinos

ativados em interação com F. pedrosoi em presença ou ausência de triciclazol.

8. Observar os efeitos do tratamento com outros inibidores da via de biossíntese da DHN-

melanina (ftalida, piroquilona e carpropamida) na pigmentação de F. pedrosoi.

9. Observar os efeitos do tratamento com triciclazol na pigmentação de outros fungos

produtores de melanina.

10. Descrever os aspectos microscópicos da distribuição de F. pedrosoi em biópsias de

pacientes com cromoblastomicose, por microscopia eletrônica de varredura ambiental.

27


Materiais e Métodos

1. CULTIVO DO FUNGO

O fungo Fonsecaea pedrosoi (5VPL), isolado de um caso humano de

cromoblastomicose (OLIVEIRA, RESENDE, LOPES et al., 1973), foi mantido em meio

definido Czapek-Dox modificado (CD) de composição em g/L: sacarose 30, NaNO3 2,

KH2PO4 0,8, MgSO4 . 7 H2O 0,5, KCl 0,5, citrato férrico amoniacal 0,01, acrescido de 3 g/L

de Ágar a 10ºC sob óleo mineral. Para os ensaios, este fungo foi cultivado em meio CD, pH

5.0, sob agitação à temperatura ambiente por 7 dias. Isolados de F. pedrosoi de pacientes de

cromoblastomicose da Unidade de Referência em Dermatologia Sanitária do Estado do Pará

"Dr. Marcello Candia” (Marituba, Pará) descritos na tabela 3 foram mantidos em meio

CDagar a 10 ºC sob óleo mineral e cultivados em meio CDagar à temperatura ambiente por 7

dias. Estes isolados foram utilizados em experimentos de análise de crescimento após

exposição a antifúngicos e triciclazol.

Prontuário Idade (anos)

Tempo de lesão na coleta (anos)

Localização da lesão Tratamento utilizado

22957 49 10 Cotovelo esquerdo Itraconazol 200mg/dia (no momento da coleta)

36020 51 14 Dorso do pé direito Itraconazol 200mg/dia

38823 47 10 Membro inferior direito Itraconazol 200mg/dia

38868 36 1 Dorso do pé direito Itraconazol 200mg/dia.

Tabela 3: Informações dos pacientes de cromoblastomicose da UMC, doadores de

isolados de F. pedrosoi.

28


Observação: A utilização de cepas isoladas de pacientes, de biópsia de lesão destes,

bem como divulgação de dados de seus prontuários, foi devidamente regulamentada pelos

comitês de ética das instituições envolvidas.

Phialophora verrucosa, Cladosporium carrioni, Exophiala dermatitidis, Exophiala

jeanselmei, cedidos pela Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil, foram mantidos em

Agar batata dextrose (Biolife, Brasil), a 4 ºC, sob óleo mineral. Aspergillus fumigatus

(Af293, tipo-selvagem) foi doado pelo Prof. Dr. Scott Filler (Los Angeles Biomedical

Research Institute at Harbor-UCLA Medical Center, California, EUA) e estocado em Ágar

batata dextrose, a 4 ºC, sob óleo mineral.

2. INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE MELANINA (IBM)

O triciclazol, gentilmente cedido por Dow Agrosciences Industrial (EUA), foi

adicionado às culturas na concentração final de 16 µg/mL para inibir a formação de melanina

no fungo F. pedrosoi (ROMERO-MARTINEZ, WHEELER et al., 2000; CUNHA,

FRANZEN et al., 2005).

Carpropamida, ftalida e piroquilona, adquiridos de Sigma-Aldrich (Brasil), foram

adicionados individualmente às culturas de F. pedrosoi na concentração final de 16 µg/mL.

Os IBM foram previamente dissolvidos em DMSO e adicionados ao meio de cultura

(Sigma-Aldrich, Brasil) garantindo-se que a concentração final do solvente no meio de

cultura, ou no meio de ensaio de susceptibilidade a antifúngicos, não ultrapassasse 0,2 %. Tal

concentração de DMSO não provocou modificação nos padrões de crescimento dos fungos

testados.

29


3. PROTOCOLO DE CULTIVO DOS FUNGOS EM PRESENÇA DE IBM

Para a verificação visual da modificação na pigmentação das colônias devido à inibição

da via de biossíntese da melanina por algum IBM, F. pedrosoi em cultura de 7 dias no meio

líquido CD foi inoculado por swab em 1 mL de meio sólido Ágar batata dextrose em placa de

24 poços contendo 16 µg de triciclazol, carpropramida, piroquilona ou ftalida. Tais

observações também foram realizadas inoculando-se o fungo em meio CD nas mesmas

condições de presença de IBM.

Esse protocolo foi estendido aos fungos Phialophora verrucosa, Cladosporium

carrioni, Exophiala dermatitidis, Exophiala jeanselmei, crescidos em tubos de vidro de 5 mL

com tampa de rosca, a temperatura ambiente, por 7 dias, e a Aspergillus fumigatus (Af293),

cultivado em placas de 24 poços a 35 ºC por 3 dias, com 1 mL de Ágar batata dextrose

contendo 16 µg de triciclazol.

4. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE PIGMENTOS TIPO MELANINA

Para a extração da melanina, 1 litro de cultura foi filtrado em papel de filtro Whatman

nº1 para remoção do meio de cultivo. O sistema foi acrescido de 1 Litro de NaOH 0,5 M e

mantido sob agitação rotatória a temperatura ambiente, por 24 horas. Em seguida, a suspensão

foi mantida em repouso a 10 ºC por 24 horas, seguida de filtração em papel de filtro e

precipitação do sobrenadante com HCl 6 M. O material, recuperado por filtração, foi lavado

exaustivamente com água destilada e liofilizado (ALVIANO, FARBIARZ, DE SOUZA et al.,

1991). O resultado desta etapa foi à obtenção de menos de 10 mg de um pó preto, insolúvel

em água e solúvel em NaOH 0,5 M o qual consideramos ser a melanina isolada.

Observação: Ao longo desta tese citaremos o pigmento derivado desta extração em

culturas suplementadas com 16µg de triciclazol como “melanina-triciclazol”, e quando em

30


referência ao pigmento oriundo de culturas controle (sem triciclazol), citaremos como

“melanina-controle”. Assim como citaremos as células derivadas das condições de cultivo em

presença de 16 µg/mL de triciclazol de fungo (ou conídios, ou F. pedrosoi)-triciclazol, e em

condições controle de fungo (ou conídios, ou F. pedrosoi)-controle.

5. RESSONÂNCIA PARAMAGNÉTICA ELETRÔNICA (EPR)

Dez microgramas do pigmento isolado do fungo-controle ou do fungo-triciclazol, foram

triturados por maceração em cadinho de porcelana para a análise por EPR. O espectro foi

adquirido em temperatura ambiente em um espectrômetro Bruker ESP 380-E CW/FT

operando a X-Band (9.5 GHz) e 100 kHz. A modulação da amplitude foi mantida em

constantes 3.0 gauss e microondas de baixa potência foram utilizadas para evitar saturação.

Os fatores “g” foram medidos contra o padrão de DPPH (2,2-difenil-1- picrilidrazila), g =

2.0023. Os experimentos de saturação de microondas foram realizados pela medição do

espectro no intervalo de 0,02-200 mW, enquanto os outros parâmetros experimentais não

foram alterados.

6. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORBÂNCIA EM ULTRAVIOLETA

Os pigmentos isolados e liofilizados foram dissolvidos em DMSO na concentração de 1

mg/mL e analisados em espectrofotômetro Shimadzu UV-1601, em cubetas de quartzo com 1

cm de caminho ótico, entre 250-400 nm. Melanina sintética (Sigma-Aldrich, Brasil) foi

utilizada para compor a curva de calibração a 400 nm utilizada para cálculo das concentrações

de pigmentos isolados.

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7. ESPECTROSCOPIA DE FORÇA

A espectroscopia de força é um recurso baseado na microscopia de força atômica e uma

das ferrramentas utilizadas para o discernimento de propriedades adesivas e elásticas de

amostras biológicas. Conídios- controle e conídios-triciclazol foram isolados por filtração,

lavados em PBS a temperatura ambiente e aderidos a lâminas de vidro revestidas com poli-L-

lisina por uma hora. As medições de espectroscopia de força foram realizadas em microscópio

de força atômica Asylum Research MFP-3D (California, EUA), com cantilever Bio-lever

(Olympus, EUA) de constante de mola 0,027 N/m. As amostras foram mantidas e analisadas

em PBS, a temperatura ambiente e, após as medições, os dados obtidos foram extraídos e

interpretados segundo algoritimo desenvovido por Monçores (2008).

8. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS

Os testes para determinação da susceptibilidade do fungo F. pedrosoi aos antifúngicos

anfotericina B, itraconazol e terbinafina foram realizados baseados na norma M38-A do

Clinical and Laboratory Standards Institute de 2002 (CLSI – antigo National Committee for

Clinical Laboratory Standards, NCCLS, EUA), divulgadas pela ANVISA

(http://www.sbmicrobiologia.org.br/clsi_OPAS1M38-A.pdf).

Para o preparo das soluções-padrão, os antifúngicos foram dissolvidos em DMSO

(Sigma-Aldrich, Brasil) em concentrações 100 vezes mais altas que a maior concentração a

ser utilizada nos testes. As soluções foram armazenadas em frascos de polipropileno à

temperatura de -25 °C, e utilizadas após, no máximo, 3 meses.

As diluições dos antifúngicos em RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Brasil), tamponado com

MOPS (ácido 3-[N-morfolino] propanosulfônico) 0,165 mol/L pH 7.0 (RPMI-MOPS) foram

feitas de acordo com a norma M38-A, sendo que as diluições para terbinafina, não descritas

32


na norma, foram feitas tais quais as sugeridas para itraconazol. Em placa de 96 poços, um

volume de 100 µL foi aplicado por poço para cada solução anteriormente à adição do inóculo

de fungo. Os experimentos consistiram na inoculação de 5 X 10³ conídios por poço, contados

em câmara de Neubauer sob microscopia ótica. O sistema foi incubado a 35 °C, e a leitura do

crescimento foi realizada após 48 horas em microscópio ótico invertido Axiovert (Zeiss,

Alemanha) para detecção dos poços onde não houve crescimento.

Observação: A norma M38-A não define pontos de corte específicos para os

antifúngicos testados. Contudo, no tratamento com anfotericina B no caso de fungos

filamentosos, CIMs superiores a 2 µg/mL têm sido associadas com fracasso dos tratamentos e

CIMs inferiores a 2 µg/mL, com cura clínica. Em relação ao itraconazol, os valores altos de

CIM (>8 µg/mL) estão associados com resistência clínica a esse agente.

O teste foi validado pela utilização de A. fumigatus Af293 como controle, de CIM a

anfotericina B comparável a cepa-padrão ATCC 204305 (CHIANG, EJZYKOWICZ, TIAN et

al., 2006).

9. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AO TRICICLAZOL

Para determinação de concentração inibitória mínima de triciclazol foram testadas

concentrações de 0,17 até 350 µg/mL, em experimentos de microdiluição em caldo, conforme

descrito no item 9. As variáveis desse experimento foram conídios de F. pedrosoi,

provenientes de culturas suplementadas, ou não, com 16 µg/mL de triciclazol.

10. SUSCEPTIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS EM ASSOCIAÇÃO AO TRICICLAZOL

Para verificar a influência da inibição da biossíntese de melanina pelo triciclazol na

susceptibilidade aos antifúngicos testados, triciclazol foi adicionado como uma variável dos

33


ensaios de susceptibilidade na concentração de 16 µg/mL. Estes ensaios foram realizados em

triplicata.

11. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO A ANTIFÚNGICOS

2 x 103 conídios foram inoculados em diluições de antifúngicos correspondentes à

concentração inibitória mínima determinada no teste de susceptibilidade descrito no item 9 e 0

(controle), 2, 4 e 16 vezes esta concentração.

Em 1 mL de RPMI-MOPS contendo uma determinada diluição de antifúngico foi então

inoculado o fungo-controle ou o fungo-triciclazol. O triciclazol foi mantido a 16 µg/mL nos

experimentos em que o fungo-triciclazol foi variável.

O sistema foi incubado a 35 ºC por 24 horas, centrifugado, lavado em RPMI-MOPS

para remoção do antifúngico e sendo uma alíquota de 50 µL retirada e plaqueada em 1 mL de

CDagar em placa de 24 poços e mantidas a temperatura ambiente. As culturas foram

acompanhadas por 10 dias, tendo seu ponto de crescimento ideal para análise definido em 7

dias.

As placas tiveram seu fundo digitalizado em escâner (Figura 9 A) (Epson Perfection

3450 photo, Epson corp, EUA) com 600 dpi de resolução em modo de 24-bit colorido. A

imagem obtida foi processada no software Adobe Photoshop CS3 (Adobe corporation, EUA)

e em seguida: (Figura 9 B) ajustada para brilho e contraste pelas ferramentas de edição não-

linear levels e curves, para destaque das colônias de fungos sobre o fundo da placa e sobre o

meio de cultivo; (Figura 9 C) convertida à imagem binária em preto e branco pela ferramenta

34


threshold, tendo o ponto de corte definido visualmente pela correspondência da área onde

houve crescimento pela área definida como “preto” após aplicação do threshold; (Figura 9 D)

invertida com uso da ferramenta invert para definição da área de crescimento como “branco”

e do fundo como “preto”, sendo então os valores de “branco” passíveis de quantificação.

A quantificação do crescimento foi feita no software Image-J (Rasband, W.S., ImageJ,

U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, http://rsb.info.nih.gov/ij/,

1997-2007) utilizando a ferramenta measure do item de menu analyze. A área definida para

medição foi a da circunferência da área interna de um poço da placa de 24 poços. Esta foi

armazenada no ROI manager (tradução livre: gerenciador de áreas de interesse) e utilizada

como área-padrão para todas as medidas dessa série de experimentos (Figura 9, E).

As medidas foram avaliadas quanto ao valor de mean gray value, ou seja, a soma dos

valores de branco e preto de cada pixel da imagem, divididos pela área medida. Sendo assim o

valor obtido foi diretamente proporcional a área do poço tomada por crescimento de fungo (e

citada ao longo dessa tese como “crescimento”), tendo sida a área definida para análise

idêntica em todas as variáveis desse experimento, os resultados foram plotados em gráficos

para análise estatística e comparação do crescimento do fungo após os diferentes tratamentos

aplicados. A análise gráfica e estatística foi feita no software GraphPad Prism 5.0 (Graphpad

software).

35


Esses procedimentos também foram aplicados a outros isolados de F. pedrosoi,

provenientes de pacientes de cromoblastomicose da Unidade de Referência em Dermatologia

Sanitária do Estado do Pará "Dr. Marcello Candia”, Marituba, Pará (Página 27, Tabela 3).

Figura 9: Etapas da edição da placa digitalizada para avaliação de crescimento fúngico

após tratamento: (A) digitalização da placa, (B) ajuste não-linear de tonalidade, (C) aplicação

de filtro de corte binário (threshold), (D) inversão dos valores (invert) e (E) medição no

software Image J dos valores médios de cinza.

36


12. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO A ALTA TEMPERATURA

2 x 103 conídios-controle ou conídios-triciclazol foram incubados em 1 mL de RPMI-

MOPS em banho-maria a 42 ºC por 1 h. Após este período, alíquotas de 50 µL foram retiradas

e plaqueadas em meio CD-agar conforme experimento descrito no item anterior para a

determinação do crescimento do fungo após exposição ao calor. Condições de controle foram

obtidas inoculando os fungos por 1 h a temperatura ambiente.

13. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS CONGELAMENTO E EXPOSIÇÃO A

ANTIFÚNGICOS

2 x 103 conídios-controle ou conídios-triciclazol foram incubados em 1 mL de RPMI-

MOPS a -20 ºC por 24 h. Após este período, alíquotas de 50 µL foram retiradas e plaqueadas

em meio CD-agar conforme experimento descrito no item 12 para a determinação do

crescimento do fungo após congelamento. Condições de controle foram estabelecidas

inoculando os fungos por 24 h a temperatura ambiente.

Nos experimentos os quais os antifúngicos também foram uma variável, 2 x 103

conídios de culturas tratadas ou não com 16 µg/mL de triciclazol foram incubados em 1 mL

de RPMI-MOPS, suplementado ou não com 2 µg/mL de anfotericina B ou 0,5 µg/mL de

itraconazol por 24 h a -20ºC. Após o período, alíquotas de 50 µL foram retiradas e plaqueadas

em meio CD-agar conforme experimento descrito no item 12 para a determinação do

crescimento do fungo após congelamento em conjunção à exposição aos antifúngicos.

Condições de controle foram estabelecidas inoculando os fungos por 24 h a temperatura

ambiente com as mesmas diluições dos antifúngicos.

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14. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO AO ÓXIDO NÍTRICO

O doador de óxido nítrico em meio aquoso SNAP (S-nitroso-N-acetilpenicilamina;

Sigma-Aldrich, Brasil) foi dissolvido em DMSO e utilizado para avaliar o crescimento do

fungo tratado ou não com triciclazol após contato com diferentes concentrações de óxido

nítrico. 2 x 103 conídios-controle ou conídios-triciclazol foram incubados em 1 mL de RPMI-

MOPS por 24 h a 35 ºC com concentrações finais de SNAP de 0, 0,1, 0,3, ou 1 mM. Após o

período, alíquotas de 50 µL foram retiradas e plaqueadas em meio CD-agar conforme descrito

no experimento do item 12 desta seção e observadas ao décimo dia para a determinação do

crescimento do fungo após contato com óxido nítrico.

15. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS INCUBAÇÃO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

Peróxido de hidrogênio (H2O2, Sigma-Aldrich, Brasil) foi mantido em estoque a 9 M e

congelado a -20 ºC. Foi utilizado para avaliar o crescimento do fungo tratado ou não com

triciclazol após contato com diferentes concentrações deste agente oxidante.

2 x 103 conídios de culturas tratadas ou não com 16 µg/mL de triciclazol foram

incubados em 1 mL de RPMI-MOPS por 1 h a 35 ºC com concentrações finais de H2O2 de 0,

0,005, 0,05, ou 0,5 M. Após este período, alíquotas de 50 µL foram retiradas e plaqueadas em

meio CD-agar conforme experimento descrito no item 12 e observadas ao décimo dia para a

determinação do crescimento do fungo após exposição ao peróxido de hidrogênio.

16. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS INCUBAÇÃO COM AGENTES DE ESTRESSE

OSMÓTICO E DE MEMBRANA CELULAR

Cloreto de sódio (NaCl, Reagen, Brasil) e Dodecil sulfato de sódio (SDS, Sigma-

Aldrich, Brasil) foram utilizados individualmente para avaliação do crescimento do fungo

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tratado ou não com 16 µg/mL de triciclazol após exposição a agentes de estresse osmótico

(NaCl) e estresse da membrana celular (SDS).

2 x 103 conídios de culturas tratadas ou não com 16 µg/mL de triciclazol foram

incubados em 1 mL de RPMI-MOPS por 24 h a 35 ºC com concentrações finais de SDS de 0,

0,005, 0,05 ou 0,5 M, ou concentrações de NaCl de 0, 0,02, 0,2 ou 2 M . Após este período,

alíquotas de 50 µL foram retiradas e plaqueadas em meio CD-agar conforme experimentos

descritos no item 12, e observados ao décimo dia para a determinação do crescimento do

fungo após exposição aos agentes de estresse.

17. POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE CONÍDIOS DE F. PEDROSOI

Foi testado o potencial seqüestrante de radicais livres dos conídios de F. pedrosoi,

tratados ou não com triciclazol, baseado no modelo fotocolorimétrico in vitro do radical livre

estável DPPH (2,2-difenil-1- picrilidrazila, Sigma-Aldrich, Brasil) dissolvido em metanol

(TediaBrazil, Brasil) (MENSOR, MENEZES, LEITAO et al., 2001). Nesse método, 1 mL da

solução de DPPH foi adicionado a 2 mL de uma suspensão de conídios em PBS nas

concentrações de 5,2 x 105, 2,6 x 105, 1,3 x 105, 2,6 x 104, 1,3 x 104 conídios/mL. O

experimento foi realizado a temperatura ambiente, por 30 min., e em seguida a absorbância

foi lida em espectrofotômetro Shimadzu UV-1601 a 518 nm. O branco foi feito adicionando-

se 1 mL de metanol a 2 mL de amostra. Como controle negativo usou-se a mistura de 1 mL da

solução de DPPH com 2 mL de PBS. Em presença de atividade antioxidante o DPPH doa um

elétron e assim deixa de absorver a 518 nm. O potencial antioxidante foi considerado maior

nas variáveis que apresentaram menor absorbância nas concentrações de fungo testadas,

tendo-se subtraído o branco.

39


18. INTERAÇÃO COM MACRÓFAGOS

Camundongos suíços foram sacrificados em ambiente de CO2 de acordo com as normas

de prática laboratorial ao estudo com cobaias do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

(UFRJ). Macrófagos peritoneais residentes foram obtidos por lavagem peritoneal com 5 mL

de solução de Hanks (Sigma-Aldrich, Brasil). Os macrófagos foram plaqueados em lamínulas

de vidro (13 mm) em placas de 24 poços, para aderência por 1 h a 37°C, em atmosfera de 5%

de CO2. As células foram então lavadas com solução de Hanks e mantidas por 24 h em meio

Eagle modificado por Dulbeccus (DMEM) contendo 5% de soro fetal bovino (SFB,

Laborclin, Brasil) a 37 °C, em atmosfera de 5% de CO2.

Os macrófagos foram ativados por 24 horas por suplementação do DMEM com 50

U/mL de interferon-γ recombinante de camundongo (IFN-γ; Sigma-Aldrich, Brasil) e 100

ng/mL de lipopolissacarídeo bacteriano de Escherichia coli 0111:B4 (LPS; Sigma-Aldrich,

Brasil). Os macrófagos foram então contados sob microscópio ótico invertido Axiovert

(Zeiss, Alemanha) e postos para interagir com conídios de F. pedrosoi de culturas controle ou

triciclazol, na proporção de 10 fungos por macrófago, e incubados a 37 ºC em atmosfera de

5% de CO2 por 24 horas.

a. VIABILIDADE DO FUNGO ANTES E APÓS INTERAÇÃO

Conídios-controle ou conídios-triciclazol foram isolados por filtração e incubados por

30 minutos, ao abrigo da luz, com 1% do marcador fluorescente FUN-1 (Invitrogen, USA) em

solução de HANKS. Para controles foram utilizados fungos em mesmas condições, porém

mortos pelo calor anteriormente à incubação com FUN-1.

Para medir a viabilidade dos fungos após a interação com macrófagos ativados de

camundongo, as células foram lisadas (com acompanhamento por microscopia ótica) com

40


jatos de água a 4 ºC sobre as lamínulas. Os conídios foram recuperados por centrifugação e

incubados em FUN-1 conforme descrito anteriormente. Os conídios foram lidos para

fluorescência em citômetro de fluxo B-D Xcalibur (Becton-Dickinson Immunocytometry

Systems, EUA) com excitação a 480 nm. As análises estatísticas, edições e plotagem de

resultados foram realizadas em software WinMDI 2.8 (http://facs.scripps.edu/software.html).

b. DETECÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZÍVEL NOS

MACRÓFAGOS EM INTERAÇÃO

Após interação de conídios de F. pedrosoi com macrófagos como descrito no item19, as

lamínulas foram lavadas com PBS a temperatura ambiente e fixadas por 30 min. em

formaldeído a 3% em PBS, lavadas novamente e incubadas por 30 minutos em 50 mM de

cloreto de amônio em PBS, e em PBS com 3% de soro-albumina bovina (PBS-BSA). As

lamínulas incubadas por 40 minutos com anticorpo (IgG) policlonal de coelho contra a óxido

nítrico sintase induzível (iNOS) de camundongos, diluído 1:100 em PBS-BSA. As lamínulas

foram lavadas com PBS, e em seguida com PBS-BSA, e incubadas com anticorpo secundário

contra IgG de coelho derivado de cabra e conjugado a isotiocianato de fluoresceína (Sigma-

Aldrich, Brasil), este diluído a 1:200 em PBS-BSA. As lamínulas foram montadas com N-

propilgalato para preservação da fluorescência e observadas em microscópio confocal Zeiss

300 com contraste diferencial interferencial e captura digital de imagem.

19. CITOTOXICIDADE DE INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE MELANINA EM

MODELOS CELULARES DE MAMÍFEROS

a. CULTIVO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Para os ensaios de citotoxicidade foram utilizadas as linhagens de células epiteliais

humanas Caco-2 (carcinoma de colo retal humano), HeLa (células de adenocarcinoma de

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cervix) foram cultivadas em DMEM e células de melanoma murino B16F10 foram cultivadas

em RPMI 1640 (Gibco, EUA). Os meios de cultivo foram suplementados com 2 mM de L-

glutamina e 10% SFB e tamponados com bicarbonato de sódio e 50 µg/mL de gentamicina.

As células foram mantidas a 37ºC em ambiente de 5% de CO2.

b. ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE

Monocamadas das células Caco-2, HeLa ou B16F10 foram formadas pela adição de 2.5

x 104 células por poço em placas de 96 poços e incubadas por 24 h. As células foram tratadas

com diferentes concentrações de triciclazol, de 1 a 1000 µg/mL, este dissolvido em DMSO e

adicionado ao meio de cultivo, e novamente incubadas a 37 ºC, em atmosfera de 5% CO2, por

48 h. A viabilidade celular foi aferida pelo método da sulforodamina B (LIN, HOULT e

RAMAN, 1999; VICHAI e KIRTIKARA, 2006), que é um corante que se liga a aminoácidos

básicos de proteínas celulares. Sua avaliação colorimétrica resulta numa estimativa do número

total de proteínas da célula, diretamente relacionada ao número de células.

O meio de cultivo foi removido, e, em cada poço, 50 µL do fixador ácido tricloroacético

a 10% foi inserido e incubado a 4 °C por 1 h. Em seguida a placa foi lavada 5 vezes com água

corrente e seca. Foram então adicionados 50 µL de solução de sulforodamina B (0,4% p/v em

ácido acético aquoso 1%) em cada poço e a placa foi incubada por 30 min. a 4 ºC e ao abrigo

da luz. O corante foi removido lavando-se os poços 4 vezes com ácido acético 1%. Para

avaliação do crescimento celular foram adicionados 150 µL de Tris base a 10 mM em cada

poço, a placa foi agitada por 15 min. e a leitura realizada em leitor de ELISA (Bio-Tek FL-

600 Microplate Fluorescence Reader, EUA), em densidade ótica de 550 nm.

A concentração do composto capaz de inibir 50% do crescimento celular (CC50) foi

calculada por regressão linear, e as análises estatísticas foram realizadas conforme descrito no

42


item 21 desta seção. Como controle de citotoxicidade foi utilizada a anfotericina B. Além do

triciclazol, concentrações variáveis de carpropamida, piroquilona e ftalida também foram

avaliadas quanto à citotoxicidade a células por essa metodologia.

c. EFEITO DO TRICICLAZOL NA MELANOGÊNESE DE CÉLULAS B16F10

5 x 105 células B16F10 em 2 mL de suspensão em placas de 6 poços foram mantidas em

RPMI por 24 h para adesão. As células foram tratadas com concentrações crescentes de

triciclazol (0, 1, 10, 50 e 100 µg/mL) por 72 h a 37ºC e em atmosfera de 5% CO2. A

monocamada foi ressuspendida em 0,01 M PBS, pH 7.2 e as células foram contadas. A

suspensão foi tratada com 1 N de NaOH para a extração da melanina por 24 h a 37 ºC e a

absorbância determinada por espectrofotometria (UV-1700-pharmaspec model –

SHIMADZU) a 475 nm. A concentração de melanina por célula foi calculada por

interpolação a curva padrão feita com concentrações de melanina sintética (Sigma-Aldrich,

Brasil) em NaOH.

20. ESTATÍSTICAS

A análise gráfica e estatística de todos os experimentos desta tese foi feita com o

software GraphPad Prism 5.0 (Graphpad software). Foram utilizadas as abordagens de teste t

(Student) para experimentos com uma variável, considerando como significativo P < 0,0001 e

testes de ANOVA para experimentos comparativos quando houve mais de uma variável,

considerando relevante quando P < 0,05. Os gráficos de barras foram expressos como média e

desvio-padrão.

43


21. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Amostras de biópsias de lesões de cromoblastomicose causadas por F. pedrosoi foram

coletadas na Unidade de Referência em Dermatologia Sanitária do Estado do Pará "Dr.

Marcello Candia”, Marituba, Pará. As biópsias de membro inferior foram obtidas, após

anestesia local, da borda da lesão com uso de um punch (vazador) inserido a 90º sobre a

epiderme. Recolheu-se amostras de cerca de 4 mm de profundidade. O material foi fixado em

solução contendo glutaraldeído a 2,5%, paraformaldeído a 4%, em tampão cacodilato de sódio

0,1 M, pH 7,2. As amostras já fixadas foram transportadas em temperatura ambiente. Estas

foram cortadas com bisturi em fragmentos de 1 mm de espessura e aderidas em stub com fita

adesiva de carbono. As observações foram feitas em microscópio de varredura ambiental

Quanta 200 (FEI company, Holanda) nos parâmetros de modo ambiental, com compressão

atingindo um máximo de 10 torr, distância de trabalho de 9 mm, 10 KV e tamanho de spot de

4.3. As imagens obtidas foram processadas digitalmente pelo software Adobe Photoshop CS 3

(Adobe corporation, EUA) quanto à coloração, brilho e contraste, por ferramentas de ajustes

não-linear (ROSSNER e YAMADA, 2004).

44


Resultados

1. INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE MELANINA (IBM)

A adição ao meio de cultivo de 16 µg/mL dos inibidores de biossíntese de melanina

carpropramida, piroquilona ou triciclazol modificou a coloração da colônia, de verde-escuro,

para um tom alaranjado (Figura 10). A adição de 16µg/mL de ftalida não provocou alteração

na coloração das culturas.

A adição do triciclazol à cultura de outros fungos demáceos (Phialophora verrucosa,

Cladosporium carrioni, Exophiala dermatitidis, Exophiala jeanselmei) e Aspergillus

fumigatus modificou a coloração escura original das colônias para tons amarelos ou

vermelho-alaranjados (Figura 11).

Figura 10: Coloração de colônias de F. pedrosoi em diferentes meios de cultura e sob os

IBM carpropamida, ftalida, piroquilona e triciclazol.

45


Figura 11: Modificação da coloração de colônias de fungos produtores de melanina em

presença de triciclazol.

2. RESSONÂNCIA PARAMAGNÉTICA ELETRÔNICA (EPR)

Os experimentos sugerem: (I) que os pigmentos podem ser definidos como melaninas

tanto do extraído do fungo controle como do fungo tratado com triciclazol; e (II) que possuem

radicais livres que se localizam em ambientes diferentes na molécula ou em menor quantidade

na melanina-triciclazol (Figura 12 A e B). A cinética de saturação com potência (Figura 13 C)

46


indica ainda que a melanina-controle possua radicais livres com o dobro da potência dos

radicais presentes na melanina-triciclazol, e que tenha mais interações intramoleculares e

intermoleculares.

Figura 12: Espectros de EPR da melanina-controle (A) e melanina triciclazol (B). Em C,

cinética de saturação de potência da melanina-controle (em verde) e da melanina-triciclazol.

47


3. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORBÂNCIA NO ULTRAVIOLETA

A melanina-triciclazol mostrou uma menor absorbância para comprimentos de onda

entre 260 e 315 nm, regiões correspondentes a faixa UV-C e UV-B, em relação à melanina-

controle (Figura 13). A melanina-controle possui maior uma heterogeneidade molecular por

apresentar 3 diferentes picos de alta absorbância: 264, 273 e 284 nm.

Figura 13: Espectroscopia de ultravioleta da melanina-controle e da melanina-

triciclazol. Maior absorbância da melanina controle (verde) nas áreas de UV-C e UV-B.

4. ESPECTROSCOPIA DE FORÇA

No módulo Young é medida a deformação do objeto em unidades de pressão (Pa). Esta

análise revelou que os conídios-controle têm uma resistência a deformação cerca de duas

vezes maior que nos conídios-triciclazol (Figura 14). O módulo K é a medição da constante

elástica, uma medida pontual que analisa o conídio do fungo como sendo uma mola. Nesta

análise temos a indicação que a rigidez do fungo-controle é maior que o fungo-triciclazol.

48


Figura 14: Espectroscopia de força de conídios-controle e conídios-triciclazol, maior

resistência a pressão e maior constante elástica do fungo-controle.

5. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS

Os experimentos para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de

antifúngicos revelaram valores (em µg/mL) de 2 para anfotericina B, 0,5 para itraconazol e

terbinafina, sugerindo que F. pedrosoi é susceptível a esses antifúngicos. Quando foi

adicionado 16 µg/mL de triciclazol a sistema experimental, os valores resultantes de CIM

mantiveram-se inalterados.

6. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AO TRICICLAZOL

Testando-se o triciclazol em concentrações que variaram de 0,17 até 350 µg/mL não

foram detectadas quaisquer diferenças no crescimento do fungo, tendo este sido cultivado

previamente em 16 µg/mL de triciclazol ou não. Notamos, porém, a inibição da formação de

pigmento verde-escuro e a formação de colônias alaranjadas após tratamento com qualquer

das concentrações de triciclazol utilizadas.

49


7. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO A ANTIFÚNGICOS

Esta série de testes (Figura 15) não revelou diferenças significativas no crescimento do

fungo-controle em relação ao fungo-triciclazol (sem antifúngico; P > 0,05), porém tal

diferença foi extremamente significativa na presença de anfotericina B (P < 0,0001),

itraconazol (P < 0,0001) e muito significativo no teste com terbinafina (P < 0,005).

Para todos esses experimentos, as variâncias entre as concentrações testadas foram

extremamente significativas (P < 0,0001).

Figura 15: Gráficos do crescimento de F. pedrosoi 5VPL, controle e fungo-triciclazol,

após contato com diferentes concentrações (abscissas) de anfotericina B (A), itraconazol (B) e

terbinafina (C).

50


8. TESTE DE CRESCIMENTO DE ISOLADOS RECENTES DE F. PEDROSOI APÓS

EXPOSIÇÃO A ANTIFÚNGICOS

O crescimento de isolados recentes de F. pedrosoi após exposição a antifúngicos variou

significativamente de acordo com a concentração dos antifúngicos e do uso ou não de

triciclazol. Entretanto, em todos os casos, o uso do triciclazol combinado ao antifúngico inibiu

o crescimento do fungo (Figura 16).

Figura 16: Gráficos do crescimento de F. pedrosoi de diferentes isolados, controle e

fungo-triciclazol, após contato com diferentes concentrações (abscissas) de anfotericina B,

itraconazol e terbinafina.

51


9. COMPARAÇÃO DO CRESCIMENTO ENTRE A CEPA LABORATORIAL E

ISOLADOS RECENTES DE F. PEDROSOI

Análises do crescimento entre a cepa laboratorial (5VPL) e os isolados recentes

sugerem que o crescimento delas é significativamente diferente em meio de cultivo sólido.

Dentre alguns isolados (36020, 38823 e 38868) o crescimento foi significativamente diferente

(P < 0,0001) em presença de 16µg/mL de triciclazol (Figura 17).

Figura 17: Gráficos do crescimento de F. pedrosoi 5VPL e diferentes isolados

(abscissas) em condições controle e com triciclazol.

10. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO À ALTA TEMPERATURA

Teste de crescimento após exposição por 1 h a 42 ºC sugerem que nestas condições o

triciclazol não interferiu no crescimento do fungo (P > 0,05), porém o aumento da

temperatura por si só contribuiu para uma inibição do crescimento (Figura 18).

52


Figura 18: Gráficos do crescimento de F. pedrosoi 5VPL, fungo-controle e fungo-

triciclazol, após incubação a temperatura ambiente e a alta temperatura (abscissas).

11. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS CONGELAMENTO E EXPOSIÇÃO A

ANTIFÚNGICOS

O teste de crescimento após exposição de 24 h a -20 ºC sugerem que nestas condições o

triciclazol interferiu no crescimento do fungo (P < 0,0001), e a redução na temperatura não

provocou uma diminuição do crescimento (Figura 19).

Figura 19: Gráficos do crescimento de F. pedrosoi 5VPL, fungo-controle e fungo-

triciclazol, após incubação a temperatura ambiente e congelamento (abscissas).

53


Os testes de crescimento após incubação a -20 ºC por 24 h, e a simultânea adição de

anfotericina ou itraconazol, sugeriram que nestas condições o triciclazol interferiu no

crescimento do fungo (P < 0,0001), como também a baixa temperatura (-20 ºC) provocou

inibição do crescimento quando comparados com a temperatura de 25 ºC (Figura 20).

Figura 20: Gráficos do crescimento de F.

pedrosoi 5VPL, fungo-controle e fungo-

triciclazol, após incubação com anfotericina B (2

µg/mL) ou itraconazol (0,5 µg/mL a temperatura

ambiente, ou congelamento (abscissas).

12. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO AO ÓXIDO NÍTRICO

De forma significativa o triciclazol proporcionou uma redução no crescimento do fungo

nas concentrações de 0,1 e 0,3 M de SNAP (P < 0,05 e < 0,001, respectivamente, Figura 21).

54


Figura 21: Gráfico do

crescimento de F. pedrosoi

5VPL, controle e fungo-

triciclazol, após crescentes

concentrações do doador de

óxido nítrico SNAP (abscissas).

13. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS EXPOSIÇÃO AO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

Nesta série de experimentos foi verificado que houve variação no crescimento dado à

adição de triciclazol ao sistema (P = 0,016, Figura 22).

Figura 22: Gráfico do

crescimento de F. pedrosoi 5VPL,

controle e fungo-triciclazol, após

crescentes concentrações de

peróxido de hidrogênio

(abscissas).

55


14. TESTE DE CRESCIMENTO APÓS ESTRESSES OSMÓTICO E DA MEMBRANA

CELULAR

O crescimento do fungo após exposição à SDS na concentração de 0,005 M foi afetado

pela presença do triciclazol, não somente pela inibição do crescimento do fungo tratado com

triciclazol, mas também pelo crescimento superior do fungo-controle (P < 0,001). Testando-se

a concentração de 0,05 M de SDS a diferença no crescimento entre o fungo-controle e o

fungo-triciclazol não foi significativamente diferente, Na concentração de 0,5 M de SDS não

foi observado crescimento (Figura 23).

Figura 23: Gráfico do crescimento de

F. pedrosoi 5VPL, controle e fungo-

triciclazol, após crescentes concentrações de

SDS (abscissas).

Em concentrações de 0,2 e 2 M de NaCl a inibição da via de biossíntese de melanina

pelo triciclazol afetou significativamente o crescimento (p < 0,001, Figura 24).

Figura 24: Gráfico do crescimento

de F. pedrosoi 5VPL, controle e fungo-

triciclazol, após crescentes

concentrações de NaCl (abscissas).

56


15. POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE CONÍDIOS DE F. PEDROSOI

Conídios revelaram atividade antioxidante significativa após exposição ao radical livre

DPPH. O uso do triciclazol, como também o aumento das concentrações de conídios, sugeriu

que ambos os fatores são significativos para a quantidade de atividade antioxidante (Figura

25). Quanto mais conídios, maior atividade antioxidante, porém o fungo-triciclazol possuiu

menor capacidade antioxidante em relação as mesmas quantidades de fungo-controle.

Figura 25: Gráfico da atividade oxidante de crescentes concentrações de conídios-

controle e conídios-triciclazol.

16. INTERAÇÃO COM MACRÓFAGOS

a. VIABILIDADE DO FUNGO ANTES E APÓS INTERAÇÃO

A viabilidade do fungo controle após interação de 24 h com macrófagos murinos

ativados mostrou-se praticamente inalterada, de 94,8% de fungos metabolicamente ativos

antes da interação, para 93,9% de viabilidade após a interação. Em fungos tratados com

57


triciclazol, a porcentagem de conídios viáveis antes da interação foi pouco menor que no

controle (4,6% menor), mas após a interação com macrófagos o número de fungos não viáveis

chegou a 23,1% (Figura 26).

Figura 26: Gráficos do resultado obtido por citometria de fluxo da distribuição da

viabilidade de conídios-controle e conídios-triciclazol após interação com macrófagos

murinos ativados. M1 se refere ao ponto de corte para cálculo de viabilidade (intercessão da

curva entre fungo morto e viabilidade antes da interação).

58


b. DETECÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZÍVEL (INOS) NA

INTERAÇÃO COM MACRÓFAGOS MURINOS ATIVADOS

A visualização da imunomarcação da iNOS por microscopia confocal de fluorescência

revelou que a enzima iNOS, responsável pela síntese de óxido nítrico nos macrófagos,

encontrava-se expressa e ativa em todas as condições testadas (Figura 27).

Figura 27: Microscopia ótica de contraste de fase, e confocal para imunodetecção de

iNOS. Nota-se que a iNOS foi detectada por imunomarcação em todas as condições

experimentais (barras=10 µm).

Contraste de fase

59


17. CITOTOXICIDADE DE INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE MELANINA EM

MODELOS CELULARES DE MAMÍFEROS

a. ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE

O ensaio de verificação de citotoxicidade do triciclazol foi realizado em 3 linhagens

celulares e os resultados indicam que o triciclazol tem baixa toxicidade, já que as CC50 foram

de 566,7 µg/mL para células Caco-2 e HeLa, e 600 µg/mL para células B16F10. A anfotericina

B teve sua citotoxicidade cerca de 20 vezes superior em comparação ao triciclazol, tendo sido

essa determinada em 30 e 26,8 µg/mL para HeLa e B16F10, respectivamente.

b. EFEITO DO TRICICLAZOL NA MELANOGÊNESE DE CÉLULAS B16F10

A melanogênese de células de melanoma murino B16F10 foi avaliada pela

quantificação da melanina produzida por essas células em presença de diferentes

concentrações de triciclazol (Figura 28). Os resultados sugerem que não houve modificação

na quantidade de melanina produzida pelas células nas concentrações de triciclazol testadas,

determinada pelo teste de one way

ANOVA (P=0,34).

Figura 28: Gráfico da quantidade

de melanina extraída de células B16F10

após tratamento destas com crescentes

concentrações de triciclazol.

60


18. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA AMBIENTAL

Pela técnica de microscopia eletrônica de varredura ambiental, e com o realce

promovido pela colorização computadorizada, foi possível observar a presença de células

escleróticas sobre o tecido infectado da biópsia, além de detalhes celulares como células em

aparente divisão e septos característicos de células escleróticas (Figura 29).

Figura 29: MEV de lesão de cromoblastomicose. (A) associação de células escleróticas

(verdes; setas brancas) a aglomerado celular (sépia). (B) células escleróticas (setas brancas)

em associação a tecido de aparência granulomatosa. (C) célula esclerótica (verde, seta) sobre

tecido queratinoso (sépia). (D) células escleróticas (verdes) com marcas de divisão (seta

branca) inseridas em tecido cutâneo (sépia).

61


Discussão

A cromoblastomicose é uma doença crônica, endêmica no Brasil, causada pelo fungo

Fonsecaea pedrosoi. Atualmente, não existe tratamento padrão para esta doença, e a literatura

sobre tratamentos e descrições de casos clínicos também reporta a freqüente reincidência

poucos anos após o fim do tratamento (LOPEZ MARTINEZ e MENDEZ TOVAR, 2007;

SANTOS, PALMEIRA et al., 2007).

A literatura descreve a histopatologia da lesão como possuindo um caráter de fibrose,

granulomatoso e inflamatório, com a presença de infiltrados celulares de macrófagos (na

derme = histiócitos), neutrófilos, fibroblastos, queratinócitos e células gigantes (macrófagos

fusionados) (HAMZA, MERCADO, SKELTON et al., 2003; LOPEZ MARTINEZ e

MENDEZ TOVAR, 2007). Não aparecem, porém, em estudos histopatológicos, descrições de

adipócitos, principais componentes da camada subcutânea. Curiosamente a

cromoblastomicose é definida como uma micose subcutânea (LOPEZ MARTINEZ e

MENDEZ TOVAR, 2007; SANTOS, PALMEIRA et al., 2007), mesmo sendo a lesão

limitada à epiderme e derme, camadas do tecido cutâneo (pele).

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV)

Até o momento, o único estudo em microscopia eletrônica de varredura de amostras de

lesão de cromoblastomicose por F. pedrosoi se limitou a observar raspados de lesão, tratados

com solução alcalina para remoção de células da epiderme (HARADA e KUSUNOKI, 1983).

O processamento convencional para MEV, com fixação, pós-fixação, secagem e metalização;

métodos físico-químicos que são danosos ao material, revelou nessas observações algumas

características das células escleróticas, como o formato arredondado e marcas de reprodução

por septação interna.

62


A metodologia de observação por MEV ambiental utilizada nesta tese permitiu uma

visão mais próxima do estado real da lesão no paciente. Primeiramente, o material de biópsia

de epiderme e derme é mais complexo que um raspado de borda de lesão, possuindo camadas

mais internas do tecido lesionado além da superfície queratinosa do stratu corneum da pele. A

MEV ambiental, baseada em observação do material com poucas etapas de processamento

físico/químico, não afetou a integridade tecidual. Nossas observações mostraram a dispersão

de células escleróticas no tecido infectado, a presença de células em camadas superficiais

queratinosas e em camadas mais internas, onde é possível sugerir a presença de granuloma, e

ainda, células escleróticas entre células do tecido da derme, sugerindo o crescimento

concomitante do fungo e de células do hospedeiro.

Nossos resultados sugerem que este método de observação deve ser encorajado para o

estudo de micoses superficiais e cutâneas por ser rápida, sem necessidade de tratamento

prévio do material, e revela a posição das células do fungo em relação à lesão e suas células.

Em experimentos futuros, em lesões de diferentes graus de evolução da doença e em

diferentes profundidades, aliados a técnicas de imunomarcação, poderemos com detalhes da

ordem de micrômetros, definir as células do hospedeiro envolvidas na formação das lesões e a

formação e crescimento das células escleróticas in vivo.

F. PEDROSOI E MELANINA

F. pedrosoi é um interessante modelo de estudo, por, além de ser o principal agente

causador de cromoblastomicoses, este fungo expressa enzimas, é termotolerânte, é dimorfico,

possui adesinas e produz melanina de forma constitutiva. Essas características são associadas

à virulência desse fungo na cromoblastomicose (SANTOS, PALMEIRA et al., 2007). Tais

fatores também costumam ser descrito como relevantes fatores de virulência presentes em

outros fungos patogênicos (CASADEVALL, 2006).

63


A melanina mereceu destaque nos estudos que utilizaram F. pedrosoi como modelo em

conseqüência de sua função protetora na evasão do sistema imune (levantados na tabela 1,

página: 9) Sua via de biossíntese nesse fungo também merece destaque, pois sugeriu um

mecanismo de síntese em organelas especializadas (melanossomos) ultraestruturalmente

semelhante entre fungos, anfíbios e humanos, ainda que as etapas bioquímicas da síntese

sejam diferentes entre animais e F. pedrosoi (FRANZEN, CUNHA et al., 2008).

Em 2005 caracterizamos a inibição da via de biossíntese da melanina em F. pedrosoi

como pentacetidea (DHN), pelo uso do triciclazol, um inibidor seletivo desta via em fungos, e

da L-DOPA , composto inicial da via da DOPA, corroborando os experimentos de Taylor e

colaboradores que detectaram por cromatografia de camada fina a formação de intermediários

da via DHN em F. pedrosoi (TAYLOR, WHEELER e SZANISZLO, 1987).

O triciclazol tem sido ferramenta no estudo de eventos relacionados à presença ou

síntese de melanina em fungos patogênicos como E. dermatitidis, Curvalaria lunata,

Cladosporium cladosporioides, S. schenkii e F. pedrosoi (WHEELER e STIPANOVIC, 1985;

LATGE, BOUZIANE e DIAQUIN, 1988; ROMERO-MARTINEZ, WHEELER et al., 2000;

LANISNIK RIZNER e WHEELER, 2003; CUNHA, FRANZEN et al., 2005; FRANZEN,

CUNHA et al., 2006). Nesta tese buscamos elucidar algumas características da melanina

produzida normalmente pelo fungo em meio de cultura, comparando-a isoladamente e como

componente estrutural do fungo, ao pigmento produzido e extraído do fungo cultivado com

triciclazol.

CARACTERIZAÇÃO DA MELANINA

A ressonância paramagnética eletrônica revelou em espectros da melanina-controle e da

melanina-triciclazol de F. pedrosoi semelhanças ao proposto pela literatura com estudo em

melanina de C. neoformans e B. dermatitidis (WANG, AISEN et al., 1996; NOSANCHUK,

64


VAN DUIN, MANDAL et al., 2004). A caracterização por EPR mostrou que ambos os

pigmentos absorvem na região próximas a 3480 gauss, o que sugere a presença de centros

paramagnéticos na molécula, ou seja, elétrons desemparelhados (radicais livres), porém em

intensidade maior na melanina controle.

Sabe-se que o ferro tem propriedades magnéticas, sendo paramagnético nas formas

elementar (Fe0) e no estado de oxidação trivalente (Fe+3), e diamagnético quando divalente

(Fe+2). Nesta tese, o estado de oxidação do ferro utilizado como nutriente nos experimentos e

nas condições de cultivo do fungo foi Fe+3, com o uso do citrato férrico amoniacal. Já foi

demonstrado que melaninas de fungos são capazes de reduzir Fe+3 a Fe+2, e que o seqüestro

desse íon pela melanina pode, impedir substancialmente a formação de radicais oxidativos

quando em reação com H2O2, o que protegeria o fungo desse agente oxidante (JACOBSON e

HONG, 1997).

Em F. pedrosoi, já foi utilizada a citoquímica com ferritina cationizada para evidenciar

diferenças de carga de superfície do fungo tratado, ou não, com triciclazol, mostrando uma

maior marcação na superfície do fungo-controle (CUNHA, FRANZEN et al., 2005). A

ferritina cationizada consiste no derivado catiônico N,N-dimetil-1,3-propanodiamina

conjugado a um complexo protéico com Fe+3. Comparando os resultados obtidos nesta tese,

com os publicados em 2005, é possível sugerir que a ligação da ferritina a parede do fungo

controle não seja somente resultado de cargas negativas - já descritas na superfície do fungo

pela presença de ácidos siálicos (SOUZA, SILVA-FILHO, DE SOUZA et al., 1986)- mas

também se deve à melanina, presente na parede, atuando na redução do Fe+3 desse composto.

Dados de microanálise de Raios X e mapeamento elementar em microscopia eletrônica

de transmissão sugeriram que F. pedrosoi, crescido em presença de triciclazol, não apresenta

quantidades detectáveis de ferro em sua parede ou organelas citoplasmáticas (FRANZEN,

65


2005). Fato também visto no fungo crescido na ausência de fonte de ferro, em contraponto ao

fungo controle que apresentou ferro na parede celular e dentro de melanossomos (FRANZEN,

CUNHA et al., 2008).

A melanina-controle e a melanina-triciclazol são pigmentos semelhantes, como sugerido

pelas caracterizações por espectrofotometria de infravermelho, EPR e ressonância magnética

nuclear (CUNHA, 2005). Porém, algumas diferenças foram notadas em todos esses

experimentos, sugerindo modificações químicas ou estruturais, as quais possivelmente eram

responsáveis pelas características atenuadas de virulência do fungo quando crescido com

triciclazol (CUNHA, FRANZEN et al., 2005; FRANZEN, CUNHA et al., 2006). Como o

ferro não esta presente no fungo-triciclazol (FRANZEN, 2005), e não tendo a melanina-

triciclazol as mesmas propriedades paramagnéticas da melanina-controle, pode-se sugerir que

o paramagnetismo é atribuído ao ferro. A presença de ferro na melanina de F. pedrosoi

(FRANZEN, 2005) e os dados de paramagnetismo por EPR descritos nesta tese sugerem que

a melanina pode estar incorporando o ferro a sua estrutura como Fe+3, ou como Fe+2, ao

reduzir o Fe+3 do meio. Contudo, é mais provável de que a espécie de ferro detectada em

nossos experimentos de EPR seja a de Fe+3, por já estar descrito as alterações de sinal de EPR

em outras melaninas na presença deste cátion (SANDRA S. EATON, 2004). Experimentos

em melanina de C. neoformans (JACOBSON e HONG, 1997) sugeriram que a melanina

funciona como um tampão redox, variando seus estados de oxidação conforme os estímulos

oxidativos e redutores do seu ambiente químico. Desta forma é possível que a melanina

maximize seu potencial antioxidante ao reduzir o Fe+3 a Fe+2, garantindo o equilíbrio redox do

seu microambiente químico, minimizando a oxidação de estruturas fundamentais ao

crescimento do fungo.

66


Experimentos de EPR de saturação de potência, ou seja, variando o campo magnético

sobre a amostra, revelaram que a intensidade da melanina controle é mais de duas vezes

superior a do triciclazol, sugerindo que a melanina controle possui mais interações

intramoleculares, e potencialmente com estruturas que possam estar associadas, ou nas suas

redondezas, e por isso seria mais compacta. Este dado corrobora ao visto na relação

peso/volume dos pigmentos, na qual a melanina-controle apresentava um volume 3 vezes

menor que o da melanina-triciclazol (CUNHA, 2005).

Resultados anteriores de nosso grupo mostraram que a parede celular de F. pedrosoi foi

severamente modificada quando o fungo foi cultivado com triciclazol, tendo sua espessura

aumentada em conídios, e sua forma alterada em células escleróticas (FRANZEN, CUNHA et

al., 2006).

Experimentos com melanina produzida por C. neoformans, biossintetizada a partir de L-

dopa, revelaram que, com este precursor, a melanina é formada por polimerização e possuí

anéis aromáticos. Submetendo esse fungo a exaustivos processos para extração físico-química

e enzimática da melanina resultam-se nos ghosts (WANG, AISEN et al., 1996), e a análise

destes por ressonância magnética nuclear de estado sólido – atualmente a técnica mais

avançada de análise de composição química de alguma substância – revelou a presença de

açúcares no polímero, sugerida como ligações covalentes da melanina aos polissacarídeos da

parede celular (ZHONG, FRASES et al., 2008). Com base nessas informações podemos

concluir que a melanina é um fator determinante da estrutura e forma da parede celular dos

fungos por interagir covalentemente com seus componentes (açúcares).

Os experimentos de espectrofotometria no ultravioleta dos pigmentos em solução

sugerem que a melanina-controle absorve mais radiação UV-B e UV-C que a mesma

concentração de melanina-triciclazol.

67


A cromoblastomicose é de ocorrência tropical, mais precisamente em regiões da Terra

que estão próximas à linha do Equador, áreas de maior incidência de raios UV vindos do sol.

Devemos considerar a melanina como um fator contribuinte para a resistência a exposição a

radiação solar, e conseqüente resiliência evolutiva dos seres vivos na Terra. Como proposto

para a distribuição de melanina no gênero homo, com representantes de pele mais clara

provenientes de regiões temperadas, e negros nas áreas tropicais (JABLONSKI, 2006). Essa

mesma pressão seletiva pode ter ocorrido na história evolutiva dos fungos, e a alta incidência

de cromoblastomicose em áreas tropicais pode estar relacionada à presença de fungos

melanizados nessas áreas.

A radiação UV-C do sol não penetra na atmosfera terrestre, o que permitiu a presença

de vida na forma que conhecemos na Terra, já que o ADN absorve UV na região UV-C, e por

isso estas freqüências de radiação são letais à célula. Comprimentos de onda na faixa de UV-

B incidem fracamente sobre o planeta, porém, em quantidade o suficiente para, em áreas

tropicais, de maior incidência, causar danos celulares graves, como queimaduras e câncer.

Essa incidência de UV-B pode ter sido determinante para a resistência e resiliência de fungos

produtores de melanina na natureza, já que a melanina em estruturas mais externas, como a

parede celular, absorveria a radiação e protegeria as estruturas internas.

No espectro de UV mostrado nesta tese notamos que a curva da melanina-controle

apresenta 3 picos (264, 273 e 284 nm), sugerindo uma heterogeneidade desse composto,

talvez por estar associado a outras moléculas da parede celular como sugerido por Zhong e

colaboradores (2008).

A melanina parece conferir mais que proteção a radiação em F. pedrosoi além dos

estudos já descritos sobre resistência a mecanismos da resposta imune do hospedeiro. Nossos

experimentos com espectroscopia de força atômica em fungos inteiros revelaram que a

68


melanina-controle atribui ao F. pedrosoi maior resistência a pressão e a deformação,

conferindo rigidez.

Na natureza, essa resistência à pressão é descrita como importante para fungos

fitopatogênicos, a exemplo de Magnaporthe grisea, já que deve haver penetração em folhas

rígidas para haver infecção. A invasão é feita ativamente pelo próprio fungo, que gera uma

alta pressão intracelular (conhecida como pressão de turgor) pelo acúmulo de glicerol e,

assim, força sua estrutura e penetra folha. Ainda é descrito que a ausência de melanina nesse

fungo impede a formação de uma rígida estrutura capaz de penetrar no vegetal (HOWARD e

VALENT, 1996; JACOBSON, 2000).

Dados anteriores (CUNHA, FRANZEN et al., 2005) mostraram que F. pedrosoi tratado

com triciclazol, na interação com macrófagos murinos ativados, não foi resistente à lise

mecânica, enquanto o fungo-controle mostrou-se resistente, tanto na forma de conídios quanto

hifas. Dados que corroboram os experimentos de espectroscopia de força atômica realizados

nesta tese que sugerem a fragilidade estrutural decorrente na interrupção na biossíntese de

melanina desse fungo.

ANTIFÚNGICOS E MELANINA

Buscamos avaliar a interferência do triciclazol na via de biossíntese da melanina em F.

pedrosoi e a susceptibilidade a antifúngicos. Observamos que testes como os ensaios

sugeridos pelo CLSI, como normas para a determinação de susceptibilidade a antifúngicos,

não tiveram sensibilidade para a detecção de diferenças na resistência aos antifúngicos entre

fungos melanizados ou não.

Experimentos em C. neoformans, H. capsulatum e P. brasiliensis, têm sugerido que

melaninas fúngicas promovem a resistência do fungo ao tratamento com antifúngicos. Estes

69


trabalhos também indicaram a falta de sensibilidade do método CLSI para tais verificações.

Chamados, pelos autores, de testes de “time-kill” ou “killing”, a aplicação de antifúngicos, em

uma cinética temporal definida, e em condições de melanização fúngica ou não, seguido de

plaqueamento do fungo em meio sólido e contagem de colônias, revelaram a interferência da

melanina na ação dos antifúngicos, sugerindo a resistência de fungos melanizados aos

mesmos (VAN DUIN, CASADEVALL e NOSANCHUK, 2002; DA SILVA, MARQUES,

NOSANCHUK et al., 2006).

Em nossa adaptação desses experimentos de “time-kill/killing”, chamadas nesta tese

como “experimentos de crescimento após exposição aos antifúngicos”, a contagem de

colônias era imprecisa e resultava em um número maior de colônias sob concentrações mais

altas de antifúngico. Como foi observada uma diminuição coerente da área crescida sobre o

meio sólido, do conseqüente incremento das concentrações de antifúngicos, relacionamos a

falta de resolução da contagem de colônias à possibilidade do crescimento maior de algumas

colônias mascararem colônias próximas, já que F. pedrosoi é um fungo filamentoso de

crescimento lento.

A medição das áreas de crescimento foi possível pela adaptação de metodologias

usualmente aplicadas em microscopia eletrônica para morfometria celular. A placa onde foi

inoculado o fungo foi digitalizada, processada digitalmente e convertida em uma imagem

binária, com valores de branco e preto, sendo o branco referente somente as colônias, e preto

a todo o resto. Na escala de tons de cinza, em uma imagem digital em tons de cinza de 8 bits,

o branco tem o valor numérico de 255, e o preto, 0. A análise digital pelo software Image J

(NIH) conta em uma determinada área quantos pixels (menor unidade de uma imagem) são

branco (ou 255) e quantos são pretos (0) e divide esse valor pela área. Assim se obtêm um

valor relativo à área de ocupação da colônia, ou, como definimos, ao crescimento. Como a

70


área utilizada (diâmetro interno do poço de uma placa de 96 poços) para medirmos as colônias

foi exatamente à mesma para todos os experimentos, devido à possibilidade de armazenar

esse parâmetro de medição no “Image J”, e de todas as placas utilizadas nos experimentos

terem sido digitalizadas na mesma resolução, as medidas realizadas são comparáveis.

Esse tipo de processamento permitiu a otimização experimental e a análise de várias

replicatas por experimento, aumentando o espaço amostral e assim, a precisão estatística dos

resultados observados.

Com este método avaliamos a influência do tratamento do fungo F. pedrosoi tratado

com triciclazol no crescimento após contato com antifúngicos (cepa laboratorial e 4 isoladas

recentemente), e a influência desse inibidor de melanina na resistência de F. pedrosoi à alta

temperatura (42 °C), ao frio (-20 ºC), ao frio conjugado a antifúngicos, a variações osmóticas

(NaCl), a detergente (SDS) e a agentes oxidantes (H2O2 e NO).

Nossos experimentos com os antifúngicos anfotericina B, itraconazol e terbinafina

mostraram um crescimento superior do F. pedrosoi-controle em comparação ao crescimento

do fungo-triciclazol. Isto também foi observado nos 4 recentes isolados de F. pedrosoi. A

inibição da via de biossíntese de melanina neste fungo aumentou a sua susceptibilidade a

antifúngicos.

Foi interessante comparar o crescimento dos isolados recentes com a cepa laboratorial,

sem a presença dos antifúngicos, e notar que 3 de 4 isolados recentes tinham o crescimento

em presença de triciclazol bastante reduzido. Cepas laboratoriais têm sido descritas como

atenuadas, por crescerem em temperaturas e meios ideais, não sofrendo estresses que possam

sinalizar para vias metabólicas que favoreçam ou acelerem o crescimento. Estes isolados

recentes de F. pedrosoi foram obtidos de pacientes em tratamento e com lesões de

características diferentes (Página 27, Tabela 3). Para a maioria desses isolados a inibição da

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via de biossíntese da melanina foi o suficiente para causar uma diferença no crescimento.

Sabe-se que células escleróticas, as formas encontradas na lesão, são mais pigmentadas que

conídios e hifas, e é possível que a melanina seja um fator importante durante a infecção,

onde o fungo tenha seu metabolismo de melanina sinalizado e estimulado na célula de forma

preferencial. Ao inibirmos esta síntese, a desregulação da via metabólica preferencial acaba

por influenciar o crescimento (ALVIANO, FRANZEN et al., 2004; PALMEIRA, KNEIPP,

ALVIANO et al., 2006).

CALOR, FRIO, ESTRESSES CELULARES E MELANINA

Um dos tratamentos propostos para a cromoblastomicose é o uso de aplicações de calor,

aumentando a temperatura local. Nossos estudos, utilizando o método de análise de área de

crescimento, sugeriram que a melanina não tem relação com a resistência ao calor, mas sim

que o calor (42 °C / 1 h) causa uma diminuição do crescimento do fungo.

O tratamento a baixa temperatura (-20 ºC/ 24 h) não interferiu no crescimento do fungo,

mas o triciclazol e os antifúngicos testados (anfotericina B e itraconazol) por si só resultaram

em diferenças significativas de crescimento. Uma das modalidades de tratamento de

cromoblastomicoses é a criocirurgia em conjunção ao tratamento quimioterápico. A literatura

sugere que o frio atue sobre o sistema imune do hospedeiro, ativando-o para a resolução da

infecção (CASTRO, PIMENTEL et al., 2003). Em nossos experimentos, verificamos que a

associação de baixa temperatura e antifúngicos é o suficiente para reduzir o crescimento do

fungo. Pode-se sugerir que a redução na temperatura reduz a velocidade metabólica do fungo,

sendo este menos capaz de reparar os danos causados pela ação do antifúngico.

Observamos também a resistência do fungo a variações osmóticas, pelo incremento de

concentrações molares de cloreto de sódio. Nesta situação a melanina pareceu contribuir para

a resistência do fungo.

72


Em experimentos com o detergente SDS, na menor concentração de SDS empregada

(0,005 M) notamos um maior crescimento do fungo-controle em relação ao fungo-triciclazol.

Nessa concentração o crescimento também foi maior ao fungo-controle sem SDS.

Observamos esse mesmo comportamento em relação à menor concentração avaliada de

anfotericina B (seção Resultados, Figura 15). Tanto a anfotericina B, como o SDS, atuam

provocando a desestabilização da membrana plasmática. A anfotericina B liga-se ao

ergosterol da membrana, formando poros, já o SDS emulsiona os lipídios da membrana

plasmática, possivelmente também resultando em poros. Em ambas as situações, a membrana

celular é desestabilizada e o conteúdo intracelular é extravasado.

Esse tipo de estresse pode mobilizar proteínas heat shock que promovem a transcrição

de genes relacionados a funções metabólicas e de reparo, justificando o crescimento

exacerbado observado em nossos experimentos (COWEN, 2008).

MELANINA DE F. PEDROSOI COMO AGENTE ANTIOXIDANTE

Melaninas são usualmente definidas como compostos antioxidantes, característica

atribuída à composição aromática (fenólica e indólica) de suas unidades. Em C. neoformans a

melanina já foi descrita como um tampão de oxi-redução do fungo, tendo sua propriedade

(oxidada ou reduzida) dependente de sinais promovidos pelo fungo ou por estímulos

oxidativos externos (JACOBSON e HONG, 1997). Em A. fumigatus foi sugerido que a

melanina tem capacidade antioxidante, definida pela não oxidação de ácido 2-nitrobenzóico

em presença dos agentes oxidantes H2O2 e hipoclorito.

Em nossos experimentos avaliamos a atividade antioxidante da célula inteira, ainda

viável, sendo a variável experimental a inibição prévia da biossíntese de melanina pelo

triciclazol. Nossos resultados sugeriram uma maior atividade antioxidante do fungo-controle.

Sabe-se que há uma grande diversidade de mecanismos antioxidantes possuídas pelos fungos,

73


como superóxido dismutases, catalases, peroxidases, glutationa redutases, tioredoxinas e

manitol (GESSLER, AVER'YANOV e BELOZERSKAYA, 2007). No fungo-triciclazol,

mesmo considerando a compensatória superexpressão de alguns desses mecanismos, a

atividade antioxidante foi inferior a do fungo-controle, sugerindo um papel importante para a

melanina na proteção contra agentes oxidantes em F. pedrosoi.

CONSIDERAÇÕES SOBRE O ÓXIDO NÍTRICO

O óxido nítrico é um gás, principal mediador citotóxico de células imunes efetoras

ativadas, e constitui a mais importante molécula reguladora do sistema imune. A síntese do

óxido nítrico resulta da oxidação de um dos dois nitrogênios guanidino da L-arginina,

convertida a L-citrulina. Em macrófagos e neutrófilos, após indução por citocinas e/ou

endotoxinas, esta reação é catalisada pela enzima i-NOS (oxido nítrico sintase induzível. O

óxido nítrico reage diretamente com metais (especialmente o ferro) presentes nas enzimas do

seu alvo e as inativa, impedindo processos essenciais de respiração e proliferação celular. Na

infecção, macrófagos e neutrófilos ativados secretam simultaneamente óxido nítrico e

intermediários reativos do oxigênio. Sua ação citotóxica consiste, principalmente, na reação

com intermediários do oxigênio como o ânion superóxido (O-2) resultando na formação de

peroxinitrito (ONOO-), que atua na oxidação de proteínas. Este pode ser protonado na

presença de íon hidrogênio (H+), gerando o radical reativo e tóxico hidroxil (HO.),

aumentando efetivamente a ação tóxica do óxido nítrico. (DUSSE, VIEIRA e CARVALHO,

2003).

Em experimentos com H. capsulatum em modelos murinos, o óxido nítrico já foi

descrito como um importante fator para a contenção do crescimento intracelular (LANE,

OTERO, WU-HSIEH et al., 1994; LANE, WU-HSIEH e HOWARD, 1994). Hifas de C.

albicans foram descritas como susceptíveis a óxido nítrico (BLASI, PITZURRA, PULITI et

74


al., 1995). O óxido nítrico também foi apontado como um fator de proteção do hospedeiro

contra C. neoformans (ROSSI, CERVI, GARCIA et al., 1999), sendo que esse fungo, quando

melanizado, é mais resistente ao óxido nítrico quimicamente gerado (WANG e

CASADEVALL, 1994).

Em S. schenkii, fungo cuja via de biossíntese de melanina é a mesma de F. pedrosoi, foi

demonstrado que os mecanismos oxidativos de procedência imune (superóxido e peróxido de

hidrogênio) não contribuíam para a redução na viabilidade de conídios e leveduras desse

fungo, e que somente o óxido nítrico, também produzido in vivo, era efetivo (FERNANDES,

COELHO, LOPES BEZERRA et al., 2000).

Já foi sugerido em modelo de infecção em murinos que F. pedrosoi estimula a síntese

de H2O2 por macrófagos (BOCCA, BRITO, FIGUEIREDO et al., 2006). Nesse mesmo

trabalho é atribuída à melanina uma capacidade de inibição da síntese de óxido nítrico, em

virtude baixos níveis detectados de nitrito em interações com macrófagos murinos ativados

com IFN-γ e LPS. Em experimentos de nosso grupo (FRANZEN, 2005), também foram

notados baixos níveis de nitrito em experimentos de interação com macrófagos murinos e,

interessantemente, níveis mais altos (em 24 h de interação) quando o fungo inoculado havia

crescido com triciclazol.

A enzima iNOS nos macrófagos, e a L-arginina, presente no meio de interação RPMI-

1640, são os únicos requerimentos para a síntese de óxido nítrico em macrófagos (DUSSE,

VIEIRA et al., 2003). Detectamos a presença da iNOS na interação de macrófagos com F.

pedrosoi, e concluímos que o fungo, mesmo melanizado, não inibe a síntese de óxido nítrico.

As propriedades de resistência do F. pedrosoi-controle ao óxido nítrico, derivado do doador

SNAP, e propriedade antioxidante do fungo-controle, nos faz sugerir que a melanina do fungo

atue como uma molécula seqüestradora, impedindo os efeitos oxidativos do óxido nítrico ou

75


da reação deste com outros agentes, que formariam radicais com potenciais oxidativos ainda

mais deletérios ao fungo.

O alargamento da parede celular de conídios de F. pedrosoi em presença de triciclazol

(FRANZEN, CUNHA et al., 2006) em conjunto a maior liberação de óxido nítrico pelo

fungo-triciclazol na interação com macrófagos (FRANZEN, 2005) sugerem que ocorre uma

maior exposição de açúcares, que são conhecidos ativadores de resposta inflamatória,

liberando mais óxido nítrico, por interagir com receptores de glucana ou TLR em macrófagos

(KATAOKA, MUTA et al., 2002). Desta forma conclui-se que a melanina não somente é um

importante constituinte da parede celular do fungo, mas que a ligação da melanina com a

parede celular é predominante o suficiente para modificar a exposição de carboidratos na

parede celular, ou ainda, que os carboidratos da superfície celular em F. pedrosoi poderiam

ser marcarados por ela.

O H2O2, principalmente liberado por neutrófilos, foi sugerido como possuindo atividade

fungicida a F. pedrosoi, sendo um importante agente reativo liberado pelo sistema imune para

controle da infecção (ROZENTAL, ALVIANO e DE SOUZA, 1996). Nesta tese detectamos

uma menor susceptibilidade do fungo-controle a exposição de H2O2 em relação ao fungo-

triciclazol.

A literatura vem apresentando resultados complementares em relação à melanina em F.

pedrosoi. Métodos diferentes de isolamento desse pigmento, seja pela solubilização em

NaOH seguido de precipitação ácida (ALVIANO, FARBIARZ et al., 1991), ou por digestão

enzimática, seguida de solventes orgânicos, detergente e tratamento com ácido quente dos

fungos (ALVIANO, FRANZEN et al., 2004), resultaram em padrões diferentes de ativação de

células do sistema imune. Restringindo essas observações aos macrófagos, foi descrito que a

melanina, isolada de acordo com Alviano e colaboradores (1991), é capaz de reduzir a

76


resposta oxidativa sobre F. pedrosoi e S. cerevisiae em interação com macrófagos

(FRANZEN, 2005; BOCCA, BRITO et al., 2006). Em contradição, experimentos com a

melanina isolada conforme Alviano e colaboradores (2004) mostraram a ativação da resposta

oxidativa e um aumento da capacidade fagocítica de macrófagos na presença do dessa.

Como a melanina que isolamos de fungos está associada a carboidratos da parede

celular (CUNHA, FRANZEN et al., 2005; CUNHA, 2005; ZHONG, FRASES et al., 2008), é

possível que a purificação deste enigmático polímero não tenha atingido o grau de pureza

necessário para desvincularmos a ativação do sistema imune detectada em modelos de

infecção, a presença desses açúcares, conhecidos ativadores de resposta oxidativa em

macrófagos (KATAOKA, MUTA et al., 2002).

Podemos considerar que as formas de isolamento da melanina atualmente utilizadas não

resultam em uma fração pura do polímero, dificultando a caracterização de seus efeitos em

modelos de estudo disponíveis. Entretanto, esta limitação não invalida o seu uso na análise da

melanina como fator de virulência. Parece mínima a probabilidade da liberação e

apresentação da melanina pelo F. pedrosoi estar totalmente desvinculada de algum

carboidrato. A associação da melanina, ou diferentes tipos de associação desta, com as

estruturas de superfície do fungo, poderiam ter diferentes resultados na ativação e

direcionamento imune, definindo-as como majoritariamente TH1 ou TH2, possivelmente

participar até dos mecanismos que definem a gravidade das lesões ou a cronicidade da

doença. Mais importante ainda seriam os estudos de compostos capazes de atuar na via de

biossíntese de melanina, in vitro e in vivo, e os efeitos da inibição dessa via na resolução da

infecção ou no direcionamento da resposta imune.

77


Contudo, certamente seria valiosa a obtenção da melanina purificada para aplicações em

biotecnologia, por ser um pigmento capaz de conferir diversas formas de resistência a

materiais e a outros compostos poliméricos.

CITOTOXICIDADE DO TRICICLAZOL E DE OUTROS INIBIDORES DA VIA DE BIOSSÍNTESE DA

MELANINA

A melanina vem sendo extensamente demonstrada como um fator de virulência em

fungos. Nesta tese verificamos a inibição na biossíntese de melanina pelo triciclazol nos

fungos patogênicos F. pedrosoi, P. verrucosa, C. carrioni, Exophiala dermatitidis, E.

jeanselmei e A. fumigatus pela modificação da coloração da colônia.

Seria de grande interesse para o tratamento de infecções fúngicas, que a inibição da via

de biossíntese da melanina, in vivo, fosse capaz de eliminar algumas características de

virulência do patógeno, não interferindo nas características do paciente, o que permitiria um

tratamento mais eficaz. Uma primeira abordagem nesse rumo foi realizada nesta tese com

testes em modelos celulares de humanos da citotoxicidade do triciclazol e de outros inibidores

da via de DHN-melanina (carpropamida e piroquilona). Nossos resultados indicaram que

esses compostos possuem uma baixa citotoxicidade em modelos in vitro, cerca de 20 vezes

menores que a anfotericina B. Em testes com uma linhagem celular produtora de melanina

(melanócitos murinos B16F10), os resultados foram semelhantes. Ainda sobre as células

B16F10, realizamos experimentos que sugeriram que a síntese de melanina dessas células não

sofria alteração com o tratamento com altas concentrações de triciclazol. Esses dados sugerem

que testes em maior escala são indicados para esses compostos, já que existe neles um

potencial para o desenvolvimento de fármacos, baseados na inibição da via de biossíntese de

fungos patogênicos.

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Interessantemente, a utilização recorrente de triciclazol em cultivares agrícolas, por

mais de 30 anos seguidos, não diminuiu sua eficiência ou gerou cepas de fungos resistentes

(KURAHASHI, 2001).

CONSIDERAÇÕES PARA O FUTURO

Um passo importante na descoberta de novos fármacos baseados na inibição da via de

biossíntese de melanina em fungos negros é a determinação e caracterização das enzimas alvo

da via, e estudos in virtuo de acoplamento de potenciais IBM com essas enzimas. Já foram

descritas diversas moléculas com estruturas semelhantes ao triciclazol, com pequenas

variações nas ramificações dos anéis aromáticos (Anexo 1). Existindo estruturas “tipo-

triciclazol” já determinadas, testes com essas substâncias (nota: algumas dessas já estão sendo

testadas em screening de substâncias anti-HIV e câncer) nos aproximam da identificação de

um inibidor de DHN-melanina em fungos, com funcionalidade a seres humanos.

Depois de identificados os compostos que bloqueiem a síntese de melanina em fungos

patogênicos, e não em humanos (nem sendo tóxicos a estes), seria possível sua administração

combinada a antifúngicos, como o itraconazol ou a terbinafina. Ademais, a associação de

formulações antifúngico-IBM a estruturas nanoméricas como lipossomas, fulerenos ou

dendrímeros, potencializariam a utilização e o sinergismo desses, melhorando a

farmacocinética e minimizando a toxicidade do tratamento de micoses causadas por fungos

produtores de melanina.

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Conclusões

• A microscopia eletrônica de varredura ambiental é uma interessante ferramenta

aplicável ao estudo da morfologia tecidual da cromoblastomicose.

• Em F. pedrosoi, a melanina confere resistência à pressão, radiação UV, altas

concentrações de sal, detergente e aos radicais oxidativos peróxido de hidrogênio e óxido

nítrico.

• A melanina de F. pedrosoi é paramagnética e antioxidante.

• Em F. pedrosoi, o mecanismo do fungo para evasão da ação do óxido nítrico em

interação com macrófagos é por seqüestro desse radical pela melanina, e não pela inibição de

sua síntese.

• A inibição da via de biossíntese da melanina pelo triciclazol aumentou a

susceptibilidade de F. pedrosoi a antifúngicos.

• A alta temperatura (42 °C) reduziu o crescimento de F. pedrosoi.

• O congelamento de F. pedrosoi (-20 °C) não alterou o crescimento do fungo, mas a

associação de baixa temperatura e antifúngicos inibiu o seu crescimento.

• A citotoxicidade do triciclazol para culturas de células humanas e murina foi 20 vezes

menor que a do antifúngico anfotericina B.

• Triciclazol não afetou a via de síntese de melanina em modelo de melanócitos

murinos.

• A metodologia de avaliação de crescimento do fungo por medição da área de

crescimento com o uso de softwares convencionais mostrou-se relevante, útil, e de baixo

custo, para ensaios com fungos filamentosos.

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Bibliografia

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ANEXOS

ANEXO 1: ESTRUTURAS TIPO- TRICICLAZOL DERIVADAS DE PESQUISA POR SIMILARIDADE

ESTRUTURAL EM BASE DE DADOS PUBCHEM COMPOUND DO NATIONAL INSTITUTE OF

HEALTH – EUA (HTTP://WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/SITES/ENTREZ?DB=PCCOMPOUND).

Triciclazol IUPAC: 8-methyl-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 189.236980 g/mol | FM: C9H7N3S

IUPAC: 8-ethyl-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 203.263560 g/mol | FM: C10H9N3S

IUPAC: 8-methyl-[1,2,4]triazolo[5,1-b][1,3]benzothiazole PM: 189.236980 g/mol | FM: C9H7N3S

IUPAC: 6,8-dimethyl-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 203.263560 g/mol | FM: C10H9N3S

IUPAC: 6-methyl-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 189.236980 g/mol | FM: C9H7N3S

IUPAC: 1-chloro-8-methyl-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 223.682040 g/mol | FM: C9H6ClN3S

92


IUPAC: 8-butyl-[1,2,4]triazolo[5,4-b][1,3]benzothiazol-1-amine PM: 246.331360 g/mol | FM: C12H14N4S

IUPAC: 8-ethyl-[1,2,4]triazolo[5,4-b][1,3]benzothiazol-1-amine PM: 218.278200 g/mol | FM: C10H10N4S

IUPAC: 8-methyl-[1,2,4]triazolo[5,4-b][1,3]benzothiazol-1-amine PM: 204.251620 g/mol | FM: C9H8N4S

IUPAC: 8-methyl-3H-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazol-9-ium PM: 190.244920 g/mol | FM: C9H8N3S

+

IUPAC: 8-methylsulfanyl-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 221.301980 g/mol | FM: C9H7N3S2


IUPAC: 8-fluoro-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 193.200863 g/mol | FM: C8H4FN3S

IUPAC: [1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 175.210400 g/mol | FM: C8H5N3S

93


IUPAC: 1-methyl-8-(trifluoromethyl)-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 257.234950 g/mol | FM: C10H6F3N3S

IUPAC: 8-ethyl-7-methyl-[1,2,4]triazolo[5,1-b][1,3]benzothiazole PM: 217.290140 g/mol | FM: C11H11N3S

IUPAC: 6-ethyl-[1,2,4]triazolo[5,1-b][1,3]benzothiazole PM: 203.263560 g/mol | FM: C10H9N3S

IUPAC: 4-methyl-N-(1,2,4-triazol-4-yl)-1,3-benzothiazol-2-amine PM: 231.276960 g/mol | FM: C10H9N5S


IUPAC: 8-propan-2-yl-[1,2,4]triazolo[5,4-b][1,3]benzothiazol-1-amine PM: 232.304780 g/mol | FM: C11H12N4S

IUPAC: 6-methyl-1-methylsulfanyl-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 235.328560 g/mol | FM: C10H9N3S2 IUPAC: 1-chloro-6-methyl-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3]benzothiazole PM: 223.682040 g/mol | FM: C9H6ClN3S

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