Mariane Barreto das Chagas - antigo.monografias.ufrn.br

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

INSTITUTO DE QUÍMICA

Mariane Barreto das Chagas

Prospecção química e microbiológica do óleo essencial de espécimens de M.

Urundeuva (aroeira-do-sertão) quimiotipos -3-careno e -ocimeno.

NATAL, RN

Dezembro/2015

Mariane Barreto das chagas

Prospecção Química e Microbiológica do óleo essencial de espécimens de M.

urundeuva (aroeira dosertão) quimiotipos -3-careno e -ocimeno

Monografia apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do grau de bacharel em Química. Orientadora: Prof. Dra. Renata Mendonça Araújo Co-orientadora: Prof. Dra. Lívia Nunes Cavalcanti

NATAL, RN

Dezembro/2015

Mariane Barreto das chagas

Prospecção Química e Microbiológica do óleo essencial de espécimens de M.

urundeuva (aroeira-do-sertão) quimiotipos -3-careno e -ocimeno.

Monografia apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do grau de bacharel em Química. Orientadora: Prof. Dra. Renata Mendonça Araújo Co-orientadora: Prof. Dra. Lívia Nunes Cavalcanti

Aprovada em :16 /12 /2015

_____________________________________

Prof. Dra. Lívia Nunes Cavalcanti

Co-orientadora

_____________________________________

Prof. Dr. Fabrício Gava Menezes

_____________________________________

Ms. Marcela de Castro N. D. Pontes

.... Ainda que eu ande pelo vale da

sombra da morte, não temerei mal algum,

porque tu estás comigo; a tua vara e o teu

cajado me consolam.

(Salmo 23)

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à Deus, meu guia, pelo dom da vida, por me dá

força, saúde durante toda minha caminhada e pelo seu infinito amor, sem ele eu

nada seria.

A toda minha família, em especial os meus pais, Rosângela e Gustavo, que

sempre incentivaram meus estudos com apoio, carinho e dedicação. Às minhas

irmãs Bruna e Marina, e meus sobrinhos Gabriela e Luís Gustavo. Amo vocês.

Ao meu namorado Renato, pelo companheirismo e ajuda nos momentos de

dificuldade.

A minha orientadora, professora Renata Mendonça pelo empenho, amizade,

dedicação, companheirismo e pela oportunidade de crescimento profissional durante

o andamento do projeto, serei grata eternamente.

A aluna de doutorado do LISCO, Marcela de Castro pela amizade no

laboratório e por aceitar compor a da banca examinadora.

Aos colegas do laboratório LISCO que sempre estiveram dispostos a me

ajudar, passar conhecimentos, e pelos bons momentos no laboratório.

As amigas Virgínia e Ana Bonifácio, por me mostrar minha capacidade, que

eu estava no caminho certo, acreditando no meu potencial quando eu já não

acreditava mais.

Ao aluno mestrando Ítalo Diego (Ppg-Biologia pararasitária - UFRN, por

realizar os testes biológicos, sob supervisão da prof. Dra. Vânia Sousa Andrade

(UFRN).

Ao instituto de Química da UFRN, pela estrutura oferecida, e a todas as

pessoas que o compõe ajudando de alguma forma.

A UFRN, por ser uma universidade de ensino superior pública e de boa

qualidade, por sua estrutura física e por todos os recursos oferecidos aos alunos.

RESUMO

Myracrodruon urundeuva Fr. Allem. é uma árvore amplamente encontrada na

"Caatinga" e outras florestas secas do Brasil. Estudos anteriores sobre a

composição química do óleo essencial de M. Urundeuva mostram uma composição

química volátil constituída por monoterpenos de forma molecular C10H16, sendo eles:

cis e trans--ocimeno, -3-careno, limoneno, mirceno e -pineno. Em virtude deste

curioso resultado, foi realizada uma análise em uma região serrana, mais

precisamente na localidade de Araruna no estado da Paraíba, visando determinar a

composição química e realização de testes biológicos antimicrobianos de

espécimens de aroeira-do-sertão. O monoterpeno cis--ocimeno foi testado em uma

reação de epoxidação, visando testar metodologias para sua modificação estrutural

e atividade biológica. A análise cromatográfica do óleo essencial demonstrou que o

monoterpeno -3-careno é o constituinte majoritário, possuindo uma atividade

biológica mais eficiente em comparação com o monoterpeno cis--ocimeno e o seu

derivado epoxidado, evidenciando um alto poder terapêutico contra bactérias. O

grau de pureza do reagente de partida cis--ocimeno para a reação de epoxidação

foi determinado por RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE 1H. De acordo

com os testes biológicos o óleo essencial da aroeira do sertão revelou-se mais

potente que o chá da aroeira liofilizado, que apenas inibiu o crescimento da bactéria.

Isso evidencia que terpenos como constituintes voláteis são mais terapêuticas do

que outras substâncias naturais, como flavonoides e taninos, já que não estão

presentes na fase aquosa. Este estudo mostrou-se bastante promissor em relação

ao efeito dos óleos essenciais sobre as bactérias testadas e instiga novas pesquisas

para modificação estrutural dos mesmos.

Palavras chave: Myracrodruon urundeuva. Monoterpenos. Aroeira do sertão

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Estrutura química dos monoterpenos: Mirceno (1), -Pineno (2),

Limoneno (3), -3-Careno (4), Cis(5) eTrans--Ocimeno (6) ................17

Figura 2- Estrutura química dos monoterpenos Timol e Carvacrol.......................19

Figura 3- Estrutura química do isopreno................................................................23

Figura 4- Compostos contendo epóxidos na estrutura..........................................30

Figura 5- Estrutura química do mCPBA.................................................................30

Figura 6- Possibilidades de produtos da epoxidação do limoneno........................31

Figura 7- Fotografia de aroeira do sertão em seu habitat natural na

localidade de Araruna-PB......................................................................32

Figura 8- Dopaminérgico 6-Hidróxidopamina.........................................................33

Figura 9- Aparelho de Clevenger com o óleo essencial obtido..............................36

Figura 10- Condições experimentais de epoxidaçãodo cis--ocimeno....................37

Figura 11- Cromatograma CG/EM de OEAS1.........................................................41

Figura 12- Espectro de massa do constituinte -3-careno.......................................42

Figura 13- Espectro de massa do constituinte (2E) -3,4,4-Trimetil-

5-oxo-2-Ácido-hexenóico........................................................................43

Figura 14- Espectro de massa do constituinte 5-isoprenil-2-

metil-7-oxabiciclo[4.1.0] heptano-2-ol...................................................43

Figura 15- Espectro de massa do constituinte 2-metilisoborneol............................43

Figura 16- Espectro de massa do constituinte (+) – Ledene...................................44

Figura 17- Espectro de massa do constituinte Globulol..........................................44



Figura 20- Espectro de massa do constituinte 5,7, octadieno

3-ol,2,4,4,7-Tetrametil-, (E) ....................................................................47

Figura 21- Espectro de massa do constituinte

(2E) -3,4,4-Trimetil-5-oxo-2-Ácido-hexenóico........................................47

Figura 22- Espectro de massa do 2-Bornanol-2-metil..............................................47

Figura 23- Espectro de massa do constituinte 3- (2-Hidroxi-2-metil-propil)

-ciclohex-2-enona...................................................................................48

Figura 24- Espectro de massa do constituinte 2-metilisoborneol.............................48



Figura 27- Espectro de massa do constituinte p-cimeno-8-ol..................................51

Figura 28- Espectro de massa do constituinte p-cimeno-8-ol..................................51

Figura 29- Espectro de massa do constituinte 5-isoprenil-2-

metil-7-oxabiciclo[4.1.0] heptano-2-ol....................................................51

Figura 30- Espectro de massa do constituinte 4,7-Metanobenzofurano,

2,2-oxibis [octahidro- 7,8,8- trimetil].......................................................52

Figura 31- Espectro de massa do constituinte -Limoneno-diepóxido...................52

Figura 32- Espectro de massa do constituinte Globulol..........................................53

Figura 33- Espectro de massa do constituinte 2,7,10,15,19,23-

Hexametil-tetracosa-2,10,14,18,22-pentaeno-6,7-diol...........................53

Figura 34- Espectro de massa do constituinte [6.3.1.0(15) ]

dodecano-2,9-diol...................................................................................53

Figura 35- Estrutura química do cis--ocimeno.......................................................55

Figura 36- Espectro de RMN 1H de (CDCl3, 300 MHz) ............................................55

Figura 37- Formação do produto 4- (3,3-dimetiloxiran-2-il) -2-

(oxiran-2-il) butan-2-ol.............................................................................56

Figura 38- Cromatograma da reação de epoxidação do cis--ocimeno...................56

Figura 39- Espectro de massa do constituinte 4- (3,3-dimetiloxiran-2-il) -2-

(oxiran-2-il) butan-2-ol..............................................................................57

Figura 40- Espectro de massa do constituinte não elucidado...................................57

LISTA DE TABELAS

Tabela 1-Rendimento do óleo essencial de M. urundeuva................................40

Tabela 2-Composição do óleo essencial OAS-1................................................42

Tabela 3-Composição do óleo essencial OAS-2................................................45

Tabela 4- Composição do óleo essencial OAS-3................................................49

Tabela 5- Resultados de IC50 em testes microbiológicos....................................58

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1- Biosíntese dos terpenos..................................................................23

Esquema 2- Mecanismo proposto para interconversão dos

Monoterpenos de M. urundeuva......................................................24

Esquema 3- Exemplos de reações clássicas de alcenos....................................29

Esquema 4- Mecanismo de epoxidação de alcenos............................................31

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

CCD- Cromatografia de camada delgada

CDCl3- Clorofórmio deuterado

CH2Cl2- Diclorometano

CH3OH- Metanol

CHCl3- Clorofórmio

CG/ME- Cromatografia gás/líquido acoplada à espectroscopia de massa

D- Dubleto

D-D- Dubleto-Dubleto

DMAPP- Dimetilalil difosfato

DMSO- Solvente utilizado para realização de testes antimicrobianos

FPP- Farnesil difosfato

GPP- Geranil difosfato

GGPP- Geranil Geranil difosfato

H2O2- Peróxido de hidrogênio

IPP- Isopentenil difosfato

mCPBA- Ácido meta-cloroperoxibenzóico

Na2SO4- Sulfato de sódio anidro

RMN 1H- Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

S- Singleto

T- Tripleto

6- OHDA- Dopaminérgico 6-Hidróxidopamina

δ- Deslocamento químico

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................16

1.1 PRODUTOS NATURAIS...................................................................................18

1.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS: CONSTITUINTES FIXOS E VOLÁTEIS.....19

1.3 ÓLEOS ESSENCIAIS........................................................................................20

1.4 TERPENOS.......................................................................................................22

1.5 MONOTERPENOS DE AROEIRA.....................................................................24

1.6 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DOS CONSTITUINTES DE M. URUNDEUVA.....24

1.7 ATIVIDADES BIOLÓGICAS COMUNS EM ÓLEOS ESSENCIAIS...................27

1.8 MODIFICAÇÃO ESTRUTURAL DOS MONOTERPENOS DE AROEIRA-

REATIVIDADE DE ALCENOS..........................................................................29

1.9 REAÇÕES DE EPOXIDAÇÃO COM MONOTERPENOS..................................31

2 MYRACRODRUON URUNDEUVA.....................................................................32

3 OBJETIVOS.........................................................................................................35

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................35

4 EXPERIMENTAL..................................................................................................36

4.1 MATERIAL BOTÂNICO......................................................................................36

4.2 EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DA AROEIRA..........................................36

4.3 ANÁLISE DO ÓLEO ESSENCIAL, ANÁLISE PRODUTO DE

REAÇÃO DO CIS--OCIMENO POR CG/EM E ANÁLISE

DO CIS--OCIMENO POR RMN 1H....................................................................37

4.4 REAÇÃO DE EPOXIDAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL

QUIMIOTIPO CIS--OCIMENO COM MCPBA...................................................38

4.5 PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE EPOXIDAÇÃO DO CIS--OCIMENO...........39

4.6 TESTES ANTIMICROBIANOS COM AS BACTÉRIAS

STHAPHYLOCOCUS AUREUS E ESCHECHERIA COLI DO

ÓLEO ESSENCIAL DE AROEIRA, CIS--OCIMENO,

CHÁ LIOFILIZADO DA AROEIRA E DO PRODUTO

DE REAÇÃO DE EPOXIDAÇÃO DO CIS--OCIMENO.......................................39

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES........................................................................40

5.1 RENDIMENTO DO ÓLEO ESSENCIAL.............................................................40

5.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DA AROEIRA............41

5.3 REAÇÃO DE DERIVATIZAÇÃO DO CIS--OCIMENO.....................................54

5.3.1- Caracterização do material de partida

Cis--Ocimeno por RMN 1H...........................................................................54

5.4 CARACTERIZAÇÃO DO PRODUTO DE REAÇÃO DE EPOXIDAÇÃO

DO Cis--OCIMENO POR CG/ME....................................................................56

5.5 TESTES ANTIMICROBIANOS COM AS BACTÉRIAS

STHAPHYLOCOCUS AUREUS E ESCHECHERIA COLI DO ÓLEO

ESSENCIAL DE AROEIRA, CIS--OCIMENO, CHÁ LIOFILIZADO DA

AROEIRA E DO PRODUTO DE REAÇÃO DE EPOXIDAÇÃO

DO CIS--OCIMENO.........................................................................................58

6 CONCLUSÕES....................................................................................................59

REFERÊNCIAS..........................................................................................................60

16

1 INTRODUÇÃO

Myracrodruon urundeuva Fr. Allem. (Anacardiaceae, Sinônimo: Astronium

urundeuva) é uma árvore amplamente encontrada na "Caatinga" e outras florestas

secas do Brasil, sendo mais abundante no nordeste do país, onde é conhecida

popularmente como "aroeira-do-sertão" ou "aroeira", abreviação de "araroeira" o que

significa árvore de araras (LORENZI; MATOS, 2000).

Estudos anteriores sobre a composição química dos óleos essenciais a partir

de M. urundeuva mostraram resultados divergentes. De acordo com Flag (1993), as

folhas de um espécimen selvagem de M. urundeuva revelou o sesquiterpeno trans-

cariofileno (38,6%) como constituinte majoritário, enquanto que as mudas de 20,0

cm e 40,0 cm de plantas cultivadas, têm o monoterpeno-3-careno como o principal

constituinte (67,2% e 48,3%, respectivamente). De acordo com Maia e

colaboradores (2012) os óleos de dois espécimens diferentes de aroeira-do-sertão,

coletadas nos estados do Maranhão e Tocantins, apresentaram o monoterpeno -3-

careno como principal constituinte químico (78,1% e 56,3%, respectivamente).

Estudos realizados pelo grupo de pesquisa em plantas medicinais da

Universidade Federal do Ceará (LAFIPLAM-UFC) e pelo grupo de pesquisa em

produtos naturais e síntese orgânica (LISCO) da UFRN, demonstraram que óleos

essenciais das folhas de 63 espécimens de "aroeira-do-sertão" coletadas nos

estados do Ceará, Rio Grande do Norte, Pernambuco e Bahia, apresentam uma

composição química volátil constituída por monoterpenos de forma molecular C10

H16, sendo eles: cis e trans--ocimeno, -3-careno, limoneno, mirceno e -pineno.

Foi observado que esta espécie produz sempre um monoterpeno majoritário, com

mais de 50 % de rendimento, e os demais constituintes são os outros 5

monoterpenos, o que permitiu a caracterização de seis diferentes quimiotipos para

M. urundeuva, revelando um maior nível de variação química intra-específica para a

espécie.

Esta variabilidade química pode ocorrer devido à influência da temperatura, à

umidade relativa, à duração total de exposição ao sol e ao regime de ventos, mas

até o momento não foi identificado o fator que determina a variação química no óleo

essencial de aroeira-do-sertão.

17

Figura 1- Estrutura química dos monoterpenos: Mirceno (A), -Pineno (B), Limoneno (C), -3-Careno (D), Cis (E) e Trans--Ocimeno (F).

Fonte: Autor, 2015

Em virtude do curioso resultado para esta espécie e da necessidade de

algumas respostas para esse sistema enzimático tão específico de M. urundeuva, a

análise foi estendida para uma região serrana na localidade de Araruna no estado

da Paraíba. Este trabalho visa determinar a composição química de dois

espécimens de aroeira-do-sertão coletadas nesta região e realizar testes biológicos

antimicrobianos, buscando uma possível aplicação destes óleos como fitoterápico.

Pesquisas recentes mostram que antibióticos causam muitos efeitos

colaterais aliados a resistência do organismo a essas drogas e infecções em

pacientes com sistema imunológico deficiente. Há a necessidade de substituir

antibióticos por novas moléculas com atividades biológicas contra infecções e que

apresentem baixa toxicidade (CARS et al., 2011).

O tratamento de doenças bacterianas com antibióticos não tem sido eficaz,

pois alguns pacientes costumam apresentar resistência ao medicamento, resultando

assim em um problema no sistema de saúde (CARS et al., 2011). Essa resistência

aumenta a taxa de mortalidade em pacientes infectados e gera alto custo para o

sistema de saúde (COUTINHO et al., 2005). Nesse contexto, é necessário o

desenvolvimento de novas drogas antibacterianas eficientes no tratamento de

infecções (MICHELIN et al., 2005).

Considerando os bons rendimentos de monoterpenos obtidos do óleo de

aroeira-do-sertão, um dos objetivos do LISCO é também desenvolver metodologias

para derivatização destes compostos, e realizar testes biológicos com os mesmos

visando potencializar os efeitos destes compostos. O monoterpeno cis--ocimeno foi

testado neste trabalho em uma reação de epoxidação.

18

1.1 Produtos Naturais

A utilização de plantas como medicamento é tão antiga quanto a própria

existência do homem. Diversas pesquisas são feitas atualmente para a

determinação da atividade biológica dos seus componentes, o que diferencia o seu

uso na antiguidade, em que apenas pelo senso comum as plantas medicinais eram

utilizadas (CATÃO et al., 2006).

Fitoterapia é uma ciência em que o tratamento das doenças é feito através de

plantas medicinais, com substâncias isoladas de uma ou mais plantas, obedecendo

à legislação para preparação e prescrição (DI STASI, 2007). Sua utilização se dá de

diversas formas, como comprimidos, soluções, pomadas e infusões (FRANCISCO,

2010).

A área de produtos naturais tem diversos segmentos, agregando profissionais

de diversas áreas, entre elas, etnobotânica, isolamento, caracterização,

farmacologia, química sintética, estudo das atividades biológicas e operação de

formulações (MACIEL, 2002).

O Brasil é o país com a maior diversidade vegetal do mundo aliado a

pesquisas que comprovam cientificamente a eficácia nos tratamentos de uso popular

(CARTAXO, 2010).

É importante informar a população à cerca do uso indiscriminado de plantas

medicinais, que podem apresentar efeitos colaterais, mesmo aquelas com

comprovada atividade farmacológica, como o chá verde (Camellia sinensis,

Theaceae), seu uso em excesso pode causar danos ao fígado, interações

medicamentosas e arritmia (SOUZA, 2012).

Segundo COUTINHO et. al., 2008, substâncias isoladas de plantas podem ser

eficazes na substituição de antibióticos. Pesquisadores avaliam o potencial das

plantas na modificação da atividade antibacteriana e sua eficácia direta (COUTINHO

et al., 2010). Para o estudo dos princípios ativos é necessário avaliar as classes de

compostos químicos presente na planta para a identificação dos metabólitos

secundários e realizar estudos farmacológicos (FIGUEREIDO et al., 2013).

19

Antimicrobianos naturais tem se destacado em esfera global por sua eficácia

contra diversas patologias. Timol e carvacrol (Figura 2) são monoterpenos fenólicos

encontrados em plantas que demonstraram atividades anticancerígena (COIMBRA

et al., 2011), antimicrobiana (GÁRCIA et al., 2011; RIVAS et al., 2010; LAI et al.,

2012; AHMAD et al., 2010), antioxidantes (UNDENGER et al.,2009) e anti-

inflamatórias (FACHINI-QUEIROZ et al., 2012).

Figura 2- Estrutura química dos monoterpenos Timol e Carvacrol

Fonte: Autor, 2015

1.2 Metabólitos secundários: Constituintes fixos e voláteis

Metabólitos secundários são substâncias orgânicas que não são

obrigatoriamente necessárias para o desenvolvimento das plantas. Apesar da

ausência de metabólitos secundários não resultar na morte da planta,

desempenham tarefas a longo prazo, agem na defesa contra herbívoros, ataque de

patógenos, dispersores de sementes e defesa contra micro-organismos

oportunistas, afetando assim a sua sobrevivência. Desempenham também tarefas

de defesa das plantas relacionada a fatores climáticos e ambientais, como proteção

contra raios ultravioleta e mudanças de temperatura. Os metabólitos secundários

são divididos em três grupos distintos: terpenos, compostos fenólicos e alcalóides

(PEREZ, 2004).

Compostos orgânicos voláteis são substâncias químicas que possuem

pressão de vapor alta o suficiente para se vaporizar à temperatura ambiente (DING

et al., 2009). Óleos essenciais são compostos voláteis de origem vegetal isolados

através de processos físicos de destilação ou outro método adequado (BRASIL,

2007). O que diferencia os óleos essenciais dos fixos, é que estes nunca se

evaporam ou volatizam totalmente, sendo em geral, misturas de substâncias

20

lipídicas, extraídas de semente de plantas, como mamona e girassol (SIMÕES;

SPTIZER, 2003).

1.3 Óleos essenciais

Os óleos essenciais são compostos naturais voláteis com cheiro forte, extraídos

de plantas aromáticas como metabólitos secundários. Sua forma de obtenção se dá

por arraste de vapor ou hidrodestilação, metodologia desenvolvida pela primeira vez

na idade média pelos árabes. Há uma grande variedade de metodologias para

extração de óleos essenciais, como extração por fluído supercrítico, micro-ondas, e

principalmente destilação por arraste de vapor, como os óleos essenciais possuem

atividades antimicrobianas e utilização na proteção do equilíbrio ecológico, a

extração por destilação é mais recomendada já para a indústria de perfumes a

extração com solventes lipofílicos ou com dióxido de carbono supercrítico é

favorecida. Apresenta atividades antimicrobianas, analgésicas, sedativas, anti-

inflamatórias, anestésicas e como conservante de alimentos. Ao longo do tempo

essas características permanecem, mas os mecanismos de ação antimicrobianos

antes desconhecidos surgem no cenário como metodologias importantes na

medicina natural. Os óleos essenciais atuam na defesa das plantas e na atração de

insetos para dispersão de pólens e sementes. Eles são extraídos de plantas

aromáticas, localizadas em países tropicais. São caracterizados por serem líquidos,

voláteis, límpido, raramente coloridos, lipossolúveis e solúveis em solventes

orgânicos, de densidade menor que a água (MASOTTI et al., 2003; ANGIONINI et

al., 2006).

Os óleos essenciais podem ser extraídos de todas as partes das plantas,

como flores, folhas, cascas, tronco, galhos, raízes, frutos ou sementes. Apesar de

todas essas partes possuírem óleos, algumas são mais concentradas que outras

(SIMÕES et al., 2000). Quando extraídos de uma mesma parte da planta podem

apresentar características diferentes, mesmo apresentando cor e aspecto

semelhante (ROBERS et al., 1997). A composição química da sua extração depende

de diversos fatores, como época da coleta, pois algumas plantas aromáticas têm

maior concentração de óleos voláteis em épocas ou dias específicos, condições

climáticas e de solo (SIMÕES; SPITZER, 2003).

21

Os óleos essenciais vêm se destacando na área de produtos naturais, pois

muitos deles apresentam a eficácia produtos sintéticos, sem apresentar os mesmos

efeitos colaterais. No entanto, há uma necessidade de conhecimento da ação

biológica para novas aplicações na medicina, agricultura e meio ambiente

(CARSON; RILEY, 2003).

Com relação às propriedades dos óleos essenciais, fica claro que eles são

misturas complexas de várias moléculas, e segundo a literatura o seu potencial

biológico não é efeito de todas as moléculas e sim os componentes presentes em

níveis mais altos de acordo com a análise cromatográfica. Os componentes

principais são isolados para uma melhor análise das características biofísicas e

biológicas (IPEK et al., 2005).

Um estudo na área de óleos essenciais que não foi totalmente elucidado diz

respeito à especificidade dos diferentes tipos de óleos essenciais, essa necessidade

surge da idéia de melhorar os efeitos terapêuticos destes, isso tem sido

demonstrado por BAKKALI et al., 2005, 2006.

A constituição química dos óleos essenciais é proveniente do metabolismo

secundário (SILVA; CASALI, 2000). Apresentam hidrocarbonetos terpênicos, álcoois

simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos, peróxidos,

furanos, ácidos orgânicos, lactonas e compostos sulfurados. Esses compostos

químicos distribuem-se em diferentes concentrações, de acordo com a planta

(SIMÕES; SPITZER, 2003).

Os óleos essenciais são formados a partir dos terpenos, derivados do ácido

mevalônico, ou de fenilpropanóides, oriundos do ácido chiquímico (GUENTHER,

1977; SIMÕES et al., 2000). Diversas substâncias vegetais compreendem os

terpenos, sendo designado assim para as substâncias que são formadas a partir da

rota Biosintética do isopreno (Figura 3), formado a partir do ácido mevalônico. Os

compostos que são encontrados em maiores quantidades nos óleos essenciais são

os monoterpenos e o sesquiterpenos. Outros terpenos também são encontrados nos

óleos voláteis, embora em menor quantidade e extraídos com solventes orgânicos,

devido à sua alta temperatura de volatilização (SIMÕES; SPITZER, 2003).

22

Terpenos e fenilpropanóides são duas classes distintas presente nos óleos

essenciais, com terpenos sendo os constituintes majoritários, contudo os

fenilpropanóides proporcionam sabor e odor relevantes para o óleo (SANGWAN et

al.,2001).

1.4Terpenos

Os terpenos são compostos presentes em todas as plantas e uma classe de

metabólitos secundários com diversas estruturas (RAVEN et al., 2001). Sua

formação se dá através da junção de unidades isoprênicas de cinco carbonos (TAIZ;

ZEIGER, 2004).

Os terpenos são classificados de acordo com o número de carbonos da sua

estrutura: hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos

(C20), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40) (OLIVEIRA et al., 2003). Os

hemiterpenos são o menor grupo, o isopreno é a sua molécula mais relevante,

sendo liberado de tecidos fotossinteticamente ativos (CROTEAU et al., 2000).

Os monoterpenos são formados por duas unidades de isopreno, tendo baixo

peso molecular. O primeiro monoterpeno a ser isolado foi a “tupertina” (C10H16), na

década de 1850 na Alemanha. Aproximadamente 1.000 monoterpenos naturais são

caracterizados atualmente, com aplicações em diversos ramos industriais. Os

Sesquiterpenos (C15) são encontrados nos óleos essenciais e em hormônios

vegetais, constituindo a maior classe de terpenos (OLIVEIRA et al.,2003).

Os terpenos são biossintetizados a partir de metabólitos primários pela rota

do mevanolato (Esquema 1), onde três moléculas de acetil-CoA são ligadas,

formando o ácido mevalônico, um intermediário de 6 carbonos, que passa por

etapas de pirofosforilação, descarboxilação e desidratação para produzir o

isopentenil difosfato (IPP), unidade básica na formação dos terpenos (TAIZ;ZEIGER,

2004).

O isopentenil difosfato e seu isômero, o dimetil difosfato (DMAPP) são

unidades pentacarbonadas ativas na biossíntese dos terpenos que se unem para

formar moléculas maiores. Os terpenos com maior quantidade de carbonos formam-

se com a junção do GPP (10 carbonos), com uma mólecula de IPP, formando o

23

farnesil difosfasto (FPP) com 15 carbonos. A adição de outra molécula de IPP forma

o geranilgeranil difosfato (GGPP). FPP e GGPP podem dimerizar para formar

triterpenos e tetraterpenos, respectivamente (TAIZ; ZEIGER, 2004).

Figura 3- Estrutura química do isopreno

Fonte: Autor, 2015

Esquema 1- Biossíntese de terpenos

Fonte: (TAIZ; ZEIGER, 2004)

24

1.5 Monoterpenos de aroeira

É interessante ressaltar que todos os monoterpenos que caracterizam os 5

quimiotipos podem ser interconvertidos quimicamente através de rearranjos

intramoleculares (Esquema 2).

Esquema 2- Mecanismo proposto para interconversão dos monoterpenos de M. urundeuva

1

2

3

4

5

6

78 9

10

Mirceno

1

2

3

4

5

6

78

9

10

limoneno

1

2

3

4

5

6

78 9

10

1

2

3

4

5

6

78 9

10

- ocimeno

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

-pineno-3-careno

Fonte: Autor, 2015

Esta variabilidade química pode ocorrer devido à influência da temperatura, à

umidade relativa, à duração total de exposição ao sol e ao regime de ventos,

caracterizando quimiotipos (QT), que ocorrem naturalmente em plantas silvestres.

QT é um termo aplicado a plantas de mesmo gênero e espécie, com a mesma

aparência externa, mas que diferem, às vezes consideravelmente, em sua

composição química.

1.6Atividades biológicas dos constituintes de M. urundeuva

O limomeno (Figura 1) é um monoterpeno extraído de diversas plantas, como

Citrus máxima, Citrus sinensis (SINGH et al., 2010), Typha latifólia (PARRA et al.,

2004), Polygonum minus (YACOOB, 1990) e Nelumbo nucifera (OMATA et al.,

1990). De acordo com a comissão Europeia (BURT, 2004), o limoneno se destaca

como aromatizante em indústria cosmética e de alimentos. Uma de suas aplicações

industriais é a sua utilização na substituição de solventes aromáticos tóxicos,

favorecendo assim o meio ambiente (GARCIA et al., 2009; SHIN; CHASE, 2005),

segundo LOHRASBI et al., 2010; POURBAFRANI et al., 2010, ele é eficiente

também como biocombustível, uso medicinal (GURGEL DO VALE et al., 2002), e

pesticidas (HEBEISH et al., 2008). O limoneno apresenta atividade antimicrobiana

contra diversos microorganismos, entre eles, Trichoderma viride, Cladosporium

25

herbarum e Aspergilus flavus (MOUREY; CANILLAC, 2002; OZTURK; ERCISLI,

2006; SINGH et al., 2010). O limoneno apresenta atividades inseticidas e

antimicrobianas, apresenta também aplicações na indústria farmacêutica devido

conter propriedades de permitir a penetração de aditivos na pele (KATTAN et al.,

2001 e KRISHNAIAH, 2008). Pesquisas diversas têm relatado a capacidade do

limoneno em impedir a proliferação de células melanona (RAPHAEL, KUTTAN,

2003; ZHAN et al 2004). Outra aplicação do limoneno é o seu potencial contra

células tumorais. Ele cessa o crescimento de células tumorais em modelos in vivo e

in vitro (CROWELL, 1999; RAPHAEL; KUTTAN, 2003; ZHAN etal., 2004). Além de

possuir segurança no procedimento quimiopreventivo (CROWELL, 1999; MO;

ELSON, 2004). A atividade do limonenocontra Leishmania e eficácia no

tratamentode Leishmaniose induzida foi estudada e comprovada (ARRUDA et al.,

2009).

-mirceno (Figura 1) é um monoterpeno encontrado em diversas plantas,

como Lemongrass, Lúpulo e Verbena (GUNTHER; ALTAUSEN, 1948), na forma de

óleo essencial (MORAES et al., 2009). Ele é bastante utilizado na fabricação de

cervejas, indústria de alimentos e de cosméticos (LEUNG, 1980).

No estudo realizado por BONAMIN e colaboradores (2014), o monoterpeno -

mirceno foi testado em testes de atividade anti-úlceras como forma de proteção,

enquanto o mirceno, constituinte minoritário age protegendo úlceras, devido não

conter na literatura aplicações na indústria farmacêutica, apenas aplicações na

indústria cosmética e de alimentos. Em comparação ao mirceno, o limoneno,

constituinte majoritário da extração do óleo essencial de Citrus aurantium também foi

testado. A atividade de proteção gástrica do limoneno está relacionada à ação sobre

o muco gástrico, a mucosa duodenal, e sua atividade ainda vão além, porque

envolve a ativação de antioxidantes importantes, exercendo assim, uma relevante

atividade anti-úlcera. Mirceno e limoneno são monoterpenos com estrututuras

semelhantes, porém pequenas diferenças podem causar diferentes atividades

biológicas de acordo com MORAES et. al.,2009. A atividade anti-úlcera e o potencial

antioxidante do mirceno foi demonstrado pela primeira vez, descoberta que sugere a

combinação do mirceno com outras substâncias para efeito antioxidante e melhora

do quadro de doenças causadas por estresse (BONAMIN et al., 2014).

26

-Pipeno (Figura1) é um monoterpeno que pode ser extraído de muitas

plantas coníferas, como o pinheiro. O pipeno é um material de partida para

síntese da cânfora, e é encontrado também no óleo essencial de eucalipto

(SIMOSEN, 1957). Há relatos na literatura que o pipeno possui propriedades anti-

inflamatória (MARTIN et al., 1993; ZHOU et al., 2004). Este monoterpeno melhora o

quadro de pancreatite por inibir a lesão tecidual e por produzir enzimas digestivas

(BAE et al., 2012).

Há muitos relatos na literatura da atividade antimicrobianos de óleos

essenciais, mas pouco estudo comparativo de componentes isolados. Um dos

principais componentes do óleo essencial de Alecrim segundo WONK; KITT, 2006 é

o -pipeno. Neste trabalho, o óleo essencial foi testado contra os microorganismos

Bacillus subtilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Eschecheria coli,

Cândida albicans e Aspergillus niger e indicou que o -pipeno possui atividade

contra esses microorganismos, mas o óleo essencial de Alecrim possuiu uma

atividade maior do que o -pipeno isolado, sendo difícil atribuir o efeito

antimicrobiano para um princípio ativo isolado (JIANG et al., 2013).

O gênero Dyciclophora pertence à família Apiaceae. Sua única espécie é a

Diciclophora pérsica, sendo uma espécie endêmica encontrada na província do Irã

(MOZAFFARIAN, 1996). Nos estudos sobre a composição dos óleos essenciais e

atividade biológica de plantas aromáticas (SOMBOLI et al., 2005), foi relatada a

composição e a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Dyciclophora pérsica

contra bactérias e fungos (SALEHI; SONBOLI; MOHAMMADI, 2005). Foram

identificados 45 constituintes, com monoterpenos como constituintes majoritários

com o total de 86,3 % do óleo total, dentre eles cis--ocimeno (Figura 1), (23%), -

pipeno (31,5%), trans--ocimeno (Figura 1) (5,4%) (SALEHI; SONBOLI;

MOHAMMADI, 2005). O óleo essencial inibiu fortemente o crescimento de Bacillus

legendagem, Staphylococus aureus e Staphylococus epidermidis. Já para os

microorganismos Enterococus faecalis, Eschecheria coli e Klebsiella pneumoniae o

óleo obteve uma atividade bacteriana moderada. Pseudomonas aeruginosa se

mostrou resistente ao óleo e para o fungo Aspergillus niger uma zona de inibição de

26 mm foi observada, com um valor de MIC igual a 0,6 mg/ml (SALEHI; SONBOLI;

MOHAMMADI, 2005).

27

O -Pinenoe o -Ocimeno foram testados isoladamente a fim de obsevar se eles

são responsáveis pela atividade antibacteriana do óleo essencial de Diciclophora

pérsica, e os resultados mostraram que eles são eficazes para a inibição do

crescimento de microorganismos (SALEH; SONBOLI; MOHAMMADI, 2005).

-3-Careno (Figura 1) é um monoterpeno bicíclico (BUCK-INGHAM, 1998),

uma olefina incomum, encontrada na terebintina de várias espécies coníferas

(NORIN, 1972; RUDLOFF, 1975). O -3-Careno foi isolado pela primeira vez a partir

de Douglas fir (Pseudotsuga menziessi) e de lodgepole pine (Pinus contorta) e foi

demonstrado que ele possui propriedades cinéticas de outros monoterpenos de

coníferas (SAVAGE; CROTEAU, 1993).

Uma pesquisa com óleos essenciais da espécie Salvia stenophylla da África

do Sul contém principalmente como constituinte majoritário do óleo essencial, o -3-

Careno com cerca de 22% do óleo total. A maioria das espécies de salvia possui

muitos tricomas glandulares peltados nos quais o óleo essencial é produzido

(KINTZIOS, 2000).

Utilizando cDNA sintetizado a partir de ARNm isolado a partir de tricomas

glandulares de Salvia stenophylla, e uma estratégia de clonagem baseada em

homologia, um cDNA foi isolado, codificando uma pré-proteína, assemelhando-se ao

processo de síntese de monoterpenos em sequência. A expressão heteróloga do

gene em Eschecheria coli desencandeou uma enzima solúvel capaz de catalisar a

conversão do difosfato de geranilo para -3-careno (HOELSCHER et al., 2002).

1.7 Atividade biológica comuns em óleos essenciais

Os óleos essenciais e seus extratos têm ganhado cada vez mais espaço nas

indústrias de alimentos, cosméticos e fármacos, devido seus efeitos não causarem

efeitos colaterais, aceitação pelos consumidores e seu uso para diversas aplicações

(RIAHI et al., 2013). Especificamente, os óleos essenciais são usados na medicina

humana como anticâncer, anticonceptivo, antiflogístico, antimicrobiano e por suas

propriedades antioxidantes (BUCHBAUER, 2010).

28

Dictamnus angustifolius (Rutaceae), conhecida como um forte cheiro de erva

perene, nativa da província de Xinjang na China, tem sido utilizada na medicina

popular. Ela é utilizada nos processos de reumatismo, sangramento, coceira,

icterícia, hepatite e doenças dermatológicas (AKHMEDZHANOVA et. al., 1978; HU

et al., 1989; SUN et al., 2013). Além de suas propriedades antinflamatória e como

desintoxicante. Algumas pesquisas revelam que extratos metanólicos de Dictamnus

angustifolius possuem atividade antiplaquetária e relaxamento vascular (WU et al.,

1999).

Do primeiro estudo da caracterização química e biológica do óleo essencial

de Dictamnus angustifolius, concluíram que o óleo essencial possui atividade

antioxidante e atividade antimicrobiana (SUN et al., 2015).

Uma aplicação importante dos óleos essenciais são suas propriedades

citotóxicas, não somente contra patógenos, como também para a conservação de

diversos produtos. Óleos essenciais e seus componentes são terapêuticos contra

diversos microorganismos, como bactérias (HOLLEY; DAVAL, 2005; BASILE et al.,

2006, SHELZ et al., 2006; BASER et al., 2006), vírus (DUSCHATZKY et al., 2005),

fungos (HAMMER et al., 2002; SOYLU et al., 2006), protozoários (MONZOTE et al.,

2006), ácaros (RIM; JEE et al., 2006), larvas (MORAIS et al., 2006), vermes e

insetos (LIU et al., 2006; CHENG et al., 2007) e moluscos (LAHLOU;BERRADA,

2001).

Com relação às aplicações medicinais, SYLVESTRE et al., 2005,2006

relataram que o óleo essencial de Myrica gale tem atividade anticâncer no cólon e

pulmão. Segundo YOO et. al., 2005, o eugenol do óleo essencial de Eugenia

Caryophyllata inibe a proliferação de células cancerígenas, e geraniol inibe células

do câncer de cólon. CARNESECCHI et al., 2004 também demonstrou a atividade do

geraniol contra câncer de cólon e além disso ele mostrou que o geraniol inibe a

síntese do DNA. MAZIÈRES et al., 2003,2004 mostraram que o farnesil e granil-

geranil evitam a formação de tumores, devido à modificação genética de células

cancerígenas.

Cernes de Criptoméria japônica, Cunninghamia lanceolata, Cryptomerioides

Taiwania e Calocedrusformosana foram plantas em que seus óleos essências foram

avaliados com atividade inseticida. A atividade larvicida do óleo essencial de Hyptis

29

fruticosa, Hyptis pectinata e Lippia Gracillis foi demonstrada (SILVA et al., 2008).

1.8 Modificação Estrutural dos Monoterpenos de aroeira - Reatividade de

Alcenos

Como todos os compostos dessa classe, os monoterpenos de aroeira

possuem em sua estrutura química o grupo funcional alceno, ou seja, são

hidrocarbonetos contendo ao menos uma ligação dupla carbono-carbono. Por causa

desta ligação pí, um alceno possui menos hidrogênios que um alcano com o mesmo

número de carbonos, sendo designado como insaturado. Esta insaturação fornece a

estas espécies uma reatividade especial, onde irão atuar majoritariamente como

nucleófilos nas chamadas reações de adição eletrofílica(Esquema 3) onde diversos

eletrófilos podem ser utilizados (SOLOMONS, 2009). Tais reações irão fornecer

estruturas bastante diversificadas e podem ser envisionadas para funcionalização

dos monoterpenos obtidos a partir do óleo essencial da aroeira e dentre estas

possíveis transformações temos: adição de HX, hidratação, adição de X2,

dihidroxilação e epoxidação.

Esquema 3: Exemplos de reações clássicas dos alcenos

Fonte: Autor, 2015

Em especial alguns compostos contendo epóxidos (Figura 4), são medicamentos

aprovados e possuem atividade antifúngica e antibacteriana, ademais epóxidos de

terpenos foram identificados como constituintes de hormônios de insetos e

30

feromônios (WATANABE et al., 2004; SERRA; FUNGATI, 2006). Devido a sua

importância, as reações de epoxidação serão discutidas mais detalhadamente no

próximo tópico. A ligação dupla carbono-carbono é rica em elétrons e pode doar um

par de elétrons para um eletrófilo (ácido de Lewis) (SOLOMONS, 2009).

Figura 4- Compostos com atividade biológica contendo epóxido na estrutura

Fonte :Autor,2015

Reações de epoxidação

A epoxidação de alcenos é bastante estudada na literatura e pode ocorrer

com a uitlização de diversos reagentes, sendo os mais comuns os oxidantes de

peróxidos e seus derivados. Dentre eles, o peróxido de hidrogênio, por ter maior

disponibilidade comercial, além de ser economicamente mais viável é o composto

mais utilizado nestas reações. Contudo, este é um reagente de epoxidação

nucleofílica e precisa de grupos fortemente retiradores de elétrons na estrutura do

alceno para que reaja de maneira satisfatória (GOTOR et al., 1988). Para suprir este

problema os reagentes do tipo perácidos, ou seja, ácidos carboxílicos que possuem

um grupo peróxido (-OOH) vêm sendo bastante utilizados (WOITISKI et al., 2004),

em especial, o ácido meta-cloroperbenzóico (mCPBA) (Figura 5) é um dos

compostos mais utilizados na síntese de epóxidos devido a sua maior estabilidade e

eletrofilicidade.

Figura 5- Estrutura química do mCPBA

Fonte: Bisol, 2011

A reação de epoxidação com mCPBA ocorre através de um mecanismo

concertado (Esquema 4), ou seja, a ligação dupla é quebrada ao mesmo tempo em

31

que a ligação C-O do epóxido é formada (BISOL, 2011), formando epóxidos com

estereoquímica relativa sin.

Esquema 4- Mecanismo de epoxidação de alcenos

Fonte: Bisol, 2011

1.9 Reações de epoxidação com monoterpenos

Reações de epoxidação com monoterpenos obtidos de produtos naturais

utilizando peróxido de hidrogênio como oxidante na presença de catalisadores

metálicos são bastante descritas na literatura (RUDLER et al., 1998, FERREIRA

et al., 2011, CAPAPÉ et al., 2008, FERREIRA et al., 2001; KUHN et al., 1999,

ROMÃO et al., 1997, NABAVIZADEH 2005; WINBERG, 1978, OLIVEIRA et al.,

2009). Em todos os exemplos o maior problema associado é sempre a baixa

seletividade da reação, sendo observada a formação de diversos produtos de

epoxidação e/ou oxidação. Por exemplo, na epoxidação do limoneno é

frequentemente relatada a produção de uma mistura contendo: óxido de 1-2

limoneno, dióxido dipentano, entre outros produtos secundários como o óxido de

limoneno e os dióis correspondentes dos epóxidos formados (Figura 6).

Figura 6- Possibilidades de produtos da epoxidação do limoneno

Fonte:MICHEL, 2012.

32

2 MYRACRODRUON URUNDEUVA

Myracrodruon urundeuva (Figura 7) é uma planta medicinal da família

Anacardiaceae, conhecida popularmente como aroeira, aroeira do sertão ou

araroeira. É limitada à América do Sul e no Brasil é encontrada mais comumente no

semi-árido nordestino, na vegetação da caatinga e do cerrado. É uma planta

caducifólia, heliófita e seletivamente xerófila. É uma árvore de grande porte,

chegando a medir mais de 6,5 m de altura (LORENZI; MATOS, 2002). Segundo

SOUZA e colaboradores (2007) a casca do seu caule tem uso ginecológico

difundido, em especial como medicação pós-parto, devido às propriedades

analgésicas e anti-inflamatória desta planta medicinal. Já SCHOFIELD; PELL, 2001,

afirmam que a presença de taninos protege a planta de sua degradação natural e as

chalconas diméricas contribuem para sua aplicação medicinal.

Figura 7- Fotografia de aroeira do sertão em seu habitat natural na localidade de Araruna-PB

Fonte: Autor, 2015

Antioxidantes naturais, encontrados na aroeira, como fenóis, flavonóides e

taninos estão sendo pesquisados em ciências médicas, devido a sua eficácia na

redução de danos oxidativos causado por radicais livres, que podem ocasionar

lesões no DNA, câncer, envelhecimento e inflamações (GUPTA; CHARMA, 2006).

33

Compostos fenólicos são metabólitos secundários eficazes na defesa da

planta contra predadores, atração de polinizadores e proteção contra raios UV

(BRAVO, 1998; PARR; BOLWEEL, 2000). Esses compostos são constituídos de

fenóis na sua estrutura básica, sendo diferente dos taninos, que compreendem

diversas classes (KING; YOUNG, 1999).

Pela primeira vez foi demonstrado por Calou et al., 2014 que Myracrodruon

Urundeuva tem propriedades neuroprotetoras, devido a conter as frações de

chalconas pertencente à classe dos flavonóides na casca do seu caule, que são

encontrados em diversas plantas (JÚNIOR; OLIVEIRA; MAIA et al., 2009). A fração

de chalcona isolada de Myracrodruon Urundeuva mostrou-se eficaz na doença de

Parkinson em testes com ratos, através da morte celular neuronal de 6-OHDA

(Figura 8) que foi induzida nas células dos ratos. O 6-OHDA foi o primeiro

dopaminérgico descoberto e empregue amplamente em modelos in vivo e in vitro.

Ele age induzindo a neurotoxicidade, sendo seletivo para estas células (LUTHMAN

et al., 1989, HERNANDÉZ et al., 2004).

Figura 8- Dopaminérgico 6-Hidróxidopamina

Fonte: Autor, 2015

Em um estudo feito para regredir a proliferação do mosquito da dengue (A.

aegypti), lectinas foram avaliadas como substâncias biodegradáveis (COELHO et al.

2009, SÁ et al 2009). Com o aumento de pessoas infectadas com o vírus da dengue,

é necessário fazer cessar a reprodução do mosquito, com inseticidas adequadas ao

ambiente (Organização mundial de saúde 2009). Segundo SÁ et al., 2008, lectinas

isoladas do cerne e casca de M. urundeuva demostram atividades inseticidas.

Muitas plantas são constituídas de lectinas, que são proteínas hemaglutinantes

(SANTOS et al., 2005). CHENG et al., 2003 demonstra que os óleos essenciais de

plantas são avaliados para uma possível aplicação inseticida.

34

Segundo MENEZES (1986), extratos hidroalcoólicos da casca do caule de M.

urundeuva são eficazes em tratamentos anti-inflamatórios, por inflamações agudas e

semi-agudas. Os extratos hidroalcoólicos também são eficientes na proteção

hepática, úlcera e diarréia (MORAIS et al., 1999). Chalconas e hidrochalconas

isoladas de Myracrodruon Urundeuva pertencente à classe dos flavonoides

revelaram atividades antioxidantes eficientes no tratamento de hematomas,

sangramentos e hemorragias nasais, mostraram-se eficazes também no

sangramento menstrual anormal, efeito anti-inflamatório devido à ação dos

flavonóides, que agem impedindo a ação de enzimas que promovem alguns

sintomas como dores de cabeça, erupções cutâneas e dores nas articulações

(ZUANAZZI, 1999).

35

3 OBJETIVOS

O objetivo central do presente trabalho consiste na caracterização química dos

oléos essenciais de dois espécimens de Myracrodruon urundeuva coletada em

Araruna-PB e realização de testes antimicrobianos.

Testar metodologia para modificação estrutural de monoterpenos.

3.1 Objetivos específicos:

Extração do óleo essencial de M. urundeuva por hidrodestilação.

Caracterização do óleo essencial por CG/EM.

Caracterização do quimiotipocis--Ocimeno por RMN 1H.

Liofilização do chá da aroeira.

Preparação de derivados monoterpênicos via reação de epoxidação com o

reagente quimiotipo cis--Ocimeno.

Testes antimicrobianos com as bactérias Eschecheria coli e Staphylococus

aureus

36

4 EXPERIMENTAL

4.1 Material botânico

As folhas frescas de Myracrodruon Urundeuva foram coletadas,no estado da

Paraíba, mais precisamente na localidade de Araruna no parque Estadual da Pedra

da Boca. A identificação foi realizada por comparação com a exsicata (No. 48904)

depositada no Herbário Prisco Bezerra(EAC) do Departamento de Biologia da

Universidade Federal do Ceará, Fortaleza , Ceará,Brasil.

4.2 Extração do óleo essencial de Aroeira

O método de extração utilizado neste trabalho foi a Hidrodestilação. Foram

realizadas 3 extrações das folhas frescas de aroeira (Myracrodruon Urundeuva), a

primeira contendo 200 g, a segunda 300 g e a terceira 400 g. A cada extração as

folhas foram adicionadas em um balão de destilação com a adição de 1 L de água

destilada e aquecido em uma manta, as folhas ficaram completamente mergulhadas

na água. Em seguida, o balão foi acoplado ao aparelho tipo Clevenger modificado

por Gottlieb (Figura 9) (GOTTLIEB; MAGALHÃES, 1960). A extração ocorreu

durante 2 horas após a água entrar em ebulição. Ao final da extração o óleo foi

coletado com uma pipeta e tratado com clorofórmio (CHCl3). Para purificar o óleo de

resíduos de água, foi adicionado o sulfato de sódio anidro (Na2SO4), um agente

dessecante, e depois ocorreu a filtração com algodão e uma micropipeta. O óleo foi

armazenado na geladeira, e posteriormente analisado pela técnica de cromatografia

gasosa acoplada à espectroscopia de massa (CG/EM) para identificação e

quantificação dos constituintes.

Figura 9- Aparelho de Clevenger com o óleo essencial obtido

Fonte: Autor, 2015

37

4.3 Reação de epoxidação do óleo essencial quimiotipo cis--ocimeno com

mCPBA

Inicialmente foi feito o teste de reação, com a metodologia descrita (Figura

10) por MAJETICK, 2003.

Figura 10- Condições experimentais de epoxidação do cis--ocimeno

Fonte: MAJETICK, 2003

Em um balão de fundo redondo foram adicionados cis--ocimeno (0,2 mmol,

27 mg) e CH2Cl2 (2 mL). A esta solução foi adicionada o mCPBA (0,3 mmol, 56 mg,

1,5 equiv). A reação foi mantida sob agitação à 0ºC (banho de gelo) por 5 minutos.

Após este tempo, foi feita uma análise por CCD, usando como eluente

hexano/acetato de etila (3:1). A análise de CCD mostrou que não houve consumo do

material de partida e a reação foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada

por 1 h. Novamente, a análise de CCD revelou que o cis--ocimeno não reagiu. Para

forçar a reação a ocorrer, foi adicionado m-CPBA (0,3 mmol, 56 mg, 1,5 equiv.) e

após 1 h foi, enfim, constatado que houve consumo do reagente, evidenciando a

necessidade do uso de mCPBA em grande excesso.

Baseado nestes resultados, uma nova reação de epoxidação foi realizada, em

uma escala maior e com 3 equivalentes de m-CPBA.

Em um balão de fundo redondo foram adicionados cis--ocimeno (2 mmol,

272 mg) e CH2Cl2 (40 mL). A esta solução foi adicionada o m-CPBA (6 mmol, 1,7 g,

3,0 equiv). A reação foi mantida por agitação por 1 hora e o material de partida foi

totalmente consumido como evidenciado por análise de CCD. A reação foi

transferida para um funil de separação, onde foram adicionados 20 ml de H2O e 10

ml de CH2Cl2, as fases orgânicas foi separada e a fase aquosa extraída com CH2Cl2

novamente. A fase aquosa foi descartada. As fases orgânicas combinadas foram

38

secas (Na2SO4), filtradas (filtração simples com papel de filtro e funil de vidro) e o

solvente evaporado no rota evaporador. O produto bruto, obtido como um sólido

branco foi coletado com uma espátula e armazenado em recipiente adequado para

posteriormente passar por testes antimicrobianos e caracterização química.

4.4 Análise do óleo essencial, análise produto de reação de epoxidação do cis-

-ocimeno por CG/EM eanálise do cis--ocimeno por RMN 1H

Os óleos essenciais foram submetidos a análises qualitativas por

Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Cromatografia Gasosa acoplada a

Espectrometria de Massa (CG-EM), e análises quantitativas por Cromatografia

Gasosa com Detector de Ionização de Chama (CG-DIC).

As análises foram realizadas em CG-EM da marca Shimadzu, modelo GCMS-

QP2010 Plus. As análises foram realizadas em coluna capilar RTx-5 (30 m x 0,25

mm e espessura de filme 0,25µm), sendo utilizado hélio (He) como gás de arraste,

em fluxo de 1,0 mL/min. A injeção em modo splitless foi realizada com injetor a 220

ºC. A temperatura da fonte de íons e da interface foi de 240 ºC. O forno foi

programado para uma temperatura de 60 ºC, com posterior incremento de 3 ºC/min

até 240 ºC.

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Próton (RMN 1H) foram

obtidos em espectrômetros Bruker, modelo Avance DRX-500, foram aplicadas

frequências de 300 MHz.

A quantificação dos constituintes dos óleos essenciais foi realizada em

cromatógrafo gasoso da marca Shimadzu, modelo GC-2010-FID. As análises foram

realizadas em coluna capilar RTx-5 (30 m x 0,25 mm e espessura de filme 0,25 µm),

sendo utilizado hidrogênio (H) como gás de arraste, em fluxo de 1,0 mL/min. A

injeção em modo splitless foi realizada com injetor a 200 ºC. A temperatura do

detector foi de 230 ºC e o forno foi programado para uma temperatura de 60 ºC, com

posterior incremento de 3 ºC/min até 240 ºC.

39

4.5 Purificação da reação de epoxidação do cis--ocimeno

Devido a utilização do mCPBA em excesso, o reagente ficou misturado com o

produto, impedindo assim a caracterização, sendo necessário uma purificação por

cromatografia em coluna, utilizando uma sephadex LH-20, com eluente metanol. As

frações foram coletadas e colocadas no banho de areia com aquecimento de 100ºC

durante 24 horas para a secagem do solvente. Foram analisadas 3 frações por CCD,

utilizando como eluente o hexano/acetato de etila na proporção 3:1.

4.6 Testes antimicrobianos com as bactérias Eschecheria coli e

Sthaphylococus aureus do óleo essencial de aroeira, cis--ocimeno, chá

liofilizado da aroeira e do produto de reação de epoxidação do cis--ocimeno

Os testes microbiológicos foram realizados no laboratório de ensaios

Imunológicos, Antimicrobianos, e de Citoxicidade/ DMP/CB/UFRN. As amostras

foram codificadas em 1- Liofilizado (chá das folhas de M. urundeuva) – 94mg/ml, 2-

Ocimeno (óleo M. urundeuva) – 822mg/ml, 3-Óleo de M. urundeuva – 208mg/ml, 4-

Epoxi (produto de reação de epoxidação do ocimeno) – 22mg/ml. As amostras foram

testadas com as bactérias Eschecheria coli ATCC 25922 – Bactéria Gram-negativa

e Staphylococcus aureus ATCC 25923 – Bactéria Gram-positiva. A metodologia

utilizada para a obtenção da concentração Inibitória mínima (CIM) foi o teste de

microdiluição em caldo- Mueller hinton (MH), 2X concentrado e para a obtenção da

concentração bactericida mínima (CBM) foi utilizado o método de semeio em spot

em ágar BHI. Em todos os testes a metodologia utilizada foi realizada em triplicata.

O solvente utilizado para diluir as amostras foi o DMSO.

40

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

Os constituintes voláteis das folhas de dois espécimens de M. urundeuva

foram analisados. Os óleos essenciais foram obtidos por hidrodestilação em

aparelho doseador do tipo Clevenger, modificado por Gottlieb (GOTTLIEB;

MAGALHÃES, 1960). O rendimento do óleo foi calculado de acordo com a

Farmacopeia brasileira (1988). A análise qualitativa dos seus constituintes químicos

foi realizada por cromatografia gás-líquido acoplada a espectrometria de massas

(CG/EM) e RMN. A identificação dos compostos presentes nestes óleos foi realizada

pela análise de seus espectros de massas, comparação com dados de espectroteca

padrão (banco de dados), combinada com os tempos de retenção e os índices de

Kovats (ADAMS, 2001; CRAVEIRO et al., 1984).

5.1 Rendimento do óleo essencial

De acordo com a Farmacopeia brasileira, o rendimento de um óleo essencial

é calculado em % volume/massa, ou seja, volume (ml) do óleo por massa (g) do

material vegetal seco. Foram realizadas 3 extrações, a 1ª e a 2ª de um espécime e a

3ª de outro indivíduo (Tabela 1).

Tabela 1: Rendimento do óleo essencial de M. urundeuva

Extração Massa de folha Volume de óleo Rendimento

1ª (OEA1) 200 g 0,3 ml 0,15 %

2ª (OEA2) 300 g 0,5 ml 0,16 %

3ª (OEA3) 400 g 1,0 ml 0,25 %

Fonte: Autor, 2015

Na 1ª e 2ª extração o rendimento do óleo essencial manteve-se quase

constante, aumentando o rendimento apenas na 3ª extração.

5.2 Caracterização química do óleo essencial da aroeira

Comparando-se a constituição dos óleos essenciais das folhas de M.

urundeuva citadas na literatura, observa-se que os óleos têm composição química

semelhante a maioria dos relatos, principalmente quanto a composição majoritária, o

constituinte -3-careno.

41

A composição química minoritária foi determinada pela análise de CG/EM, na

qual os cromatogramas indicam os diferentes constituintes do óleo essencial da

aroeira e cada pico representa um constituinte diferente, tendo assim para cada um

tempo de retenção associado. Através da comparação com o banco de dados

NIST08s.LIB o constituinte é identificado. Abaixo estão apresentados nas Figuras 12

a 34, os espectros de massa, para cada constituinte volátil pertencente às amostras

analisada, assim como a estrutura química correspondente.

Figura 11- Cromatograma CG/EM de OEAS1

42

Tabela 2-Composição do óleo essencial OAS-1

CONSTITUINTES TEOR NO ÓLEO

(%)

TEMPO DE RETENÇÃO

(MIN)

-3-Careno 51.91 10.161

(2E) -3,4,4-Trimetil-5-oxo-2-

Ácido hexanóico 10,13 23,925

5-Isopropenil-2-metil-7-

oxabiciclo[4.1.0] heptano-2-

ol

12,00 24,690

2-Metilisoborneol 4,79 26,435


(+) - Ledene 3,38 27,190

Globulol 8,11 29,890

100

Figura 12- Espectro de massa do constituinte -3-careno

43

Figura 13- Espectro de massa do constituinte (2E) -3,4,4-Trimetil-5-oxo-2-Ácido-hexenóico

Figura 14- Espectro de massa do constituinte 5-isoprenil-2-metil-7-oxabiciclo[4.1.0] heptano-2-ol

Figura 15- Espectro de massa do constituinte 2-metilisoborneol

44

Figura 16- Espectro de massa do constituinte (+) - Ledene

Figura 17- Espectro de massa do constituinte Globulol

45

Tabela 3- Composição do óleo essencial AOS-2

CONSTITUINTES TEOR NO ÓLEO (%) TEMPO DE

RETENÇÃO (MIN)

-3-Careno 54,43 10.164

5,7, octadieno-3-

ol,2,4,4,7-Tetrametil, (E) 11,42 24,015

(2E) -3,4,4-Trimetil-5-

oxo-2-Ácido hexanóico 13,40 24,786

2-Bornanol,2-metil 6,13 26,524

3- (2-Hidroxi-2-

metil-propil) -ciclohex-2-

enona

4,96

26,560


100

46


Figura 19- Espectro de massa do constituinte 3-careno

47

Figura 20- Espectro de massa do constituinte 5,7, octadieno-3-ol,2,4,4,7-Tetrametil-, (E)

Figura 21- Espectro de massa do constituinte (2E) -3,4,4-Trimetil-5-oxo-2-Ácido-hexenóico

Figura 22- Espectro de massa do 2-Bornanol-2-metil

48

Figura 23- Espectro de massa do constituinte 3- (2-Hidroxi-2-metil-propil) -ciclohex-2-enona

Figura 24- Espectro de massa do constituinte 2-metilisoborneol

49

Tabela 4-Composição do óleo essencial OAS-3

CONSTITUINTES TEOR NO ÓLEO

(%)

TEMPO DE RETENÇÃO

(MIN)

-3-Careno 43,56 10.151

P-cimeno-8-ol 8,24 16,447

P-cimeno-8-ol 6,29 16,591

5-Isopropenil-2-metil-7-

oxabiciclo[4.1.0] heptano-2-ol 9,38 16,721

4,7-

Metanobenzofurano, 2,2-

oxibis[octahidro-7,8,8- trimetil

3,91 20,933

-Limoneno diepóxido 15,25 26,570

Globulol 6,98 30,021

2,7,10,15,19,23-Hexametil-

tetracosa-2,10,14,28,22-

pentaeno-6,7-diol

3,41 36,154

4,4,8-

Trimetiltriciclo[6.3.1.0(15) ]

dodecano-2,9-diol

2,97 37,189

100

50


Figura 26- Espectro de massa do constituinte-3-careno

51

Figura 27- Espectro de massa do constituinte p-cimeno-8-ol

Figura 28- Espectro de massa do constituinte p-cimeno-8-ol

Figura 29- Espectro de massa do constituinte 5-isoprenil-2-metil-7-oxabiciclo [4.1.0] heptan-2-ol

52

Figura 30- Espectro de massa do constituinte 4,7-Metanobenzofurano,2,2´-oxibis [octahidro- 7,8,8- trimetil]

Figura 31- Espectro de massa do constituinte -Limoneno diepóxido

Figura 32- Espectro de massa do constituinte Globulol

53

Figura 33-Espectro de massa do constituinte 2,7,10,15,19,23- Hexametil-tetracosa-2,10,14,18,22-pentaeno-

6,7-diol

Figura 34- Espectro de massa do constituinte [6.3.1.0(15) ] dodecano-2,9-diol

De acordo com as análises cromatográficas do óleo essencial de aroeira, o

constituinte majoritário é o monoterpeno -3careno, que de acordo com pesquisas

anteriores, é um dos constituintes majoritários do óleo essencial da aroeira. Os

outros monoterpenos constituintes apresentaram-se em menor proporção como o 5-

Isopropenil-2-metil-7-oxabiciclo[4.1.0] heptano-2-ol que é um álcool monoterpênico;

e o alfa-limoneno-diepóxido, um monoterpeno epoxidado. Depois dos

monoterpenos, os constituintes mais presentes nos óleos essências são os

sesquiterpenos, que foram identificados na análise como o (+) – Ledene, um

monoterpeno constituído de apenas carbono e hidrogênio e o Globulol, um álcool

sesquiterpênico, o 4,4,8-Trimetiltriciclo[6.3.1.0(15) ]dodecano-2,9-diol, um álcool

sesquiterpênico, o 2,7,10,15,19,23-Hexametil-tetracosa-2,10,14,28,22-pentaeno-6,7-

54

diol, o único álcool triterpênico.

Os constituintes não terpênicos foram o 2-metilisoborneol, um álcool bicíclico

derivado de borneol; o (2E) -3,4,4-Trimetil-5-oxo-2-Ácido hexanóico, um ácido

carboxílico; 2-Bornanol,2-metil, derivado do borneol; 3- (2-Hidroxy-2-metil-propil) -

ciclohex-2-enona, uma cetona; p-cimeno-8-ol, um álcool aromático.

Conclui-se que os constituintes presentes na extração em triplicata do óleo

essencial de aroeira são os monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, álcoois,

ácido carboxílico e cetonas. Embora a classe de fenilpropanóides constituírem os

óleos voláteis, não foram identificados no óleo essencial da aroeira.

5.3 Reação de derivatização do cis--ocimeno

O cis--ocimeno utilizado para derivatização foi extraído anteriormente de um

espécimen de M. urundeuva, coletada no jardim botânico de Porto Alegre (Rio

Grande do Sul). Este constituinte foi selecionado inicialmente para o teste de

reatividade em reações de epoxidação, devido sua estrutura ser simples e de fácil

obtenção.

5.3.1- Caracterização do material de partida cis--ocimeno por RMN 1H

Foi realizada a análise por RMN 1H para verificar o grau de pureza do

reagente. O espectro de RMN 1H (Figura 36) do cis--ocimeno (300 MHz, CDCl3)

(Figura 35), apresentou sinais característicos de esqueleto terpênico poli-insaturado,

compatível com derivado de geranila, devido aos sinais de hidrogênios olefínicos em

δ 5,12 (H3, t, J = 6,9 Hz), 5,36 (H5, t, J = 7,0 Hz) e 6,81 (H1, d-d, J = 16,0 e 10,5 Hz)

e de hidrogênios vinílicos diastereotópicos em δ 5,12 (H6, d, J = 10,0 Hz) e 5,22 (H6,

d, J = 16,0 Hz). Foram observados também os sinais referentes aos hidrogênios

metilênicos em δ 2,86(H4, t, J = 7,0 Hz) e as três metilas em δ 1,83 (H8, s),1,71 (H10,

s), e 1,65 (H9, s).

Além da estrutura molecular, a estereoquímica dos componentes dos óleos

essenciais determina, notavelmente, o tipo de resposta olfativa provocada pelos

compostos. Os isômeros geométricos cis/trans são em muitos casos prontamente

distinguidos tanto no que se refere à qualidade quanto à intensidade do odor

(ROBBERS et al.,1997). A diferença entre o trans e cis--ocimeno é observada pela

55

diferença no deslocamento químico de H-1, que é 6,39 e 6,82, respectivamente, este

dado também pode ser observado no espectro a seguir, que contem cis--ocimeno

como constituinte majoritário e trans como impureza.

Figura 35- Estrutura química do cis--ocimeno

Fonte: Autor, 2015

Figura36- Espectro de RMN 1H do cis--Ocimeno (CDCl3, 300 MHz)

1

2

3

4

5

6

78 9

10

- ocimeno

56

5.4 Caracterização do produto de reação de epoxidição do cis--ocimeno por

CG/EM

A análise do produto reacional foi realizada por cromatografia gás-líquido

acoplada a espectrometria de massas (CG/EM), que indicou a formação do

composto 4- (3,3-dimetiloxiran-2-il) -2- (oxiran-2-il) butan-2-ol (Figura 37), do ácido

para clorobenzóico, que é um subproduto clássico desta reação e outro produto não

elucidado.

Figura 37- Formação do produto 4- (3,3-dimetiloxiran-2-il) -2- (oxiran-2-il) butan-2-ol

O O

OHmCPBA (exc.)

Fonte: Autor, 2015

Figura 38-Cromatograma da reação de epoxidação do cis--ocimeno

57

Figura 39- Espectro do constituinte 4- (3,3-dimetiloxiran-2-il) -2- (oxiran-2-il) butan-2-ol

Figura 40- Espectro do constituinte não elucidado da reação de epoxidação do cis--ocimeno

5.5 Testes antimicrobianos com as bactérias Sthaphylococus aureus e

Eschecheria coli do óleo essencial de aroeira, cis--ocimeno, chá liofilizado da

aroeira e do produto de reação de epoxidação do cis--ocimeno

O extrato aquoso liofilizado das folhas (A), o óleo essencial quimiotipo cis--

ocimeno (B), o óleo de essencial quimiotipo -3-careno (C) e o produto de reação de

epoxidação (D), obtidas de M. urundeuva, foram investigadas acerca de suas

atividades microbiológicas sobre as bactérias Eschecheria coli ATCC 25922

(Gram-negativa) e Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Gram-positiva) (Tabela

5). Os resultados de CI50 demonstraram que para S. aureus, o extrato liofilizado das

folhas de M. urundeuva (A) teve apenas efeito bacteriostático, ou seja, apenas inibiu

58

a bactéria, no entanto não teve ação bactericida. O óleo essencial quimiotipo -

ocimeno (B), matou a bactéria (bactericida) até a conc. de 0,8 mg/ml. No entanto,

em 0,4 mg/ml, a amostra tem um efeito apenas de inibição (bacteriostático). O óleo

de essencial quimiotipo -3-careno (C) na concentração testada (104mg/ml), tanto

inibiu quanto matou a bactéria. O produto de reação de epoxidação do óleo de M.

urundeuva (D) tanto inibiu, quanto matou a bactéria apenas na concentração

máxima de 22mg/ml.

Já para E. coli o extrato liofilizado das folhas de M. urundeuva (A) também

apresentou apenas efeito bacteriostático e não teve ação bactericida. O óleo

essencial quimiotipo -ocimeno (B), teve ação bactericida até a concentração de

102,7 mg/mL e ação bacteriostática em 51,3 mg/ml. O óleo de essencial quimiotipo

-3-careno (C) na concentração testada (104mg/ml), tanto inibiu quanto matou a

bactéria. O produto de reação de epoxidação do óleo de M. urundeuva (D)

apresentou apenas ação bacteriostática na concentração de 11 mg/ml.

Tabela 5- Resultados de IC50 em testes microbiológicos

Código da fração

Testada

Linhagens de células (IC50 mg/mL)

Staphylococcus

aureus

Eschecheria coli

A 1,46 23,5

B 0,4 51,3

C 104,0 104,0

D 22,0 11,0

Fonte: Autor, 2015

59

6 CONCLUSÃO

O estudo fitoquímico das folhas de dois espécimes deM. urundeuva permitiu a

obtenção dos óleos essenciais e de um extrato aquoso. A composição química dos

óleos essenciais é constituída basicamente por monoterpenos e sesquiterpenos, e

apresenta um constituinte em maior proporção o monoterpeno -3-careno, sendo

este o quimiotipo mais comum na literartura, o que sugere, que o clima ameno da

região serrana de Araruna não é um fator determinante para a variação

intraespecífica dos constituintes voláteis de aroeira do sertão. As frações obtidas

foram submetidas a testes de atividade microbiológica frente as bactérias

Eschecheria coli e Staphylococcus aureus. O óleo apresentou efeito bacteriostático

e bactericida, mas o extrato liofilizado apresentou apenas efeito bacteriostático e não

teve ação bactericida, o que indica que os monoterpenos são os responsáveis pela

atividade microbiológica testada, já que eles não são encontrados em extratos

aquosos.

Uma amostra de óleo essencial quimiotipo cis--ocimeno foi submetida a

reação de epoxidação, rendendo um produto epoxidado, mas com baixo rendimento

na metodologia testada. Estas frações também foram testadas frente as bactérias E.

coli e S. aureus. O constituinte cis--ocimeno foi mais eficaz contra S. aureus do

que frente à E.coli. Já a amostra epoxidada foi mais eficaz visivelmente contra, a

amostra foi capaz de matar S. aureus na máxima concentração, e não foi capaz de

matar E. coli, que foi apenas inibida.

Este estudo mostrou-se bastante promissor em E. coli, uma vez que

apresentou CIM menor em relação à apresentada contra S. aureus. E instiga

também o desenvolvimento de novas metodologias de oxidação destes óleos, haja

vista que o composto epoxidado teve bons resultados de inibição bacteriana, e

podemos chegar numa metodologia eficaz para produção de compostos oxidados

puros, e em larga escala, para realização de novos testes biológicos.

60

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