outubro de 2013

Universidade do MinhoEscola de Engenharia

Marília Helena Fernandes Machado

Produção de coalho líquido de cardo para aplicação industrial

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Dissertação de Mestrado Mestrado integrado em Engenharia Biológica Ramo Tecnologia Química e Alimentar

Trabalho efetuado sob a orientação do Doutor João Monteiro Peixoto

outubro de 2013

Universidade do MinhoEscola de Engenharia

Marília Helena Fernandes Machado

Produção de coalho líquido de cardo para aplicação industrial

DECLARAÇÃO

Nome: Marília Helena Fernandes Machado

Endereço eletrónico: mariliahfm@hotmail.com

Número do cartão de cidadão: 13728357

Título da dissertação: Produção de coalho líquido de cardo para aplicação industrial

Orientador: Doutor João Monteiro Peixoto

Ano de conclusão: 2013

Designação do Mestrado: Mestrado Integrado em Engenharia Biológica, Ramo Tecnologia

Química e Alimentar

É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO, APENAS PARA EFEITOS DE

INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE

COMPROMETE.

Universidade do Minho, ___/___/____

______________________________________

(Marília Helena Fernandes Machado)

| i

Agradecimentos

Gostaria de expressar a minha gratidão a todas as pessoas que contribuíram para a

realização deste trabalho e para a conclusão de uma etapa importante e muito desejada na

minha vida.

Ao orientador, Professor João Peixoto, e ao supervisor na empresa, Rui Campos, por me

terem proporcionado sempre a liberdade de conduzir este projeto e as minhas escolhas estando,

no entanto, sempre disponíveis.

Ao Professor António Vicente pela disponibilidade e pela atenção que dedicou na

resolução de alguns problemas que foram surgindo.

À equipa de trabalho da BLC3, pelo acompanhamento e esforço ao longo destes seis

meses.

Aos meus amigos pelo apoio e pela partilha de bons momentos, em especial à minha

Pipa que me acompanha desde há muitos anos.

Agradeço às pessoas mais importantes na minha vida, os meus pais e aos meus

maninhos, a quem dedico esta dissertação. Obrigada por sempre me encorajarem e

possibilitarem este momento. Obrigada também aos meus avós e tios pelo carinho e pelos

conselhos.

A todos aqueles que direta e indiretamente marcaram a minha vida e contribuíram para

este momento, um muito Obrigada!

| iii

Sumário As proteases aspárticas (EC 3.4.23) são uma sub-subclasse de enzimas que se

encontram amplamente distribuídas na natureza. Estas enzimas desempenham um papel

importante na indústria dos laticínios, pois catalisam a coagulação do leite, podendo substituir os

coalhos de origem animal.

O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um coagulante de origem vegetal,

extraído da planta Cynara cardunculus e avaliar a sua eficácia na coagulação do leite. As flores

desta planta, comummente designadas por flor de cardo, possuem proteases aspárticas

responsáveis pela coagulação do leite. Ao longo de várias décadas, estas têm sido usadas na

produção artesanal dos queijos de ovelha da Serra da Estrela.

Neste trabalho, para promover a extração de proteínas rompeu-se as paredes celulares

da planta por congelamento e descongelamento lento e posterior maceração do extrato de flores

de C. cardunculus. O coagulante líquido foi obtido pela precipitação com solventes orgânicos

(acetona e etanol) variando a razão de extrato bruto:solvente (1:1, 1:2, 1:4 e 1:6).

Posteriormente, foi determinado o conteúdo de proteína, o poder coagulante e a

atividade coagulante e proteolítica de cada um dos coagulantes.

O conteúdo de proteína, determinado pelo método de Lowry, variou proporcionalmente

com a razão de extrato bruto:solvente, ou seja, quanto maior foi a razão de solvente utilizado

maior foi a proteína total quantificada. O coagulante obtido pela precipitação com etanol na

razão 1:6 foi o que apresentou uma quantidade de proteínas superior, com 4,468 g/L.

O coagulante obtido pela precipitação com etanol na razão 1:4, apresentou uma razão

entre a atividade coagulante e proteolítica (R= 60,3) superior a todos os outros, assim como

também apresentou um poder coagulante superior, de 1:1624 g/mL, isto é, 1 g deste extrato

enzimático vegetal é capaz de coagular 1,6 L de leite a uma temperatura de 30 °C em 40 min.

As constantes cinéticas de Michaelis-Menten (Km e Vmáx) foram determinadas pela

linearização de Lineweaver-Burk, com posterior ajuste ao modelo não linear. O coagulante obtido

pela precipitação com etanol na razão 1:4 apresentou um valor de Km maior (38 g/L) do que o

coalho obtido pela precipitação com acetona (18 g/L), o que indica uma maior afinidade deste

último em relação ao substrato.

O conjunto de resultados mencionados acima sugere que o coagulante obtido pela

precipitação com etanol na razão 1:4 apresenta um maior potencial para ser usado como

coagulante do leite.

| v

Abstract

The aspartic proteases (EC 3.4.23) are a sub-class of enzymes that are widely

distributed in nature. These enzymes play an important role in the dairy industry as they catalyze

the coagulation of milk and therefore constitute an alternative to animal curds.

The objectives of the current work were the development of a vegetable coagulant,

extracted from the Cynara cardunculus plant and the evaluation of its efficacy in milk coagulation.

The flowers of this plant, commonly denominated as cardo flower posses the aspartic proteases

responsible for milk coagulation. Throughout the decades, these flowers have been used in the

artisanal production of Serra da Estrela sheep cheese.

In this work, the extraction of the proteins was promoted by the rupture of the plant cell

walls through freezing and slow unfreezing followed by the maceration of the C. cardunculus

flower extract. The liquid coagulant was obtained by precipitation with organic solvents (acetone

and ethanol) varying the ratio of crude extract and solvent (1:1, 1:2, 1:4 e 1:6).

Afterwards the protein content, coagulant power and proteolytic and coagulant activity of

each coagulant was determined.

The protein content determined by the Lowry method varied proportionally to the ratio

crude extract and solvent, meaning that the higher the crude extract and solvent ratio used, the

higher protein was quantified. The coagulant obtained by ethanol precipitation with a ratio of 1:6

yield higher quantities of proteins with 4,468 g/L.

The coagulant obtained by precipitation with ethanol in a 1:4 ratio presented a superior

coagulant and proteolytic activity ratio (R= 60,3) as well as a superior coagulant power of 1:1624

g/mL, i.e. 1 gram of this enzymatic vegetable extract is capable of coagulating 1,6 L of milk at a

temperature of 30 °C in 40 min.

The kinetic constants of Michaelis-Menten (Km and Vmáx) were determined by the

linearization of Lineweaver-Burk followed by an adjustment to the non-linear model. The

coagulant obtained by ethanol precipitation with a ratio of 1:4 presented a higher Km value (38

g/L) than the curds obtained by acetone precipitation (18 g/L) which indicates a higher affinity of

the latter towards the substrate.

The set of results above mentionated suggests that the coagulant obtained by etanol

precipitation with a ratio of 1:4 presents higher potential to be used as a milk coagulante.

| vii

Índice

Sumário .................................................................................................................. iii

Abstract ................................................................................................................... v

Lista de figuras ....................................................................................................... ix

Lista de tabelas ....................................................................................................... xi

Lista de abreviaturas ............................................................................................. xiii

CAPÍTULO I – Contextualização e Apresentação do Projeto ..................................... 1

1.1. Introdução................................................................................................................. 3

1.2. Objetivos do Projeto................................................................................................... 5

1.3. Motivação ................................................................................................................. 6

CAPÍTULO II – Revisão Bibliográfica ........................................................................ 7

2.1. Cynara cardunculus L. ............................................................................................... 9

2.2. Enzimas .................................................................................................................. 10

2.2.1. Classificação de enzimas ................................................................................. 11

2.2.2. Cinética Enzimática ......................................................................................... 11

2.2.3. Proteases Aspárticas........................................................................................ 13

2.2.4. Proteases Aspárticas Vegetais .......................................................................... 14

2.2.5. Cardosinas ...................................................................................................... 15

2.2.6. Purificação de proteínas por precipitação com solventes orgânicos ................... 16

2.3. Coagulação Enzimática do Leite .............................................................................. 17

2.3.1. Estrutura da micela de caseína ........................................................................ 18

2.4. Enzimas coagulantes de origem vegetal. .................................................................. 19

CAPITULO III – Materiais e Métodos ...................................................................... 21

3.1. Origem dos extratos de Cynara cardunculus ............................................................ 23

3.2. Extração e Purificação das proteases aspárticas....................................................... 23

3.3. Determinação do conteúdo em proteínas ................................................................. 24

3.4. Determinação da atividade coagulante ..................................................................... 25

3.5. Determinação da atividade proteolitica ..................................................................... 25

3.6. Determinação do poder coagulante .......................................................................... 26

3.7. Caracterização cinética ............................................................................................ 26

CAPITULO IV – Resultados e Discussão .................................................................. 27

CAPÍTULO V – Conclusões ..................................................................................... 37

CAPÍTULO VI – Recomendações ............................................................................. 41

Referências Bibliográficas ..................................................................................... 45

Anexos ................................................................................................................... 51

| ix

Lista de figuras

Figura 1- Inflorescência de C.cardunculus. .............................................................................. 9

Figura 2- Aspecto do extrato de C.cardunculus aquando da sua recepção. ............................ 23

Figura 3- Coalhos obtidos por precipitação com acetona na razão 1:1, 1:2, 1:4 e 1:6 (da

esquerda para a direita) e ressuspensão em tampão citrato de sódio a pH 6. .......................... 29

Figura 4- a) Precipitado obtido para o sistema extrato bruto:etanol na razão 1:1, após 12 h em

repouso. b) Coalhos obtidos por precipitação com etanol na razão 1:2, 1:4 e 1:6 (da esquerda

para a direita) e ressuspensão em tampão citrato de sódio a pH 6. ......................................... 30

| xi

Lista de tabelas

Tabela 1- Nomenclatura e classificação de enzimas .............................................................. 11

Tabela 2- Concentração de proteínas dos coalhos líquidos obtidos pela precipitação com

acetona e etanol variando as razões de extrato bruto:solvente. ................................................ 31

Tabela 3- Atividades coagulante e proteolítica, razão entre as atividades (R) dos coalhos obtidos

pela precipitação com acetona, variando a razão de extratobruto:acetona. ............................... 32

Tabela 4- Atividades coagulante e proteolítica, razão entre as atividades (R) dos coalhos obtidos

pela precipitação com etanol, variando a razão de extratobruto:etanol. .................................... 33

Tabela 5- Resultados do poder coagulante dos coalhos líquidos de origem vegetal obtidos pela

precipitação com acetona e etanol variando as razões de extrato bruto:solvente. ..................... 34

Tabela 6- Parâmetros cinéticos (Km e Vmáx) determinados para os coalhos obtidos pela

precipitação com acetona na razão 1:6 e pela precipitação com etanol na razão 1:4. .............. 35

| xiii

Lista de abreviaturas

a.a. Aminoácido

Abs Absorvância

AC Atividade coagulante

Ala

Alanina

AP Atividade proteolítica

Asp Ácido aspártico

BSA Albumina sérica de bovino

CaCl2 Cloreto de cálcio

CuSO4. 5H2O Sulfato de cobre penta hidratado

DOP Denominação de Origem Protegida

E

Enzima

ES Complexo enzima substrato

Glu Glutamina

GMP Glicomacropeptido

Km Constante cinética de Michaelis-Menten

Leu Leucina

Na2CO3 Carbonato de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

P Produto

p Peso

PAs Proteases aspárticas

Phe Fenilalanina

S Substrato

t Tempo

TCA Trichloroacetic acid (ácido tricloroacético)

Tyr Tirosina

UAC Unidade de atividade coagulante

UAP

Unidade de atividade proteolitica

V Volume

Val Valina

Vmáx

Velocidade máxima de reacção

| 1

CAPÍTULO I – Contextualização e Apresentação

do Projeto

CAPÍTULO I – Contextualização e Apresentação do Projeto

| 3

1.1. Introdução

No processo de produção de queijo é necessária uma etapa de coagulação do leite, para

que ocorra a passagem do leite do estado líquido para estado sólido. Nesta etapa, ocorre a

desestabilização das caseínas do leite pela ação de enzimas proteolíticas coagulantes. Estas

enzimas são capazes de hidrolisar a cadeia de aminoácidos da κ-caseína, mais especificamente

a ligação peptídica existente entre as unidades 105 (fenilalanina) e 106 (metionina). Os dois

resíduos resultantes desta divisão são a para- κ-caseína, insolúvel, hidrofóbico, constituído pelos

aminoácidos 1-105 que permanece associada à micela de caseína e o resíduo

glicomacropeptido (GMP), solúvel, hidrofílico, constituído pelos aminoácidos 106-169. No

segundo passo, não enzimático, a estrutura micelar residual precipita na presença de cálcio,

formando o paracaseinato de cálcio. A coagulação, tem início quando cerca de 80 a 90 % da κ-

caseína for afetada, nesta fase as micelas de paracaseína começam a agregar (Almeida, 2006;

Alvarenga, 2008; Chitpinityol e Crabbe, 1997).

A renina é a enzima mais usada na produção de queijo, estando presente no coalho de

animais ruminantes. No entanto, a escassez de matéria-prima, alto preço e crescimento da

produção mundial de queijo, impulsionou a procura de substitutos de qualidade semelhante.

(Kumar et al., 2005; Nelson, 1975). Segundo Hashem (1999), um substituto adequado deve

apresentar atividade coagulante elevada e atividade proteolítica reduzida de forma a minimizar a

dissolução do coágulo.

Os substitutos de coalho presentes no mercado incluem, quimosinas produzidas por

fermentação, coagulantes fúngicos, extratos de plantas e coalhos de outros animais. Devido à

sua aplicação na indústria de laticínios, para coagulação do leite, diversos estudos tem sido

efetuados na pesquisa de proteases de origem microbiana (Cavalcanti et al., 2004; Hashem,

1999; Kumar et al., 2005), animal (Kumar et al., 2006) e de plantas (Ahmed et al., 2009;

Raposo, Domingos, 2008; Silva, Malcata, 2005).

A utilização das proteases de origem vegetal como coagulantes do leite tem despertado

interesse, uma vez que estas enzimas podem substituir o coalho de origem animal e a

quimosina recombinante, dado que a utilização destes produtos está a ser questionada pelas

entidades reguladoras da indústria dos laticínios de diversos países (Sousa, 2002).

Neste projeto irá ser desenvolvido um coagulante vegetal, extraído da espécie Cynara

cardunculus L., vulgarmente conhecida por flor de cardo, que é uma matéria-prima essencial à

indústria do queijo da serra da Estrela.

Esta planta cresce espontaneamente em Portugal Continental, na região centro e sul,

nos Arquipélagos da Madeira e das Canárias, podendo também ser encontrada nas zonas a Sul

e a Oeste da região Mediterrânica e no Norte de África (Silva, 2011; Abreu, 2009; Soares,

2008).

As flores desta planta podem ser usadas como coagulantes do leite, devido à atividade

proteolítica das suas enzimas constituintes, denominadas por cardosinas.

| 5

1.2. Objetivos do Projeto

Objetivo geral:

Desenvolver uma metodologia através do estabelecimento de determinadas condições

de processamento, de forma a obter um coagulante adequado para aplicação na produção de

queijo.

Este objetivo será concretizado através dos seguintes objetivos específicos:

- Extração das proteases aspárticas, responsáveis pela coagulação do leite, dos extratos de

Cynara cardunculus L.;

- Concentração do extrato enzimático pela precipitação com solventes orgânicos;

- Variação da razão de extrato enzimático:solventes;

- Determinação do conteúdo de proteínas, atividade coagulante e proteolítica e poder coagulante

do extrato enzimático de origem vegetal;

- Caracterização cinética do extrato enzimático.

1.3. Motivação

Este projeto foi atribuído pela Alva Solos, que se encontra integrada na BLC3 que é uma

Plataforma de Desenvolvimento da Região Interior Centro, que tem como missão desenvolver e

apoiar projetos empresariais de base tecnológica que se destaquem pela inovação e criatividade,

com o intuito de gerar emprego e valor para a região.

O desenvolvimento deste projeto possibilitou estabelecer condições ótimas de extração

das cardosinas, que conduziu por sua vez à obtenção de um produto de valor acrescentado, o

coalho líquido para queijos. Além disso, a Cynara cardunculus L. é uma espécie vegetal

característica desta zona, pelo que este projeto permitiu a valorização dos recursos da região.

De salientar ainda que o desenvolvimento de coagulantes líquidos vegetais tem elevada

importância, pois os queijos com denominação de origem protegida (DOP), como é o caso do

“Serra da Estrela”, apenas podem ser produzidos usando a Cynara cardunculus L. como agente

coagulante. Portanto, o desenvolvimento destes coagulantes permitirá a adaptação da produção

artesanal para uma produção semi-industrial, assim como poderá despertar o interesse de

produtores industriais neste tipo de coagulante.

Posto isto, considero que este projeto será uma mais valia para a região e o para o

mercado nacional, pois irá impulsionar a produção deste tipo de coalho.

| 7

CAPÍTULO II – Revisão Bibliográfica

CAPÍTULO II – Revisão Bibliográfica

| 9

2.1. Cynara cardunculus L.

A espécie Cynara cardunculus L, vulgarmente conhecida por flor de cardo (Figura 1),

classifica-se por pertencer à família Asteracea e género Cynara (Silva, 2011).

Esta planta é originária da região Mediterrânea e Norte de África, sendo já conhecida

pelos antigos Egípcios, Gregos e Romanos. Atualmente esta planta cresce espontaneamente em

Portugal Continental, na região centro e sul, nos Arquipélagos da Madeira e das Canárias,

podendo também ser encontrada nas zonas a Sul e a Oeste da região Mediterrânica e no Norte

de África (Silva, 2011; Abreu, 2009; Soares, 2008).

A C. cardunculus é uma planta herbácea perene com um caule erecto, podendo atingir

ciclos de metro e meio de altura, densamente coberto por folhas basais grandes e espinhosas.

Os caules terminam em inflorescências de capítulos globulosos de cor azul violeta, as folhas são

verdes na página superior e brancas na página inferior e muito largas. Quanto às raízes, estas

apresentam-se profundas e espessas, o que lhes permite uma boa extração de água e nutrientes

(Silva 2011, Abreu, 2009).

A flor de cardo desenvolve-se em condições muito severas, em solos pedrosos (bordos

da estrada), possuindo uma grande capacidade de adaptação climática. O ciclo desta planta tem

início com a germinação de sementes, no final do Verão aquando das primeiras chuvas, nos

meses seguintes as plantas desenvolvem-se formando uma roseta de folhas, e passando o

Inverno no estado vegetativo. A floração desta espécie é sazonal, entre os meses de Junho e

Julho (Silva, 2011).

Devido às suas características particulares esta planta é passível de ser utilizada para

diversos fins. Nomeadamente, as suas folhas podem ser consumidas cozidas ou utilizadas para

fins terapêuticos, em perturbações digestivas, redução do colesterol ou, mesmo, doenças de

Figura 1- Inflorescência de C.cardunculus.

fígado, assim como podem ser utilizadas no fabrico de bebidas amargas e licores. As folhas

contêm cianopicrina, taninos, ácidos orgânicos, vitamina A e compostos fenólicos.

Relativamente às flores, estas são tradicionalmente usadas como coagulante do leite

para produção de queijos, em particular aqueles que possuem Denominação de origem

protegida (DOP), devido à atividade proteolítica das enzimas constituintes, denominadas

proteases aspárticas. Estudos realizados confirmam que a maior concentração de substância

coagulante está presente na parte superior do estiolo, estando a atividade coagulante restrita ao

pistilo (Silva, 2011; Abreu, 2009, Soares, 2008; Valentão, 2002).

A utilização das proteases de origem vegetal como coagulantes do leite tem despertado

interesse, uma vez que estas enzimas podem substituir o coalho de origem bovina e a quimosina

recombinante, pois o uso destes produtos está a ser questionado pelas entidades reguladoras da

indústria dos laticínios de diversos países (Sousa, 2002).

Atualmente, esta planta pode também ser aplicada à produção de energia, eletricidade e

biodiesel (Silva, 2011).

2.2. Enzimas

As enzimas são proteínas com atividade catalítica, formadas por longas cadeias de

pequenas moléculas, designadas por aminoácidos, que estão unidos entre si por ligações

peptidícas, segundo um arranjo tridimensional. Estas ligações envolvem uma reação entre o

grupo amino (-NH2) de um a.a. e o grupo carboxilo (-COOH) de outro a.a. adjacente (Pinto,

2008).

Uma enzima pode apresentar diferentes conformações, devido à rotação dos

aminoácidos em torno das ligações covalentes simples. No entanto, apenas na conformação

nativa a enzima mantém o seu máximo potencial ativo, a sua atividade biológica (Pinto, 2008).

Dado que, existe um local na superfície das enzimas, designado por centro ativo, que

permite a ligação do substrato à enzima e o contato com o centro catalítico onde ocorre a

reação, pode-se dizer que estas são específicas para um ou vários substratos (Silva, 2011).

As enzimas são catalisadores, pois aceleraram a velocidade de uma reação reduzindo a

barreira de energia requerida para a transformação de um substrato num produto, sem alterar a

termodinâmica envolvida. Logo, quanto mais baixa for a energia de ativação a fornecer, mais

eficaz será o catalisador (Silva, 2011; Parkin, 2010).

| 11

2.2.1. Classificação de enzimas

A Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica foi a responsável pela

criação de um sistema de classificação e nomenclatura de enzimas.

Esta classificação divide as enzimas em seis classes distintas de acordo com o tipo de

reação que catalisam, como apresentado na Tabela 1.

As enzimas apresentam um código constituído por 4 números, precedido das iniciais EC.

O primeiro dígito designa a classe a que a enzima pertence, o segundo dígito indica a subclasse

o terceiro a subsubclasse e por fim o último dígito refere-se ao ordenamento da enzima dentro

da subsubclasse (Pinto, 2008; Silva, 2011).

Tabela 1- Nomenclatura e classificação de enzimas

2.2.2. Cinética Enzimática

A cinética enzimática proporciona uma melhor compreensão do mecanismo das

enzimas. A velocidade de uma reação enzimática pode definir-se como a variação do substrato

consumido ou de produto formado por unidade de tempo e é dependente da temperatura e pH

(Silva, 2011).

Dado que as enzimas são únicas no tipo de cinética que exibem, a interpretação da sua

cinética é fundamental.

Primeiro Dígito Classe de Enzima Tipo de reação Catalisada

1 Oxirredutases Reações de oxirredução

2 Transferases Transferência de grupos entre moléculas

3 Hidrolases Reações de hidrólise

4 Liases Remoção de um grupo de uma molécula

5 Isomerases Reacções de isomerização

6 Ligases Reações de síntese acopladas à hidrólise de uma

molécula de ATP

O modelo de Michaelis-Menten (Equação 1) traduz uma reação enzimática simples que

envolve a transformação de um único substrato (S), pela ação de uma enzima (E), num

complexo de associação simples (ES), resultando num único produto (P).

E + S

k−1

k1

ES kcat E + P (Equação 1)

Nos instantes iniciais da reação a quantidade de produto formada é zero, o que torna

unidirecional o segundo passo da reação. Quando a concentração de substrato é

suficientemente elevada para converter toda a enzima no complexo ES, o segundo passo da

reação torna-se limitante, de modo que a velocidade aproxima-se duma assímptota (velocidade

máxima).

A concentração de substrato necessária para obter metade da velocidade máxima é

definida como a constante de Michaelis-Menten (Km). Portanto, esta constante representa a

concentração de substrato necessária para saturar metade da quantidade de enzima e é

característica de cada enzima (Equação 2).

𝑣0 =𝑉𝑚á𝑥 ∗ [S]

𝐾𝑚 + [S] (Equação 2)

Logo, possibilita o estudo da velocidade da reação da enzima, na formação de produto

por minuto (Parkin, 2010; Costa, 2012).

Dado que a representação de v0 em função de [S] é hiperbólica, a determinação de

Vmáx é pouco exacta, pois este torna-se assimptótico. Assim, é necessário recorrer a formas

linearizadas da equação de Michaelis-Menten., sendo a representação de Lineweaver-Burk

(Equação 3) a mais usada (Evangelista, 2005).

1

𝑣0=

1

𝑉𝑚á𝑥+

𝐾𝑚

𝑉𝑚á𝑥

1

[S] (Equação 3)

| 13

2.2.3. Proteases Aspárticas

As proteases aspárticas (PAs; E.C.3.4.23) representam uma sub-subclasse de proteases,

que hidrolisam ligações peptídicas. Em 1836, Theodor Schwann, identificou a primeira PA no

estômago de animais, designada por pepsina. Com o desenvolvimento da ciência foi possível

identificar enzimas que apresentassem características comuns à classe das proteases aspárticas

em diferentes tecidos e organismos (Sousa, 2002; Pereira, 2007; Soares, 2008). Posto isto, as

PAs foram descritas num vasto grupo de organismos entre vertebrados, plantas, nemátodos,

leveduras, fungos, bactérias e vírus (Abreu, 2009;Soares, 2008).

De modo a permitir uma classificação de todas as proteases identificadas foi criada uma

base de dados de proteases, denominada por MEROPS. Nesta base de dados existem 14

famílias de proteases aspárticas que se encontram agrupadas de acordo com o grau de

homologia das suas sequências de aminoácidos, podendo estas dividir-se em sub famílias

atendendo à percentagem de similaridade da sua estrutura primária. As famílias, por sua vez

estão agrupadas em clãs, de acordo com as suas relações evolutivas e estrutura terciária (Abreu,

2009; Soares, 2008; Pereira, 2007).

Na sua maioria as enzimas desta classe exibem em comum uma atividade proteolítica

máxima a pH ácido, são inibidas pela pepstatina (hexapeptídeo produzido por streptomyces sp.),

mostram especificidade para hidrolisar ligações peptídicas entre resíduos aromáticos, e o

mecanismo catalítico é composto por dois resíduos de ácido aspártico (Asp32 e Asp215) (Abreu,

2009; Sousa, 2002; Pereira, 2007).

Estas enzimas caracterizam-se ainda pela elevada homologia que apresentam, em

termos de sequência e de estrutura. A molécula é constituída por dois domínios homólogos que

se enrolam produzindo uma estrutura terciária composta por dois domínios simétricos, que se

encontram ligados por seis sequências em folhas-β antiparalelas. Relativamente, à estrutura

secundária os dois domínios são semelhantes, compostos maioritariamente por folhas-β,

apresentando um baixo conteúdo em α-hélices. No que diz respeito à estrutura terciária, apesar

da grande homologia estrutural há diferentes estados oligoméricos (Pereira, 2007).

Apesar das características comuns presentes entre as PAs, estas exibem diferentes

propriedades catalíticas e diferentes localizações ao nível das células e tecidos, o que poderá

estar relacionado com os seus variados papéis fisiológicos.

Estas enzimas são responsáveis pela degradação de proteínas (pepsina), pelo

processamento de proteínas precursoras (renina e catepsina D) e poliproteínas (PA do vírus da

imunodeficiência humana). Para além disso, é possível salientar o seu papel em processos

fisiológicos como a regulação da pressão sanguínea (renina), da digestão (pepsina, quimosina e

gastricsina) e estão associadas a condições patológicas importantes, como a SIDA, a malária

(plasmepsinas), o cancro (catepsina D e catepsina E) e a doença de Alzheimer (proteína

precursora β-amilóide e memapsina 2). No entanto, o papel das PAs em plantas, na sua

maioria, continua ainda por caracterizar (Abreu, 2009; Sousa, 2002).

2.2.4. Proteases Aspárticas Vegetais

Um grande número de PAs vegetais foram, até à data, detetadas e/ ou purificadas,

nomeadamente a partir de Gimnospérmicas (pinheiro), Monocotiledóneas (arroz, cevada, milho e

trigo) e Dicotiledóneas (Arabidopsis, Brassica, pepino, cardo, tabaco, tomate e plantas carnívoras

Nepenthes) (Abreu, 2009; Soares, 2008).

Estas enzimas têm sido isoladas principalmente a partir de sementes em dormência, ou

de diferentes partes de sementes em germinação, mas também foram purificadas a partir de

folhas, flores e pólen (Abreu, 2009; Soares, 2008).

No entanto, comparativamente com PAs de outras origens, a informação relativa às PAs

vegetais é ainda muito reduzida, dado que apenas algumas delas se encontram completamente

caracterizadas (Abreu, 2009).

Contudo, sabe-se que a maioria das PAs vegetais possui características típicas da sua

sub-subclasse, nomeadamente a atividade proteolítica máxima a pH ácido e a inibição pela

pepstatina. Estas enzimas podem ser monoméricas, como as que estão presentes em sementes

de arroz, de trigo, de Brassica e folhas de Nicotiana ou heterodiméricas como as que estão

presentes nas flores de Cynara sp. (Soares, 2008).

Relativamente à sua localização subcelular, estudos demonstraram que a maioria das

PAs se encontram armazenadas em vacúolos de armazenamento proteico e em corpos proteicos

(fitepsina, cardosina A) ou são secretadas para o espaço extracelular (cardosina B) (Abreu,

2009; Soares, 2008).

As funções biológicas das proteases aspárticas vegetais são ainda pouco claras, ao

contrário do que sucede com as PAs de outros organismos. Contudo, as PAs vegetais têm vindo

| 15

a ser associadas a funções de processamento e degradação de proteínas, senescência,

respostas ao stress, morte celular programada e reprodução nas células vegetais (Abreu, 2009;

Soares, 2008).

2.2.5. Cardosinas

As cardosinas são proteases aspárticas presentes nas flores de Cynara cardunculus L.,

sendo que até à data, foram isoladas e caracterizadas duas formas de cardosinas, A e B,

responsáveis pela atividade proteolítica (Abreu, 2009; Sousa, 2002; Andrade, 2006).

Estas cardosinas são as que mais contribuem para o conteúdo em proteínas solúveis

totais presentes nos estigmas maduros da flor de cardo, pois juntas correspondem a cerca de

60 % deste conteúdo. Sendo assim, estas são expressas em quantidades pouco usuais, em

relação às restantes PAs de plantas (Abreu, 2009; Andrade, 2006).

Todas as cardosinas identificadas e caracterizadas até ao momento, mostram ser

heterodiméricas e glicosiladas. Estas, como na maioria das outras proteases aspárticas, clivam

preferencialmente péptidos em bandas entre resíduos hidrofóbicos, a cardosina A hidrolisa o

péptido na banda Leu15-Tyr16, Leu17-Val18 e Phe25-Tyr26, a clivagem pela cardosina B foi

encontrada em Glu13-Ala14, Ala14- Leu15, Leu15-Tyr16, Leu17- Val18, Phe24-Phe25 e Phe25

(Pereira, 2007).

Além disso, apresentam diferenças ao nível da sequência aminoacídica, ao nível da

localização histológica e ao nível da especificidade enzimática (Sousa, 2002).

Ao nível da localização histológica e citológica, estudos demonstraram que a expressão

da cardosina A restringe-se ao pistilo da flor, acumulando-se, predominantemente, nos vacúolos

de armazenamento proteico das papilas estigmáticas em menor abundância nos vacúolos das

células epidérmicas do estilete (Abreu, 2009; Sousa, 2002; Soares, 2008; Pereira, 2007;

Andrade, 2006).

Ao contrário da cardosina A que é maioritariamente direcionada para o vacúolo, a

cardosina B é secretada para a matriz extracelular e paredes celulares do tecido de transmissão

do estilete durante a maturação da flor (Abreu, 2009).

A cardosina B, apesar de menos abundante na flor do cardo, apresenta uma maior

atividade proteolítica e menor especificidade em relação à cardosina A (Abreu, 2009; Andrade,

2006).

A comparação das sequências de aminoácidos das cadeias de ambas as cardosinas

indica que são produtos de genes diferentes, embora apresentem um elevado grau de homologia

e como tal pensa-se que tenham surgido por um fenómeno de duplicação genética (Abreu,

2009; Pereira, 2007; Andrade, 2006).

Estudos demonstram que as cardosinas apresentam atividade em pH que varia entre 2

e 7, sendo que a atividade máxima verifica-se para um pH de aproximadamente 5, utilizando a

caseína como substrato. Já em condições de pH alcalino as cardosinas apresentam elevada

instabilidade (Soares, 2008).

Relativamente à temperatura sabe-se que as cardosinas mantêm actividade a 60 °C, no

entanto a estabilidade a temperaturas elevadas é relativamente baixa.

2.2.6. Purificação de proteínas por precipitação com solventes

orgânicos

A precipitação de proteínas de uma solução aquosa concentrada (extrato) é uma técnica

de purificação.

A acetona e o etanol são solventes orgânicos miscíveis em água que possuem a

capacidade de precipitar proteínas. Estes solventes apresentam um valor de constante dielétrica

bastante inferior ao da água, logo ao serem acrescentados à solução aquosa possibilitam que as

interações proteína-proteína prevaleçam sobre o poder de solvatação da água, ocorrendo assim

a precipitação de proteínas.

Esta técnica geralmente é muito dependente da temperatura a que é realizada, pois os

solventes quando são usados a temperaturas negativas são muito eficazes na separação de

proteínas de misturas aquosas. Por outro lado, quando são usados a temperaturas elevadas

podem provocar a desnaturação das proteínas, pois quebram-se as pontes de hidrogénio e

estabelecem-se interacções apolares, importantes na manutenção da conformação proteica

(Leite, 2011; Voet D., Voet J., 2005).

| 17

2.3. Coagulação Enzimática do Leite

A coagulação enzimática da proteína do leite pode ser dividida em duas fases e é

efectuada por meio de enzimas de origem animal, vegetal e microbiana.

Numa primeira fase, designada por primária ou enzimática, após a adição do agente

coagulante, ocorre a hidrólise da ligação peptídica existente entre a fenilalanina (105) e

metionina (106) da κ-caseína (Phe105-Met106) e a consequente libertação do

glicomacropeptido (GMP) (Almeida, 2006; Alvarenga, 2008).

Sendo assim, esta ação promove a divisão da κ-caseína em dois resíduos, o resíduo

glicomacropeptido (GMP), solúvel, hidrofilico, constituído pelos aminoácidos 106-169, o qual fica

no soro e o resíduo para-κ-caseína, insolúvel, hidrofóbico, constituído pelos aminoácidos 1-105,

o qual permanece ligado as αS1- e β-caseínas e, por ser altamente hidrofóbico e alcalino,

conduz a destabilização das micelas (Alvarenga, 2008).

Quando ocorre a libertação do GMP verifica-se uma redução importante da carga das

micelas de caseína e uma diminuição das forças de repulsão eletrostáticas que, no estado inicial

são responsáveis pele manutenção do estado coloidal, destabilizando as micelas de caseína.

Nesta fase, os fatores relacionados com a atividade enzimática têm maior importância, como a

concentração e o tipo de enzima, a temperatura e o pH (Almeida, 2006).

A segunda fase da coagulação, designada de fase secundária ou de agregação micelar,

tem início quando cerca de 80 a 90 % da κ-caseína for afetada. Nesta fase ocorre a agregação

das micelas de caseína destabilizadas e a formação de uma rede, inicialmente débil, que vai

aprisionando os glóbulos de gordura, a água e os materiais solúveis em água (Almeida, 2006;

Alvarenga, 2008).

Em seguida, as partículas começam a agregar-se em cadeias cada vez maiores

verificando-se uma reorganização das micelas agregadas e formando-se por fim uma rede

proteica, designada de coalhada. Esta fase caracteriza-se por ser muito sensível à concentração

de Ca2+ presente, à temperatura e ao pH (Almeida, 2006; Alvarenga, 2008).

A fase final da coagulação assenta num fenómeno conhecido por sinérese, no qual

ocorre uma expulsão espontânea do soro na sequência do aumento da rigidez do gel (Almeida,

2006; Alvarenga, 2008).

2.3.1. Estrutura da micela de caseína

Para compreender melhor a dinâmica da coagulação é essencial compreender o

comportamento das moléculas de proteína bem como as alterações que se vão verificando ao

longo do processo.

As moléculas de proteína formam complexos que são conhecidos como micelas de

caseína. A sua estrutura é coloidal, a forma pode ser considerada esférica e são compostas por

várias moléculas agrupadas em subunidades (αS1-, αS2-, β-, e κ-caseínas) (Alvarenga, 2008).

A κ-caseína encontra-se na superfície da micela e desempenha um papel fundamental

na estabilidade do coloide, dado que estabiliza as micelas num estado coloidal, devido ao seu

comportamento simultaneamente hidrofóbico e hidrofilico, conferindo-lhe propriedades de

superfície (Alvarenga, 2008).

As αS1-, αS2- e β-caseínas localizam-se no centro hidrofóbico, ligando-se entre si por

ligações fosfato de cálcio, rodeadas por uma camada rica em κ-caseínas, uma vez que estas têm

propriedades de superfície (Alvarenga, 2008).

A estrutura da micela de caseína é sensível a fatores externos, como por exemplo a

presença de enzimas, o pH e a temperatura (Alvarenga, 2008).

Estudos demonstram que à medida que o pH do leite vai descendo, entre 6,7 e 5,9,

observa-se uma dissociação de 40 a 50 % dos minerais da micela e uma solubilização lenta das

caseínas. Para valores de pH inferiores a 5,3, próximos do ponto isoelétricos da caseína (pH

4,6), observa-se a precipitação da caseína (Alvarenga, 2008).

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2.4. Enzimas coagulantes de origem vegetal.

Coagulantes de origem vegetal incluem enzimas de Cynara cardunculus, sete espécies

de papilionoideae (Eriosema shirense, E. ellipticum, E. pauciflorum, E. gossweilleri, E.

psoraleoides, Adenolichos anchietae e Droogmansia megalantha), Solanum dobium fresen e

Centaurea calcitrapa, Cynara scolymus, Calotropis procera, Helianthus annuus, Lactuca sativa,

figueira (Ficus carica), papaia (Carica papaya), abacaxi (Ananas sativa) e sementes de mamona

(Ricinus communis) com capacidade de coagular o leite (El- Sayed et al, 2013).

Muitas espécies de plantas podem dar origem a coagulação do leite, no entanto as

enzimas extraídas têm uma atividade proteolítica relativamente intensa em relação à atividade

coagulante.

As proteases de plantas podem ter um efeito proteolítico desfavorável na produção de

queijo, pois podem gerar sabores indesejáveis. Duas exceções conhecidas são as proteases

extraídas das flores do cardo (Cynara cardunculus e Cynara humilis) e das bagas (Withania

coagulans) que podem ser adequadas para o fabrico de queijo cottage ou queijo macio (Yusef,

2004).

As enzimas utilizadas na produção de queijo devem apresentar um elevado poder

coagulante e baixa atividade proteolítica, isto é, as enzimas devem romper rapidamente a ligação

Phe105-Met106 da κ-caseína, mas devem possuir baixa atividade proteolítica em relação às

restantes caseínas (Brutti et al 2012).

A atividade proteolítica das enzimas exerce grande influência sobre as características

sensoriais do queijo, como sabor e textura, pois para além da hidrólise da ligação Phe105-

Met106 na κ-caseína, outras ligações peptídicas são quebradas a taxas que variam de acordo

com a enzima utilizada. Uma elevada atividade proteolíca pode ser responsável pelo

desenvolvimento de sabores amargos durante a maturação, além de modificações indesejáveis

na textura do queijo (Vasconcelos M. et al 2004).

| 21

CAPITULO III- Materiais e Métodos

3.

CAPITULO III- Materiais e Métodos

| 23

3.1. Origem dos extratos de Cynara cardunculus

Os extratos secos da planta utilizada neste trabalho, nomeadamente a espécie

C.cardunculus, foram cedidos pela empresa Alva Solos. Após a sua receção, os extratos de

C.cardunculus (Figura 2) foram mantidos em local seco e arejado.

3.2. Extração e Purificação das proteases aspárticas

4. Para efetuar a extração, pesou-se 5 g de extrato de C.cardunculus aos quais foram

adicionados 50 mL de tampão citrato de sódio 0,1 mol/L a pH=5,9. Para promover a extração

de proteínas rompeu-se as paredes celulares da planta por congelamento seguido de

descongelamento à temperatura ambiente. Posteriormente o extrato bruto foi homogeneizado e

centrifugado a 3800 g durante 30 min para eliminar o material insolúvel. O sobrenadante foi

recuperado e filtrado.

5. Os sobrenadantes foram concentrados por precipitação com solventes, para remover os

hidratos de carbono solúveis e pigmentos. A 30 mL de extrato enzimático foi adicionado acetona

a -15 °C com agitação suave. Para a operação foram utilizadas as seguintes razões de extrato

enzimático:acetona, 1:1, 1:2, 1:4 e 1:6.

6. Após completa solubilização, as amostras foram mantidas no congelador over night, e de

seguida foram centrifugadas a 3800 g por 10 min.

Figura 2- Aspecto do extrato de C.cardunculus aquando da sua recepção.

7. O sobrenadante foi removido e o precipitado ressuspendido em 30 mL de tampão citrato

de sódio a pH=5,9.

8. Posteriormente, foi adicionado benzoato de sódio a 10 g/L.

9. O procedimento foi repetido utilizando o etanol como solvente, para as razões de extrato

enzimático:etanol de 1:1, 1:2, 1:4 e 1:6.

10.

3.3. Determinação do conteúdo em proteínas

O conteúdo de proteínas foi determinado pelo método de Lowry, cujo princípio é o

desenvolvimento de um complexo de cor azul, devido à reação das ligações peptídicas de

aminoácidos das proteínas com o reagente de Folin Ciocalteau.

Inicialmente, foram medidos 0,6 mL do extrato enzimático aos quais foram adicionados

3 mL da solução C, composta por A (Na2CO3 20 g/L dissolvido em NaOH 0,1 mol/L) e B (CuSO4.

5H2O a 10 g/L e tartarato de Na e K a 20 g/L), numa proporção de 50:1. Após 10 min foram

adicionados 0,3 mL do reagente Folin- Ciocalteau 1 mol/L e deixou-se reagir durante 30 min, à

temperatura ambiente. Por fim, a absorvância foi lida a 750 nm e determinada a concentração

de proteína, usando a reta padrão previamente estabelecida. Os ensaios foram realizados em

triplicado.

Curva de calibração para a determinação de proteínas

Para a preparação da curva padrão, adicionou-se a tubos de ensaio uma solução de BSA

a 2 mg/mL em quantidades de 10, 20, 30, 40, 50 e 60 µL e completou-se com água destilada

até perfazer 0,6 mL.

A cada tubo adicionou-se 3 mL da solução C e deixou-se 10 min à temperatura

ambiente. De seguida, adicionou-se 0,3 mL do reagente Folin- Ciocalteau 1 mol/L. Após 30 min

mediu-se a absorvância a 750 nm. Os ensaios foram realizados em triplicado.

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3.4. Determinação da atividade coagulante

A atividade coagulante (AC) foi determinada de acordo com Dini (2010), com

modificações. Uma solução de 5 mL de leite, cedido por uma queijaria local, com CaCl2 0,01

mol/L foi pré incubada a 35 °C por 10 min. Adicionou-se 0,5 mL da solução enzimática e

iniciou-se a contagem do tempo. A formação do coágulo foi observada enquanto o tubo de

ensaio era agitado manualmente. O tempo em que as primeiras partículas se formaram foi

medido.

Uma unidade de atividade coagulante (UAC) foi definida como a quantidade de enzima

necessária presente em 1 mL de extrato que coagulou 10 mL de substrato em 40 min e foi

calculada pela Equação 4. Nesta, t é o tempo necessário para formação do coágulo, Vleite é o

volume de leite e Venzima é o volume de enzima.

UAC

mL=

2400

t∗

Vleite

Venzima (Equação 4)

3.5. Determinação da atividade proteolitica

A atividade proteolitica (AP) foi determinada de acordo com Merheb et al. (2007), com

modificações. A mistura reacional era composta por 0,4 mL de caseína a 5 g/L em tampão

citrato de sódio 0,1 mol/L pH=5,9 e 0,2 mL de extrato enzimático. A mistura de reacão foi

incubada a 35 °C e ao final de 30 min a reacão foi interrompida pela adição de 1 mL de TCA

(ácido tricloroacético) a 10 %. As amostras foram centrifugadas a 2800 g durante 10 min. Um

controle foi preparado, onde o TCA foi adicionado antes do extrato enzimático. Fez-se a leitura da

absorvância a 280 nm.

Uma unidade de atividade proteolitica (UAP) e definida arbitrariamente como a

quantidade de enzima necessária para causar um aumento de 0,1 na absorvância a 280 nm,

nas condições de ensaio.

A atividade proteolítica foi calculada pela equação 5. Nesta, Venzima é o volume de enzima e

t e o tempo da reacão.

UAP

mL=

∆Abs ∗ 10 ∗ fator de diluição

Venzima ∗ t (Equação 5)

3.6. Determinação do poder coagulante

O poder coagulante foi determinado de acordo com Yusef (2004). Num recipiente com

um orifício de 1 mm, na parte inferior, foram colocados 100 mL de leite e 0,02 g de CaCl2, a

uma temperatura de 30 °C. Adicionou-se 5 mL de extrato enzimático sob agitação e deixou-se

escorrer o leite pelo orifício até que o gotejamento parasse. O tempo desde que se adicionou e

coagulante até que a última gota caiu foi registado. O leite utilizado nos ensaios foi fornecido por

uma queijaria local.

O poder coagulante foi determinado pela equação 6. Nesta, Vleite é o volume de leite,

pcoagulante é o peso do coagulante e t é o tempo.

Poder coagulante =Vleite ∗ 2400

pcoagulante ∗ t (Equação 6)

3.7. Caracterização cinética

Para a determinação das constantes cinéticas, preparou-se várias soluções de caseína a

diferentes concentrações, 10, 20, 30, 50 e 100 g/L. Reagiu-se 0,4 mL de cada uma das

soluções de substrato com 0,2 mL de extrato enzimático à temperatura de 30 °C. A reação foi

interrompida pela adição de 1 mL de TCA a 10 %. As amostras foram centrifugadas a 2800 g

durante 10 min. Recuperou-se os sobrenadantes e fez-se a leitura da absorvância a 280 nm.

Para a curva de calibração, preparou-se uma serie de soluções de GMP em

concentrações de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 %.

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CAPITULO IV- Resultados e Discussão

CAPITULO IV- Resultados e Discussão

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4. Extração de proteínas da C. cardunculus

Para promover a extração de proteínas rompeu-se as paredes celulares da planta por

congelamento e descongelamento lento e posterior homogeneização do extrato de flores.

4.1. Precipitação de proteínas com acetona e etanol

Os coalhos líquidos obtidos pela precipitação, com acetona e etanol, dos extratos de

flores de C. cardunculus são apresentados nas figuras 3 e 4, respectivamente. Foram testadas

várias razões de extrato enzimático bruto:acetona/etanol, (1:1, 1:2, 1:4 e 1:6), de modo a

apurar qual seria a técnica mais eficiente para concentração e purificação das enzimas

presentes, investigando assim a ação de solventes orgânicos (acetona e etanol) que são

compostos comummente usados para esta finalidade.

Após a adição do solvente o sistema foi mantido em repouso por 12 h a -15 °C. O

precipitado foi recuperado, sendo que este variou com a razão de extrato bruto:acetona, ou seja,

para as razões 1:1 e 1:2 verificou-se que a quantidade de precipitado recuperado foi mais

reduzida do que para as razões 1:4 e 1:6. Este facto foi evidenciado pela cor dos coalhos

apresentados na figura 3, pois quanto maior a quantidade de precipitado recuperado mais

escuro foi o coalho obtido.

Figura 3- Coalhos obtidos por precipitação com acetona na razão 1:1, 1:2, 1:4 e 1:6 (da esquerda

para a direita) e ressuspensão em tampão citrato de sódio a pH 5,9.

Portanto, a avaliação visual dos coalhos demonstrou que à medida que o valor da

concentração de acetona aumentava, o sobrenadante obtido ficava mais claro e a altura

(quantidade) do precipitado aumentava.

No caso da precipitação com etanol, após a adição do solvente o sistema foi mantido em

repouso over night a -15 °C. O precipitado foi recuperado, sendo que, também variou com a

razão de extrato bruto:etanol. No entanto, para a razão 1:1 a quantidade de precipitado obtido,

após 12 h em repouso, foi insignificante, como se pode verificar na figura 4 a), acabando

mesmo por se dissolver aquando da remoção do sobrenadante. Assim, a não obtenção de

precipitado para a razão 1:1, poderá ser explicada pela desnaturação das proteínas no decorrer

da aplicação desta técnica, pois geralmente é efectuada a temperaturas abaixo dos 0 °C, dado

que a temperaturas mais altas os solventes tendem a desnaturar proteínas. Como tal, a solução

extrato bruto:etanol deve ter sido sujeita a temperaturas acima de 0 °C, conduzindo a uma

precipitação residual de proteína para a razão 1:1.

Para os sistemas restantes foi possível recuperar o precipitado formado, sendo que foi

para a razão 1:6 que se verificou uma quantidade de precipitado mais elevada. Este facto pode

ser comprovado pela cor dos coalhos apresentados na figura 4 b), pois quanto maior foi a

quantidade de precipitado recuperado mais escuro foi o coalho obtido.

a) b)

Figura 4- a) Precipitado obtido para o sistema extrato bruto:etanol na razão 1:1, após 12 h em repouso.

b) Coalhos obtidos por precipitação com etanol na razão 1:2, 1:4 e 1:6 (da esquerda para a direita) e

ressuspensão em tampão citrato de sódio a pH 5,9.

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4.2. Conteúdo em proteína dos coalhos de origem vegetal

O conteúdo em proteínas, determinado pelo método de Lowry, dos coalhos de origem

vegetal obtidos pela precipitação com acetona e etanol, para as várias razões de extrato

enzimático bruto:solvente, encontra-se apresentado na tabela 2.

Tabela 2- Concentração de proteínas dos coalhos líquidos obtidos pela precipitação com acetona e

etanol variando as razões de extrato bruto:solvente

O conteúdo de proteína de uma preparação enzimática está diretamente relacionado

com a probabilidade de encontrar uma maior quantidade de enzimas coagulantes do leite, e por

sua vez, encontrar uma maior quantidade de enzimas implica o aumento do poder coagulante,

que conduzirá a uma diminuição do tempo de coagulação do leite.

A precipitação de proteínas de extrato bruto com acetona apresenta uma concentração

de proteínas em solução inferior à precipitação de proteínas com etanol.

Os resultados apresentados na tabela 2 revelam ainda que a concentração de proteína

total varia proporcionalmente com a razão de extrato bruto:solvente, pois quanto maior foi a

razão de solvente utilizado maior foi a proteína total quantificada. Este facto verifica-se pois a

acetona e o etanol possuem uma constante dielétrica menor que a da água, aumentando assim

a atração entre as moléculas proteicas, conduzindo à precipitação das mesmas.

Claramente o coalho obtido pela precipitação com etanol na razão 1:6 apresenta uma

quantidade de proteínas maior, com 4,468 g/L, do que o coalho obtido pela precipitação com

acetona, com 1,418 g/L.

Razão de extrato bruto:solvente

Proteína total ACETONA (g/L)

Proteína total ETANOL

(g/L) 1:1 0,198 -

1:2 0,301 0,805

1:4 0,901 2,086

1:6 1,418 4,468

4.3. Atividade Coagulante e Proteolítica

Na tabela 3 e 4 encontram-se apresentadas as atividades coagulante e proteolítica dos

coalhos obtidos pela precipitação com acetona e etanol, respectivamente. Os resultados

determinados para a razão entre a atividade coagulante e proteolítica (R) também são

apresentados na tabela 3 e 4.

Tabela 3- Atividades coagulante e proteolítica, razão entre as atividades (R) dos coalhos obtidos pela

precipitação com acetona, variando a razão de extratobruto:acetona

A atividade coagulante foi determinada pela medição do tempo de formação dos

primeiros coágulos, o que não foi possível no caso do coalho obtido pela precipitação com

acetona na razão 1:1, dado que a adição deste coalho ao leite não originou a formação de

partículas em suspensão. Relativamente à atividade proteolítica este coalho apresentou um valor

residual (0,079 UAP/mL), que pode estar associado à clivagem de alguma ligação peptídica,

exceptuando a ligação Phe105-Met106, ou à presença de alguma partícula em suspensão.

Um coalho adequado deve possuir intensa atividade coagulante e baixa atividade

proteolítica para minimizar a dissolução do coágulo, como tal, pela análise dos restantes

resultados é possível constatar que o coalho obtido pela precipitação com acetona na razão 1:6

apresentar maior atividade coagulante (86,44 UAC/mL) e a atividade proteolítica menor (0,841

UAP/mL) foi conseguida para o coalho obtido pela precipitação com acetona na razão 1:2.

A Tabela 3 também mostra os resultados obtidos para as determinações de R para as

várias razões de extrato bruto:acetona. Nota-se que em todas as razões o valor de R foi maior

que 1, ou seja, a atividade coagulante foi maior que a proteolítica.

Razão de extrato bruto:acetona

Atividade Coagulante (UAC/mL)

Atividade Proteolítica (UAP/mL)

R

1:1 - 0,079 -

1:2 32,54 0,841 38,68

1:4 57,74 1,181 48,91

1:6 86,44 1,757 49,20

| 33

Dado que, a razão entre atividade coagulante e proteolitica (R) é usada como um índice

para justificar a adequabilidade de um extrato enzimático, quanto maior for o seu valor, melhor.

Portanto, a análise da tabela 3 revela que o melhor coalho foi o obtido pela precipitação com

acetona na razão 1:6, pois este possui o maior valor de R (49,2).

Tabela 4- Atividades coagulante e proteolítica, razão entre as atividades (R) dos coalhos obtidos pela

precipitação com etanol, variando a razão de extratobruto:etanol

Relativamente aos resultados dos coalhos obtidos pela precipitação com etanol,

apresentados na tabela 4, é possível constatar que o coalho que apresenta maior atividade

coagulante foi o obtido pela precipitação com etanol na razão 1:4 (122,66 UAC/mL) e o que

possui menor atividade proteolítica foi o coalho obtido pela precipitação com etanol na razão 1:2

(0,963 UAP/mL).

No caso dos coalhos obtidos pela precipitação com etanol, também se verifica que para

as várias razões de extrato bruto:etanol o valor de R foi sempre maior que 1, ou seja, a atividade

coagulante foi superior à proteolítica.

A análise da tabela 4 revela ainda que o melhor coalho foi o obtido pela precipitação

com etanol na razão 1:4, pois este possui o maior valor de R (60,32). Portanto, foram

necessários quatro volumes de etanol para um volume de extrato bruto para obter uma boa

precipitação.

Os resultados referentes aos coalhos obtidos pela precipitação com acetona foram

insatisfatórios quando comparados com os dados do etanol, pois utilizando o etanol como

solvente atingem-se valores mais elevados de R.

Razão de extrato bruto:etanol

Atividade Coagulante (UAC/mL)

Atividade Proteolítica (UAP/mL)

R

1:2 38,20 0,963 39,65

1:4 122,66 2,033 60,32

1:6 67,80 1,342 50,51

4.4. Poder Coagulante dos Coalhos de Origem Vegetal

O poder coagulante é um dos fatores mais importantes na produção queijo, em termos

de qualidade e desempenho, dado que expressa a capacidade de coagulação do leite. Os

resultados do poder coagulante de cada um dos coalhos de origem vegetal obtidos pela

precipitação com acetona e etanol, para as várias razões de extrato enzimático bruto:solvente,

encontram-se apresentados na tabela 5.

Tabela 5- Resultados do poder coagulante dos coalhos líquidos de origem vegetal obtidos pela

precipitação com acetona e etanol variando as razões de extrato bruto:solvente

A comparação dos resultados relativos ao poder coagulante dos coalhos obtidos pela

precipitação com acetona (1:595, 1:875 e 1:1416 g/mL) com os resultados relativos ao

conteúdo de proteína das mesmas amostras (0,301, 0,901 e 1,418 g/L) revelaram que quanto

maior o conteúdo de proteínas maior o poder coagulante do coalho. De salientar ainda, que para

o coalho obtido pela precipitação com acetona na razão 1:1, que possui um conteúdo em

proteína de 0,198 g/L (Tabela 2), não foi possível obter o valor do poder coagulante, pois após a

adição deste coalho ao leite não ocorreu a formação de coágulos. Sendo assim, pode-se afirmar

que as proteínas precipitadas pela acetona na razão 1:1 não apresentavam capacidade de

coagulação, ou seja, este coalho não possuía proteases aspárticas ou então possuía-as numa

quantidade residual, incapaz de provocar a coagulação do leite.

No caso dos resultados relativos ao poder coagulante dos coalhos obtidos pela

precipitação com etanol (1:752, 1:1624 e 1:1134 g/mL), não se verifica a mesma tendência

apresentada para os coalhos obtidos pela precipitação com acetona, pois o coalho que

apresenta maior conteúdo em proteína (4,469 g/L) não corresponde ao coalho que possui maior

Razão de extrato bruto:solvente

Poder coagulante ACETONA (g/mL)

Poder coagulante ETANOL (g/mL)

1:1 - -

1:2 1:594,9 1:751,6

1:4 1:875 1:1623,8

1:6 1:1417,6 1:1134,2

| 35

poder coagulante. Logo, um maior conteúdo em proteínas nem sempre implica uma maior

quantidade de enzimas coagulantes, responsáveis pelo aumento do poder coagulante.

A análise da tabela 5 revela ainda que os solventes usados na razão 1:1, não são

capazes de precipitar as proteases aspárticas responsáveis pela coagulação do leite, pois a

adição destes coalhos não induziu qualquer alteração no leite.

Portanto, os resultados, apresentados na tabela 5, para o poder coagulante dos coalhos

enzimáticos indicam que o maior poder coagulante, 1:1624 g/mL, foi o do coalho obtido pela

precipitação com etanol na razão 1:4, isto é, 1 g deste extrato enzimático vegetal é capaz de

coagular 1,6 L de leite a uma temperatura de 30 °C em 40 min.

4.5. Cinética enzimática

A determinação dos parâmetros cinéticos, apresentados na tabela 6, foi conseguida pela

linearização de Lineweaver-Burk, com posterior ajuste a um modelo não linear. Esta

determinação foi efectuada apenas para os dois coalhos que se revelaram mais eficientes, no

caso da precipitação com acetona, o mais eficaz foi o coalho obtido na razão 1:6 e no caso do

etanol foi o obtido na razão 1:4.

Tabela 6- Parâmetros cinéticos (Km e Vmáx) determinados para os coalhos obtidos pela precipitação

com acetona na razão 1:6 e pela precipitação com etanol na razão 1:4

Como pode ser observado na tabela 6, o valor de Km para o coalho obtido pela

precipitação com etanol na razão 1:4 (38 g/L) é maior do que o atingido para o coalho obtido

pela precipitação com acetona (18 g/L), o que indica uma maior afinidade deste último em

relação ao substrato. Isso denota que as proteases do coalho obtido pela precipitação com

acetona na razão 1:6 são menos específicas, pois apresentam mais opções de sítios de hidrólise

na caseína.

Km (gCaseína/L) Vmáx (gGMP/L.min)

Coalho acetona 1:6 18 ± 11 0,239 ± 0,048

Coalho etanol 1:4 38 ± 14 0,327 ± 0,053

| 37

CAPÍTULO V – Conclusões

CAPÍTULO V – Conclusões

| 39

Neste projeto foi feita a avaliação do potencial de obtenção de um coagulante líquido a

partir de extratos de C. cardunculus. Várias estratégias foram definidas, nomeadamente a

precipitação das proteases asparticas, responsáveis pela coagulação do leite, com recurso a

solventes orgânicos (acetona e etanol). Avaliou-se também o efeito da variação da razão de

extrato bruto:solvente na efetividade dos coagulantes obtidos.

Numa fase inicial procedeu-se à extração proteínas, uma vez que rompeu-se as paredes

celulares da planta por congelamento e descongelamento lento e posterior homogeneização do

extrato de flores. Aos extratos brutos obtidos foi adicionado solvente nas razões 1:1, 1:2, 1:4 e

1:6. A avaliação visual das amostras precipitadas com acetona revelou que à medida que a

razão de acetona aumentava, o sobrenadante obtido ficava mais claro e a altura (quantidade) do

precipitado aumentava. Relativamente às amostras precipitadas com etanol, foi possível verificar

a mesma tendência, exceto para a razão 1:1, pois neste caso não foi possível recuperar o

precipitado obtido, dado que foi residual, acabando por ser descartado. A quantidade de

precipitado recuperado foi mais elevada para o etanol na razão 1:6.

Os resultados relativos ao conteúdo de proteína dos coalhos revelam que, as amostras

obtidas pela precipitação com acetona apresentam uma concentração de proteínas em solução

inferior às obtidas pela precipitação com etanol. A maior concentração de proteínas foi

conseguida para o coalho obtido pela precipitação com etanol na razão 1:6, com 4,468 g/L.

A atividade coagulante máxima foi conseguida para o coalho obtido pela precipitação

com etanol na razão 1:4 (122,66 UAC/mL) e a atividade proteolítica mínima (0,841 UAP/mL)

foi conseguida para o coalho obtido pela precipitação com acetona na razão 1:2. No entanto, a

razão entre atividade coagulante e proteolitica (R) foi superior para o coalho obtido pela

precipitação com etanol na razão 1:4.

O coalho obtido pela precipitação com etanol na razão 1:4 atingiu um poder coagulante

superior a todos os outros, pois um grama deste extrato enzimático vegetal foi capaz de coagular

1,6 L de leite a uma temperatura de 30 °C em 40 min. Este coalho apresentou um valor de Km

maior do que o atingido para o coalho obtido pela precipitação com acetona (18 g/L), o que

indica uma maior afinidade deste último em relação ao substrato, ou seja as proteases do coalho

obtido pela precipitação com acetona na razão 1:6 são menos específicas, pois apresentam

mais opções de sítios de hidrólise na caseína.

Assim, os resultados do coagulante obtido pela precipitação com etanol na razão 1:4,

sugerem que este realmente tenha potencial tecnológico para ser aplicado na produção de

queijo, pois exibiu elevada atividade coagulante e baixa atividade proteolítica. O valor de R, usado

como um índice para justificar a adequabilidade de um extrato enzimático, e o poder coagulante

também foram elevados.

| 41

CAPÍTULO VI – Recomendações

CAPÍTULO VI – Recomendações

| 43

No decorrer do desenvolvimento deste projeto revelaram-se algumas necessidades de

eventuais linhas de investigação para projetos futuros.

Como tal, seria pertinente avaliar a influência de outras variáveis, tais como o pH e a

temperatura, no processo de extração das proteases aspárticas, de forma a otimizar o processo

de extração.

No que diz respeito à purificação das proteases aspárticas, seria interessante testar

outras técnicas, tais como a ultrafiltração e/ou técnicas cromatográficas, de forma a obter um

extrato enzimático mais puro.

Também seria importante avaliar os efeitos dos coagulantes obtidos sobre os

parâmetros de textura (dureza, elasticidade e coesividade) e sabor do queijo assim como avaliar

os efeitos de um coagulante vegetal comercial sobre esses mesmos parâmetros, de forma a

efectuar a sua comparação.

No decorrer do desenvolvimento deste projeto revelaram-se algumas necessidades de

eventuais linhas de investigação para projetos futuros.

Como tal, seria pertinente avaliar a influência de outras variáveis, tais como o pH e a

temperatura, no processo de extração das proteases aspárticas, de forma a otimizar o processo

de extração.

No que diz respeito à purificação das proteases aspárticas, seria interessante testar

outras técnicas, tais como a ultrafiltração e/ou técnicas cromatográficas, de forma a obter um

extrato enzimático mais puro.

Também seria importante avaliar os efeitos dos coagulantes obtidos sobre os

parâmetros de textura (dureza, elasticidade e coesividade) e sabor do queijo assim como avaliar

os e coagulante vegetal comercial sobre esses mesmos parâmetros, de forma a efectuar a sua

comparação.

| 45

Referências Bibliográficas

Referências bibliográficas

| 47

Abreu S. (2009). Obtenção e caracterização de linhas celulares de BY-2 a expressar

cardosinas. Tese de Mestrado, Universidade do Minho, Portugal.

Ahmed I. (2009) Characterisation of partially purified milk-clotting enzyme from Solanum

dubium Fresen seeds. Food Chemistry, v. 116, p. 395-400.

Almeida M. (2006) Caracterização da lactação e do leite de ovelhas da raça Assaf.

Universidade Técnica de Lisboa, Portugal.

Alvarenga N. (2008) Introdução da tecnologia de congelação na produção de queijo de

ovelha. Universidade Técnica de Lisboa, Portugal.

Andrade A. (2006) A associação cardosina-quitosano como potencial biomaterial na

prevenção das fibroses peritoneais.Estudo toxicológlco em ratinhos. Universidade de Aveiro,

Portugal.

Brutti C. et al. (2012) Onopordum acanthium L. (Asteraceae) flowers as coagulating agent for

cheesemaking. Food Science and Technology, v. 45, p. 172-179.

Cavalcanti M. et al. (2004) Partial purification of new milk-clotting enzyme produced by

Nocardiopsis sp. Bioresource Technology, v. 93, p. 29-35.

Chitpinityol S., Crabbe M. J. (1997) Chymosin and aspartic proteinases. Food Chemistry,

v. 61, p. 395-418.

Costa P. (2012) Modelo cinético estocástico para a transcrição considerando colisões entre

moléculas de RNA Polimerase. Tese de Mestrado, Universidade Estadual Paulista, Brasil.

Dini C. (2010) PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA PROTEASE DE

THERMOMUCOR INDICAE-SEUDATICAE N31 E AVALIAÇÃO DE SUA APLICAÇÃO NA

FABRICAÇÃO DE QUEIJO MATURADO. Tese de Doutoramento, Universidade Estadual Paulista,

Brasil.

El- Sayed S. et al. (2013) Purification and Characterization of a Novel Milk-Clotting Enzyme

from Brassica napus Seeds. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, v. 7, p. 482-493.

Evangelista A. et al. (2005) Produção e estudo do potencial de hidrólise de uma nova fonte

de enzimas amilolíticas a partir do malte de milho (Zea mays). Revista Brasileira de Produtos

Agroindustriais, v 7, p.1-14.

Hashem A. (1999) Optimization of milk-clotting productivity by Penicillium oxalicum.

Bioresource Technology, v. 70, p. 203-207.

Kumar S. et al. (2005) Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae: purification and

characterization. Process Biochemistry, v. 40, p. 1701-1705.

Kumar A. et al. (2006) Purification and characterization of milk clotting enzyme from goat

(Capra hircus). Comparative Biochemistry and Physiology, Part B, v. 145, p. 108-113.

Leite M. (2011) Desenvolvimento e Optimização de uma Metodologia Analítica para a

Determinação de α- e β-Amanitina em urina humana por LC-MS/MS. Tese de Mestrado,

Universidade de Coimbra, Portugal.

Merheb C. et al. (2007) Partial characterization of protease from thermophilic fungus

Thermoascus aurantiacus and its hydrolytic activity on bovine casein. Food Chemistry, v.104, p.

127-131.

Nelson J. H. (1975) Impact o f new milk clotting enzymes on cheese technology. Journal of

Dairy Science, v. 58, p. 1739-1750.

Parkin K. (2010) Enzimas in Damodaran S., Parkin K., Fennema O., p.265-281. Quimica de

Alimentos de Fennema. Brasil.

Pereira A. (2007) Cardosina A como modelo para o estudo da estabilidade conformacional de

proteinases aspárticas. Universidade de Aveiro, Portugal Pinto A. (2008) Efeito da alta pressão na actividade da enzima peroxidase. Tese de Mestrado,

Universidade de Aveiro, Portugal.

Raposo S., Domingos A. (2008) Purification and characterization milk-clotting aspartic

proteinases from Centaurea calcitrapa cell suspension cultures. Process Biochemistry, v. 43, p.

139-144.

Silva R. (2011) Produção de biodiesel por catálise enzimática a partir de óleo de cardo.

Universidade Técnica de Lisboa, Portugal.

Silva R. (2011) Produção de biodiesel por catálise enzimática a partir de óleo de cardo.

Dissertação de Mestrado, Universidade Técnica de Lisboa, Portugal.

Silva S., Malcata F. (2005) Studies pertaining to coagulant and proteolytic activities of plant

proteases from Cynara cardunculus. Food Chemistry, v. 89, p. 19-26.

Soares R. (2008) Estudo da acção anti-tumoral do extracto de ciprosina, isolado de Cynara

cardunculus. Tese de Mestrado, Universidade do Algarve, Portugal.

Sousa A. (2002) Proteinases asparticas em flores de Cynara Humius: Estudos de expressão

durante o desenvolvimento floral. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, Portugal.

| 49

Valentão P. (2002) Limonete, Hiperecão-do-Gêres, Cardo-do-Coalho, Fel-da-Terra -

Metodologias de controlo de qualidade com base na fracção fenólica - Estudos de acção

antioxidante e hepatoprotectora. Universidade do Porto, Portugal.

Vasconcelos M. et al. (2004) EFEITO DO pH DE COAGULAÇÃO DO LEITE E DO TIPO DE

COALHO SOBRE O RENDIMENTO DE MASSA NA PRODUÇÃO DE QUEIJO. Agrociência, v.10, p.

499-502.

Voet D., Voet J. (2005) Techniques de purification des proteins et des acids nucleiques in

Voet D., Voet J., p. 132. Biochimie. França.

Yusef J. (2004) Extracción de Proteasas de Ulex europaeus L. y su potencial utilización como

sustituto de cuajo. Universidad Austral de Chile.

| 51

Anexos

Anexos

| 53

y = 1,650x + 0,068R² = 0,994

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Ab

s (n

m)

CBSA (g/L)

Figura i- Curva de calibração obtida pelo método de Lowry para a concentração de proteínas.

Tabela i- Absorvâncias dos coagulantes obtidos pela precipitação com acetona, para determinação

da concentração de proteínas.

Razão de extrato

bruto:acetona Absorvância (nm) Média

1:1 0,394 0,374 0,417 0,395

1:2 0,553 0,595 0,548 0,565

1:4 0,825 0,733 0,879 0,812

1:6 0,627 0,683 0,651 0,654

Tabela ii- Absorvâncias dos coagulantes obtidos pela precipitação com etanol, para

determinação da concentração de proteínas.

Razão de extrato

bruto:etanol Absorvância (nm) Média

1:1 - - - -

1:2 0,713 0,736 0,751 0,733

1:4 0,518 0,499 0,480 0,499

1:6 0,540 0,534 0,515 0,530

Tabela iii- Tempos dos coagulantes, obtidos pela precipitação com acetona, para a

determinação da atividade coagulante.

Tabela iv- Tempos dos coagulantes obtidos pela precipitação com etanol, para determinação da

atividade coagulante.

Tabela v- Absorvâncias dos coagulantes obtidos pela precipitação com acetona, para

determinação da atividade proteolítica.

Razão de extrato

bruto:acetona tempo (seg) Média

1:1 - - - -

1:2 734 738 741 737,7

1:4 414 417 416 415,7

1:6 273 286 274 277,7

Razão de extrato

bruto:etanol tempo (seg) Média

1:1 - - - -

1:2 624 632 629 628,3

1:4 198 196 193 195,7

1:6 356 349 357 354,0

Razão de extrato

bruto:acetona Absorvância (nm) Média

1:1 0,04 0,054 0,048 0,047

1:2 0,507 0,499 0,508 0,505

1:4 0,705 0,711 0,709 0,708

1:6 0,512 0,508 0,561 0,527

| 55

Tabela vi- Absorvâncias dos coagulantes obtidos pela precipitação com etanol, para

determinação da atividade proteolítica.

Razão de extrato

bruto:etanol Absorvância (nm) Média

1:1 - - - -

1:2 0,577 0,579 0,578 0,578

1:4 0,612 0,608 0,61 0,610

1:6 0,809 0,802 0,805 0,805

Tabela vii- Tempos dos coagulantes, obtidos pela precipitação com acetona, para a

determinação do poder coagulante.

Tabela viii- Tempos dos coagulantes obtidos pela precipitação com etanol, para determinação

da atividade coagulante.

Razão de extrato

bruto:acetona tempo (seg) Média

1:1 - - - -

1:2 1347 1342 1345 1344,67

1:4 910 915 918 914,33

1:6 564 567 562 564,33

Razão de extrato

bruto:etanol tempo (seg) Média

1:1 - - - -

1:2 1060 1068 1065 1064,33

1:4 492 495 491 492,67

1:6 706 709 701 705,33

y = 0,908x + 0,004R² = 0,999

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Ab

s (n

m)

C GMP (g/L)

Tabela ix- Valores de absorvância do coagulante obtido pela precipitação com acetona na razão 1:6, para caracterização cinética

Tabela x- Valores de absorvância do coagulante obtido pela precipitação com etanol na razão 1:4, para caracterização cinética

t C (min) (g/L)

0 3 6 9 12 15

10 0,057 0,06 0,298 0,23 0,483 0,487 0,719 0,738 0,845 0,761 0,525 0,56

20 0,062 0,061 0,383 0,41 0,7 0,731 1,018 1,069 0,625 0,549 0,791 0,728

30 0,058 0,061 0,57 0,541 0,263 0,254 0,352 0,365 0,458 0,465 0,507 0,532

50 0,065 0,06 0,16 0,168 0,288 0,246 0,335 0,341 0,463 0,479 0,529 0,498

100 0,063 0,052 0,144 0,116 0,207 0,229 0,316 0,33 0,452 0,414 0,524 0,528

t (min)

C (g/L) 0 3 6 9 12 15

10 0,046 0,054 0,141 0,14 0,261 0,271 0,371 0,435 0,551 0,56 0,699 0,729

20 0,048 0,057 0,278 0,259 0,529 0,525 0,839 0,858 0,593 0,586 0,754 0,729

30 0,055 0,068 0,334 0,317 0,685 0,706 0,618 0,598 0,812 0,7911 0,522 0,552

50 0,06 0,056 0,379 0,323 0,461 0,481 0,716 0,78 0,401 0,464 0,624 0,522

100 0,051 0,059 0,335 0,382 0,444 0,475 0,775 0,758 0,46 0,501 0,609 0,6

Figura ii- Curva de calibração de GMP, para determinação dos parâmetros cinéticos