Diversidade 50 mil espécies de plantas

8% conhecidas e estudadas

Crescimentode 10–20%

ano

Brasil: US$ 1,5 bilhões

Mundo: US$ 20 bilhões

MERCADO DA FITODIVERSIDADEFITOTERÁPICOS

Grande potencial como matéria-prima para produção de MEDICAMENTOS e COSMÉTICOS

Brasil

Metabólitos secundários amplamente distribuídos em plantas

Elementos lipofílicos = triterpênica ou esteroidal

Elementos hidrofílicos = açúcares

GPP sintase

FPP sintase

Esqualeno sintase

Esqualenoepoxidase

Considerável valor econômico agregado

De Costa et al., Mini Rev Med Chem 11, 857-880, 2011.

✓Alimentícia:

emulsificante e agente espumante;

✓Têxtil: lavagem de tecidos finos;

✓Fotográfica;

✓Farmacêutica:medicamentos, vacinas, cosméticos e reagentes para análises clínico-laboratoriais.

SUSTAINABLE SOLUTIONS, FROM ROOTS TO CANOPY

ANTÍGENO ADJUVANTE

VACINA

Adição de ADJUVANTE leva

a vacinas com menos custo e mais eficazes

25% menos antígeno

Exploração limitada

US$ 13,4 mi extrato bruto

28 mil árvores

Quillajabrasiliensispau-sabão / timbuva

Sul do Brasil

Folhas e cascas sãoricas em saponinas

PRIMEIRO PASSO

Kauffmann et al., Nat Prod Res 18: 153-157, 2004.

Pró-sapogenina do ácido3-O-β-D-glicuronopiranosil-quiláico

AE-folhas Hidrólise ácida QB-H1

Saponinas com sinais de RMN similares

AE - folhas

QB-80 QB-90

Kauffmann et al., Nat Prod Res 18: 153-157, 2004.

Saponinas com perfil cromatográfico similar

AE - folhas

QB-80 QB-90

Saponinas de Q. brasiliensis são similares às da espécie chilena

Wallace et al., Phytochemistry Letters 20: 228-233, 2017.

ENCORAJADOR, MAS…

ESSAS SAPONINAS TAMBÉM SÃO

IMUNOADJUVANTES?

E SE SÃO, ELAS SE COMPARAM COM QUIL-A® OU OUTRO ADJUVANTE PADRÃO?

SEGUNDO PASSO

Atividade imunoadjuvante de saponinas QBBHV tipo I BHV tipo V

Efeito imunoadjuvante de QB contra herpesvirus bovino é comparável a Quil-A® de Q. saponaria (100 µg)

Fleck et al., Vaccine 24: 7129-7134, 2006; Silveira et al. Vaccine 29: 9177-9182, 2011.

poliovirus

De Costa et al., PLOS One 9 (8): e105374, 2014; Cibulski et al., CIMID 45: 1-8, 2016.

BVDV

Yendo et al. Vaccine 34: 2305-2311, 2016.

Camundongos foram desafiados com vírus letal e QB

protegeu mesmo com 1 dose

Grupo 1: AE 2DQB-90 100μg 1D/2D QB-80 50μg 1D/2D QB-80 100μg 1D/2D Fr B 50μg 2DQuil-A 50μg 1D/2D Alum 2D

Vírus da raiva

Figure 5. Rabies virus RNA recovered from challenged mice with a lethal dose of CVS 35 days after the first immunization. Black lines indicate the geometric mean. Groups received one (1D) or two (2D) immunizations of rabies vaccines. Fr 3 and Fr B groups received two doses.

Formulação de ISCOMs torna resposta mais potente

Cibulski et al., Vaccine 34: 11162-1171, 2016.

De Costa et al., PLOS One 9 (8): e105374, 2014; Cibulski et al., Vaccine 34: 11162-1171, 2016.

QB também induz a produção de anticorpos em mucosas

Fig 4. Poliovirus-specific IgA antibody responses in mice vaccinated with non-adjuvanted

vaccine or QB-90-, AE-, or Quil-A- adjuvanted preparations in bile (a), fecal (b) and vaginal

washings (c). Mice were euthanized at day 56 and bile, feces and vaginal washing samples

were collected, processed and assayed for poliovirus-specific IgA antibodies. Results are

expressed as the mean value ± S.D. (n=4). Different letters indicate significant difference by a

Tukey test (ρ ≤ 0.05).

bile fezes

Lavado vaginal

Cibulski et al., CIMID 45: 1-8, 2016.; Cibulski et al., unpublished.

QBs induzem robusta resposta humoral e celular

QB-90 (45)

IMQB-90 (23)

Ccl19Ccr7

Nos2Prf1Stat3Stat4Tbx21Lif

Cd28Cd3eCd40Cd40lgCd80Cd86Cd8a

Il12bIl15Il1bTnfTnfrsf18Icam1

Ccl2Ccl3Csf2Ctla4FasFaslGzmbPtgs2

Il9Lta

Il5Il6Il10Il15Infg

Cxcl10Cxcl11

Fn1Il7Il2ra

Il4Il2

Lrp2

(26)

(19)

Socs1Stat1Edn1

(4)

Fig 9. Distribution of genes differentially expressed with at least ≥

2 fold changes by QB-90 and IMQB-90 compared to saline group.

Menos tóxico que Quil-A®

Cibulski et al., CIMID 45: 1-8, 2016.; Cibulski et al., Vaccine 34: 11162-1171, 2016.

AE = 822,3 µg/mL

G. Paniculata = 298,6 µg/mL

Q. Saponaria = 126,6 µg/mL

QB-80 = 55,0 µg/mL

QB-90 = 95,4 µg/mL

Quil A® = 35,9 µg/mL

HD50:

150 µg/ds = 0% de mortalidade com QB-80100% de mortalidade com Quil-A®

0 2 4 4 8 7 2

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0Q B -8 0 1 5 0 g /d s

Q u il A 150 g /d s

H o u rs

Su

rv

iva

l ra

te (

%)

Q u il A 75 g /d s

Q u il A 37 ,5 g /d s

0 2 4 4 8 7 2

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0Q B -8 0 1 5 0 g /d s

Q u il A 150 g /d s

H o u rs

Su

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iva

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te (

%)

Q uil A 75 g /d s

Q u il A 37 ,5 g /d s

Menos tóxico que Quil-A®

Cibulski et al., CIMID 45: 1-8, 2016.; Cibulski et al., Vaccine 34: 11162-1171, 2016.

PODEMOS ESTIMULAR PLANTAS

PARA PRODUZIR MAIS SAPONINA

BIOATIVA POR UNIDADE DE

BIOMASSA?

Estratégias e alvos moleculares para a produção de metabólitos em cultura têm sido desenvolvidos

Aumentar metabólitos de interesse

Sistemas de cultura de células e de tecidos têm falhado para se obter rendimentos comercialmente atraentes destes metabólitos

Metabólitos secundários: ↓ concentração

Produção pode responder a estímulos ambientais:

Gobbo-Neto and Lopes, 2007.

TERCEIRO PASSO

Tratamentos podem

aumentar os teores de

saponinas nas folhas

De Costa et al, Plant Physiology and Biochemistry 66 : 56-62, 2013.

De Costa et al, Plant Physiology and Biochemistry 66 : 56-62, 2013.

De Costa et al, Plant Physiology and Biochemistry 66 : 56-62, 2013.

De Costa et al, Plant Physiology and Biochemistry 66 : 56-62, 2013.

De Costa et al, Plant Physiology and Biochemistry 66 : 56-62, 2013.

De Costa et al, Plant Physiology and Biochemistry 66 : 56-62, 2013.

Estabilidade das saponinas bioativas no pós-colheita

Yendo et al, Industrial Crops and Products 74: 228-233, 2015.

Folhas de plantas adultasFolhas de plantas jovens

Aplicaçãoindustrial:

folhas jovenssão a melhor

fonte!

Yendo et al, Industrial Crops and Products 74: 228-233, 2015.

Folhas de plantas jovens

Aplicaçãoindustrial:

folhas jovenssão a melhor

fonte!

Yendo et al, Industrial Crops and Products 74: 228-233, 2015.

OV

A

OV

A

QB

-90

QB

-80

QB

-90U

V

QB

-80U

V

QB

-90L

V

QB

-80L

V

0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

Q B -9 0 y 8 0 Ig G 1

tra ta m ie n to s

UA

/mL

OV

A

OV

A

QB

-90

QB

-80

QB

-90U

V

QB

-80U

V

QB

-90L

V

QB

-80L

V

0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

Q B -9 0 y 8 0 Ig G 2 b

tra ta m ie n to s

UA

/mL

1 Folha = 6 doses

Total de doses por m2 = 51 k

ou 150 k POR m2 COM

ELICITAÇÃO PÓS-COLHEITA

PODEMOS CULTIVAR AS PLANTAS DE

FORMA RACIONAL E SUSTENTÁVEL?

Schwambach et al., New Forests 36, 261-271, 2008.

Será que mini-jardim clonal e sistema de mini-estaquia podem ser aplicados a Quillaja brasiliensis?

Possibilita produção em larga-escala

MINI-ESTAQUIA: obtenção de mini-estacas a partir de brotos axilares de mini-cepas(planta-mãe) → enraizadas em casas de vegetação

VANTAGENS:

Estado de “juvenilidade” – aumenta enraizamento

Menor custo operacional e técnico

Produz população clonal mais uniforme

QUARTO PASSO

Cultura de meristema apical (BAP 0,05 mg.L-1) para clonagem de plantas

Enraizamento de micro-estacas (AIA 10 mg.L-1)

Germinação in vitro

Protocolos de micropropagação

Aclimatação ex vitro Manutenção ex vitro

Fleck et al.,In Vitro Cell Dev Biol – Plant 45: 715-720, 2009.

Protocolos de mini-estaquia

Mini-cepas em casa de vegetação

Mini-estacas Enraizamento de mini-estacas

87% de enraizamento5,78 mini-estacas/mini-cepa

Plantas de 6 meses de idade

20.000 mini-estacas /m2/ ano

80.000 folhas/m2/ano ou 26 g de saponinas QB

Protocolo de propagação em mini-jardim clonal

CULTIVO CLONAL DE GENÓTIPOS ELITE

1 mini-jardim clonal –cerca de 2.000 m2 (½ campo de futebol) ---- 1 jardim pode gerar 50 kg de saponinas QB por ano ----

QUINTO PASSO

Extração

Maceração H2O

Separação

Coluna RP-18

H2O – MeOH

100g / 800 mL 1g / 820 mL MeOH

QB-90 ~ 1%

Herbário da UFRGS: ICN 137550 e 142953 Autorização coleta - 010540/2011-3 – Acesso ao Patrimônio Genético - CNPq

↑ Custo da fase estacionária - Uso de solventes orgânicos- Tempo - Rendimento

QB-80 ~ 3%

Purificação de saponinas

MERCADO Global de vacinas veterinárias

2010

US$ 4,23 bi

2016

US$ 5,81 bi

2021

US$ 7,68 bi

240 mi cabeças de gado

Líder em exportação de aves

4º produtor de carne suína

52,2 mi de cães e 22 mi de gatos

MVPUS$ 480 / grama

1g = 20.000 doses (US$ 0,02/dose)

Mercado - B2B

Mercado bovino Brasil (240 mi doses/ano)

US$ 4,8 mi

Receita potencial para vacina contra 1 doença:

Cultivo Processamento Purificação Distribuição

Perspectivas

Wallace et al., Phytochemistry Letters 20: 228-233, 2017.

Shingrix - Herpes zosterMosquirix - Malária

Perspectivas

Márcia Almeida Arthur Fett-Neto

CEO e fundadoraBióloga, mestre e

doutora em Biologia Celular e Molecular.

CEO e fundadoraFarmacêutica, mestre

e doutora em Botânica.

Sócio investidorBiólogo, mestre e

doutor em Fisiologia Vegetal.

Grace Gosmann

Sócia investidoraFarmacêutica, mestre e

doutora em Ciências Farmacêuticas.

Anna Yendo

Time

UFRGS:Prof. Paulo Roehe (Virologia)

Dr. Samuel Cibulski (Virologia)

Dr. Fernanda de Costa (Botânica)

Msc. Yve Magedanz (Botânica)

Kelen Arossi (Farmácia)

Luana Colling (Biotecnologia)

Ana de Carvalho (Biologia)

UDELAR – Uruguai

Prof. Fernando Ferreira (Química)

Prof. Fernando Silveira (Bioquímica/Virologia)

Agradecimentos