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Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais

Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol

MeT 05/2016

Processos de Fermentação Alcoólica com Reciclo de Células

Celina Kiyomi Yamakawa

Jairo Silvestre Moura Leal

Jonas Nolasco Junior

Carlos Eduardo Vaz Rossell

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RESUMO

O desenvolvimento da pesquisa em fermentação alcoólica com reciclo

de células envolvem as etapas de propagação celular, formulação do substrato

e a fermentação alcoólica propriamente dita. Todas essas etapas devem ser bem

delineadas para alcançar resultados reprodutivos e conclusivos em relação ao

efeito das variáveis estudadas. Neste memorial técnico são apresentados os

métodos bases para pesquisa, desenvolvimento e validação de processos.

Palavras-chave: fermentação alcoólica, protocolo, batelada, batelada alimentada

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SUMÁRIO

RESUMO............................................................................................................ 2

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 4

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 5

3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 6

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 15

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 16

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1 INTRODUÇÃO

A pesquisa aplicada ao desenvolvimento e validação de uma nova

tecnologia em fermentação alcoólica é testada primeiramente em bancada para

reproduzir condições similares à um processo industrial, cujo objetivo é testar a

robustez e estabilidade de um novo processo ou novo produto, nova cepa ou

novo micro-organismo, e também desenvolver soluções de desengargalamentos

técnicos. As configurações empregadas em experimentos de bancada

dependem da maturidade do produto ou do processo. São eleitas

preferencialmente sistema batelada e batelada alimentada, entretanto, não se

exclui a configuração contínua.

A fermentação em batelada pura tem sido aplicada para obter dados

cinéticos fundamentais para analisar o comportamento do micro-organismo

frente à ampliação de escala, tensão de cisalhamento, inibições por substrato,

células ou produtos. Essas primeiras informações norteiam a configuração do

processo. Quando essas informações são conhecidas, o objeto de pesquisa é

testado na configuração batelada alimentada em que altas produtividades e

conversões são alcançadas.

O Laboratório de Fermentação Alcoólica pertencente ao grupo de

Biotecnologia de Processamento de Biomassa (BPB) da Divisão de

Processamento de Biomassa (Proc) do CTBE tem adotado protocolos

experimentais padrões para a pesquisa e desenvolvimento de novos processos

biotecnológicos. Assim, este memorial técnico tem por objetivo apresentar

protocolos experimentais padrões de cultivo de Saccharomyces cerevisiae, de

fermentação alcoólica em batelada e em batelada alimentada e as técnicas

analíticas de acompanhamento de processos.

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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Há inúmeras referências sobre a quantidade necessária para avaliar o

desempenho de um processo de fermentação alcoólica com reciclo de células.

Andrade et al. (2013) realizaram estudo cinético de fermentação alcoólica em

batelada com reciclo de células com substrato a partir de licor hidrolisado

celulósico de bagaço e melaço de cana de açúcar em 7 fermentações

sucessivas. O rendimento fermentativo estabilizou a partir do 4° ciclo, entretanto

a produtividade específica de etanol oscilou entre 1,75 a 2,25 a partir do 2° ciclo.

Silva et al. (2015) validaram a produção de licor hidrolisado celulósico de bagaço

de cana de açúcar em 5 sucessivas fermentações alcoólica em batelada com

reciclo de células enriquecendo o licor com extrato de levedura e KH2PO4. A

produtividade específica de etanol aumentou conforme o reciclo, sendo no 1°

ciclo de 1,94 g/L.h e no último ciclo de 5,81 g/L.h. O rendimento fermentativo

oscilou entre 85% e 88%. Rivera et al. (2013) propuseram um procedimento para

estimar os parâmetros cinéticos utilizando dados de 3 sucessivas fermentações

alcoólica em batelada alimentada com reciclo de células com caldo de cana de

açúcar. Exceto o primeiro ciclo, as duas fermentações seguintes apresentaram

perfis semelhantes de substrato, células e etanol. Marques & Serra (2004)

realizaram estudo de reciclagem de células em batelada com melaço de cana

de açúcar em baixa e alta concentração. O rendimento fermentativo foi

praticamente igual a partir do 4° ciclo no meio de baixa concentração de

açúcares diferentemente das fermentações com alta concentração de açúcares

em que houve uma variação do rendimento fermentativo.

Portanto, o número de reciclos de células dependerá do objeto do

estudo. Em geral para um levantamento preliminar de avaliação de um novo

meio ou nova cepa recomenda-se 5 a 6 ciclos que representação 4 e 5 reciclos

de células. Já para validar um novo processo e/ ou micro-organismo em termos

de robustez, produtividade, reprodutibilidade, recomenda-se no mínimo 10 ciclos

que representarão 9 reciclos. Independentemente da quantidade de reciclos é

fundamental o acompanhamento e análise de cada fermentação através de

técnicas analíticas rápidas e simples para facilitar a tomada de decisão sobre a

continuidade ou finalização dos experimentos.

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O processo em batelada é caracterizado pela transferência do meio ao

biorreator em uma única vez seguida de inoculação do micro-organismo. É uma

maneira simples e largamente utilizada em laboratório e industrialmente. No

processo contínuo há suplementação contínua de meio ao biorreator e uma

retirada contínua dos produtos, subprodutos e células. Após um determinado

tempo, as concentrações de substrato, produtos e células se mantêm

constantes. O processo contínuo fornece condições constantes para o

crescimento celular e a formação de produtos dentro de um padrão de qualidade.

O processo em batelada alimentada, substrato e nutrientes são continuamente

ou semi-continuamente alimentados enquanto que o produto é removido

intermitentemente é usualmente empregada para superar a inibição por produto

ou repressão catabólita e dessa maneira, melhorar a produtividade (Shuler &

Kargi, 1992).

O processo industrial brasileiro para produção de etanol combustível por

fermentação de caldo e melaço de cana de açúcar com reciclo de células é

predominantemente conduzido em batelada alimentada e poucas em processo

contínuo (Andrietta et al. 2011). A fermentação em batelada alimentada com

reciclo de células é também chamada de fermentação Melle-Boinot uma vez que

este foi baseado no processo desenvolvido pela Usina Melle e por Fimin Boinot

em 1936 (Patente US2230318A). O processo Melle-Boinot permitiu aumentar a

produtividade e rendimento da fermentação por meio da alta densidade celular,

alimentação gradativa de substrato que minimizaram inibições e dessa forma,

reduziu o tempo total de fermentação. Além disso, o reciclo de células eliminou

a demanda de açúcares e nutrientes somente para propagação celular.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

O experimento de fermentação alcoólica pode ser dividido nas seguintes

etapas:

Propagação celular;

Formulação do substrato;

Fermentação alcóolica.

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Neste item são apresentados os protocolos básicos de propagação

celular, formulação do substrato e fermentação alcoólica.

3.1 Propagação celular

A propagação celular inicia com a transferência da cultura pura estoque,

armazenada em criogenia em glicerol ou em placa ou em tubo slant em meio de

cultura sólido, para um meio líquido YPD formulado de acordo com a Tabela 1

denominado de pré-inoculo.

Tabela 1. Formulação do pré-inoculo

Reagentes Concentração (g/L)

Extrato de levedura 10,00 Bacto peptona 20,00 Glicose 20,00

Extrato de levedura e bacto peptona estão no estado sólidos e são

autoclavados a 121°C/ 15 minutos com quantidade de água correspondente. A

solução de glicose é preparada separadamente a aproximadamente 500 g/L e

esterilizada em autoclave. Usualmente o pré-inoculo é preparado em frasco

Erlenmeyer de 1 L com 200 mL de volume útil. As quantidades dos reagentes

correspondentes estão apresentadas na Tabela 2.

Tabela 2. Quantidade dos reagentes para 200 mL

Reagentes Quantidade Unidade

Extrato de levedura 2,000 g Bacto peptona 4,000 g Solução de glicose a 500 g/L 8,000 mL Água 192,000 mL

A solução de glicose e a cultura estoque são transferidos ao frasco estéril

sob o fluxo laminar e em seguida é incubado em um shaker orbital a 250 rpm e

temperatura entre 30 e 34°C durante 24 horas. Essas condições são variáveis e

dependem da cepa do micro-organismo. Se a cultura estoque estiver em placa

ou slant são transferidas 3 alçadas para o meio líquido.

Em seguida 10% do volume do pré-inoculo é transferido à um novo meio

chamado inoculo que é um meio similar ou idêntico ao meio de propagação da

fase seguinte. O meio inoculo contêm açúcares, sais, proteínas que fornecerão

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os nutrientes para a multiplicação celular. A Tabela 3 mostra uma formulação

típica. As soluções termosensíveis, ureia e DAP, são filtradas em membranas de

0,45 ou 0,22 micra. Os sais, extrato de levedura e água são autoclavadas juntas

a 121°C/ 15 min. O substrato convencional de processos industriais de etanol

por via bioquímica é preparado com melaço e caldo de cana de açúcar.

Usualmente formula-se com 79% de ART (açúcar redutor total) proveniente do

caldo/ xarope e o restante do melaço. O xarope é de difícil estoque uma vez que

é suscetível a contaminação, uma boa alternativa é o uso de açúcar cristal

comercial. Para isso é necessário preparar uma calda previamente. O inoculo é

incubado nas mesmas condições do pré-inoculo, mas em um tempo menor entre

6 a 12 horas.

Tabela 3. Formulação do inoculo

Reagentes Concentração Un.

Ureia (NH2)2CO 5,00 g/ L

DAP (NH4)2HPO4 1,10 g/L

Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) 1,00 g/ L

Sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) 5,00 mg/ L

Substrato- ART 80,00 g/ L

Extrato de levedura 5,00 g/ L

A propagação celular pode ser realizada em um fermentador de 2 L (New

Brunswick, EUA), apresentado na Figura 1, para atingir a massa necessária para

fermentação em alta densidade celular. A propagação começa em batelada

seguida de batelada alimentada de maneira a manter a concentração de ART

abaixo de 20 g/L para favorecer a via metabólica aeróbia da levedura. A vazão

é medida através de uma balança semi-analítica (4) instalado sob o frasco de

alimentação de substrato (3) e um cronômetro digital. Pela diferença de duas

medidas de massa dividido pelo tempo cronometrado têm-se a vazão em g/min.

e este é correlacionado com a rotação da bomba peristáltica (5). O vaso do

fermentador (2) é montado com sondas de pH e oxigênio dissolvido e esterilizado

com água potável a 121°C/ 30 min, seguindo o protocolo de operação padrão do

equipamento CTBE-ME-014/11 rev.00. Após a calibração da sonda de DO, as

soluções de sais, açúcares e o inoculo são transferidos ao vaso. O controle da

temperatura e DO é realizado através da torre de controle do fermentador (1).

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Figura 1. Set up experimental de uma propagação de levedura

Em um fermentador de 2 L o volume inicial da batelada é de 800 mL e o

volume a ser alimentado é de 1.200 mL. A formulação dos dois meios é igual

exceto pela quantidade de açúcares. O meio batelada possui 50 g/L e o meio da

batelada alimentada possui 150 g/L. A Tabela 4 apresenta a formulação do meio

de propagação celular em fermentador. O inoculo obtido na etapa anterior em

frascos é centrifugado e o pellet é diluído em água estéril até o volume total de

50 mL e transferido à um frasco mariote para inocular. A temperatura é ajustada

entre 30 e 34°C e os parâmetros de agitação de vazão de ar são controlados de

forma a manter o DO acima de 30% por controle em cascata ou ajuste manual.

Tabela 4. Formulação do meio de propagação

Reagentes Concentração Un.

Ureia (NH2)2CO 5,00 g/ L

DAP (NH4)2HPO4 1,10 g/L

Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) 1,00 g/ L

Sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) 5,00 mg/ L

Substrato – ART 50,00 g/ L

(2)

(1)

(5)

(3)

(4)

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A alimentação do meio inicia-se normalmente após 1 hora em que os

açúcares já estão abaixo de 20 g/L e quando observa-se o turvamento do meio.

A vazão é ajustada de acordo com a taxa de consumo de açúcares, mas também

pode-se adotar uma alimentação linear de forma a manter a limitação em ART.

O tempo total de propagação é entre 20 e 24 horas.

Os valores típicos de velocidade máxima específica de crescimento

(max) na fase exponencial é entre 0,30 a 0,45 h-1 e na fase estacionária é entre

0,10 a 0,15 h-1.

O meio fermentado, após a finalização da propagação, é bombeado

frasco schott que serviu de alimentação. Antes desse procedimento é necessário

aumentar a vazão de ar em 1,0 L/min para evitar a sucção do ar através do

condensador e resfriar o meio entre 15 °C e 20 °C para evitar a formação de

vácuo durante a centrifugação. Em seguida, de forma estéril, no fluxo laminar, o

meio fermentado é dividido em dois frascos de centrífuga de 1 L estéril ou

sanitizado para centrifugação em uma centrífuga Avanti J-26 XP (Beckman

Coulter, EUA) com rotor JLA-9100 a 8.000 rpm (13225,3 x g) durante 20 minutos.

Em seguida, o sobrenadante é descartado e o pellet é diluído em água no volume

requerido para compor a solução de leveduras comumente chamada de pé de

cuba, da fermentação alcoólica. Caso o tempo para o início da fermentação

alcoólica superar 20 dias, recomenda-se o armazenamento no refrigerador em

solução salina com 1% de peptona.

Figura 2. Imagem de Saccharomyces cerevisiae em microscópio óptico com lente objetiva de 40x

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As análises recomendadas durante a propagação são açúcares, etanol,

absorbância a 600 nm, e microscopia óptica. A Figura 2 mostra uma microscopia

típica com uma lente objetiva de 40x, de levedura Saccharomyces cerevisiae

durante a propagação celular, nota-se a presença de brotos na maioria das

células adultas.

3.2 Formulação do substrato

O substrato ou comumente chamado de mosto nas usinas, para

fermentação alcoólica pode ser formulado em diferentes concentrações e

proporções de caldo e melaço de cana de açúcar. Também pode ser sintético a

partir de sais, minerais e outros açúcares. Outras matérias primas também

podem são utilizadas para compor o mosto, por exemplo, licor celulósico de

bagaço de cana de açúcar. Em todos os casos recomenda-se um tratamento

físico-químico e de forma separada no caso de formulações de diferentes fontes

de açúcar ou proteínas para evitar reações indesejáveis durante a esterilização.

Basicamente um tratamento físico-químico do substrato ocorre com a

adição de ácido fosfórico, H3PO4 a 85%, adição de leite de cal até atingir pH de

6,4, seguido de aquecimento até 95°C e então adição de polímero não-iônico.

Em seguida mantém em repouso para a formação de flocos seguida de

resfriamento e separação por centrifugação ou decantação. O tratamento físico-

químico visa formar flocos para agregar os sólidos suspensos que possam

decantar a uma velocidade satisfatória, fornecer condições de temperatura, pH

e concentração de íons que maximizam a precipitação das impurezas solúveis e

enfim produzir um meio clarificado de alta qualidade com mínima turbidez e baixa

concentração de cálcio. A função do H3PO4 é remover corantes e parte dos

coloides. O leite de cal somado ao aquecimento induzem a precipitação de

fosfato de cálcio, sais de ácidos orgânicos, proteínas desnaturadas, gorduras,

ceras e gomas. O polímero adicionado no final do processo tem por objetivo

formar cadeias longas de massa molecular alta para arrastar as impurezas

(Coopersucar, 1987). As quantidades de ácido fosfórico e polímero são

determinadas previamente em um teste de bancada inicial.

Após o tratamento físico-químico, o mosto é dividido em frascos

Erlenmeyer na quantidade necessária para cada fermentação para ser

esterilizado a 121°C ou de acordo com o procedimento experimental. O tempo

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de esterilização dependerá da concentração do mosto e do volume. Recomenda-

se usar no máximo 50% do volume total do frasco para permitir uma troca térmica

efetiva.

O cálculo da concentração de ART no mosto é definido em função da

concentração de etanol final desejado e da conversão aproximada de substrato

à etanol (YP/S). Assim são necessários definir os principais parâmetros listados a

seguir:

Concentração de etanol final: a faixa típica industrial é entre 67 g/L (8,5%

v/v) e 75 g/L (9,5% v/v), mas há usinas que operam acima desse valor e há

linhas de pesquisas para obter vinhos de alto teor alcoólico (15%v/v) devido

às inúmeras vantagens. Para esse cálculo é necessário considerar o etanol

que é reciclado juntamente com a suspensão celular após o tratamento de

células (pé de cuba);

Taxa de reciclo (R): relação da quantidade de pé de cuba sobre soma de pé

de cuba e mosto. O valor usual é de 0,3 no processo batelada alimentada,

ou seja, 1/3 do volume total do fermentador é dedicado ao pé de cuba e 2/3

do fermentador é para o mosto;

Conversão aproximada (YP/S): conversão de açúcares fermentescíveis a

etanol. O valor teórico estequiométrico é de 0,511 g/ g. Comumente

adotamos o valor de 0,46 g/g que corresponde a um rendimento de 90%

para considerar o desvio de substrato para crescimento e manutenção

celular, produção de ácidos orgânicos, glicerol e outros subprodutos;

Concentração de células (X): tipicamente o processo Melle-Bonoit opera

com 10% (v/v) ou cerca de 30 g/ L (base seca). Portanto, com uma taxa de

reciclo de 0,3, a concentração do pé de cuba deve ser de 90 g/ L para atingir

30 g/ L após o término da alimentação de mosto. Tipicamente a relação de

base seca para base úmida é de 3. Essa relação pode alterar em função da

cepa de levedura e das condições de fermentação.

É apresentado um exemplo para ilustrar o cálculo para definir a

concentração do mosto.

Teor alcoólico do vinho final: 9,5 °GL ou 75 g/L;

Taxa de reciclo (R): 0,3;

Conversão aproximada (YP/S): 0,46;

Concentração de células (X): 10% (v/v) ou 30 g/L.

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O volume útil do fermentador é de 2,1 L. Assim, a quantidade de pé de

cuba corresponderá a 700 g e a quantidade de mosto será de 1633 g. A

quantidade final será de aproximadamente 2.100 g descontando quantidade de

CO2 liberado e a quantidade de perda por amostragem considerando 15 g em 5

amostragens.

Quantidade de CO2 produzido = Etanol produzido x 0,956.

Etanol produzido = massa de ART x 0,46 + massa de pé de cuba x

concentração de etanol no pé de cuba/ densidade.

Estimativa da concentração de etanol no pé de cuba = concentração de

etanol no vinho final x massa úmida de células/ massa de pé de cuba => 75

g/ L x 189 g / 700 g = 20,25 g/ L.

A quantidade de ART necessário obtém através do cálculo interativo, por

exemplo com o solver do Excel, considerando as restrições de taxa de reciclo

e volume final.

Figura 3. Exemplo de cálculo no Excel

Dessa forma, a quantidade de mosto necessário é de 2.177,2 g a 217,46

g/L.

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3.3 Fermentação alcoólica

A diferença da fermentação alcoólica em batelada e batelada alimentada

é a maneira que ocorre a transferência de substrato. Em ambos os casos a

suspensão de células estará no fermentador previamente. No caso da batelada

alimentada, após o tratamento celular, todo mosto é bombeado de uma só vez.

Já na batelada alimentada, o mosto é bombeado gradativamente.

Figura 4. Diagrama de blocos de fermentação alcoólica com reciclo de células

A Figura 4 apresenta esquematicamente o processo base de

fermentação alcoólica com reciclo de células. A fermentação alcoólica inicia com

a transferência primeiramente da suspensão celular ao fermentador e em

seguida transfere-se o substrato previamente formulado, tratado e esterilizado.

Durante a fermentação há exaustão de CO2 pelo condensador, assim espera-se

que o peso final do vinho seja menor que a soma da massa do que entrou,

suspensão celular e substrato. Durante a exaustão dos gases há arraste de

componentes voláteis que representam cerca de 1 a 2% de etanol produzido.

Após o término da fermentação, o meio fermentado chamado de vinho é

centrifugado. O meio fermentador isento de células é descartado ou destilado. É

interessante fixar a massa úmida de pellet para iniciar a próxima fermentação

com aproximadamente a mesma quantidade de células iniciais. Após ajustar a

quantidade de biomassa úmida, acrescenta-se água potável estéril para diluir o

pellet e transferir de volta ao fermentador. O tratamento ácido é realizado no

mesmo vaso de fermentador. Se a próxima fermentação não começar

imediatamente, a suspensão celular deve ser mantido refrigerado a 10°C e

aerado para manter a pressão positiva no biorreator. Assim a fermentação

seguinte inicia com o ajuste da temperatura e tratamento ácido.

Fermentação alcoólica

CentrifugaçãoTratamento

ácido

VinhoCreme de levedura

Vinho delevurado

Água

Ácido

Pé de cuba

Mosto

CO2

V.C.

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O balanço mássico para calcular rendimento fermentativo, produtividade

de etanol e de células é realizado no volume de controle em destaque (V. C.).

As massas de suspensão celular, substrato e meio fermentador são medidas por

peso em balança semi-analítica e a massa de CO2 liberado é calculado

indiretamente em função da quantidade de etanol produzido. Os componentes

são analisados por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). A

determinação da concentração de células é realizada por gravimetria. A

densidade de cada corrente é consultada em tabelas que correlacionam com a

quantidade de sólidos solúveis (°Brix) ou medidas.

Durante a fermentação são realizadas análises de monitoramento por

meio de espectroscopia de infravermelho com curvas calibradas de sacarose,

açúcares redutores (glicose e frutose) e etanol. A concentração celular é

monitorada por análise de absorbância a 600 nm e também por analisador on

line de capacitância. Outras técnicas podem ser aplicadas para controlar e

monitorar o desenvolvimento de processos de fermentação alcoólica.

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

É fundamental um protocolo experimental base para o desenvolvimento

da pesquisa em fermentação alcoólica seja em batelada, batelada alimentada

ou contínua e validação de novos processos.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

De Andrade, R.R. et al., 2013. Kinetics of ethanol production from sugarcane bagasse enzymatic hydrolysate concentrated with molasses under cell recycle. Bioresource Technology, 130, pp.351–359.

Andrietta, M., Andrietta SR & Stupiello, E., 2011. Bioethanol what has Brazil learned about yeasts inhabiting the ethanol production processes from sugar cane? , pp.67–84. Available at: http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/20057.pdf.

Rivera, C. E. et al., 2013. A Procedure for Estimation of Fermentation Kinetic Parameters in Fed-Batch Bioethanol Production Process with Cell Recycle. Chemical Engineering Transactions, 32, pp.1369–1374.

Coopersucar, Cooperativa de produtores de cana, açúcar e álcool do estado de São Paulo (1987): Fermentação. São Paulo.

Marques, T.A. & Serra, G.E., 2004. Estudo da reciclagem de células na produção biológica de etanol. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 24(4), pp.532–535.

Boinot, F. & Melle,1936. Process for carrying out industrial alcoholic fermentations. Patent US2230318A.

Silva, V.F.N. et al., 2015. Using of cell recycle batch fermentations to validate a setup for cellulosic ethanol production. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, (February), p.n/a–n/a. Available at: http://doi.wiley.com/10.1002/jctb.4778.

Shuler, M. & Kargi, F., 1992. Bioprocess Engineering: Basic concepts. Prentice Hall, ISBN 0-13-478215-1.