MET-UCCIRT-Res-55 2 Cloranfenicol en tejido animal y leche

OFICINA DE CENTROS DE DIAGNÓSTICO Y PRODUCCIÓN

Unidad del Centro de Control de Insumos y

Residuos Tóxicos MET-UCCIRT/Res-55

MÉTODO DE ENSAYO: “DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE CLORANFENICOL EN TEJIDO ANIMAL Y LECHE POR CROMATOGRAFÍA LIQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TANDEM (LC/MS-MS)”

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TABLA DE CONTENIDO:

Introducción.

1. Objetivo.

2. Campo de aplicación.

3. Referencias.

4. Definiciones.

5. Metodología.

6. Antecedentes.

7. Anexos.

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

Dealí Salazar Huamaní Especialista UCCIRT

Orlando Lucas Aguirre

Director UCCIRT

Cesar de la Cruz Director OCDP

FIRMA

FECHA 31/08/2021

06/09/2021

06/09/2021

Fernando Carrasco

Solis Especialista UCCIRT

FIRMA

FECHA 31/08/2021





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INTRODUCCIÓN

Método de ensayo implementado, tomando como referencia el Journal of AOAC

International Vol, 86 N°6, 2003; el cual se utiliza para el análisis cuantitativo de residuos de

cloranfenicol en músculo de tejido animal y leche mediante Cromatografía Líquida acoplada

a Espectrometría de Masas en Tándem (LC/MS/MS).

1. 1. OBJETIVO

Determinar cuantitativamente residuos de cloranfenicol en tejido animal y leche mediante

Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas en Tándem (LC/MS/MS).

2. 2. CAMPO DE APLICACION

Este método aplica para la “Determinación de residuos de cloranfenicol en tejido animal y

leche por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tandem (LC/MS-

MS)” cubriendo el nivel de LMPR (límite máximo de performance del equipo de 0.3 ppb).

3. 3. REFERENCIAS

Referencia de los documentos relacionados al procedimiento:

• ITR-UCCIRT/Res-04 Manejo del cromatógrafo liquido de alta performance (HPLC)

Alliance 2695 XE.

• Manual Xevo TQXS

• ITR-UCCIRT/Res-05 Manejo del generador de nitrógeno NM30LA/ NM32LA

• ITR-UCCIRT/Res-06 Manejo del espectrómetro de masa Quattro Premier.

• ITR-UCCIRT/Lab-07 Lavado de materiales de la UCCIRT.

• REG-UCCIRT/Lab-30 Registro de verificación de la balanza.

• ITR-UCCIRT/Lab-06 Manejo del Sistema de Gases y de la Unidad de Vacío de la

UCCIRT.

• REG-UCCIRT/Lab-61 Hoja de Trabajo de Ensayos.

• REG-UCCIRT/Res-10 Registro de toma de muestras.





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4. 4. DEFINICIONES

4.1 Cloranfenicol

El cloranfenicol (CAP) es un antibiótico de amplio espectro que interfiere con la

síntesis proteica de muchas bacterias gram (-) y gram (+) por lo que se utiliza para

tratar ciertas infecciones bacterianas en animales como pollos, cerdo, camarón, etc.

Sin embargo puede causar anemia aplástica en seres humanos. En 1997 la agencia

de gobierno de los Estados Unidos, responsable de la regulación de alimentos

“Administración de Medicamentos y Alimentos” (FDA), decretó la prohibición del uso

de cloranfenicol en los animales productores de alimentos, tres años antes la

comunidad europea había tomado la misma medida mediante la “Commission

Regulation 1430/94” ,esta sustancia por su alta peligrosidad se toma en cuenta el

concepto definido por la comunidad europea “límite mínimo de funcionamiento

exigido” (MRPL), estableciendo un valor para el cloranfenicol de 0,3ug/kg en carne,

huevo, leche, orina, productos de acuicultura, y miel, en ese sentido El Servicio

Nacional de Sanidad Agraria (SENASA-PERÚ), mediante resolución directoral (RD-

0072-2013 MINAGRI-SENASA-DIAIA) , prohíbe la importación y comercialización de

Cloranfenicol, entre otros principios activos.

5. 5. METODOLOGÍA.

El método es ejecutado por el especialista o técnico autorizado en el registro listado

de personal autorizado para realizar ensayos REG-UCCIRT/Cal-11.

5.1 Principio

Este método se basa en que los residuos de CAP son extraídos del tejido animal y

leche con acetato de etilo mediante extracción líquido-líquida y concentrada por

evaporación. Los extractos son analizados mediante cromatografía líquida usando

una columna de fase reversa y el CAP determinado mediante un Espectrómetro de

Masas en Tándem usando Ionización Electrospray (ESI) en modo negativo.

5.2 Precauciones de seguridad en el laboratorio





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Para la ejecución de este método de ensayo se deben usar los siguientes equipos

de protección: guantes de nitrilo, mandil, lentes de protección y mascarillas

respiradoras, para la manipulación de solventes orgánicos como hexano y acetato

de etilo es obligatorio trabajar dentro de la campana extractora.

5.3 Precauciones analíticas

Es importante verificar que los materiales se encuentren lavados de acuerdo al

instructivo (ITR-UCCIRT/Lab-07) y que se encuentren aptos para la realización del

análisis.

El procedimiento de extracción involucra muchos pasos, tomar todas las

precauciones para evitar contaminación cruzada con los estándares.

También es importante verificar la calidad y vigencia de los reactivos y estándares

empleados en el análisis.

Durante el análisis el personal debe aplicar las buenas prácticas de Laboratorio.

5.4 Materiales y equipos.

5.4.1 Materiales:

• Tubos de polipropileno descartables de 15 y 50 ml con tapa rosca.

• Tabla de picar.

• Envases de vidrio para la conservación de la muestra.

• Cuchillos de acero inoxidables.

• Diferentes pipetas automáticas con volumen variable que permitan medir

volúmenes requeridos para el análisis (ver punto 5.6)

• Tips según la micropipeta a usar (ver punto 5.6)

• Pipetas Pasteur.

• Gradilla para tubos.

• Viales silanizados de 2 ml para autosampler HPLC.

• Fiolas de 10, 25, 100 y 1000 ml.

• Insertos de 250 - 300 µL para autosampler HPLC.

• Jeringas descartables de 1 ml.

• Filtros de jeringa PTFE 13 mm, 0.45 µm.

• Equipo de protección personal.





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5.4.2 Equipos:

• Moledor de carne.

• Balanza analítica Digital con precisión de 0,1 mg o mejor para pesaje de

estándares.

• Homogeneizador para tubos tipo Vortex

• Centrífuga con capacidad para funcionar a más de 3000 rpm

• Evaporador con flujo de nitrógeno

• Lavador ultrasónico

• Para LC MSMS Q-Premier: Columna cromatográfica LC: T3 C18 ; 150 X 3 mm,

3µm, 150Å / T3 C18 ; 100 X 3 mm, 3µm, 100Å / 2.1 X 150 mm, 3µm, 100Å

• Para UPLC MSMS XEVO TQXS: Columna cromatográfica 1.7 µm (2.1 x 100

mm)

• Sistema LC: Sistema HPLC/MSMS Alliance 2695_Q-Premier o UPLC/MSMS

Xevo TQXS , ambos con sonda ESI negativo

• Sistema de filtración para fases móviles

• Bomba de vacío.

5.5 Reactivos :

5.5.1 Sustancias químicas

• Agua ultrapura grado HPLC

• Acetonitrilo grado LCMS y/o HPLC.

• Metanol grado LCMS y/o HPLC HPLC.

• Acetato de etilo grado reactivo

• Hexano grado HPLC o grado reactivo.

• Cloruro de sodio grado reactivo.

• Sulfato de magnesio anhidro.

• Acetato de amonio grado reactivo.

• Formiato de amonio grado reactivo.

5.5.2 Fase móvil para HPLC/MSMS Q-Premier

Fase móvil A: Fase móvil B (60:40)





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• Fase móvil A: Disolver 0,770 g de acetato de amonio en una fiola de 1000 ml

con agua grado HPLC.

• Fase móvil B: Acetonitrilo 100 %.

5.5.3 Fase móvil para UPLC/MSMS Xevo TQXS

Fase móvil A: Fase móvil B (70:30) modo Isocrático

• Fase móvil A: FORMIATO DE AMONIO 0,5mM

Disolver 0,315 mg de formiato de amonio en una fiola de 1000 ml con agua

grado HPLC.

• Fase móvil B: Acetonitrilo 100 %.

5.5.4 Estándares:

• Cloranfenicol estándar de referencia, de pureza mayor a 98%.

• Cloranfenicol D5. CAP D5 de concentración 100 ug/ml. 5.6 Análisis de muestra.

5.6.1 Preparación de los estándares de Cloranfenicol.

• Solución stock primaria, aprox. 2000 µg/mL. (Sol 1) Pesar 20 mg de cloranfenicol estándar de referencia en una fiola de 10 mL (balón aforado), disolver con metanol con ayuda de un baño ultrasónico, atemperar y aforar con metanol. Almacenar a temperatura (-10° a -30°C). Estable un año.

• Solución stock intermedia, aprox. 5 ug/mL (Sol 2). Transferir 25 µL de solución stock a una fiola de 10 mL, diluir y enrasar con metanol. Almacenar a temperatura (-10° a -30°C). Estable 3 meses.

• Solución de fortificación y Curva de Calibración, 100 ng/ml (Sol 3). Preparar para cada análisis; transferir 200 µL de solución stock intermedia 5 µg/mL y diluirla en una fiola de 10mL con agua y almacenar en refrigeración.

5.6.2 Preparación del estándar interno CAP-D5

• Solución stock de estándar interno CAP-D5, 2 ug/ml (2 ppm) (SI 1) Transferir una alícuota de 100 µL de la solución stock 100 ug/ml a una fiola de 5 ml, diluir y enrasar con metanol.





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• Solución de estándar interno CAP-D5, 0,2 ug/ml (200 ppb) (SI 2) Tranferir una alícuota de 100 µL de la solución SI 1 a una fiola de 10 ml, diluir y enrasar con metanol. • Solución de estándar interno CAP D5, 2 ng/ml (2 ppb). Tranferir una alícuota de 100 µL de la solución SI 2 a una fiola de 10 ml, diluir y enrasar con agua. Nota: de requerirse diferente volumen hacer los cálculos proporcionales para alcanzar la concentración de 2 ng/ml (2 ppb).

5.6.3 Preparación de los estándares para la curva de calibración.

• Soluciones conteniendo 0,1; 0,3; 1; 3 y 5 ng/g de CAP y 50 ng/mL de CAP D5, en agua. (Solución stand. Interno 50 ng/mL)

1. Tomar los volúmenes según el nivel (ver tabla) y llevar a un Vial.

Nivel de concentración m/v

Concentración Equivalente m/m

Solución CAP 100 ng/mL

1 ng/mL 0.1ng/g 10 µL 3 ng/mL 0.3ng/g 30 µL 10 ng/mL 1ng/g 100 µL 30 ng/mL 3ng/g 300 µL 50 ng/mL 5ng/g 500 µL

2. Luego evaporar por completo con corriente de nitrógeno. 3. Reconstituir todos los tubos con 1 mL de solución de estándar interno 50ng/mL,

homogenizar con ayuda de Vortex por 1 minuto, luego con ultrasonido por 3 minutos y nuevamente con vortex por 30 segundos

4. Filtrar a través de un filtro de jeringa PTFE 0,45 µm dentro de viales del autosampler de HPLC.

5.6.4 Preparación y extracción del cloranfenicol en la muestra.

• Preparación de la muestra para el análisis La muestra se corta en pequeñas piezas para luego llevarlo al procesador de carnes, se homogeniza y una porción representativa se transfiere a bolsa de polietileno con cierre hermético previamente etiquetados. La muestras se conservan a – 20ºC hasta el momento del análisis. • Extracción del cloranfenicol Analizar un control negativo y controles positivos con cada set de muestras.





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a. Pesar 10 g de muestra y blancos de matriz en tubos de centrifuga de polipropileno de 50 mL.

b. Para las muestras de control positivo, Para fortificar las muestras adicionar volúmenes de Solución CAP 100 ng/mL en Agua, según la tabla:

c. Para el blanco de reactivo usar tubo vacío

d. A todos los tubos añadir 5mL de agua y agitar vigorosamente sobre un Vortex por 10 min.

e. Añadir 20mL de acetato de etilo y agitar vigorosamente sobre un Vortex por 10 min, luego centrifugar los tubos por 4000rpm por 5 minutos

f. Transferir todo el extracto orgánico a un tubo de vidrio de 50mL, y llevar a sequedad con flujo de nitrógeno y una temperatura de 55 0C ± 2 0C.

g. Reconstituir los residuos con 1,0 mL de solución CAP D5 50 ng/ml y mezclar sobre un vortex y luego sonicar por 10 min

h. Filtrar a través de un filtro de jeringa PTFE 0,45 um dentro de viales del autosampler de HPLC.

Nivel de concentración m/v

Concentración Equivalente m/m

Solución CAP 100 ng/mL

Blanco de reactivos 0 ng/g 0 µL 3 ng/mL 0.3ng/g 30 µL

10 ng/mL 1ng/g 100 µL





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Flujograma del método

Continúa en la siguiente página;

Pesar muestra homogenizada y molida

en tubos de polipropileno de 50mL.

(10g+/- 0.05g) →Muestras y

fortificados.

Adicionar 5mL de agua y agitar

vigorosamente en un vortex por 10min,

luego llevar a baño ultrasónico x 5min,

agregar 20 mL, de Acetato de Etilo y vortizar

por 10 minutos y centrifugar los tubos a

4000rpm x 5min luego transferir el extracto

orgánico a un tubo de vidrio de 50mL

Llevar a sequedad los 20 ml de extracto

orgánico bajo una temperatura de 550C y flujo

de nitrógeno, luego reconstituir con 1ml de

CAP-D-5 (50ng/mL), sonicar a 400C por 5min,

vortizar por 5 minutos

Filtrar sobre viales autosampler de 2ml,

finalmente llevar a lectura por LC-MSMS

Fortificación:

Agregar volúmenes de 30 y 100 uL, de la

solución stock CAP 100ng/ml, acuoso

Inicio





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Preparación de estándar Cloranfenicol

Preparación de estándar interno Cloranfenicol-D5

Tomar 25µL de solución de (2000ng/uL) y

diluirlas en una fiola de 10mL con MeOH (Sol.

Stock Intem. (5ug/ml).

Pesar 20mg de estándar, y diluir

con metanol, en fiola de 10 mL

(Sol stock. Primaria (2000ng/uL)

Tomar 200µL de (Sol. Stock Intermedia

5ug/ml) y diluirlas en una fiola de 10mL con

Agua (Solución CAP 100ng/ml)

Transferir 50uL, de una solución

stock 100 ug/mL, a una fiola de

100mL y aforar con agua,

( Sol. Stock Std Interno 50ng/ml)

Fin





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5.6.5 Condiciones del Cromatógrafo Líquido (UPLC):

Equipo: Sistema de Cromatografía: UPLC – Waters/ ACQUITY I-CLASS PLUS. Columna: ACQUITY UPLC : C-18 — 100 x 2.1 mm id, 1.7µm Temperatura de Columna: 40°C Volumen de inyección: 4 ul Solvente, Isocrático

5.6.6 Condiciones del Espectrómetro de Masa en Tandem (MS/MS):

Equipo: Quattro

Premier XE (Waters, Milford, MA, USA). Polaridad: ESI positivo Voltaje del Capilar (kV): 3.0 Voltaje de Cono (V): variable Temperatura de la fuente (ºC): 120 Temperatura de desolvatación (ºC): 350 Flujo del gas de desolvatación (L/h): 650 Flujo del gas de cono (L/h): 50 Resolución LM 1: 15.00 Resolución HM 1: 15.00 Energía del ión 1(eV): 0.2 Entrada: 1 Colisión: 2 Salida: 1 Resolución LM2: 15.00 Resolución HM2: 15.00





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Parámetros del MRM:

Se utiliza dos transiciones MRM una para cuantificación y otra para confirmación:

ANALITO Transición MRM

Precursor Productos

CLORANFENICOL (CAP) Cuantificación

Confirmación

320.9

151.9

256.9

175

D5-CLORANFENICOL

(D5-CAP)

Cuantificación 326

157

5.6.7 Secuencia de inyección:

� Blanco de reactivo.

� Blanco de matriz.

� Estándar 0.1 ppb.





� Fortificado 0.3 ng/g.

� Fortificado 1 ng/g.

� Blanco de matriz o Blanco de reactivo.

� Muestras.

� Cada 20 muestras incluir un control de Estándar 0.3 ppb.

5.7 Cálculo y expresión de resultados

La cuantificación de los resultados se realiza interpolando las respuestas en

áreas de las muestras analizadas en la curva de calibración.





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Los datos crudos se anotan en el REG-UCCIRT/Lab-61, disponible en el PRO-

UCCIRT/Lab-06 Control de Datos.

El procesamiento de datos de las muestras, blancos, y estándares se realiza

con el software MassLynx 4.1 con la aplicación QuanLynx 4.1.

610

100)(/ ××××=

FDst

FDmpPot

Wmp

Wst

FRst

FRmpppbgng

Donde:

Fmp: Relación de las área de la muestra versus área del estándar Interno.

Fst : Relación del área del estándar versus área del estándar Interno.

Wst : Peso del estándar expresado en mg.

Wmp : Peso de la muestra expresado en g. FDmp : Factor dilución de muestra.

FDst : Factor dilución de estándar.

Recuperación:

En las muestras fortificadas el porcentaje de recuperación debe calcularse de la

siguiente forma:

% Recuperación = Conc. d x 100

Conc. f

Donde: Conc. d = Concentración determinada de CAP en la muestra, ng/g Conc. f = Concentración adicionada de CAP, ng/g

5.8 Control de Calidad aplicado al método de ensayo

Control de calidad Interno

Frecuencia Criterio

de aceptación

Acción inmediata*

Acciones en casos reiterativos **

Blanco reactivo En cada lote de muestras analizadas

< LoD Corroborar resultado con Blanco Matriz.

Verificar St y reactivos usados. Repetir Blanco Reactivo.





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Blanco Matriz En cada lote de muestras analizadas

< LoQ

Si Blanco Reactivo también incumple criterio, Repetir el lote analizado

Verificar St y reactivos usados. Repetir lote analizado.

Duplicados

Por cada 5 muestras se hace un duplicado a uno de ellos elegido al azar.

RSD < 20%

En caso positivo, Repetir la muestra analizada

Verificar la homogeneidad de la muestra y repetir análisis.

Blanco Matriz Fortificado

En cada lote de muestras analizadas.

Recuperación 50-120%

Repetir las inyecciones de los viales, después de verificar la performance del equipo. Y si no cumple repetir el lote analizado.

Reevaluar el método de ensayo.

Estándar de verificación de calibración (QC)

Inyectar mínimo el Estándar 0.3 ppb Al final de cada lote de análisis.

RSD ≤ 20% con respecto a

la primera inyección.

Verificar la performance del equipo y repetir el total de inyecciones.

Reevaluar la estabilidad de estándares.

* acción inmediata tomada cuando no se cumple los criterios establecidos ** Las acciones en casos reiterativos (tres o más casos) necesariamente originan la apertura de una SACP.

6. ANTECEDENTES

• Hammack Et Al.: “Multilaboratory Validation of a Method To Confirm

Chloramphenicol in Shrimp and Crabmeat by Liquid Chromatography-Tandem

Mass Spectrometry”. Journal of AOAC Internacional Vol, 86, N° 6, (2003), 1135-

1142.

7. ANEXO

No Aplica.

MET-UCCIRT-Res-55 2 Cloranfenicol en tejido animal y leche

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