UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOCENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCINCIASDEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICABACHARELADO EM QUMICA INDUSTRIALBIOQUMICA APLICADA

Metabolismo

ESTUDANTES: Jailson SilvaJoyce Evanns Mayra Weddija Welenilton JniorPROFESSORA: Jenyffer Medeiros CamposTURMA: I0 e I1

Recife, dezembro de 20131. Introduo

O termo metabolismo celular usado em referncia ao conjunto de todas as reaes qumicas que ocorrem nas clulas. O metabolismo dos microrganismos influenciado por uma srie de variveis que podem interferir na sua sobrevivncia e/ou rendimento dos processos metablicos. Entre estas variveis, destacam-se as ambientais, fsicas, qumicas e biolgicas. A temperatura, varivel ambiental mais significativa para o processo, sem dvidas o fator mais importante na interferncia do crescimento, e sobrevivncia dos microrganismos. Tanto temperaturas muito frias ou muito quentes so capazes de reduzir o crescimento dos micrbios, mas a temperatura mnima e a mxima so variadas para cada espcie de microrganismo. Quando a temperatura aumenta, reaes qumicas e enzimticas na clula procedem mais rapidamente e o microrganismo tem um crescimento mais rpido. Entretanto, acima de determinada temperatura, as protenas podem ser irreversivelmente desnaturadas e as funes celulares caem acentuadamente ao zero. O pH outro fator importante, como bem sabemos, ele varia de acordo com a composio do meio, influenciando o comportamento dos microrganismos, que em sua marioria tem pH timo em torno da neutralidade. Contudo muitos processos fermentativos se desenvolvem melhor em pH cido, geralmente em torno de 5,0.As fontes de carbono, desencadeiam os processos de regulao metablica. Os meios de cultivo industriais apresentam composies complexas, e um exemplo tpico o meio utilizado na produo de cerveja, que tem como fonte de nitrognio uma mistura de aminocidos, uma pequena quantidade de amnia livre e como fonte de carbono uma mistura de carboidratos. Os sais representam substncias reguladoras do metabolismo celular, tm participao nos mecanismos de osmose, estimulando em funo de suas concentraes, a entrada/sada de gua na clula. A concentrao dos sais na clula determina o grau de densidade do material intracelular em relao ao meio extracelular. Em funo dessa diferena ou igualdade de concentrao que a clula vai se mostrar hipotnica, isotnica ou hipertnica em relao ao seu ambiente externo, justificando as correntes osmticas ou de difuso atravs da sua membrana plasmtica sendo, por essa razo, altamente importantes para a manuteno do equilbrio hidrossalino, da presso osmtica e da homeostase na clula.O objetivo desse experimento foi demonstrar de maneira emprica como essas quatro variveis so de fato significativas nos processos metablicos das clulas, influenciando o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae em diferentes condies ambientais.

2. Materiais e Mtodos

2.1 Materias Extrato de levedura; Uria; Soluo de KH2PO4; MgSO4.7H2O; gua destilada; Glicerina; Etanol; Microrganismo: Saccharomyces cervisiae; Amido; Celulose; Sacarose; Glicose; Ernlenmeyers; Algodo hidrofbico; Recipientes plsticos; Esptulas; Basto de vidro; Tubos de ensaio; Estante para tubos de ensaio; Pipeta graduada de 5 mL com pera; Bico de bnsen; Balana analtica; Encubadora.

2.2 Procedimento Experimental

2.2.1 Preparao do Meio

Efeito da temperatura;O meio foi preparado utilizando-se ureia, glicose, extrato de levedura, KH2PO4, MgSO4.7H2O e gua destilada. Posteriormente a soluo foi separada em trs partes e cada uma foi armazenada uma temperatura diferente, 4C, 30C, e 60C.

Efeito do pH;O meio preparado foi exatamente igual ao do item efeito da temperatura. Aps o preparo, a soluo foi dividida em trs partes e cada uma teve o pH ajustado para uma faixa diferente, 2, 7 e 10.

Efeito da fonte carbono;O meio foi preparado contendo uria, extrato de levedura, KH2PO4, MgSO4.7H2O e gua destilada. Este foi separado em trs partes e a cada uma foi adicionada uma fonte de carbono diferente: glicose, sacarose e celulose.Para as fontes de carbono, amido, etanol e glicerina, foram utilizadas na preparao do meio, em uma proveta de 500 mL: de 0,6 g de extrato de levedura; 0,3 g de uria; 0,15 g de MgSO4.7H2O; 270 mL de gua destilada.

Aps o preparo da soluo, esta foi separada em trs erlenmeyers, 90 mL em cada, nos quais foram adicionadas as fontes de carbono: 1 g de amido no primeiro, 20 g de glicerina no segundo e etanol no terceiro. Posteriormente foi adicionado ao meio 10 mL de uma soluo de KH2PO4. Os erlenmeyers foram tampados com algodo hidrofbio. Em seguida, os erlenmeyes contendo as solues foram armazenados numa incubadora 30C por uma semana.

Efeito da concentrao de sais.Para a preparao do meio foram utilizados glicose, extrato de levedura, ureia, KH2PO4, MgSO4.7H2O e gua destilada. Em seguida a soluo foi dividida em 5 partes, no foi adicionado NaCl na primeira, adicionou-se 1% de NaCl segunda, 5% de NaCl terceira, 8% de NaCl quarta e 10% de NaCl quinta parte.

2.2.2 Inoculao

Aps uma semana do preparo do meio, foi realizada a inoculao. Esta foi conduzida de maneira assptica com a utilizao da chama do bico de bnsen. Foram separadas 17 tubos de ensaio contendo os meios preparados anteriormente, cada um com uma condio ambiental: 3 tubos para analisar a influncia de diferentes temperaturas; 3 para diferente pHs; 6 para diferentes fontes de carbono; 5 para diferentes concentraes de sais. cada tubo foi adicionada, utilizando uma pipeta estril e sobre a chama do bico de bnsen,1 mL da suspenso de levedura contendo o microrganismo Saccharomyces cervisiae. Em seguida os tubos foram armazenados numa incubadora por alguns dias 30C.

2.2.3 Determinao de biomassa

Aps alguns dias de encubao os tubos foram analisados para determinar as mudanas ocorridas no meio. Os resultados foram anotados.

3. Resultados e Discusses

3.1 Efeito da Temperatura

Aps uma semana de crescimento da levedura no meio, foram avaliados os efeitos das temperaturas de 4, 30 e 60 C. A figura 1 mostra os produtos obtidos. O crescimento foi avaliado pela formao de um corpo de fundo nos tubos de ensaio, que indica (as leveduras em si, ou o produto da fermentao delas?). Foi notado esse corpo de fundo no tubo de ensaio submetido a 30C, o que est de acordo com a literatura, que estima uma faixa de 25-30C de temperatura tima para o crescimento, sendo que at 40C a levedura consegue crescer (com menor rendimento).

Figura 1. Efeito da temperatura no crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae

3.2 Efeito do pH

De acordo com a literatura o pH timo para o crescimento da levedura 5.0~5.3, atende as expectativas do experimento. O corpo de fundo s foi notado no tudo de ensaio com pH 7,0, sendo os outros dois condies muito extremas para o desenvolvimento significativo do fungo.

Figura 2. Efeito do pH do meio reacional no crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae.

3.3 Efeito da fonte de carbono

Clulas haplides de Saccharomyces cerevisiae crescem principalmente em meio com cujos susbtratos so mais fermentveis como glicose e frutose, mas podem ser utilizadas outras fontes de carbono (aucares alternativos) sacarose, maltose, orgalactose, galactose e rafinose, ou compostos no fermentveis como glicerol, lactato, etanol e oracetate. Como esperado, no foi notado crescimento nos meios com celulose e amido. O meios com etanol e glicerol tambm no foram favorveis ao crescimento da levedura, o que pode ser atribudo a baixa concentrao deles em soluo. O crescimento ocorreu apenas nos meios com glicose e sacarose, que so fontes de carbono mais eficientes nesse processo.

Figura 3. Efeito da fonte de carbono no crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae

3.4 Efeito da concentrao de sais

De acordo com pesquisas, a levedura Saccharomyces cerevisiae tem baixa tolerncia a concentrao de NaCl no meio reacional, o chamado efeito do estresse salino, que explica o porqu da levedura no ter crescido significativamente nas concentraes de 5, 8 e 10% de sal. A figura 5 mostra o resultado de um estudofeito com diferentes concentraes de NaCl e os resultados relativos ao crescimento da levedura [*].

Figura 4. Efeito da concentrao de NaCl no crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Figura 5. Efeito hiperosmtico de estresse do sal na viabilidade celular de leveduras [*]

Concluso

A sobrevivncia e desenvolvimento dos microrganismos depende de um ordenado conjunto de reaes que ocorrem no interior das clulas para produzir energia. Para que essas reaes aconteam e o metabolismo funcione, necessrio que haja um ambiente favorvel. A atividade do microrganismo estudado, Saccharomyces cerevisiae, nas condies impostas experimentalmente demonstram isso. Baseando-se nos resultados encontrados, podemos afirmar com prioridade que na indstria, esses fatores merecem uma ateno especial, pois so totalmente responsveis pelo sucesso do processo, alm de que, quando manipulados de maneira correta, otimizam os resultados e consequentemente podem aumentar os lucros obtidos.Vale ressaltar que, no meio onde foi analisada a presena do amido como fonte carbono, no houve desenvolvimento do microrganismo. A turbidez no tubo foi devido dissoluo do amido no meio.

Referncias

[*] Efeito hiperosmtico de estresse do sal na viabilidade celular de leveduras. Stelios Logothetis, Graeme Walker, Elias T. Nerantzis. Proc. Nat. Sci., Matica Srpska Novi Sad, iIssue 113, pages 271284, 2007.

MARZZOCO, A., TORRES, B. B.; Bioqumica Bsica. 2 ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara, 1999, p. 73-124.

Questionrio

1. Voc espera que a levedura cresa em anaerobiose, aerobiose ou facultativa?

O crescimento da levedura est restrito a presena de oxignio, portanto, s ocorre em meio aerbio, mas aps o esgotamento do oxignio, a levedura tem respirao facultativa e pode ento produzir etanol e gs carbnico em ambiente anaerbio. Quando esse fungo se encontra em um ambiente onde h muita oferta de oxignio, ele far a respirao aerbia e no produzir lcool, mas, sim, gua e gs carbnico (responsvel por formar as bolhas que inflam e tornam a massa mais macia).

2. Quais as funes dos nutrientes de um meio de cultura?

Os nutrientes fornecem a energia qumica e o esqueleto carbnico da estrutura celular das leveduras (compostas principalmente de carbono, oxignio e hidrognio). Diversos outros componentes podem ser encontrados em um meio especifico para um determinado organismo visando satisfazer as condies ideais para determinado teste. Alguns destes componentes visam nutrir e incentivar apenas os microorganismos que sero objetos de estudo e por tanto devem conter fatores de crescimento especficos como vitaminas, aminocidos e etc.H outros elementos requeridos no meio em concentraes menores que tambm fazem parte da composio da levedura como nions inorgnicos. Podemos tambm ter num meio de constituintes que inibem o crescimento de determinados microorganismos ou at mesmo a ausncia de algum componente essencial para um determinado grupo, sendo estes considerados meios seletivos.

3. Escolha um meio para autotrficos e outro para heterotrficos. Explique-os.

Os meios de cultura devem conter os nutrientes em quantidades e propores corretas para a manuteno e multiplicao dos microrganismos. A maior parte dos microrganismos utiliza substncias de baixo peso molecular que so, frequentemente, derivadas da degradao enzimtica de nutrientes complexos. Por isso, os nutrientes indispensveis ao organismo em causa devem estar sob forma assimilvel.A gua um componente importante e sempre presente em altas quantidades. Todas as clulas requerem gua no meio para que os nutrientes de baixo peso molecular possam atravessar a membrana celular, logo, a gua est presente em todos os meios de cultura.Meio para autotrficos: usam carbono inorgnico na forma de dixido de carbono como nica ou principal fonte de carbono. Estes microrganismos podem ser cultivados num meio de cultura s com compostos inorgnicos, pois no necessitam de compostos orgnicos e podem ser inibidos por eles. A fonte de energia para autotrficos a a energia radiante,utilizam a fontossntese. Meio para heterotrficos: usam compostos orgnicos como principal fonte de carbono. Estes microrganismos no podem ser cultivados num meio s com compostos inorgnicos, pois eles necessitam de nutrientes orgnicos, principalmente glicose. Dependem da oxidao de compostos qumicos como fonte de energia. Alguns microrganismos usam molculas orgnicas (como a glicose), enquanto outros usam compostos inorgnicos (como o H2S e o NaNO2).

4. Qual a funo especfica dos sais no crescimento celular?

Como falado anteriormente na introduo deste trabalho, os sais tem um papel fundamental de regulao da presso osmtica do corpo celular, favorecendo o equilbrio inico da membrana plasmtica da clula e controlando a entrada e sada de gua atravs dela e atuando na homeostase da clula, permitindo o crescimento dos fungos.

5. Descreva etapa por etapa a via metablica envolvida.

Reao 1Na primeira reao, a glicose que entra nos tecidos fosforilada no grupo hidroxila em C6, com o gasto energtico de uma molcula de ATP, dando origem a glicose-6-fosfato e ADP.1 Essa reao, catalisada pela enzima hexoquinase, irreversvel sob condies fisiolgicas devido a seu G altamente negativo.

Reao 2Na segunda reao, catalisada pela enzima glicosefosfato-isomerase , a glicose-6-fosfato, uma aldose, convertida num processo de isomerizao reversvel em frutose-6-fosfato, uma cetose, assim, permitindo um stio de entrada para a frutose da dieta na gliclise.

Reao 3A clula investe e outra molcula de ATP faz a fosforilao da frutose-6-fosfato e a convert em frutose-1,6-bisfosfato. Esta tambm uma reao irreversvel e de controle desta via metablica, catalisada pela enzima fosfofrutoquinase, que a enzima marca-passo da glicliseReao 4Na reao 4, a frutose-1,6-bisfosfato clivada em duas trioses: gliceraldedo-3-fosfato e dihidroxiacetona fosfato. Esta reao catalisada pela enzima aldolase.

Reao 5O gliceraldedo-3-fosfato e a dihidroxiacetona fosfato so ismeros facilmente interconvertveis pela enzima triosefosfato isomerase. Ocorre ento a converso da dihidroxicetona P em gliceraldedo 3P, a nica triose que pode continuar sendo oxidada.

De um modo geral,as reaes de 1-5 so as reaes preparatrias,onde ocorre a fosforilao da glicose e sua conservao em gliceraldedo-3-fosfato.

Reao 6Nesta reao cada gliceraldedo-3-fosfato oxidado (desidrogenado) pelo NAD+ (e o NAD+ passa a NADH) e fosforilado por um fosfato inorgnico, dando origem a 1,3-Bifosfoglicerato. Esta reao catalisada pela enzima Triose fosfato desidrogenase.

Reao 7Na reao 7, catalisada pela enzima 1,3 BiP glicerato cinase, a 1,3 BPG transfere um grupo fosfato para uma molcula de ADP dando origem a uma molcula de ATP e a 3-fosfoglicerato. Esta a primeira etapa da gliclise que sintetiza ATP diretamente na via.

Reao 8Na reao 8, a enzima fosfogliceromutase reposiciona a posio do grupo fosfato 3- Fosfoglicerato, dando origem a 2-fosfoglicerato , preparando o substrato para a prxima reao.

Reao 9A reao 9 uma reao de desidratao catalisada pela enzima enolase. O 2-fosfoglicerato desidratado formando uma molcula de gua e fosfoenolpiruvato (PEP), um composto altamente energtico. Foi devido a esta configurao energtica que o grupo fosfato foi transferido da posio 3 para 2 na reao anterior.

Reao 10A reao 10, ltima desta via metablica, catalisada pela enzima piruvato cinase, h transferncia do grupo fosfato do fosfoenolpiruvato para uma molcula de ADP, formando-se ento uma molcula de ATP e piruvato. Tendo em conta que por cada molcula de gliceraldedo-3-fosfato produz-se duas molculas de ATP, na gliclise so produzidos ao todo 4 ATPs e gastos 2. O saldo energtico de 2 molculas de ATP e 2 NADH por molcula de glicose.De um modo geral ,as reaes de 6-10 so as reaes de conservao de energia , onde o gliceraldedo-3-fosfato convertido em piruvato e a formao aclopada de ATP e NADH +H+

6. Quais os caminhos para o piruvato em aerobiose e anaerobiose? (dados em sala)

O piruvato, produto final da gliclise, pode seguir diferentes vias metablicas dependendo do organismo considerado e das condies metablicas encontradas.Em aerobiose,no caso em condies aerbicas, ser descarboxilidado a acetil-CoA e utilizado no ciclo de Krebs. Em anaerobiose, em condies anaerbicas, poder ser utilizado na fermentao alcolica ou ltica.

7. D 05 exemplos de uso industrial da via glicoltica.

Na indstria farmacutica na produo do antibitico, a penicilina, que derivado de um mofo que cresce em uma mistura fermentativa de substncias ; Na indstria alimentcia na produo de conservas e azedamento de leite por fermentao ltica, chucrutes e linguias fermentadas ; Na produo de bebidas alcolicas e fabricao de pes por fermentao alcolica; Na produo de vinagre pela fermentao actica.

8. Descreva a lanadeira de eltrons em todas as suas etapas e onde ocorre na clula.

A lanadeira de eltrons a cadeia respiratria, que uma etapa da respirao celular, que ocorre nas cristas mitocondriais onde se encontram transportadores proteicos com diferentes graus de afinidade para os eltrons. As molculas de NADH e de FADH2, anteriormente formadas (Gliclise e Ciclo de Krebs), transferem os eltrons que transportam para as protenas (Citocromos) da cadeia transportadora de eltrons. Ao longo da cadeia respiratria ocorre libertao gradual de energia, medida que os eltrons passam de um transportador para outro. Esta energia libertada vai ser utilizada na sntese de molculas de ATP, a partir de ADP+Pi, dissipando-se alguma sobre a forma de calor. Cada molcula de NADH permite a sntese de trs molculas de ATP, enquanto que a molcula de FADH2 apenas permite a sntese de duas molculas de ATP. No final da cadeia transportadora, os eltrons so transferidos para um aceitador final - oxignio, que capta dois prtons H+, formando-se uma molcula de gua. responsvel pela maior parte de ATP da clula.