METODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTENMETODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTEN

Instituto Adolfo LutzDivisão de Bromatologia e Química

Serviço de AlimentosSeção de Doces e Amiláceos

Rejane Weissheimer de Abreurwabreu@ial.sp.gov.br

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Por que da ADVERTÊNCIA nos rótulos dos alimentos, em relação à presença ou ausência de glúten

DOENÇA CELÍACA

TRATAMENTO

Intolerância às proteínas provenientes do trigo, centeio, aveia e cevada

PROLAMINAS

Frações proteícas solúveis em álcool

Alimentação totalmente isenta de

glúten

proteína do trigo = Glúten = glutenina + gliadina

Pro-Ser-Gln-Gln-Pro

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LEGISLAÇÃO

Lei Federal nº 8543/1992 Determinou a impressão de advertência em rótulos e embalagens de alimentos industrializados que contenham glúten ou apresentem em sua composição trigo, centeio, malte, cevada, aveia e/ou seus derivados.

Resolução RDC nº 40/2002 Estendeu a obrigatoriedade da advertência “CONTÉM GLÚTEN” em caracteres com destaque, nítidos e de fácil leitura também as bebidas embaladas.

Lei nº 10.674/2003 Obriga as inscrições “CONTÉM GLÚTEN” ou “NÃO CONTÉM GLÚTEN” para os produtos alimentícios comercializados, como medida preventiva e de controle da doença celíaca.

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IMPLANTAÇÃO

Implantação de métodos analíticos sensíveis e específicos para

detecção de glúten em alimentos.

Testes Imunológicos

Parceria BQ e BM

Projeto FAPESP

Objetivo: desenvolver metodologia Comparação ELISA in house x kit comercial ω gliadina

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ELISA

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Equipamentos básicos: balança, pHmetro, agitador de tubos (PHOENIS), agitador orbital (FANEM), misturador digestor de líquidos (HEIDOLPH) e centrífuga (CELM)

EQUIPAMENTOS

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Lavadora de placas Wellwash 4 – Labsystems

Leitora de placasMultiskan Ascent - Labsystems

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Glúten de trigo (gluten from wheat)

SIGMA –– G5004

Gliadina (Gliadin): SIGMA – G-3375,

PADRÕES DE CONTROLE

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KITS

TRANSIA PLATE PROLAMINS DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320

TRANSIA PLATE PROLAMINS DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320

RIDASCREEN® GLIADIN R BIOPHARM - Art. N◦ R7001

RIDASCREEN® GLIADIN R BIOPHARM - Art. N◦ R7001

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Amostras do teste de gliadina: controle negativo, controle A e controle B

(positivas)

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KIT PARA ELISA

COMPOSIÇÃO: ω GLIADINA e R5

Substrato TMB concentrado (tetrametilbenzidina)

Solução de lavagem concentrada (tampão Tris-salino)

Solução diluente concentrada (PBS com gelatina e timerosal)

Solução finalizadora (ácido fosfórico 25%).

Placa de microtitulação com 12 tiras (96 alvéolos) sensibilizada com: * anticorpo anti-ω gliadina (ω gliadina) * pentapeptideo (R5) Padrão de gliadina liofilizada e padrões prontos

Conjugado peroxidase anti-gliadina (peroxidase ligada a anticorpo monoclonal de rato Anti-ω gliadina) diluído em PBS

Controles alto, médio e baixo

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DOT DOT ELISA NA DETECÇÃO DE GLIADINA

Linhas A – H: Diluição seriada ½ . Colunas: 1) Curva-padrão gliadina; 2, 3 e 4) Padrões glúten 3000, 400 e 160ppm; 5) Amostra FAPAS; 6) Sopa de feijão com macarrão; 7) Grão de cevada; 8, 9 e 10) Amido de milho, sopa de vegetais e Arroz - controle negativo

A

B

C

D

E

F

G

H

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CODEX ALIMENTARIUS

Alimento naturalmente sem glúten até 20ppm

Mistura de alimentos naturalmente sem glúten até 100ppm

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Dot ELISA

N.º ALI MENTO ELI SA (ppm) Dot ELI SA ROTULAGEM

1 Sopa de abobrinha 34 -

2 Sopa de carne 44 -

3 Sopa de mandioquinha ND -

4 Sopa de três queijos ND -

5 Sopa de galinha ND -

6 Caldo de carne ND -

7 Pipoca ND -

8 Macarrão ND -

9 Leite ND - Não

10 Creme de arroz ND - Contém

11 Amido de milho ND - Glúten

12 Creme de milho ND -

13 Biscoito sequilho ND -

14 Soja ND -

15 Lasagne ND -

16 Farinha de mandioca ND -

17 Sêmola de milho ND -

18 Farinha de arroz ND

19 Caldo de carne 54 -

20 Sopa de f eijão e macarrão 2393 +++

21 Biscoito maisena 745 +++

22 Sopa de cebola 2996 +++ Contém

23 Centeio 1704 +++ Glúten

24 Cevada ND

25 Biscoito integral aveia e mel 2679 +++

26 Farinha de aveia 247 -

ND = Não detectável – Abaixo dos limites de quantificação (10ppm)

DETECÇÃO DE GLIADINA EM ALIMENTOS INDUSTRIALIZADOS

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DESAFIOS

1. Composição do alimento – diferença entre as matrizes

quantidade e ingredientes do alimento interferem diretamente na quantificação do analito

VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA PARA CADA ALIMENTO

2. Procedência dos ingredientes

3. Diferentes respostas ente os kitsExtração PadrãoReferência

Resultados de controle interlaboratorial FAPAS para Mistura de pão seco (2712B) e Misturas para bolo de chocolate (2733 A e B)

Resultados de controle interlaboratorial FAPAS para Mistura de pão seco (2712B) e Misturas para bolo de chocolate (2733 A e B)

Material teste /kit Valor de consenso de

glúten (mg/Kg)

Nº escores dentro [z]≤2

Nº total de escores

% Intervalo satisfatório

2712-BR-Biopharm

35,4 21 23 91 22,7-48,2

2712-BTepnel & Transia

131,9 15 19 79 84,4-179,4

2733-AR-Biopharm

7,12 21 23 91 -

2733-BR-Biopharm

173 26 29 90 -

2733-BTepnel

61,1 5 5 83 -

2733-BNeogen

177 11 11 100 -

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PRIORIDADES

Profissionais capacitados Padrões Controles internos Validação do método para os laboratórios Comprovação do resultado com outro método

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ELISAFONTE DE GLIADINA DOS INGREDIENTES PCR

SEQUENCIAMENTO

CONCLUSÃO

TRABALHO INTEGRADOTRABALHO INTEGRADO

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ALIMENTO

IALCVS

ANVISA

EQUIPE MULTIDISCIPLINAR

CVE

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rwabreu@ial.sp.gov.br