Métodos Analíticos em Biotecnologia

Métodos envolvendo Ácidos Nucleicos:

•Extração e quantificação;•Enzimas de modificação;•Marcação;•Hibridizações Moleculares; •Desenho de iniciadores;•PCR de várias modalidades;•Clonagem gênica;•Sequenciamento gênico;•Genômica e bioinformática;

Precisamos de um novo olhar para o básico conhecido na estrutura dos ácidos nucleicos para compreender os métodos com mais facilidade

Pirimidinas

Purinas

5-Metildicetopirimidina Dicetopirimidina

BASES NITROGENADAS

Base-Pareamento nos ácidos nucleicos

Bases nitrogenadas e ABSORÇÃO DE LUZ

U.V.

DOSAGEM DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR ABSORÇÃO DE LUZ U.V.

D.O 260nm = 1,0 corresponde a

• 50g/mL de DNA dupla fita

•40 g/mL de DNA ou RNA simples fita

•20 g/mL de oligonucleotídeos.

D.O 260nm/ D.O 280nm : fornece a pureza de uma preparação de ácidos nucleicos (1,8 e 2,0 para DNA e RNA respectivamente). Valores inferiores indicam contaminação com fenol e proteínas.

Purificação de DNA por gradiente de Cloreto de Césio e visualização por luz U.V.

O CsCl tem sua solução aquosa com uma gravidade específica próxima a do DNA . Quando esta solução é centrifugada por um longo período de tempo e em alta velocidade, atinge-se um equilíbrio com a formação de um gradiente de densidade contínuo, com a porção mais concentrada de CsCl no fundo do tubo e a porção menos concentrada no topo.

Tratamento ácido: depurinação

MARCAÇÃO NÃO RADIOATIVA DO DNA VIA BASES NITROGENADAS

•DIGOXIGENINADIGOXIGENINA: : O DNA é marcado com o glicosídeo digoxigenina-11-UTP

•BIOTINABIOTINA: : O DNA é marcado com biotina

•COMPOSTOS FLUORESCENTESCOMPOSTOS FLUORESCENTES: : O DNA é marcado com compostos fluorescentes como Texas Red.

dUTP- Biotina

dUTP-Digoxigenina

AÇÚCARES DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Ligação P-O sensível a alkali e enzimas

Grupamentos Fosfatos nos ácidos nucleicos

dATP

β α

As sondas genéticas podem ser produzidas pelo emprego de nucleotídeos marcados com radiosótopos no fosfato α, por exemplo α 32P .

Ligações FosfodiésterLigações fosfodiéster constituem o núcleo principal da vida já que são parte da constituição básica de todos os ácidos nucleicos.

A hidrólise das ligações fosfodiester são catalisadas pelas fosfodiesterases (quebra do DNA)

•Etanol e isopropanol: A natureza higroscópica do DNA forma precipitados quando colocado em presença de etanol ou isopropanol e pequenas concentrações de

cátions monovalentes.

Química de formação : Rosalind Franklin (1920-1958): Novembro de 1951- Cadeia de fosfato-desoxiribose no exterior com bases no interior havendo entre 2 e 4 hélices co-axiais.

A: desidratada B: Helicoidal alongada

Laboratório de Biofísica do Kings College

Maurice Wilkins 15/12/1916- 05/10/2004

Uma estrutura de ferro e madeira, imitando uma hélice dupla, foi a forma que os biólogos James Watson e Francis Crick encontraram para demonstrar como é a forma da molécula de DNA.

25 de abril de 1953 - Prêmio Nobel em 1962 junto com Maurice Wilkins)

Grupos fosfatos das ligações fosfodiester são carregados negativamente

Por quê o mesmo tamanho

molecular pode migrar

diferentemente no gel de

eletroforese?

Estrutura e propriedades dos RNAs80% do material genético das células: rRNA15%: tRNA5%: mRNA2%: sn RNA e scRNA

•Regiões dupla fita (Pontes de H) são rompidas por altas temperaturas e calor (como no DNA!)

•Ligações fosfodiester são rompidas por alkalis (NÃO OCORRE NO DNA!!!!)

mRNA

RNA polimerase II: Transcreve os genes do mRNA (e também o snRNA).

Ribosomos são compostos por moléculas de RNA e proteínas formando grandes complexos que compreendem a maior parte da massa de uma célula. O ribossomo tem um coeficiente de sedimentação de 70S, e pode ser dividido em duas subunidades: 50S e 30S. Estas subunidades são compostas por unidades separadas: a subunidade 50S possui 2 moléculas de RNA, uma de 23S e outra de 5S bem como 34 proteínas diferentes. A subunidade 30S tem como subunidades a molécula de rRNA de 16S e 21 proteínas diferentes.

rRNA

RNA polymerase I (Pol I): Transcreve os genes do rRNA dos precursores 23S e 16SRNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para o rRNA 5S

tRNA RNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para os tRNAs.