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Métodos de Descalcificación Dimitrius Leonardo Pitol. PhD Técnico de Laboratorio IV FORP/USP XXII CONGRESO ARGENTINO DE HISTOTECNOLOGIA
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Métodos de Descalcificación
Dimitrius Leonardo Pitol. PhD
Técnico de Laboratorio IV
FORP/USP
XXII CONGRESO ARGENTINO DE
HISTOTECNOLOGIA
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En primer lugar, me gustaría recapitular conceptos
básicos, sobre huesos y dientes.
CORONA
PULPA
DENTINA Hueso Cortical,
Compacto o Denso
Medula ósea
roja
Hueso Trabeculado
o Esponjoso
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La corona esta formada por
esmalte (que es la parte que
contiene mas calcio en el diente)
Tejido Mineralizado
El tejido mineralizado contiene 33% de matriz
orgánica siendo que el 28% corresponde al colágeno
tipo I y los otros 5% son:
Osteonectina.
Osteocalcina.
Proteglicanos.
Sialoproteina.
Proteina morfogenética ósea.
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Tejido mineralizado
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El otro 67% corresponde a la matriz inorgánica
conteniendo: fosfato, magnesio, potasio, sodio y
citrato.
De estos elementos, el calcio es el que se encuentra
en mayor cantidad, y para estudiar los contituyentes
celulares, tenemos que retirarlo del tejido.
Métodos de descalcificación
Existen básicamente 3 métodos para hacer la
descalcificación de tejidos:
Soluciones ácidas diluidas: ejemplos (ácido clorhidrico,
acido nítrico a 5 o 7%, ácido fórmico a 5%).
Soluciones quelantes: ejemplo (EDTA 10%).
Mezcla de soluciones ácidas + soluciones quelantes.
Por ejemplo el ETDA, “también conocido como
descalcificador Americano”.
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Mecanismo de acción de los agentes
descalcificadores
Los mecanismos de acción de los agentes descalcificadores
son diferentes.
Cuando colocamos una muestra de hueso o diente en una
solución descalcificadora como el ácido nítrico, ocurre una
salida de calcio de ese tejido, hacia el líquido de la solución
descalcificadora, y esto provoca una reacción química en el
liquido descalcificador, dejando su solución tamponada, con
esto el descalcificador pierde su capacidad de retirar cálcio del
tejido.
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Ca++
Ca++
Ca++
Solución descalcificadora
Ácido (H+)
H3PO4 (ácido fosfórico) + cloreto de calcio + agua
Ca++(PO4)6 (OH)2
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Cuando Trabajamos con soluciones ácidas tnemos que
saber la hora exacta para retirar las muestra de los
descalcificadores para continuar el con la técnica
histológica.
Ahora, si la muestra ya es encuentra sin cálcio, y
colocamos la solución ácida descacificadora, tendremos
una corrosión del tejido.
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Mecanismo de acción de los agentes
descalcificadores
Cuando utilizamos soluciones quelantes (EDTA al 10%), la
remoción de calcio ocurre de forma mas lenta, y cuando el
tejido no tenga mas calcio, la solución de EDTA detendrá la
corrosión sobre el tejido.
En general el pH de la solución de EDTA está en torno de 7.
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Mecanismo de acción de los agentes
descalcificadores
Descalcificadores mas
utilizados
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• Acido nítrico 5%.
• Acido fórmico + citrato de sódio.
• EDTA (ácido etileno-diamino-tetracético).
• ETDA (tartarato de sódio e potássio, tartarato de
sódio, Acido clorídrico e H20
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Aqui tenemos una imagen de
un diente descalcificado con
ácido nítrico 7% con
coloración de tricrómica de
Masson con una optima
preservación, podemos ver las
fibras del ligamento
periodontal.
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Acido Nítrico
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Esto hace que el EDTA 10 % sea un descalcificador
de óptima calidad para la morfologia del tejido, y
muy bueno cuando trabajamos con microscopia
electrónica, inmunohistoquímica, y también para
las técnicas de biologia molecular.
Y la mejor decalcificador
promueve la descalcificación lenta.
muy lento.
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EDTA 10%
En esta imagen de microsopía
electrónica de transmisión,
tenemos a un osteocito, con las
organela visibles: mitocondrias,
reticulo endoplasmático,
complejo de golgi.
Si ese non fuese descalcificado
con EDTA 10%, dificilmente
observariamos las organelas.
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EDTA 10%
Pitol et al Braz Dent J (2007) 18(2): 153-157
ETDA 14
El ETDA és un descalcificador con substancias
quelantes y ácidas.
És un excelente descalcificador, permite buenos
resultados en la inmunohistoquímica
Promueve una descalcificación más rápida
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ETDA
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Este es el protocolo para preparar la solución:
EDTA. 0,7g
Tartrato de sodio e potasio. 8g
Tartrato de sodio. 0.14g
HCl (Acido clorídrico) 120ml
H2O destilada. 900ml
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FEMUR ETDA DESCALCIFICADO EN 24
HORAS
Observen esta imagen
radiográfica de un femur de
rata descalcificado con ETDA.
En 24 horas el hueso ya esta
listo para el proceso
histológico
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ETDA X EDTA 10%
En nuestro laboratorio realizamos este test comparativo,
para evaluar la calidad de preservación del descalcificador
ETDA, y lo comparamos con el EDTA 10%, utilizamos para
este analisis (calvarias de ratas) hicimos la misma tinción
para los dos descalcificadores.
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Percibimos que no habia
diferencias signficantes, en
cuanto a la calidad de las
muestras, con una ventaja
para el ETDA, el tiempo de
descalcificación fue de 24h,
El EDTA 10% lleva de 25 a 30
dias.
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ETDA EDTA10%
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Cuidados con la descalcificación
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• El material debe ser fijado adecuadamente
• Debemos utilziar la concentración establecida en
los protocolos.
• El aumento de la concentración para acelerar el
procedimiento, puede dañar la muestra
XXII CONGRESO ARGENTINO DE
HISTOTECNOLOGIA
Cuidados con la descalcificación
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• Cuando utilizamos descalcificadores a base de
ácido, los cambios deben ser constantes.
• Saber el punto ideal para parar la
descalcificación.
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Tiempo para cambio de descalcificador
Cuando trabajamos con descacificador ácido,
debemos hacer el cambio de ese descalcificador,
todos los dias.
Entretanto cuando usamos EDTA 10%, ese
cambio debe ser realizado a cada 5 dias.
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Tiempo para cambio de descalcificador EDTA
Tenemos aquí espectrofotometría de
absorción.
Como podemos observar en esta tabla,
de un artículo sobre descalcificación.
Si cambiamos la solución cada día
estamos gastando por nada.
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Pitol et al.; Int.J.Morphol 25(2): 309 – 313, 2007
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¿Como saber el punto ideal de
descalcificación?
Saber el punto ideal para parar el proceso de
descalcificación es un factor determinante, para
obtener un buen resultado.
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Métodos mas utilizados
Método radiográfico: es muy bueno, pero en la práctica se torna
dificil, pues tendriamos que tener un Rayo X.
• Método cuantitativo: optima alterantiva para quien tien poca
experiencia con el procesamiento de tejido óseo.
• Utilización de alfileres e agujas: puncionar con una aguja o alfiler
en el local del espécimen que no comprometa el análisis, puede
ser una buena alternativa.
• La Flexibilidad y el método más apropiado evaluar muestras.
XXII CONGRESO ARGENTINO DE
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Método Cuantitativo
• Colectar 5ml de Descalcificador del fondo del Frasco.
• Aumentar 1 mL de Amonio concentrado (Mezclar).
• Aumentar 0,1mL de Oxalato de amonio.
• Dejar por 10 minutos para verificar la presencia de calcio.
• Si no se forma precipitado aumentar 0,1mL, con un intervalo de
10 minutos.
• Hasta el máximo de 0,6 mL .
• Si no se forma precipitado, el tejido es considerado
descalcificado.
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Vídeo La Flexibilidad
El objetivo de este video es mostrar el
punto ideal de descalcificación del hueso.
El hueso y el femur de una rata.
Dejamos descalcificando por 24 horas
ETDA
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Horno Microondas domestico: da para acelerar la descalcificación,
sólo que el técnico precisa estar atento a algunas reglas para su
uso.
Saber donde incide el mayor número de microondas dentro del
horno, trabajar con el plato fijo, colocar un becker en el forno para
robar calor etc.
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Métodos para agilizar la descalcificación
XXII CONGRESO ARGENTINO DE
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Pero existen también hornos microondas
produciodos espcificamente para ser
utilizados en el laboratorio e son mucho
mas seguros.
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Métodos para agilizar la descalcificación
XXII CONGRESO ARGENTINO DE
HISTOTECNOLOGIA
La descalcificación también puede ser
acelerada por estímulos eléctricos
(funciona mejor para descalcificadores
ácidos)
Colocamos nuestras muestra en la
solución descalcificadora y dejamos
los electrodos pasando corriente
eléctrica.
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Métodos para agilizar la descalcificación
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Láminas de diente o Huesos pueden
soltarse de la lámina en el momento de
la coloración, para que esto no ocurra
lo ideal es tener cortes de 5 a 3µm de
espesor y utilizar láminas tratadas con
silano, polisina o láminas con carga.
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Adesión de cortes en la Lámina
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La tinción con HE, es una de
nuestras tinciones de rutina.
Podemos observar una lámina
de un diente, el área del
cemento, área del ligamento
periodontal y hueso alveolar.
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Hematoxilina Eosina
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Mandibula de camundongo o
raton, podemos observar un
diente, primer molar y sus
raizes.
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Hematoxilina Eosina
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La tinción com Tricómica de
Masson, es una de nuestras
tinciones de rutina
En azul claro la dentina.
En rojo, el área con los
odontoblastos.
Aquí en la parte mas clara con
vairas células tenemos a la pulpa
dentaria.
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Tricrómica de Masson
ODONTOBLASTOS
DENTINA
POLPA DENTÁRIA
Calvaria de rata corte con
historesina
Articulación de rodilla de
raton ( Verde Luz)
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Tricrómico de Masson
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Picro-Sirus
En la coloración de picro sirus, podemos utilizar microscopía
de polarización para evidencias fibras colágenas.
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TRAP
La coloración de TRAP (fosfatasa ácida resistente al tartrato) permite
que identifiquemos los osteoclastos, como una reacción de color
rojo.
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Pitol et al : Int. J. Morphol., 25(4):907-910, 2007
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Aquí tenemos un corte de
mandibula de rata en
historesina, marcando
osteoclastos.
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Inmunohistoquímica
• Fijación con formol tamponado 10%.
• Láminas sinalizadas.
• Cortes 3 a 2 µm.
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Protocolo del tejido óseo • Dilución de anticuerpo primario em BSA.
• Incubación de anticuerpo por 2 horas.
• Un lavado de 5 minutos em PBS.
• Incubar con anticuerpo secundario “conjugado” por 40 minutos.
• Un lavado de 5 minutos.
• Aplicación de DAB (Cromógeno) por 5 minutos.
• Un lavado em PBS por 5 minutos.
• Pasar un minuto en hematoxilina, deshidratar y montar con lámina.
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Anticuerpos •MMP-9 Ab 19016 (CHEMICON)
•CD 34 Sc 9095 (SANTA CRUZ)
•CD 31 Ab 64543 (ABCAM)
•FGF BASIC Ab 16828 (ABCAM)
•VEGF R2 Ab2349 (ABCAM)
•VEGF Ab44714 (ABCAM)
•OSTEOCALCINA Sc 30044 (SANTA CRUZ)
•SIALOPROTEINA Ab 1851 (CHEMICON)
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HISTOTECNOLOGIA
¿Que tiene que ver la
Histotecnología aplicada al
tejido óseo con las
escamas de peces?
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Las escamas también son estructuras rigidas, con origen en la capa mas
profunda de la demis desde el tejido óseo.
Colocado 12 horas en el EDTA, permite que cortes fuesen realizados sin
dificultades, y identificamos las estructuras presentes.
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Mostrando las capas de colagenos
con luz polarizada.
Coloración de Orceina mostrando las
fibras elásticas en el tejido epitelial.
43 XXII CONGRESO ARGENTINO DE
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Coloración de Alcian Blue, mostrando
depósitos de polisacaridos ácidos
Coloración de PAS, mostrando
polisacaridos neutros
Aqui tenemos algunos de los trabajos
científicos, publicados por nuestro
grupo de pesquisa.
Estas relevantes publicaciones se
tornan posibles gracias, a la
histotecnologia de calidad.
La histotecnología es una herramienta
indispensable para diagnósticos e
investigación científica.
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HISTOTECNOLOGIA
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Agradecimientos
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