MÉTODOS DE ESTUDO: CELULAS E TECIDOS · “Preservar” a morfologia e composição dos tecidos....
Transcript of MÉTODOS DE ESTUDO: CELULAS E TECIDOS · “Preservar” a morfologia e composição dos tecidos....
03/02/2018
4
Raduan
FixaçãoFinalidades:
Evitar a autólise; Impedir a atividade e proliferação de
bactérias;Endurecer as células resistir as
próximas etapas; afinidade das estruturas celulares
pelos corantes usados na M.O. e contrastes na M.E.
“Preservar” a morfologia e composição dos tecidos.
Raduan
FixaçãoAgentes Fixadores:
Físicos:Frio (Congelação); Calor
QuímicosFormaldeído (+comum);Aldeído glutáricoTetróxido de ósmioMisturas fixadoras (Bouin,etc)
Microscopiaeletrônica
03/02/2018
5
Raduan
Desidratação[ ] etanol = 70%Absoluto Consiste na remoção da água dos tecidos, pois as substâncias
utilizadas para inclusão em parafina não se combinam homogeneamente com a água.
DiafanizaçãoClareamento = benzol, xilol ou toluol Visa remover completamente o álcool do interior dos
tecidos, preparando-os para as etapas subsequentes. pois a parafina não se mistura homogeneamente com o álcool.
Raduan
Impregnação
Os fragmentos de tecidos serão imersos e mantidos em parafina líquida (60ºC).
03/02/2018
6
Raduan
InclusãoIncluídos (protegidos) em parafina ou resina plástica M.O.
Incluídos em resinas do tipo epóxi (Araldite, Epon) M.E.
OBS.: Envolvem e penetram nas células.
Raduan
Inclusão
Orientação dos fragmentosÉ um processo importante
na confecção dos cortes e análise dos tecidos.
03/02/2018
8
http://www.icb.usp.br/mol/
http://www.icb.usp.br/mol/
http://www.icb.usp.br/mol/
http://www.icb.usp.br/mol/
03/02/2018
9
Raduan
MicrotomiaMicrótomoMicroscopia óptica: cortes de 1 a 6 m, geralmente;
Microscopia eletrônica: cortes de 0,02 a 0,1 m, geralmente;
Micrótomo de congelação(obtenção rápida de cortes, histoquímica, etc).
https://www.leicabiosystems.com/histology-equipment
https://www.leicabiosystems.com/histology-equipment
03/02/2018
10
Raduan
ColoraçãoA maioria dos tecidos é incolor;Facilita a visualização dos componentes teciduais;Propicia contraste entre os componentes celulares;
Raduan
Corantes básicosO grupamento químico responsável pela cor (cromóforo) = catiônico
Combinam-se com grupamentos ácidos (aniônicos) das moléculas celulares. Ex.: DNA, RNA (Basófilas = afinidade por corantes básicos)
Raduan
Corantes básicos
Azul de toluidina
Azul de metileno
Hematoxilina
03/02/2018
11
Raduan
Corantes ácidosCromóforo = aniônicoCombinam-se com grupamentos básicos (catiônicos) das moléculas celulares. Ex.: Componentes básicos das proteínas citoplasmáticas (acidófilas = afinidade por corantes ácidos).
Raduan
Corantes ácidos
Orange G
Fucsina ácida
Eosina
Raduan
HEMATOXILINA & EOSINA (H&E)
Coloração dupla + utilizada na rotina histológica;
Hematoxilina: cora em azul os núcleos celulares e estruturas de natureza ácida (basófilas);
Eosina: cora em diversas tonalidades de vermelho o citoplasma e o colágeno do material extracelular (acidófilas).
03/02/2018
12
MICROSCÓPIOS
Raduan
Microscópio óptico
Parte mecânicaSuporte para a parte óptica
Parte ópticaCondensador
Objetiva
Ocular
03/02/2018
13
Raduan
Microscópio óptico
Raduan
Microscópio óptico
Ampliação total da imagem =
Aumento da objetiva
x
Aumento da ocular
03/02/2018
14
Raduan
Microscópio óptico
Poder de resolução (sistema óptico) = capacidade de separar detalhes
Raduan
Microscópio óptico
Limite de resolução = menor distância que deve existir entre 2 pontos para que eles apareçam, individualizados. Ex.: 2 partículas separadas por 0,3 m aparecem individualizadas em um sistema óptico com limite resolutivo de 0,2 m, porém aparecem como partícula única quando o limite resolutivo é de 0,5 m
Raduan
Microscópio ópticoLimite de resolução (LR)LR = K x
ANK = constante de valor 0,61;AN = abertura numérica (AN= n x sen ; n=índice de refração; = semi-
ângulo da abertura)
03/02/2018
15
Raduan
Microscópio óptico“ O que determina a riqueza de detalhes da imagem formada por um sistema óptico é o seu limite de resolução, e não o seu poder de aumentar o tamanho dos objetos”.
Raduan
Microscópio de Contraste de fase
Transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade;
de fase de intensidade luminosa = perceptível
Traduzida
Raduan
Microscópio de Contraste de fase
Utilizado no estudo de células e tecidos vivos;
Estruturas celularesEscuras = fase positiva
Claras = fase negativa
03/02/2018
17
Raduan
Microscópio Confocal
A iluminação é feita por um delgado feixe de raios laser, que varre ponto por ponto um determinado plano da célula = “corte óptico”;
A imagem é formada exclusivamente pelas estruturas que estão no plano de varredura imagem muito nítida.
Raduan
Raduan
03/02/2018
18
Raduan
Raduan
Microscópio de fluorescência
Utiliza fonte de luz ultravioleta;
Luz UV espécime Luz visível
Estruturas marcadas com corantes fluorescentesEx.:Alaranjado de acridina (DNA verde-amarelado; RNA vermelho-alaranjado)
RaduanCitoesqueleto (cultura de fibroblastos)RITC-phalloidin – M. fluorescência
Citoesqueleto (cultura de fibroblastos)M. eletrônica
03/02/2018
19
Raduan
Microscópio eletrônico
Apresenta alta resolução;
Riqueza de detalhes;
Utiliza feixes de elétrons;
Cortes ultra-finos (20 a 100 nm)
Raduan
Microscópio eletrônico
TransmissãoAquecimento do cátodo (filamento de tungstênio) no vácuo = elétronsacelerados por uma de potencial de 60 a 100 kV placa perfurada feixes de elétrons lentes eletromagnéticas (condensadora) objeto lentes (objetiva) lente (projetora) tela fluorescente ou filme fotográfico
Raduan
Microscópio eletrônico de transmissão