MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR I - MICROSCOPIAS.
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MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULARCELULAR
I - MICROSCOPIAS
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MMIICCRROOSSCCOOPPIIAASS
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Início (1600):- Incorporação do microscópio aos estudos
anatômicos;- Desenvolvimento de técnicas de preparo para a
visualização dos materiais biológicos
1663Robert Hooke
185217501689Marcello Malpighi
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Marcello Malpighi(1628-1694)
(1689)
“ Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena,interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso
a nenhum médico”
Médicos: Rejeitaram microscopia – inútil
Descrições sobre os capilares eram falsas
Anatomia comparada era irrelevante para medicina
Anatomia humana → só era útil para descrição
Introdução da microscopia à medicina
Estudo de capilares
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Fundamento: Sistema de lentes combinadas, que são colocadas de forma a ampliarem a imagem do objeto
Interação da luz com o espécime
Absorção
Refração dos
raios de luz
ou
Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve
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Na formação da imagem aos Microscópios, dois fenômenos devem ser considerados: a
absorção e a refração
Interação da luz com o espécime
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Microscópio
produção de imagens aumentadas de objetos não
visualizados à olho nú
Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia
1) De luz (ML) / óptico (comum) Modificado (variações) com propósitos especiais
Contraste de fase Invertido Polarização
Fluorescência2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Microscópio eletrônico de varredura (MEV)
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Fonte luminosa → luz branca(lâmpada com filamento de
tungstênio)
Óptica → lentesampliação condensação
Mecânica
Sistema de iluminação
Microscópio de luz comum / campo claro
Componentes:
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Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho
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Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Fonte de luz condensadora
objetivaocular
objetoImagem
I
Imagem II
F F FC C C
O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a formação de uma imagem Invertida
Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular
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Trajeto da luz
Centralização do feixe de luz
“Iluminação de Köhler”
Iluminação perfeita
Menos ocorrência de aberrações e
irregularidades no trajeto luminoso
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Objetiva (s) = próxima ao objeto Corrige aberrações = qualidade da imagem Tipos: acromática, semi-apocromática, apocromática, planacromática, planapocromática
Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão)
Projeta imagem real e invertida
Ocular (es) = imagem projetada pela objetiva Aumentos: 10x, 12x
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Aumento final
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4x = Vermelha10x = Amarela40x = Azul claro100x = Preta / branca
Objetiva
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A = Ângulo de abertura da objetiva = Ângulo correspondente à metade de AAN = Abertura numéricaN = Índice de refração do meio de montagemsen = Fornecido pelo fabricante da lente
AN = 0,12 (4x)AN = 0,34 (10x)AN = 0,60 (40x)AN = acima de 1 (100x)
AN = n.senα
Abertura numérico
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Bom microscópio:
1) Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou do próprio microscópio) em formar imagens com
detalhes mínimos”
2) Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos distintos do objeto, que poderão ser
individualizados na imagem final”
> > PR < LRPR < LR
Poder de Resolução X Limite de Resolução
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ou
Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2 pontos distintos do
objeto (< LR) maior será a definição da imagem formada no aparelho ( >
PR)
Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscópio
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Planos de cortes
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Imagem microscópio = bidimensional Objeto de estudo = tridimensional
Planos de cortes
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Leia a etiqueta da lâmina material / corte / coloração
Examine a lâmina macroscopicamente pode-se obter muita informação
Objetiva de menor aumento (panorâmica)
Ajustar área a ser observada, centralizando-a na platina
Iluminação de Köehler
Objetivas de aumentos maiores
Sequência de passos
Observação: imagem → invertida
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Microscopia de LuzMicroscopia convencionalMicroscopia de contraste de faseMicroscopia de contraste interferencialMicroscopia de campo escuroMicroscopia de polarizaçãoMicroscopia de fluorescênciaMicroscopia confocal a laser
Microscopia eletrônicaMicroscopia eletrônica de transmissãoMicroscopia eletrônica de alta voltagemMicroscopia eletrônica de varredura
Outros tipos de microscópioMicroscopia de tunelamento quânticoMicroscopia de força atômicaMicroespectrofotometria
Tipos de Microscópios
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Princípios da Difração da LuzAnéis metálicos colocados no caminho da luz (Zerniké, 1950)Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase)
Retardo ópticoe
Refração da luz
Microscopia de Contraste de fase
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Microscopia de Contraste de fase
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Análise do material biológico sem coloração prévia:
1.Culturas de células2. Exames parasitológicos3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios)4. Sangue5. Protozoários de ambientes aquáticos6.Algas 7. Bactérias
Diferenças de índices de refração
Sem coloração
BactériasCultura de células: neurônios
Aplicações da Microscopia de Contraste de fase
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Esfregaço de Sangue Divisão Celular em Raiz de Cebola
Aplicações da Microscopia de Contraste de fase
Análise do material com coloração prévia
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Prismas ópticos posicionados no caminho da luz
Microscopia de Contraste Interferencial
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Os prismas modificam a fase da onda luminosa
Contraste com o meio em que se encontra o material
Microscopia de Contraste Interferencial
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Defasagem dos comprimentos de onda
Microscopia de Normarski
Microscopia de Contraste Interferencial
Gera uma “deformação” na imagemPermite contraste interferencial
Aumentando o relevo das superfícies do material
analisado
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Observação de materiais biológicos sem coloração: 1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices parasitos (taxonomia) 2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material biológico 3. Monitoramento de culturas celulares
Algas
Escamas
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial
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Cultura Celular: macrófago Ácaro
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial
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Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Com coloração fluorescente
Sem coloração
Com coloração
Diferenças de índices
de refração
Cores de interferênci
a
Campo escuro
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2 Filtros / Prismas:1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o condensador
2º Analisador → Entre a objetiva e a ocular
Promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração das ondas luminosas Plano da luz polarizada
(PLP) Observação: Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de vibração em todos os planos
Microscopia de Polarização
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2º
1º
Microscopia de Polarização
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1º
2º
PLP
Microscopia de Polarização
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Anisotropias Ópticas
Fenômenos de ordem espectral
Dicroísmo(1 filtro
polarizador)
Birrefringência(2 filtros polarizadores
cruzados perpendiculares)
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Filtros polarizadores, quando colocados no caminho da luz e rotacionados a 90o permitem a distinção de macromoléculas ditas anisotrópicas (birrefingentes ou dicróicas)
Microscopia de Polarização
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Birrefringência ocorre
Componentes macromoleculares birrefringentes
Anisotrópicos (brilho colorido ou não)
Cruzamos perpendicularmente os 2
filtros (polarizador e analisador)
Realçados
Outros componentes
Isotrópicos (não refrigentes) Indistintos em fundo escuro
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1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina2. Análise de células que apresentem organização interna de suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular esquelética, espermatozóides (ordem molecular)3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos arranjos macromoleculares: tecidos ósseos, cartilagens, dente4. Análise de componentes cristalinos dos minerais
5. Outros: parede celular; amido.
Aplicações da Microscopia de Polarização
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Tecido ósseo
Grãos de Amido
Aplicações da Microscopia de Polarização
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Birrefringência pode ser
intensificada por corantes
Exemplos: Colágeno
- Xylidine Ponceau- Picro-sirius
Cromatina / Matriz Extracelular- Azul de toluidina
(ordem e agregação molecular )
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Tecido ósseo: osso esponjoso / fibras colágenas
Tecido ósseo : sistema de Havers ou ósteon / fibras
colágenas
Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada
Aplicações da Microscopia de Polarização
![Page 42: MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR I - MICROSCOPIAS.](https://reader036.fdocumentos.com/reader036/viewer/2022062400/570638431a28abb8238f1d65/html5/thumbnails/42.jpg)
Mesentério de rato. Coloração: Picro-sirius (fibras de colágeno: intensa birrefringência / brilhante /
amarelo)
Microscopia de Luz Polarizada
![Page 43: MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR I - MICROSCOPIAS.](https://reader036.fdocumentos.com/reader036/viewer/2022062400/570638431a28abb8238f1d65/html5/thumbnails/43.jpg)
Birrefringência dependendo do grau de agregação de cristalinidade
Medida das propriedades anisotrópicas (dicroísmo e birrefringência)
Diagnósticos patológicos
Material biológicos
Estabelecimento ordem molecular
Fases da vida celular
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Os microscópios de campo escuro apresentam um tipo especial de condensador - inclina a luz de tal modo que ela não atravessa o objeto
A luz se dispersa
Apenas os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema (objetivas e oculares)
Microscopia de Campo Escuro
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É empregada para estudos de pequenos materiais: Plâncton Bactérias Cristais Estruturas subcelular (fimbrias e flagelos) Grãos de pólen
Microscopia de campo escuro da bactéria
Leptospira spp
Aplicações da Microscopia de Campo Escuro
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Propriedade física de algumas substâncias absorverem a luz em
um determinado comprimento de
onda e emitirem luz com comprimentos de onda maiores e níveis energéticos
mais baixos
Microscopia de Fluorescência
Microscopia de fluorescência mostrando uma célula embrionária de Caenorhabditis elegans em divisão
![Page 47: MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR I - MICROSCOPIAS.](https://reader036.fdocumentos.com/reader036/viewer/2022062400/570638431a28abb8238f1d65/html5/thumbnails/47.jpg)
Fluorescência natural:Existem componentes celulares ou moleculares
naturalmente fluorescentes
ClorofilaLignina de parede
vegetalElastina
Colágeno
A fluorescência visível neste nudibranqueo é dupla: os pigmentos verdes próprios da lesma e as algas
vermelhas no seu intestino Algas (clorofila)
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Outros componentes:Se ligam a substâncias fluorescentes → fluorocromos
→ emitem brilho contra fundo escuro
Alaranjado de acridina
(fluorocromo)
Células do testículo de triatomíneos
(barbeiro)Divisão celular
RNA - vermelho
DNA - verde
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1. Sistema óptico interage com pouca luz:
Luz de mercúrio de alta pressão2. Sistemas de filtros para detectar o brilho do material contra o fundo negro (a. Filtro de excitação; b. Filtro de barragem)Fonte de luz → Fótons → Filtro de excitação (seleciona os fótons de determinado comprimento) → Objeto → Emite luz fluorescente → Filtro de barragem (luz de excitação é bloqueada) → Imagem observada (formada pela luz que atravessa o filtro de barragem)
b. Filtro de barragemOcular
a. Filtro de excitação
Fonte de luz
Objetiva
Microscopia de Fluorescência
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Microscopia de Fluorescência
![Page 51: MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR I - MICROSCOPIAS.](https://reader036.fdocumentos.com/reader036/viewer/2022062400/570638431a28abb8238f1d65/html5/thumbnails/51.jpg)
![Page 52: MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR I - MICROSCOPIAS.](https://reader036.fdocumentos.com/reader036/viewer/2022062400/570638431a28abb8238f1d65/html5/thumbnails/52.jpg)
Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) → muitas são as utilizações da microscopia e fluorescência
Fluorocromos:Alaranjado de acridina
EosinaDAPI
RodaminaFluoresceina
Emitem brilho contrafundo escuro
Aplicações da Microscopia de Fluorescência
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Outras aplicações da Microscopia de Fluorescência
Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica
Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos que permite identificação de moléculas específicas
Imunocitoquímica
Hibridação “in situ” (FISH)
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Aplicações da Microscopia de Fluorescência
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1987 - Disponível mundialmente
O microscópio confocal tem seu funcionamento baseado nos princípios da microscopia de fluorescência → Utiliza laser como fonte de luz
Permite a visualização: materiais espessos; corpos inteiros sem coloração prévia (vivos ou pré-fixados)
Reconstrução do objeto tridimensionalmente → Vários planos focais ou cortes ópticos (programas computacionais)
Microscopia confocal a laser
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Aplicações da Microscopia confocal a laser1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de fluorescência convencional
2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos
3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares. Exs: microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos finos da matriz extracelular
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Células em apoptose: condrócitos
Células em prófase
Aplicações da Microscopia confocal a laser
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Protozoário
Macrófago
Aplicações da Microscopia confocal a laser
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Grãos de Pólen
Divisão celular / Fuso mitótico
Aplicações da Microscopia confocal a laser
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Início: Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons
Semelhantes a fótons num
sistema de vácuoPrimeiros experimentos: Década de 1920 → Busch (elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas)
1931 → Ruska → Primeiro M.E. → Poder de resolução: 0,5 nm → 25 mil vezes a capacidade do olho humano
Microscopia eletrônica
Ernst August Friedrich Ruska
(1906-1988)
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Principais diferenças
Fonte Luz (porção inferior)
Elétrons (porção superior)
Lentes Vidro EletromagnéticasLentes de aumento (principal)
Objetivas e oculares Eletromagnéticas
Suporte para amostra
Lâmina de vidro Grade de metal (telinha)Cobre ou
níquelLimite de resolução
0,2 µ 0,0002 µ
Formação da imagem
Transparência e coloração Variações de densidade e contrastação
Microscópio eletrônicode transmissão (MET)
Microscópio de luz (ML)
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Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica
Questões importantes: Ampliação e Resolução
Microscopia eletrônica
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O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de que os elétrons tinham comportamento
ondulatório semelhante aos fótons de luz
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e de Varredura (MEV)
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Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
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Microscópio eletrônico
de transmissão (MET)
Microscópio eletrônicode varredura(MEV)
Formação da imagem ao Microscópio eletrônico:Fonte de elétrons → Caminha por um sistema de lentes eletromagnéticas (coluna) → Feixe de elétrons → Acelerados → Lente condensadora → Amostra → Lentes objetivas (primeira imagem aumentada da amostra) → Lentes intermediarias / projetivas (formação final da imagem) → Imagem ampliada → Anteparo fluorescente / monitor
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Fixação
Desidratação
Inclusão
Cortes
Contrastação commetais pesados
Principais etapas da preparação das amostras para MET
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Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro etc Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram elementos como: hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio etcObservação:
Contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos): metais pesados
Imagem final ao MET
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Coloração negativa: vírus Tecido muscular
Hepátócito: Complexo de
Golgi
CílioCélulas epiteliais
Microscopia Eletrônica de Transmissão
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Revela feições topográficas da superfície (detalhes) Imagens tridimensionais:
- Vermes- Insetos- Células livres (animais/vegetais)- Embriões- Fragmentos geológicos
Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Scanning Electron Microscopy (SEM)
Guelras de um peixe
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Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Preparação das amostras
Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio)
Desidratação
Secagem (“ponto crítico”)
Evaporação com ouro na superfície a ser analisada
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Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
![Page 72: MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR I - MICROSCOPIAS.](https://reader036.fdocumentos.com/reader036/viewer/2022062400/570638431a28abb8238f1d65/html5/thumbnails/72.jpg)
Title: “An Army of One" Category: Photo Microscopy Photographer: Freder Medina
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
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Descrição de estruturas subcelulares (µ)Ex.: Citoesqueleto
Aparelho grande: equivalente a um edifício de três andares- Alta aceleração eletrônica (500 a 1.000 KV)- Permite estudos de corte grossos- Reconstrução tridimensional
Microscopia Eletrônica de Alata Voltagem ou Alta Aceleração
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Década de 1980 Potência visual do olho humano: 1 milhão de vezes (100x a capacidade do MET) = Estrutura atômica Benning / Rohrer (1986): Prêmio Nobel de Física Corpos: - Características ondulatórias - Emissão de energia
Microscopia de Tunelamento Quântico
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Agulha que dista da superfície da amostra em 1Å Percorre a superfície da amostra → corrente elétrica (tunelamento) Corrente atrai elétrons do material para a agulha → “tunel” Agulha sobre um átomo → corrente ↑ Agulha sobre os espaços entre os átomos → corrente ↓ Esses sinais (↑ e ↓) são transmitidos para o computador → imagens ≈ à superfície de vales e montanhas
Microscopia de Tunelamento Quântico
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1 milhão de Vezes (100x a capacidade do MET) =
ESTURUTRA ATÔMICA
Molécula de miosina Cromossomos
Microscopia de Tunelamento Quântico
![Page 77: MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR I - MICROSCOPIAS.](https://reader036.fdocumentos.com/reader036/viewer/2022062400/570638431a28abb8238f1d65/html5/thumbnails/77.jpg)
É semelhante ao Microscópio de Tunelamento QuânticoDiferença: - Microespelho - Feixe de “laser” sobre a agulha Menor agressividade à amostra Detecção de detalhes de superfície
Aplicações: - Imagens em solução - Sequências de reações químicas / modificações ao longo do tempo - Estrutura atômica de biomoléculas
Microscopia de Força Atômica
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Microscopia de Força Atômica
Imagem de uma plaqueta obtida por microscopia de força
atómica
Imagem de eritrócitos obtida por microscopia de força
atómica
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Brasileiro ganha prêmio internacional para imagens de microscopia de força atômica
Luciano Paulino da Silva, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, conquistou o segundo lugar na primeira edição do Prêmio Internacional de Imagens de Microscopia de Força Atômica.
A imagem de autoria do pesquisador da Embrapa, que mostra a superfície das células vermelhas do sangue depois do tratamento com peptídeos antibióticos, foi a única imagem não européia premiada dentre as mais de 250 inscritas. O prêmio visa o reconhecimento da importância das imagens de microscopia para os avanços da nanotecnologia em todo o mundo.
Reportagem publicada no dia 10/09/2007
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Title: “Formosa Nano-Rose" Photographer: Dr. Kuei-Hsien ChenVencedor do “Science as Art Contest” de 2008
Scanning electron Microscopy – imagem representa um único cristal de Wurtzite indium nitride (InN) sintetizado
Fim