Métodos Físicos de Análise - ESPECTROMETRIA DE MASSASCEFARMA) MASSAS - junho 2012... ·...

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Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012

Métodos Físicos de Análise - ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Prof. Dr. Leonardo Lucchetti

Mestre e Doutor em Ciências – Química de Produtos Naturais – NPPN/UFRJ

Depto. de Química de Produtos Naturais – Farmanguinhos – FiocruzDocente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – FiocruzDocente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica – Farmanguinhos – Fiocruz

Princípio da EM: elementos diferentes podem seridentificados por suas massas

Métodos Físicos de Análise




O que é a espectrometria de massas?

• Ferramenta analítica utilizada para medir o peso molecular de uma amostra e obter informação qualitativa estrutural e quantitativa

• São necessárias apenas concentrações picomolares

• Acurácia de 0.01% do peso total da amostra e 5ppm para moléculas orgânicas pequenas

• Para um peso de 40 kDa, um erro de 4 Da

• Útil na determinação de fragmentos deamostras e no sequenciamento debiomoléculas e na identificação desubstâncias específicas em misturascomplexas

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AULA 3

ESPECTROMETRIA DE MASSAS



Espectrometria de massas

• Visão geral• Espetrometria de massas é a geração, separação e caracterização de ions em

fase gasosa de acordo com suas massas relativas em função da carga

• Previamente, o requerimento era que a amostra fosse passível de vaporização (limitação semelhante à CG), porém técnicas de ionização modernas permitem o estudo de moléculas não voláteis (como proteínas e nucleotídeos)

• A técnica é uma poderosa ferramenta qualitativa e quantitativa; as análises de rotina são realizadas em escala de femtogramas (10-15 g) level, podendo chegar até zeptomoles (10-21 mol) para proteínas

• Dentre todas as técnicas de espectroscopia orgânica, é usada para os mais diferentes fins: metalurgia, biologia molecular, semicondutores, geologia, arqueologia etc mais que nenhuma outra

• Encontrar um caminho para “carregar” um átomo ou molécula (ionização)

• Colocar o átomo ou molécula em um campo magnético ou submeter a um campo elétrico e medir sua velocidade ou raio de curvatura relativamente à sua razão massa-carga



Espectro de massas típico

• Caracterizado por sinais finos

• Eixo x indica a razão m/z para os ions (para aqueles com carga simples, corresponde à massa do ion)

• Altura do sinal indica a abundância relativa de do ion (não confiável para quantificação)

• Intensidade do sinal indica a capacidade do ion de ser dessorvido ou “voar” (alguns voam melhor que outros)



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Espectro de massas



Usos da espectrometria de massas

• Descoberta de isótopos

• Determinação de pesos moleculares

• Caracterização de novos elementos

• Análises quantitativas (metabólitos)

• Identificação de sequências

• Marcação isotópica

• Identificação de elementos-traço, poluentes e drogas



Limitações

● As substâncias não podem ser caracterizadas se as amostras não estiverem limpas

● A técnica não tem grande condição de garantir análise seletiva e sensível de misturas complexas

● Para moléculas grandes, os espectros são bastante complexos e de difícil interpretação



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Princípios da EM: o espectrômetro

ionizador

amostra

+_

analisador demassas

detector



Como funciona um espectrômetro?

• 3 partes fundamentais: a fonte de ionização, o analisador e o detector

• Separação no analisador de acordo com a razão massa/carga (m/z)

• Detecção dos ions separados e suas abundâncias relativas

• Sinais enviados ao sistema de dados e formatados num espectro m/z



O espectrômetro de massas (esquema geral)

►Geração de ions – as moléculas da amostra são submetidas à fontes que convertem parte delas a ions

► Separação de ions – à medida em que são aceleradas em um campo elétrico, são separadas de acordo com suas razões massa-carga (m/z)

► Detecção de ions – à medida em que cada população separada de ions é gerada, o instrumento precisa qualificá-las e quantificá-las

As diferenças nos modelos de espectrômetros baseiam-se nas formas diferentes de realizar estas três funções



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Esquema de um espectrômetro



InletIon

SourceMassFilter Detector

DataSystem

ALTO VÁCUO

BOMBAS

Sample PlateTargetHPLCGCSolids probe

MALDIESIIonSprayFABLSIMSEI/CI

TOFQuadrupoloIon TrapSetor magné-ticoFTMS

Placa de micro-canaisMultiplicador deeletrons

PC

ALTO VÁCUO

ENTRADA DA

AMOSTRA

Inlet de gás

Probe de sólidos

CGCLAE

FONTE DE IONS

FILTRO DE

MASSASDETECTOR

SISTEMA DE

DADOS

Introdução da amostra

• Inlet de gás

• Probe de sólidos• CG

• CLAE• Cromatógrafo de líquido supercrítico• Eletroforese capilar



• GC-MS (CG-EM) – Cromatografia com fase gasosa acoplada à espectrometria de massas

– separa componentes voláteis na coluna e identifica por massas

• LC-MS (CL-EM)- Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas

– separa compostos mais lábeis por CLAE e identifica por massas

• MS-MS (EM-EM) - Tandem Mass Spectrometry

– separa fragmentos de compostos por campo magnético e identifica por massas



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Cromatografia com fase gasosa acoplada à espectrometria de massas



Configuração mais comum: ionização por impacto de eletrons e filtro de massas quadrupolo

Ionização


InletIon


DataSystem

ALTO VÁCUO

BOMBAS





PC

ALTO VÁCUO

ENTRADA DA

AMOSTRA

Inlet de gás

Probe de sólidos

CGCLAE

FONTE DE IONS

FILTRO DE

MASSASDETECTOR

SISTEMA DE

DADOS


A fonte de ions depende da amostra…

Amostra sólida Amostra líquida Amostra gasosa

EICIMALDI ESI

prepara solução?transforma em sólido? vaporiza?

Propriedades químicas do

analito no gás?

Propriedades químicas do

analito na solução?



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Modos de ionização• Impacto de eletrons (EI – método drástico)

– Moléculas pequenas (1-1000 Daltons): estrutura

• Ionização química (CI – método brando)– Moléculas pequenas (1-1000 Daltons): ion molecular, grandes fragmentos

• Fast Atom Bombardment (FAB – “semi-drástico”)– Peptídeos, açúcares (até 6000 Daltons)

• Eletrospray (ESI – “semi-drástico”)– Peptídeos, proteínas (até 200.000 Daltons)

• Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI - branda)– Peptídeos, proteínas, DNA (até 500kD)



• A amostra é dissolvida em tampão polar volátil (sem sais) e bombeado através de um capilar de aço inoxidável (70-150mm) num fluxo de 10-100 mL/min

• Alta voltagem (3-4kV) é aplicada no fluxo de gás nebulizado, fazendo com que a amostra também se nebulize (ou se torne um aerossol)

• O aerossol é direcionado através de regiões de alto vácuo até que as gotículas evaporem até quase o tamanho atômico

• Pode ser modificada a “nanospray” com fluxo < 1mL/min

• Técnica muito sensível: requem menos que um picomol de material

• Bastante afetada por sais e detergentes

• Medição via modos positivo ou negativo [(M + H) por adição de ácido fórmico ao solvente; (M - H) por adição de amônia ao solvente]



Ionização por eletrospray

Processo em três etapas1) Formação da gota 2) Encolhimento da gota3) Formação de ions gasosos

O processo de eletrospray não ioniza as amostras!

Taylor Cone



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• Maioria das amostras são líquidas.– CG requer aquecimento da amostra para gerar evaporação– Ionização ocorre por impacto de eletrons ou reações químicas– Nem todos os analitos são termicamente estáveis

• Eletrospray foi desenvolvido para garantir uma forma branda de geração de ions gasosos

• Pode ser facilmente interfaceado com cromatógrafo a líquido

• Sinais absolutos do eletrospray são mais facilmente reproduzidos garantindo, assim, melhor quantificação

• Acurácia de massa é considerada melhor

• Carregamento múltiplo é mais comum que em MALDI



Por que eletrospray?

• Diferente da ESI, MALDI gera espectros que apresentam apenas um ion carregado simples

• Modo positivo gera ions de (M+H) e modo negativo gera ions de (M-H)

• Geralmente mais robusto que ESI (tolera sais e compostos não voláteis)

• Maior facilidade de uso e manutenção, capaz de maior escala de trabalho

• Requer amostra de 10 mL de 1 pmol/mL• A amostra é ionizada pelo seu bombardeamento com luz laser

• A amostra é misturada a uma matriz que absorve no UV (ácido sinapínico para proteínas, ácido 4-hidroxicinâmico para peptídeos, por exemplo)

• O comprimento de onda iguala ao de máxima absorbância da matriz, fazendo com que ela transfira parte de sua energia ao analito (levando à pulverização dos ions)



MALDI: Matriz Assisted Laser Desorption Ionization

O analito é co-depositado com a matrizO laser excita a matriz que, por sua vez, transfere energia para o analitoProduz espécies com apenas uma cargaTipicamente usada para biomacromoléculas/polímerosMALDI é comumente combinada com TOFMoléculas da amostra (M) são ionizadas por transferência de protons:

XH+ + M � MH+ + X



MALDI

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• Não pode ser volátil (a maioria é sólida em temperatura ambiente)

• Precisa absorver o comprimento de onda em uso (337nm na maioria dos casos)

• Preferencialmente solúvel no mesmo solvente da amostra

• As matrizes são, tipicamente, ácidas: geralmente, um ácido aromático forte que absorve fortemente o laser de N2 em 335nm e cristaliza



A matriz

• Menos sensível a sais

• Menores limites de detecção (na prática)

• Espectros de interpretação mais fácil (menor número de cargas múltiplas)

• Rápido e fácil

• Detecção de massas mais altas

• Maior rendimento (>1000 amostras por hora)



Por que MALDI?

Impacto de eletrons

• Amostra de interesse é vaporizada no equipamento• A energia suficiente para ionização e fragmentação das moléculas do

analito é adquirida pela interação com eletrons provenientes de filamento aquecido

• 70 eV são comumente usados• A fonte de eletrons é um fio fino de rênio aquecido eletricamente a

uma temperatura na qual emite eletrons livres



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• Amostra introduzida no instrumento por aquecimento, até a evaporação• A amostra em fase gasosa é bombardeada com eletrons provenientes

de filamentos de rênio ou tungstênio (70 eV)• A molécula é estilhaçada em fragmentos (70 eV >> 5 eV ligações)• Os fragmentos são enviados ao analisador de massas



Impacto de eletrons

Uma partícula carregada passando por um campo magnético é defletida através de uma trajetória circular, com um raio proporcional à sua relação massa/carga.

Num espectrômetro de impacto de eletrons, um feixe de eletrons de alta energia é usado para deslocar um eletron da molécula orgânica para formar um cation radical, conhecido como ion molecular. Se ele for instável, pode ser então fragmentado em outros ions menores.

A coleção de ions é então focalizada em um feixe e acelerada para o campo magnético e defletida nas trajetórias circulares de acordo com as massas dos ions. Ao ajustar o campo magnético, os ions podem ser focalizados no detector e registrados



Impacto de eletrons

M

e-e- e-

M(g) + e- � M+(g) + 2e-

M+(g) � A+f

rag 1 (g) + Bfrag 2 (g)



Impacto de eletrons

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Exemplo: fragmentação por IE de CH3OH

CH3OH CH3OH+

CH3OH CH2O=H+ + H

CH3OH + CH3 + OH

CHO=H+ + HCH2O=H+



Impacto de eletrons

Quebra da molécula de maneiras previsíveis

Molecular ionEM/IE CH3OH



Impacto de eletrons

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Impacto de eletrons

Espectro de massas gerado por impacto de elétrons: formação dos fragmentos

Exemplo: Formação do m/z = 57.

Exemplo: Formação do m/z = 43 (íon base= 100%).





EXEMPLO: cocaína por EI• Fragmentação extensa• Ion molecular é fraco em m/z 303

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Algumas considerações...Espectrômetros comerciais detectam íons com carga positiva (M+ ou M+.)

Em rotina, os aparelhos não detectam grupos neutros e nem os carregadosnegativamente (exigem outras condições).

Ao sofrer um impacto de 70eV, a substância perde um elétron e ficainstável, o que ocasiona a perda de fragmentos até uma maior estabilidade. Aanálise dos fragmentos gerados permite inferir sobre a estrutura. Grande parte dassubstâncias gera íons moleculares estáveis, o que permite o conhecimento do pesomolecular.

Quanto maior for a capacidade de uma molécula em estabilizar o produtoformado a partir do impacto com 70eV, maior será a chance deste chegar aodetector e ser identificado.

Nem todas as substâncias podem ser analisadas com a técnica de impactode elétrons, já que não se ionizam com esta energia ou não podem ser volatilizadasna câmara de ionização ou geram produtos muito instáveis para serem analisados.Assim, existem outras técnicas para transferir energia para a substância para queesta possa se ionizar, como a ionização química.



• Usada para confirmar o peso molecular• Reconhecida como uma técnica de ionização branda• Difere do impacto pois, alternativamente, as moléculas são

ionizadas por interação ou colisão com ions do gás reagente mais do que com eletrons

• Os gases reagentes mais comumente usados são metano, isobutano e amônia

• O gás reagente é bombeado diretamente na câmara de ionização e os eletrons do filamento o ionizam



Ionização química

• 1º - ionização eletrônica do CH4:– CH4 + e- → CH4

+ + 2e-

• Formas fragmentadas: CH3+, CH2

+, CH+

• 2º - reações ion-molécula criam ions reagentes estáveis:– CH4

+ + CH4 → CH3 + CH5+

– CH3+ + CH4 → H2 + C2H5

+

• CH5+ e C2H5

+ são os ions reagentes dominantes do metano




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• Forma ions pseudomoleculares (M+1)– CH5

+ + M → CH4 + MH+

– Ions M+1 podem gerar fragmentações posteriores para produzir um espectro complexo

• Forma adutos

– C2H5+ + M → [M + C2H5]+ (aduto M+29)

– C3H5+ + M → [M + C3H5]+ (aduto M+41)

• Ion molecular por transferência de carga– CH4

+ + M → M+ + CH4

• Abstração de hidreto (M-1)

– C3H5+ + M → C3H6 + [M-H]+




• Fragmentação limitada• Ion molecular é fraco em m/z 303



EXEMPLO: cocaína por CI

Ionização em fase gasosa

•EI e CI são técnicas de ionização em fase gasosa•Amostra é aquecida para volatilizar•A molécula deve ter peso molecular baixo e polaridade suficientes para que:

Tvap< Ttermodecomp



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Ions reagentes do metano (CI)

– Ions em m/z 17, 29 e 41 são originários do metano; • H3O+ também se forma pelo vapor d´água no sistema de vácuo



Cocaína (CI – metano)Ions pseudomolecular e fragmentos





Cocaína (CI – isobutano)Menor fragmentação

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Métodos de ionização (resumo)



Quando usar EI e CI?

EI

•Quando é necessário o “fingerprint” para identificação por comparação em bases de dados

•Análise de traços

•Forense

•Ambiental

•Desconhecidos totais (ex. produtos naturais)

•Homologia de fragmentação em uma série (ex. produtos naturais)

CI

•Quando é necessária a identificação confiável do ion molecular

•LC-MS

•Acompanhamento de uma rota sintética, identificação de impurezas

•Amostras biológicas ou outras frágeis ou sensíveis à decomposição (ex. drogas e metabólitos)

•Minimizar a fragmentação, ganhando maior intensidade no ion molecular





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Filtros de massa/analisadores/separadores de ions


InletIon


DataSystem

ALTO VÁCUO

BOMBAS





PC

ALTO VÁCUO

ENTRADA DA

AMOSTRA

Inlet de gás

Probe de sólidos

CGCLAE

FONTE DE IONS

FILTRO DE

MASSASDETECTOR

SISTEMA DE

DADOS


Modo positivo ou negativo?

• Se a amostra contém grupos funcionais que sejam bons aceptores H+

(como amida e grupos amino presentes em peptídeos e proteínas) então a detecção positiva é usada

• Se a amostra apresenta grupos funcionais que percam protons facilmente (como ácidos carboxílicos e hidroxilas, como as encontradas em ácidos nucleicos ou açúcares), então a detecção negativa é usada



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Analisadores de massas

• Setor magnético (MSA)– Alta resolução, massa exata (é o analisador original)

• Quadrupolo (Q)– Baixa resolução (1 u.m.a.), rápido, barato

• Tempo-de-voo (Time-of-Flight - TOF)– Sem limite de m/z, alto rendimento

• Ion Trap– Boa resolução, analisador “all-in-one”

• Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR)– Mais alta resolução, massa exata, caro



• Tempo-de-voo (TOF, TOF-MALDI)– Mede o tempo requerido para os ions voarem pela extensão da câmara– Comumente combinado com MALDI

• Tandem MS - MS/MS - MSn

– Separação e identificação de componentes em misturas complexas– Induz fragmentação e analisa os fragmentos– Usa dois ou mais analisadores/filtros separados por uma célula de

colisão

• Diferentes configurações de MS-MS– Quadrupolo - quadrupolo (baixa energia)– Setor magnético - quadrupolo (alta energia)– Quadrupolo - tempo-de-voo (baixa energia)– Tempo-de-voo – tempo-de-voo (baixa energia)



LC/LC-MS/MS-Tandem LC, Tandem MS



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Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)

• A ideia é fragmentar ions a partir de ions-pai para obter informação estrutural sobre uma molécula

• Permite ainda separação de massa e identificação em misturas complexas

• Usa dois ou mais analisadores/filtros separados por uma célula de colisão preenchida com argônio ou xenônio

• A célula de colusão é onde os ions selecionados são direcionados para posterior fragmentação



O primeiro (MS1) é usado para SELECIONAR, nos ions primários, aquele(s) com um valor de m/z para passar na região de fragmentação. O ion selecionado é o ion-pai e pode ser o ion

molecular resultante da fragmentação primária. A DISSOCIAÇÃO ocorre na região de fragmentação. Os ions filhos são analisados num segundo espectrômetro (MS2). Na verdade, o

MS1 pode ser visto como fonte de ions para MS2.

MS2MS1



Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)

• Identificação de desconhecidos• Potencialmente dois compostos de interesse têm a mesma massa (e o

mesmo tempo de retenção)• Melhorias quantitativas (redução do ruído)



Por que Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)?

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Setor magnético





Setor magnético



Setor magnético

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Quadrupolo

• Consiste de quatro hastes metálicas paralelas com diferentes cargas

• Duas hastes opostas apresentam potencial positivo e as outras duas apresentam potencial negativo

• As voltagens aplicadas afetam a trajetória dos ions que migram ao longo do trajeto de voo

• Para determinadas voltagens de correntes alternada ou contínua, somente ions com razões massa-carga específicas passam pelo quadrupolo e todos os demais ions são ejetados de sua trajetória original



Quadrupolo



Quatro magnetos hiperbólicos em seção cruzada, são arranjados; em um par é aplicada corrente alternada; no outro, aplica-se corrente contínua

Somente um ion em particular consegue “ressonar” adequadamente e atingir o detector

A vantagem é o tamanho compactodo instrumento –cada haste tem o tamanhoaproximada de uma canetaesferográfica

Quadrupolo

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Quadrupolo



Quadrupolos



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• O tamanho compacto e a velocidade destes instrumentos propiciam que eles sejam eficientes e poderosos como detectores para CG: uma vez que os compostos já se encontram vaporizados, somente o gás carreador precisa ser eliminar para que o processo ocorra

•Pequeno: as moléculas são facilmente defletidas de suas trajetórias e são ejetadas pelo vácuo; os ions mais pesados, como maiores momenta, tendem a permanecer no centro do jato e são enviados ao detector

interface GC-MS: uma bomba é usada para evacuar

a interface



Quadrupolo



Quadrupolo



Tempo-de-voo (TOF)

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Tempo-de-voo (TOF)





Tempo-de-voo (TOF)



Tempo-de-voo (TOF)

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TOF



Ion Trap

São dispositivos que fazem uso de campos de quadrupolos tridimensionais para capturar e analisar as massas dos ions com bom poder de resolução



Ion Trap



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Ion traps



ION TRAPS x QUADRUPOLOS

Separação de massa no tempo

Alta sensibilidade –varredura total

Estágios múltiplos de detecção de massas (MSn)

Alta resolução

Separação de massa no espaço

Baixa sensibilidade –varredura total

Não há estágios múltiplos

Perda da varredura de espécies neutras



FT-Ion Cyclotron



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Ion cyclotron resonance - FT

• Usa um magneto poderoso (5-10 Tesla) para criar um ciclotron em miniatura

• Abordagem por FT permite a determinação simultâne de muitas massas de ions - EFICIÊNCIA

• Apresenta resolução mais alta que qualquer outro analisador de massas disponível







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Espectrômetro de massas



Espectrômetro de massas



Detecção




InletIon


DataSystem

ALTO VÁCUO

BOMBAS




PC

ALTO VÁCUO

ENTRADA DA

AMOSTRA

Inlet de gás

Probe de sólidos

CGCLAE

FONTE DE IONS

FILTRO DE

MASSAS

SISTEMA DE

DADOS

DETECTOR

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Detectores

• Os primeiros usavam filmes fotográficos• Hoje, produzem sinais eletrônicos quando atingidos por ions• Mecanismos de tempo integram estes sinais com voltagens em

varredura que permitem ao instrumento registrar a m/z que atinge o detector

• Necessitam de calibragem constante e regular

• Monitoram a corrente de ions, amplificam e transmitem o sinal para o sistema de dados

• Mais comuns:• Fotomultiplicador• Multiplicador eletrônico

• Placa de microcanais



O espectro de massas– Apresentação: abundância relativa x razão m/z (massa) – o ion mais abundante

formado durante a ionização gera o sinal mais alto no espectro = pico-base

pico-base, m/z 43



O espectro de massas– Todos os demais picos são relativos ao pico-base e expressos como

porcentagem

– Se a molécula perde somente um eletron no processo de ionização, o ion molecular é observado e fornece seu peso molecular – designado como M+ no espectro



M+, m/e 114

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fragmentos



O espectro de massas– Na maioria dos casos, quando a molécula perde um eletron de valência, as

ligações são quebradas ou o ion formado rapidamente se fragmenta gerando ions de mais baixa energia

– As massas dos ions carregados são registrados como fragmentos iônicos –fragmentos neutros não são registrados!



O espectro de massas– Quando um pico M+ é observado, ele fornece a massa molecuar – considerando

que cada átomo se encontra em sua forma isotópica mais abundante

– Lembrar que o carbono é uma mistura de 98,9% de 12C, 1,1% de 13C e menos que 0,1% de 14C – na tabela periódica, a massa de 12,011 é a média

– Por sua natureza, o espectrômetro de massas vê um sinal de massa 12 como carbono e um pico M+1 em 13, que apresentará 1,1% da altura do primeiro

– Determinação da massa molecular

• Algumas moléculas são altamente frágeis e os picos M+ não são observados – um método usado para confirmar a presença de um pico M+ é reduzir a voltagem de ionização – ions de energia mais baixa não fragmentam facilmente

• Três fatos são aplicáveis ao pico do ion molecular:

– O pico deve corresponder ao ion de massa mais alta no espectro, excluindo os picos de isótopos

– O ion deve ter número ímpar de eletrons – geralmente, um cation radical

– O ion deve ser capaz de gerar outros fragmentos no espectro pela perda lógica de fragmentos neutros

Determinando padrões isotópicos no espectro de massas

•Espectrômetros de massas são capazes de separar e detectar ions individuais, mesmo que suas diferenças sejam de apenas uma unidade de massa

•Como resultado, moléculas que contenham isótopos diferentes podem ser distinguidos

•Isto é mais claro quando átomos tais como bromo ou cloro estão presentes (79Br:81Br, intensidade 1:1; 35Cl:37Cl, intensidade 3:1) quando picos em "M" e "M+2" puderem ser obtidos

•A razão das intensidades nos padrões dos isótopos são devidas às abundâncias naturais dos isótopos

•Picos de "M+1“ são vistos devido à presença de 13C na amostra



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Espectro de Massas gerado por impacto de elétrons: presença de M+2 emsubstâncias contendo cloro (M+2 1/3 do M+) e bromo (M+2 = M+)



Isótopos podem ajudar na identificação de compostos

EM/IE CH3Br



EM x RMN

• Picos em EM são mais finos que em RMN• EM é muito mais sensível (104 x) que RMN (está entre as ferramentas

analíticas mais sensíveis)• Com EM é possível analisar moléculas muito maiores (>50 kD) • Amostras para EM são mais difíceis de serem preparadas

• EM não é propriamente quantitativa• Espectrômetros de massas custam um pouco menos que os de RMN



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A “regra do nitrogênio”

• Moléculas contendo átomos limitados a C, H, O, N, S, X e P de massa molecularpar contêm número par ou não contêm nitrogênio (também se aplica a radicais) –serve para confirmar a presença de um ion molecular

• Não se aplica a cations radicais

• No caso da ionização química, onde se observa [M+H]+, subtrair de 1 e entãoaplicar a regra

• Exemplo: se uma substância não contém nitrogênio e gera um ion em m/z 201,então este pico não pode ser o do ion molecular

• Se a molécula contém número par de nitrogênios ou não contém este elemento,o ion molecular apresentará relação massa/carga par; por outro lado, se amolécula contém número ímpar de nitrogênios, o ion molecular terá massa ímpar

• Se a molécula contém cloro ou bromo, cada qual com dois isótopos comuns, adeterminação do M+ pode ser simplificada ou dificultada!...



1. Tome o peso do ion e divida por 13

2. Esta resposta é o “n”, para (CH)N e qualquer sobra é adicionada como H

Ex. 92

92/13 = 7 com sobra de 1; C7H8 pesa 92. Este é a fórmula candidata

Pode-se avaliar outras alternativas que possuam heteroátomos. Para cada membro da lista abaixo, substitua o número indicado de CHs na resposta abaixo

Hetero substituição

CH substituição Hetero substituição

CH substituição

O CH4 P C2H7

N CH2 S C2H8

O+N C2H6 O+S C4

F CH7 I C10H7

Si C2H4 Cl,Br (usar isótopos)



A “regra dos 13” e a predição da fórmula

Rearranjo de McLafferty

Cations radicais localizados no oxigênio da forma ceto podem ser β-clivadosO mecanismo se limita à fragmentação por impacto de eletronsÉ necessário um H em um carbono γ de hibridação sp3

Cetonas, ésteres, ácidos carboxílicos geram produtos por este rearranjo

O+

HR2

R1

• O+

H

•

O H

R1 R2

••

•

+



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Clivagem αααα de C=O

O O

O

: .

+

++:

+:

:

neutro

CH3C=O+

m/z=43



Clivagem α em heteroátomos (O, N)

O

R

: .

+•

Clivagem heterolítica

R

O :: .

neutro

+

+



Rearranjos e fragmentações que geram bons carbocations

C H 2+

CH

+ C H 2

H C

C H 2

C H +

+Cation benzílico (estabilizado como tropílio) m/z=91



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Aminas

N+

-R•

R

Aminas cíclicas perderão H• adjacentes formando ion imínio



A clivagem “retro Diels-Alder”

+

+•

+•

+

+•

Cicloexenos com estado de transição de 6 membros favorável; pode incluir

heteroátomos (N,O)




QUESTÕES DE CONCURSOS


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O espectrômetro de massas é um equipamento que fornece dados para a identificação de compostos. Ele pode ser acoplado a um cromatógrafo de modo a permitir a identificação de vários compostos presentes em uma mesma amostra. O espectro de massas é produzido quando:

a) a molécula do analito é fragmentada por ação de forças magnéticas;b) a molécula do analito é excitada por um feixe de luz e a luz emitida pela

molécula é captada pelo detector;c) a molécula do analito absorve energia proveniente de radiação

eletromagnética sofrendo vários tipos de excitação;d) dois protons adjacentes quimicamente diferentes, alinham-se em relação a

um campo magnético externo;e) a molécula do analito é bombardeada em fase gasosa por um feixe de

elétrons.

(PERITO LEGISTA – TOXICOLOGIA – PF)



Ao selecionar o monitoramento seletivo de íons na análise por espectrometria de massas, devemos utilizar algum critério para garantir que estamos identificando corretamente o composto. O critério considerado de maior segurança é quando a identificação pode ser concluída se o analito possuir:

a) o íon de maior intensidade do composto padrão de comparação;b) pelo menos 3 íons característicos do composto padrão de comparação;c) o mesmo tempo de retenção no cromatograma, ainda que os íons sejam

diferentes do composto padrão de comparação;d) pelo menos 2 íons característicos do composto padrão de comparação;e) pelo menos alguns íons característicos, ainda que ainda que o tempo de

retenção no cromatograma seja diferente do composto padrão de comparação.

(PERITO LEGISTA – TOXICOLOGIA – PF)



45 – Julgue as afirmações abaixo, sobre a espectrometria de massas:

I – Um espectro de massa é o registro do que acontece com as moléculas quantos estas são bombardeadas em fase gasosa por um feixe de elétrons, em um instrumento chamado espectrômetro de massas.

II – As moléculas são destruídas em pedaços. Usualmente é possível deduzir do estudo dos fragmentos a estrutura da molécula original.

III – Os espectros de massa podem ser também usados para determinar a extensão e localização da incorporação de isótopos.

IV – Durante a interação entre a molécula e o elétron de alta energia há transferência de energia para a molécula. Uma das maneiras pelas quais as moléculas excitada pode dissipar a energia em excesso é pela ejeção de um elétron, ficando positivamente carregada.

V – Geralmente a pressão da amostra de espectrômetro e massa não ultrapassa 10-5 mm Hg. Nesta baixa pressão podem ocorrer os fragmentos e rearranjos intramoleculares, mas a probabilidade de ração intermoleculares entre ions ou moléculas neutras é baixa.

São verdadeiras:

a) I,II,IV e Vb) I,II e IIIc) II,III e Vd) Todas as afirmações

(PERITO – PF 1993 – ENG.QUÍMICA/FARMÁCIA/QUÍMICA/C.BIOLÓGICAS/BIOQUÍMICA)



Métodos Físicos de Análise - ESPECTROMETRIA DE MASSASCEFARMA) MASSAS - junho 2012... ·...

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