Michelle Sabrina da Silva -...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Médicas

Michelle Sabrina da Silva

O papel do extrato de Rhodiola rosea e Chlorella

na modulação de cicatrizes queloideanas

The role of Rhodiola rosea extract and Chlorella in the

modulation of keloid scars

Campinas

2017

Michelle Sabrina da Silva

O papel do extrato de Rhodiola rosea e Chlorella

na modulação de cicatrizes queloideanas

Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de

Campinas como parte dos requisitos exigidos

para a obtenção do título de Doutora em

Farmacologia.

Orientadora: Profª Drª Mary Luci de Souza Queiroz

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA

MICHELLE SABRINA DA SILVA, E ORIENTADA PELA PROFª DRª MARY LUCI DE SOUZA

QUEIROZ.

Campinas

2017

I. Dedicatória

Gosto muito de te ver, leãozinho

Caminhando sob o sol

Gosto muito de você, leãozinho

Para desentristecer, leãozinho

O meu coração tão só

Basta eu encontrar você no caminho

Um filhote de leão, raio da manhã

Arrastando o meu olhar como um ímã

O meu coração é o sol, pai de toda cor

Quando ele lhe doura a pele ao léu

Gosto de te ver ao sol, leãozinho

De te ver entrar no mar

Tua pele, tua luz, tua juba

Gosto de ficar ao sol, leãozinho

De molhar minha juba

De estar perto de você e entrar no mar

Aos meus filhos, que são os motivos do ser e

fazer da minha alma. Caio e Isabela, as

forças que me movem. Não existem palavras

que descrevam o amor que sinto por vocês.

I. Dedicatória

Não é sobre ter todas as pessoas do mundo pra si

É sobre saber que em algum lugar alguém zela por ti

É sobre cantar e poder escutar mais do que a própria voz

É sobre dançar na chuva de vida que cai sobre nós

É saber se sentir infinito num universo tão vasto e bonito, é saber sonhar

Então fazer valer a pena cada verso daquele poema sobre acreditar

Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu

É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu

É sobre ser abrigo e também ter morada em outros corações

E assim ter amigos contigo em todas as situações

A gente não pode ter tudo

Qual seria a graça do mundo se fosse assim?

Por isso eu prefiro sorrisos e os presentes que a vida trouxe pra perto de mim

Não é sobre tudo que o seu dinheiro é capaz de comprar

E sim sobre cada momento, sorriso a se compartilhar

Também não é sobre correr contra o tempo pra ter sempre mais

Porque quando menos se espera a vida já ficou pra trás

Segura teu filho no colo, sorria e abraça os teus pais enquanto estão aqui

Que a vida é trem-bala parceiro e a gente é só passageiro prestes a partir

A minha amada mãe, o exemplo de mulher, minha

inspiração, minha fonte de energia. Ao meu amado pai,

acolhedor à sua forma, muito mais carinhoso do que ele

mesmo imagina ser. Aos meus amados irmãos, Douglas e

Mirella, cuidadosos e presentes, tão fundamentais em

minha vida. Ao Fabio, meu parceiro eterno, exemplo de

honra, caráter, lealdade e amizade. Amo vocês do fundo

do meu coração.

I. Dedicatória

Que nada nos limite, que nada nos defina,

que nada nos sujeite. Que a liberdade seja

nossa própria substância, já que viver é ser

livre. Porque alguém disse e eu concordo

que o tempo cura, que a mágoa passa, que

decepção não mata. E que a vida sempre,

sempre continua.

Simone de Beauvoir

A todas as mulheres que, antes de mim, lutaram

para que eu pudesse estar aqui. A todas as

mulheres que seguem lutando para que nossas

filhas (e as que vierem depois delas) possam ir

mais longe ainda.

II. Agradecimentos

À Profa. Dra. Mary Luci de Souza Queiroz, orientadora deste trabalho, por

me receber tão bem em seu laboratório, por confiar, apoiar e estimular o meu trabalho.

Suas orientações influenciaram não apenas meu desenvolvimento científico, mas

também meu desenvolvimento pessoal. Saiba que sou muito grata por tudo.

A minha querida amiga Samara Eberlin pela amizade acima de tudo, por

todo o auxílio científico e apoio emocional durante o desenvolvimento deste estudo, por

acreditar e confiar no meu trabalho e me oferecer uma oportunidade profissional única.

Por estar sempre por perto e não me deixar esquecer as coisas que realmente importam.

A minha querida amiga Sueli, o coração do laboratório CFU, a mãezona de

todos, sempre atenta e cuidadosa, ouvindo os alunos, aconselhando, dando as merecidas

broncas, mas também os merecidos abraços. Sua amizade é muito importante pra mim.

A Cristiane pela sua contribuição no desenvolvimento deste trabalho.

As queridas Fabiana e Camilla, foi um prazer imenso trabalhar com vocês,

nunca vou me esquecer dos nossos feriados e finais de semana no CFU regados a muito

trabalho e muitas risadas. Vou sempre lembrar com saudosismo desta época.

A Analeda que me auxiliou nos ensaios de citometria de fluxo de forma tão

cuidadosa e dedicada.

A Profª Drª Ana Paula Campanelli, que plantou, regou e cultivou a semente

de cientista que existe dentro de mim.

As minhas amadas amigas-irmãs Patrícia e Adriana, por me conhecerem

melhor que eu mesma, por absolutamente tudo que fizeram nestes nossos longos e bons

anos de amizade. Amo vocês!

Ao amigo Gustavo que sempre me socorreu nas minhas dificuldades com

softwares e afins.

Ao meu tio Celino que sempre esteve ao meu lado independente de tudo, me

ajudando e me apoiando.

A minha família, que me apoiou e incentivou a vida inteira, por estarem sempre

ao meu lado segurando minha mão.

Ao Fabio por acreditar nos meus sonhos junto comigo, por confiar, apoiar,

mesmo quando tudo isso existia apenas na minha cabeça.

Aos meus filhos por me inspirarem e me ensinarem o quanto o amor é capaz de

mover o mundo.

A todos que fizeram parte e me ajudaram com tanta dedicação fazendo com que

tudo isso acontecesse.

Ao Departamento de Farmacologia, ao Hemocentro e ao Hospital das

Clínicas da Unicamp pela equipe, infra-estrutura disponibilizada e todo o apoio durante

a realização deste trabalho.

Ao Grupo Kosmoscience, em especial ao Adriano e a Samara, pela

contribuição técnica e apoio a este trabalho e pela compreensão aos momentos em que

tive que me ausentar para me dedicar a este estudo.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior

(CAPES), pelo apoio financeiro durante o desenvolvimento deste trabalho.

III. Resumo

As cicatrizes queloideanas são definidas como o produto final de um processo

inflamatório crônico que culmina no enrijecimento e crescimento excessivo do tecido

como resultado da deposição excessiva de colágeno. Estudos na literatura mostram que

as citocinas e os fatores de crescimento aumentam a atividade metabólica dos

fibroblastos, ativando caminhos de sinalização intracelular, levando à produção

exacerbada de componentes da matriz extracelular e à consequente formação dessas

cicatrizes. Apesar do grande número de tratamentos disponíveis, os resultados são

inconsistentes e pouco frutíferos com altas taxas de recorrência, além do alto custo

financeiro. Neste contexto, a busca por terapias alternativas que podem atuar para

prevenir a formação dessas cicatrizes é de grande relevância para das indústrias

farmacêutica e cosmética. Desta forma avaliamos neste estudo a capacidade de

modulação in vitro e ex vivo da alga Chlorella e do extrato da planta Rhodiola rosea nos

mecanismos intracelulares da resposta inflamatória na pele, com o objetivo de prevenir

ou minimizar as manifestações clínicas dos queloides. Nossos resultados mostraram que

a alga Chlorella e o extrato da planta Rhodiola rosea modulam parâmetros

imunológicos e fibroproliferativos envolvidos na formação de queloides. Esta atividade

demonstrada por ambas as espécies pode ser considerada uma ferramenta importante na

tentativa de restaurar a atividade metabólica celular normal, contribuindo assim para a

redução da aparência e formação de queloides.

Palavras-chave: Queloide, cicatrização, Chlorella, Rhodiolla rosea.

IV. Abstract

Keloid scars are defined as the end product of a chronic inflammatory process that

culminates in hardening and excessive tissue growth as a result of excessive deposition

of collagen. Studies in the literature show that cytokines and growth factors increase the

metabolic activity of fibroblasts, activating pathways of intracellular signaling, leading

to the exacerbated production of extracellular matrix components and the consequent

formation of these scars. Despite the large number of treatments available, the results

are inconsistent and not very fruitful with high recurrence rates, in addition to the high

financial cost. In this context, the search for alternative therapies that can act to prevent

the formation of these scars is of great relevance for the pharmaceutical and cosmetic

industries. In this study we evaluated the ability of in vitro and ex vivo modulation of

Chlorella algae and Rhodiola rosea extract in the intracellular mechanisms of the

inflammatory response in the skin, with the aim of preventing or minimizing the clinical

manifestations of keloids. Our results showed that Chlorella algae and Rhodiola rosea

plant extract modulate immunological and fibroproliferative parameters involved in the

formation of keloids. This activity demonstrated by both species can be considered an

important tool in the attempt to restore normal cellular metabolic activity, thus

contributing to the reduction of the appearance and formation of keloids.

Key-words: Keloid, Wound Healing, Chlorella, Rhodiola rosea.

V. Lista de Ilustrações

Figura 1. Diagrama do processo de cicatrização de uma ferida onde ocorreu o

rompimento da epiderme e derme (45)........................................................................... 24

Figura 2. Evolução do processo de reparo e regeneração do tecido com formação de

cicatrizes normotróficas, hipertróficas e queloideanas (61). .......................................... 27

Figura 3. Diferentes formas da alga Chlorella. A. Visualização em microscópio

óptico – Aumento de 20x (68). B. Tanques de cultivo da alga (69). C. Alga em formato

pulverizado e comprimido (70). ..................................................................................... 30

Figura 4. Rhodiola rosea. A. Rodhiola rosea em solo arenoso e seco (90). B. Raiz da

planta Rhodiola rosea (91). C. Extrato de Rhodiola rosea (92). .................................... 33

Figura 5. Estrutura química dos principais constituintes fitoquímicos de Rhodiola

rosea. A. Rosavin. B. Rosin. C. Rosarin. D. Salirosídeo (93). ....................................... 35

Figura 6. Fotos de um dos fragmentos de pele provenientes de abdominoplastia antes

de iniciar o processo de assepsia. ................................................................................... 41

Figura 7. Fragmentos de pele normal plaqueados para posterior tratamento com

Chlorella e ERR. ............................................................................................................ 41

Figura 8. Isolamento de fibroblastos normais e derivados de queloides em garrafas de

cultura. ............................................................................................................................ 42

Figura 9. Análise microscópica das culturas primárias de fibroblastos humanos. Cultura

de fragmento de queloide após 3 (A), 7 (B) e 11 (C) dias de incubação. ....................... 42

Figura 10. Efeitos da Chlorella e do extrato de Rhodiola rosea (ERR) sobre a

viabilidade celular de fibroblastos humanos. Fibroblastos foram incubados com

diferentes concentrações (10-0,002mg/mL) de Chlorella e ERR, separadamente,

durante 48 horas e a viabilidade celular foi avaliada pelo método de MTT. A. Chlorella.

B. Extrato de Rhodiola rosea. Os dados representam a média da porcentagem de células

viáveis em relação ao controle obtidos de 3 experimentos independentes..................... 50

Figura 11. Avaliação da viabilidade tecidual de fragmentos de pele humana

mantidos em condições de cultura. Fragmentos de pele humana foram mantidos em

incubadora úmida à 37°C com 5% de CO2 por 5 dias. A avaliação da viabilidade do

tecido foi realizada em intervalos de 24 horas utilizando o corante vital MTT. ............ 51

Figura 12. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de colágeno em

fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram

incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de ERR. A

produção de colágeno foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos

isolados da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e

queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal; ** P <0,01

comparado ao controle queloide; *** P <0,001 em comparação com o controle queloide

(Anova, Tukey). .............................................................................................................. 74

Figura 13. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TGF-β1 em



produção de TGF-β1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos


queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal; *** P

<0,001 em comparação com o controle queloide (Anova, Tukey). ............................... 76

Figura 14. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de MMP-1 em



produção de MMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos




Figura 15. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de IL-6 em



produção de IL-6 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados

da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide

(KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal; *** P <0,001 em

comparação com o controle queloide (Anova, Tukey). ................................................. 80

Figura 16. Efeitos de Rhodiola rosea na proliferação de fibroblastos de pele

humana. As células foram incubadas por 72 horas na presença ou ausência de

Rhodiolla rosea em diferentes concentrações. A produção de proliferação celular foi

mensurada através da marcação com anti-BrdU e Iodeto de propídeos (PI) e analisada

por citometria de fluxo (FacsCalibur). A e B. Dot plots representativos de pele normal.

C. Fibroblastos obtidos de queloide, tratados com ERR. . #P<0,001 em relação ao

normal. ***P<0,001 em relação ao queloide (Anova, Tukey). ...................................... 82

Figura 17. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de VEGF em



produção de VEGF foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos




Figura 18. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TIMP-1 em



produção de TIMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos


queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal (Anova,

Tukey). ............................................................................................................................ 86

Figura 19. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TIMP-2 em



produção de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos


queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal (Anova,

Tukey). ............................................................................................................................ 87

Figura 20. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-1 em fibroblastos e

fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas

durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de Chlorella. A produção

de TIMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da

pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide

(KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal (Anova, Tukey). 112













VI. Lista de Abreviaturas e Siglas

3R’S SUBSTITUIÇÃO, REDUÇÃO E REFINAMENTO – REPLACEMENT, REDUCTION

AND REFINEMENT

µL MICROLITRO

µG MICROGRAMA

ACTH HORMÔNIO ADRENOCORTICOTRÓFICO

AKT PROTEÍNA QUINASE SERINA/TREONINA

ALA ÁCIDO 5-AMINOLEVULÍNICO

ANVISA AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA

ATCC AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION

BRACVAM CENTRO BRASILEIRO DE VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ALTERNATIVOS

BCRJ BANCO DE CÉLULAS DO RIO DE JANEIRO

BRDU 5-BROMO-2´-DEOXYURIDINA

BSA ALBUMINA DE SORO BOVINO

CAT CATALASE

CFU-GM UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA DE MACRÓFAGOS E GRANULÓCITOS

CM CENTÍMETROS

CNC/MS CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE/ MINISTÉRIO DA SAÚDE

CSA ATIVIDADE ESTIMULADORA DE COLÔNIA

CO2 DIÓXIDO DE CARBONO

DH DIETA HIPERLIPÍDICA

DMEM DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM

EGF FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL

ELISA ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO

ERR EXTRATO DE RHODIOLA ROSEA

FB FIBROBLASTO NORMAL

FBQ FIBROBLASTO DERIVADO DE QUELOIDE

FGF FATOR DE CRESCIMENTO DE FIBROBLASTOS

GM-CSF FATOR ESTIMULADOR DE COLÔNIA DE MACRÓFAGOS E GRANULÓCITOS

HCL ÁCIDO CLORÍDRICO

HHA EIXO HIPOTÁLAMO ADRENOCORTICOTRÓFICO

H2O2 PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

H2SO4 ÁCIDO SULFÚRICO

HFF-1 HUMAN FORESKIN FIBROBLAST 1

IFN INTERFERON

IL INTERLEUCINA

INCQS INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE

IRΒ RECEPTOR DE INSULINA BETA

IRS-1 SUBSTRATO DO RECEPTOR DE INSULINA 1

KEL FIB SKIN KELOID FIBROBLAST

KO KNOCKOUT

LM LYSTERIA MONOCYTOGENES

LTBMC CULTURA LÍQUIDA DE LONGA DURAÇÃO DE CÉLULAS DA MEDULA

ÓSSEA

MCP-1 PROTEÍNA QUIMIOATRATIVA PARA MONÓCITOS 1

MCTI MINISTÉRIO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E INOVAÇÃO

MEC MATRIZ EXTRACELULAR

MIP-1Α PROTEÍNA INFLAMATÓRIA PARA MACRÓFAGOS 1ALFA

ML MILILITRO

MM MILIMOLAR

M MOLAR

MAPKINASE PROTEÍNA-QUINASE ATIVADA POR MITÓGENOS

MMPS PROTEÍNAS METALOPROTEINASES DE MATRIZ

MRNA ÁCIDO RIBONUCLEICO MENSAGEIRO

MTT 3-(4,5-DIMETILTIAZOL-2-IL)-2,5-BROMETO DE DIFENILTETRAZOLIUM

N NORMAL

NG NANOOGRAMA

NAOH HODRÓXIDO DE SÓDIO

NF-B FATOR NUCLEAR KAPPA B

NK NATURAL KILLER

PB CHUMBO

PI IODETO DE PROPÍDEO

PBS PHOSPHATE BUFFERED SALINE

PDGF FATOR DE CRESCIMENTO DERIVADO DE PLAQUETAS

PDL PULSED-DYE LASER

PG PICOGRAMA

RENAMA REDE NACIONAL DE MÉTODOS ALTERNATIVOS

RER RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO

RNA ÁCIDO RIBONUCLEICO

RPM ROTAÇÃO POR MINUTO

ROS ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO

SMAD SMALL MOTHERS AGAINST DECAPENTAPLEGIC

SBF SORO FETAL BOVINO

SNC SISTEMA NERVOSO CENTRAL

SOD SUPER ÓXIDO DISMUTASE

TA TEMPERATURA AMBIENTE

TΒRI RECEPTOR DE TGF-Β1

TΒRII RECEPTOR UBÍQUO DE SERINA TIROSINA QUINASE

TCLE TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

TMB TETRAMETILBENZIDINA

TGF-Β FATOR TRANSFORMADOR DE CRESCIMENTO BETA

TIMPS INIBIDOR TECIDUAL DE METALOPROTEINASES

TNF-Α FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA

UV ULTRAVIOLETA

VEGF FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR

Sumário

1. Introdução ............................................................................................................ 20

1.1. Revisão da Literatura ................................................................................... 21

1.2. A pele e o processo de reparo e regeneração tecidual .................................. 23

1.3. Formação de cicatrizes queloideanas e tratamentos atuais disponíveis ....... 27

1.4. Chlorella....................................................................................................... 30

1.5. Rhodiola rosea ............................................................................................. 33

1.6. Uso de pele ex vivo como modelo alternativo ao uso de animais em pesquisa

37

2. Objetivos .............................................................................................................. 38

3. Material e Métodos .............................................................................................. 39

3.1 Sujeitos da pesquisa ..................................................................................... 39

3.2 Processamento dos Fragmentos de pele ....................................................... 40

3.3 Avaliação da viabilidade dos fragmentos de pele em cultura ...................... 41

3.4 Isolamento das culturas primárias ................................................................ 42

3.5 Caracterização das culturas primárias .......................................................... 43

3.6 Cultivo celular .............................................................................................. 43

3.7 Tratamento das Culturas Celulares .............................................................. 43

3.8 Determinação da viabilidade celular/citotoxicidade .................................... 44

3.9 Quantificação das citocinas e fatores de crescimento IL-6, TGF-β1 e VEGF

44

3.10 Quantificação de Colágeno Total ................................................................. 45

3.11 Mensuração da produção de MMP-1, TIMP-1 e TIMP-2 ............................ 45

3.12 Ensaio de Proliferação celular por Citometria de Fluxo .............................. 46

3.13 Análise estatística ......................................................................................... 47

4. Resultados ............................................................................................................ 48

4.1. Padronização das Concentrações de Tratamento e Avaliação da Viabilidade

Tecidual em Cultura ................................................................................................ 49

4.2. Chlorella....................................................................................................... 52

Comprovante de Submissão. ................................................................................... 52

4.3. Rhodiola rosea. ............................................................................................ 73

4.3.1 Quantificação de Colágeno Total. ................................................................. 73

4.3.2 Quantificação de TGF-β1. ............................................................................. 75

4.3.3 Quantificação de MMP-1. .............................................................................. 77

4.3.4 Quantificação de IL-6. ................................................................................... 79

4.3.5 Avaliação da Proliferação Celular. ............................................................... 81

4.3.6 Quantificação de VEGF. ................................................................................ 83

4.3.7 Quantificação de TIMP-1 e TIMP-2. ............................................................. 85

5. Discussão ............................................................................................................. 88

6. Conclusão ............................................................................................................ 93

7. Referências Bibliográficas ................................................................................... 94

8. Apêndices e Anexos .......................................................................................... 111

Apêndice 1 – Quantificação de TIMP-1 e TIMP-2 após o tratamento com Chlorella

............................................................................................................................... 111

Apêndice 2 – Avaliação da proliferação celular após o tratamento com Chlorella.

............................................................................................................................... 114

Anexo 1 – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa para execução do projeto.

............................................................................................................................... 115

Anexo 2 – Termo de Consentimento livre e esclarecido - TCLE ......................... 117

Introdução 20

1. Introdução

Cicatrizes queloideanas são definidas como produto final de um processo

inflamatório crônico que culmina no crescimento exacerbado e enrijecimento tecidual, em

consequência do excesso de deposição de colágeno (1). Estudos na literatura demonstram que

o aumento na produção de colágeno e na proliferação de fibroblastos é estimulado na

presença de citocinas e fatores de crescimento, tais como, fator de crescimento tecidual beta

(TGF-β), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e interleucina (IL) 6, as quais

levam à produção exacerbada de componentes da matriz extracelular, sendo a colágeno o

principal, além de um aumento na capacidade de migração e o desequilíbrio entre a atividade

das proteínas metaloproteinases de matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs), os

quais são decisivos no desenvolvimento destas desordens fibróticas (2–7).

Apesar do número de tratamentos disponíveis, os resultados apresentados são

inconsistentes e muitas vezes frustrantes para o paciente (1,8–15). Dentro deste contexto,

avaliamos neste trabalho a atividade moduladora da alga Chlorella e do extrato da planta

Rhodiola rosea (ERR) sobre os mecanismos intracelulares da resposta inflamatória da pele,

visando prevenir a formação ou minimizar as manifestações clínicas de queloides. Um

aspecto importante na escolha dessas duas espécies consiste na capacidade adaptogênica

apresentada por ambas, o que implica na habilidade de modificar a resposta biológica,

aumentando de forma não específica à resistência do hospedeiro, tornando-o mais apto para

produzir resposta mais adequada frente a diferentes tipos de estresses químicos, físicos,

biológicos e psicogênicos, sem causar distúrbios em parâmetros biológicos normais.

Relevante para o presente trabalho são os resultados anteriores obtidos em nosso

laboratório com as duas espécies aqui propostas. O enfoque destes trabalhos foi original e

pioneiro (16–30), e consiste na escolha de diferentes modelos experimentais in vivo, nos quais

a hematopoese tem papel fundamental no desenvolvimento da doença, visando investigar a

ação adaptogênica de plantas medicinais de domínio popular sobre os mecanismos

reguladores do sistema imunológico e hematopoético.

Introdução 21

1.1. Revisão da Literatura

O processo de cicatrização é realizado por uma cascata de eventos complexos,

dinâmicos e sobrepostos, seguidos de uma reação inflamatória, proliferativa e de remodelação

tecidual (31). As alterações nestes processos fisiológicos resultam na formação de uma

cicatriz patológica denominada queloide, caracterizada pelo crescimento da lesão além das

bordas iniciais (32) e pela regressão não espontânea ao longo dos anos (33).

Os queloides e as cicatrizes hipertróficas são causados por lesões e irritação

cutânea, incluindo trauma, mordida de inseto, queimadura, cirurgia, vacinação, piercing, acne,

foliculite, varíola e infecção por herpes zóster. Lesões superficiais que não atingem a derme

reticular nunca causam cicatrizes queloideanas. Isto sugere que estas cicatrizes patológicas

são devidas a lesões nesta camada de pele e, subsequente, cicatrização anormal da lesão,

caracterizada por inflamação contínua e histologicamente localizada. Como resultado, a

camada reticular de queloides e cicatrizes hipertróficas contêm células inflamatórias, aumento

do número de fibroblastos, vasos sanguíneos recém-formados e depósitos de colágeno (34).

Embora os queloides e as cicatrizes hipertróficas geralmente sejam observados

em torno de 3 meses após a lesão, isso meramente reflete o fato de que a inflamação da derme

reticular, que começa imediatamente após a lesão inicial, só se torna visível através da

epiderme a olho nu neste momento. Além disso, no caso de feridas cirúrgicas, pacientes e

médicos tendem a acreditar de forma equivocada que a ferida suturada amadureceu quando as

suturas são removidas. Isso ocorre porque neste ponto (ou seja, 7-14 dias após a cirurgia), a

epiderme se regenerou e a ferida está fechada e seca. No entanto, nesta fase, a matriz dérmica

ainda está amadurecendo e há inflamação em curso na derme reticular. Se, neste momento, a

camada reticular é submetida à estimulação externa e/ou interna, a inflamação não diminui e,

em vez disso, se torna cada vez mais pronunciada. Isso resulta em cicatrizes patológicas que

eventualmente se tornam aparentes alguns meses após a cirurgia. A intensidade, a frequência

e a duração dos estímulos determinam a rapidez com que as cicatrizes aparecem, a direção, a

velocidade do crescimento e a intensidade dos sintomas. Os estímulos que influenciam as

características e a quantidade de queloides e cicatrizes hipertróficas incluem uma variedade de

fatores locais, sistêmicos e genéticos. Consequentemente, é provável que as diferenças

clínicas entre queloides e cicatrizes hipertróficas apenas reflitam diferenças na intensidade,

frequência e duração da inflamação da derme reticular (35,36).

Em termos de fatores de risco sistêmicos, a adolescência e a gravidez parecem

associar-se a um maior risco de desenvolver cicatrizes patológicas (37,38). Pode ser que os

Introdução 22

hormônios sexuais, como os estrógenos e os andrógenos, tenham efeitos vasodilatadores que

intensifiquem a inflamação, promovendo o desenvolvimento de cicatrizes patológicas ou

piorando cicatrizes existentes. O aumento dos níveis de esteroides sexuais no início da

adolescência é responsável pelo maior risco de desenvolvimento de cicatrizes patológicas em

adolescentes. Em um estudo foi demonstrado que a hipertensão se associa ao

desenvolvimento de queloides graves (39). Esse estudo, envolvendo 304 pacientes, com

queloides avaliou se a hipertensão arterial, um fator sistêmico, influencia a gravidade da

cicatriz patológica. As análises de regressão logística ordinal mostraram que a pressão arterial

associou-se significativamente e positivamente com o tamanho e o número de queloides. Este

estudo fornece evidências epidemiológicas sobre a possibilidade de que a hipertensão possa

agravar o desenvolvimento dos queloides. Esta associação pode refletir o fato de que a

hipertensão danifica os vasos sanguíneos, aumentando assim a inflamação no tecido local,

levando a um processo de inflamação prolongada que, por si só, é um fator de risco para o

desenvolvimento e/ou progressão destas cicatrizes patológicas.

A literatura relata o caso de uma mulher adulta cujos queloides auriculares

foram agravados durante o curso de sua doença de Castleman. A doença de Castleman é uma

desordem linfoproliferativa rara que se caracteriza pela superprodução não regulada de IL-6,

levando a linfadenopatia sistêmica e sintomas inflamatórios constitucionais. Acredita-se que a

inflamação sistêmica seja responsável pelo desenvolvimento de cicatrizes hipertóficas em

pacientes submetidos à cirurgia reconstrutiva de queimaduras extensas: queimaduras graves

iniciais associam-se a uma massiva produção de citocinas que aumentam significativamente o

risco de desenvolver queloides e cicatrizes hipertróficas durante pelo menos 1 (um) ano (34).

A literatura clássica considera que os queloides e as cicatrizes hipertróficas são

tipos distintos de cicatrizes. Os clínicos definem cicatrizes hipertróficas como cicatrizes que

não crescem além dos limites da ferida original e os queloides como cicatrizes que se

espalham pela pele normal circundante. Em contrapartida, os patologistas fazem uma

distinção histológica entre queloides e cicatrizes hipertróficas com base na presença de

colágeno eosinofílico (hialinizantes), sendo que estes estão presentes em maior quantidade

nos queloides, quando comparado a cicatrizes hipertróficas. No entanto, existem muitos casos

em que a cicatriz apresenta o crescimento e as características histológicas das cicatrizes

hipertróficas e queloides concomitantemente. Notavelmente, observa-se que as cicatrizes que

se espalham na pele normal circundante tendem a ter um grande volume de colágeno

hialinizado e muitos vasos sanguíneos, enquanto que aqueles que não crescem além dos

limites da ferida original geralmente têm um pequeno volume de colágeno hialinizado e

Introdução 23

poucos vasos sanguíneos. Assim, é possível que as cicatrizes hipertróficas e os queloides

sejam, na verdade, manifestações da mesma doença fibroproliferativa da pele e apenas

diferem na intensidade e duração da inflamação (35,36).

Essas características podem, por sua vez, ser influenciadas por fatores de risco

locais, sistêmicos e genéticos. Foi relatado que fatores pró-inflamatórios, como IL-1α, IL-1β,

IL-6 e TNF-α, são regulados positivamente nos tecidos de queloides (40,41). Como resultado,

Dong e colaboradores (40) especularam que os genes pró-inflamatórios na pele de pacientes

com queloides são sensíveis ao trauma, ou seja, que eles tendem a serem mais rapidamente

ativados sobre lesões na derme e mais propensos a manter essa regulação positiva do que os

mesmos genes em outras pessoas. Isso resulta em inflamação crônica que também explica o

crescimento invasivo dos queloides. Além disso, a regulação positiva de fatores pró-

inflamatórios em queloides sugere que, ao invés de serem classificados como tumores de pele,

os queloides e as cicatrizes hipertróficas são distúrbios inflamatórios da pele, especificamente

distúrbios inflamatórios da derme reticular.

1.2. A pele e o processo de reparo e regeneração tecidual

Anatomicamente, a pele atua como uma interface entre o meio externo e a

homeostase interna, atuando como um órgão complexo com múltiplos tipos de células e

estruturas, o qual pode ser dividido em três camadas distintas: derme, epiderme e hipoderme

(42).

A ação dos diferentes fatores ambientais ou endógenos no tecido cutâneo pode

promover estímulos iniciais para o desencadeamento de uma resposta inflamatória,

culminando em um dinâmico processo de migração celular, transmissão de sinais e

processamento da informação, que pode ocorrer de maneira benéfica ou prejudicial para o

hospedeiro. Estudos revelam que uma resposta inflamatória exagerada induz a produção

excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) que excede a capacidade antioxidante da

célula, resultando em uma condição conhecida por estresse oxidativo (43). Este ambiente

inibe a migração e proliferação celular, causando um dano tecidual que culmina na

perpetuação da inflamação (44,45).

O processo de regeneração da pele se inicia imediatamente após o dano

tecidual e consiste em três fases distintas: inflamação, proliferação e maturação. Estas fases

ocorrem através de uma complexa e bem organizada interação entre tecidos, células, fatores

Introdução 24

de crescimento e proteases, buscando uma completa regeneração do tecido (46,47). A figura 1

representa um diagrama do processo de cicatrização de uma ferida onde ocorreu o

rompimento da epiderme e derme.

Figura 1. Diagrama do processo de cicatrização de uma ferida onde ocorreu o rompimento da epiderme e derme (48

- adaptado).

A lesão da pele ocorre quando a camada epidérmica é violada, expondo a

derme subjacente ao ambiente. O reparo temporário é realizado através da fixação de um

coágulo de fibrina, que impede o contato da ferida com o ambiente. Em decorrência da lesão

os queratinócitos passam a produzir IL-1 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), alertando as

células ao redor da lesão, o que resulta em um aumento do infiltrado de células inflamatórias.

As plaquetas, além de liberarem o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF),

secretam também o fator de crescimento epidérmico (EGF), TGF-β e diversas quimiocinas,

Introdução 25

ativando e recrutando células e estimulando a primeira fase de proliferação das

células epidérmicas, fibroblastos e células endoteliais (46,49).

As células inflamatórias desempenham um papel importante na cicatrização,

sendo os neutrófilos as primeiras células que chegam à lesão atuando na remoção de debris e

contaminação bacteriana, além de secretarem citocinas pró-inflamatórias que ativam os

fibroblastos e queratinócitos locais.

Após alguns dias, os neutrófilos são substituídos por macrófagos derivados da

corrente sanguínea, que produzem mais citocinas e fatores de crescimento essenciais para

a cicatrização da lesão, dentre estas citocinas, IL-1 e TNF-α, induzem a via de transcrição do

fator nuclear-κB (NF-κB) e a produção dos fatores de crescimento FGF (fator de crescimento

de fibroblastos), TGF-β e EGF que amplificam os sinais produzidos por neutrófilos e

plaquetas. Além disso, esses fatores de crescimento sintetizados pelos macrófagos são

essenciais para a migração e proliferação das células epiteliais, resultando no início do

processo de re-epitelização (46).

Ishida e colaboradores demonstraram um envolvimento essencial de IL-6

durante o processo de regeneração do tecido através do uso de camundongos IL-6 knockout

(KO), seus resultados evidenciaram que estes animais apresentam uma cicatrização mais lenta

(50). Outros estudos revelaram que a ausência do receptor antagonista para IL-1 em

camundongos culmina em uma bioatividade exacerbada de IL-1, resultando em um

favorecimento da resposta inflamatória e consequente diminuição da regeneração do tecido

(51). Por outro lado, a ausência do receptor de TNF p55 reduz a resposta inflamatória e

favorece a angiogênese e a produção de colágeno, acelerando a regeneração do tecido (52).

Adicionalmente, a expressão dos genes para a proteína quimioatrativa para

monócitos 1 (MCP-1) e a proteína inflamatória para macrófagos 1α (MIP-1α), predominante

no recrutamento de macrófagos/monócitos, é essencial para um reparo tecidual normal (43).

Para evidenciar o papel dos macrófagos no controle do reparo tecidual,

diversos estudos analisaram o processo de regeneração de tecido em modelos experimentais

que envolviam a depleção de macrófagos, os resultados destes trabalhos demonstraram que a

ausência destas células influencia negativamente na etapa de re-epitelização, formação do

tecido de granulação, angiogênese, produção de citocinas cicatrizantes e na contração da lesão

associada aos miofibroblastos (53).

Cerca de quatro dias após a lesão, o tecido de granulação está completamente

formado e os macrófagos passam a secretar VEGF e FGF, aumentando o infiltrado de

Introdução 26

fibroblastos e provendo a angiogênese, este processo de neovascularização é fundamental

para a síntese, deposição e organização da nova matriz extracelular (MEC).

Para que a formação da MEC seja bem sucedida é necessário que ocorra o

processo de revascularização, acompanhado da remoção do tecido de granulação, que será

substituído por um conjunto de fibras de elastina e colágeno saturado com proteoglicanas e

glicoproteínas. Este processo é seguido por uma remodelação do tecido que envolve a síntese

de um novo colágeno, mediada por TGF-β, resultando em um tecido de cicatrização. A

transição do tecido de granulação para o tecido de cicatrização é dependente de um processo

contínuo de síntese e degradação do colágeno, que será controlado por diversas enzimas

MMPs que são secretadas por macrófagos, células epidérmicas, células endoteliais e

fibroblastos (49).

Até agora, mais de 25 diferentes MMPs humanas foram identificadas. A

atividade destas enzimas é precisamente regulada por seus inibidores, os TIMPs. Citocinas,

quimiocinas e fatores de crescimento estão envolvidos na regulação das atividades destas

enzimas e em sua interação. O fator de crescimento TGF-β induz a expressão de MMP-9 que

é importante para a remodelação da matriz e para angiogênese e também induz a regulação de

MMP-1, sustentando assim o sutil equilíbrio entre a síntese e a degradação da matriz (54–56).

Outros reguladores cruciais de MMPs são as interleucinas, podendo citar a IL-1 que leva a

liberação de MMP-1, MMP-3, MMP-9 e à inibição de TIMP-1 em fibroblastos.

Introdução 27

1.3. Formação de cicatrizes queloideanas e tratamentos atuais disponíveis

Os queloides constituem desordens fibróticas que podem ser desfigurantes e

afetar adversamente a qualidade de vida do indivíduo por causar estresse tanto físico quanto

psicológico (57). Ao contrário de outras cicatrizes, como as hipertróficas, por exemplo, que

não se estendem além da ferida original, os queloides, mesmo quando oriundos de pequena

lesão tecidual, podem atingir extensas áreas do corpo, especialmente após procedimentos

cirúrgicos. Estas lesões podem crescer durante meses e causar desconforto importante devido

à dor e ao prurido local, além de não serem esteticamente aceitos pela sociedade. Na prática

diária, o tratamento e prevenção dessas desordens constituem um desafio comum às diversas

especialidades médicas. Embora existam fatores prognósticos importantes a serem avaliados,

frequentemente é difícil prever o desenvolvimento de uma cicatriz indesejada (8).

O reparo e regeneração tecidual cutânea constituem um processo dinâmico e

orquestrado de eventos inflamatórios, proliferação celular e remodelamento tecidual que se

inicia logo após o rompimento da barreira epidérmica, envolvendo vários tipos celulares,

mediadores solúveis e componentes da MEC (46,50). A evolução natural deste processo é a

formação de uma cicatriz normotrófica e, consequentemente, uma pele com textura e

consistência semelhantes à anterior ao trauma. Entretanto, a desarmonização nas etapas do

processo de cicatrização pode levar a condições patológicas, tais como as cicatrizes

hipertróficas e queloideanas (Figura 2) (58,59).

Figura 2. Evolução do processo de reparo e regeneração do tecido com formação de cicatrizes normotróficas,

hipertróficas e queloideanas (60).

Cicatrizes queloideanas são definidas como produto final de um processo

inflamatório crônico induzido por uma variedade de estímulos que culminam no crescimento

Introdução 28

exacerbado e enrijecimento tecidual, em consequência do excesso de deposição de colágeno

(1,61). Essas cicatrizes podem surgir após qualquer trauma cutâneo que alcance a derme,

como lacerações, abrasões, cirurgias, piercings, vacinação e queimaduras (62). O queloide

ocorre predominantemente em indivíduos predispostos, como negros e hispânicos, com uma

prevalência entre 4,5 e 16%, sendo também resultado da excessiva formação do tecido de

cicatrização devido a uma alteração no processo de reparo tecidual (8,63). Na literatura,

diversas hipóteses sobre a patogênese da formação dos queloides são discutidas, incluindo

alteração na regulação de fatores de crescimento, disfunção imune, produção exacerbada de

colágeno, entre outros (3).

Está estabelecido que os processos de proliferação e migração desregulada dos

fibroblastos derivados de queloides estão intimamente envolvidos na formação destas

cicatrizes, através da síntese exacerbada de componentes da MEC (64). Fibroblastos

derivados de queloides apresentam um padrão de migração para o centro da lesão mais

intenso do que aquele apresentado por fibroblastos normais (6), este aumento na capacidade

de migração e o desequilíbrio entre a atividade das MMP e seus inibidores TIMPs são

decisivos no desenvolvimento da formação de desordens fibróticas, entretanto o

conhecimento exato da patofisiologia destas lesões é uma questão ainda aberta na literatura

(2–4,65).

O TGF-β, VEGF e a IL-6 são descritos por desempenhar papel importante na

patologia do queloide (66–68). Estes fatores aceleram a migração celular através da

estimulação da produção de colágeno e da proliferação de fibroblastos derivados de queloides.

Muitos grupos de pesquisa estudam a relação potencial entre a expressão anormal de fatores

de crescimento, citocinas e a migração celular estimulando a formação de cicatrizes

queloideanas (5–7).

As terapias atuais utilizadas no tratamento de cicatrizes queloideanas se

baseiam na redução da resposta inflamatória local atuando em diferentes parâmetros

importantes no processo inflamatório durante o reparo do tecido. Dentre as técnicas utilizadas

para a redução do excesso de tecido de cicatrização temos a crioterapia, a qual é pouco

utilizada por poder induzir dano vascular, estase circulatória, formação de trombose, anóxia e

eventual necrose, além da hipopigmentação e dor pós-operatória (1,69). Da mesma forma, a

incisão cirúrgica, por estar associada à radioterapia, apresenta resultados duvidosos quanto à

indução carcinogênica (47). O uso de laser tipo PDL (pulsed-dye laser) apresenta custo

elevado, além do risco considerável de recidivas (1,70).

Introdução 29

Outra prática terapêutica consiste em intervenções farmacológicas em níveis

sub-celular e celular, com o objetivo de corrigir o metabolismo anormal do colágeno e a

produção de citocinas, entre elas o TGF-β, e modular tanto as respostas imunológicas e

inflamatórias como as propriedades mecânicas do reparo tecidual. Apesar de ser uma

aproximação metodológica mais promissora, os compostos disponíveis para este tipo de

tratamento também apresentam efeitos indesejáveis. Os corticosteróides constituem os

fármacos mais utilizados e os seus efeitos adversos consistem principalmente em discromia

cutânea, atrofia dérmica, telangectasias e dor durante a injeção (1). Antineoplásicos, como o

5-fluorouracil e a bleomicina, além da conhecida toxicidade sistêmica, levam também à dor

local intensa, hiperpigmentação, atrofia dérmica e formação de gangrena (1,71). A aplicação

intralesional de interferon (IFN) também é acompanhada de sintomatologia de gripe, além da

produção de dor e do alto custo deste tratamento (1). Outros ativos, incluindo tacrolimus,

imiquimode, tamoxifeno, toxina botulínica, extrato de Allium cepa e curcumin, vêm sendo

descritos, porém a ausência de estudos específicos inviabilizam suas aplicações (1,9–14).

Apesar do número de tratamentos existentes para o manejo das cicatrizes

queloideanas, os resultados apresentados têm sido inconsistentes e muitas vezes frustrantes.

Não há dados conclusivos na maioria dos estudos sobre eficácia terapêutica e segurança dos

métodos empregados, devido principalmente à falta de grupos-controle específicos, ao

tamanho e qualidade inadequados da amostra utilizada, e ao tempo de avaliação. Além disso,

o próprio mecanismo de ação e os efeitos colaterais da maioria dessas terapias são

controversos e podem prejudicar o estado geral do paciente, particularmente no pós-cirúrgico

(1,8–15,71,72).

Considerando a alta taxa de reincidência das lesões e o alto custo dos

tratamentos atuais disponíveis para o tratamento das cicatrizes queloideanas, o

desenvolvimento de uma linha de pesquisa que trabalhe com o conceito de prevenção destas

cicatrizes é inovador e de grande relevância para o segmento dermatológico. Neste contexto,

avaliamos em nosso trabalho o potencial de modulação da resposta biológica da pele da alga

Chlorella e pelo extrato da raiz de Rhodiola rosea.

Introdução 30

1.4. Chlorella

Chlorella, anteriormente identificada como Chlorella vulgaris, é uma alga

verde unicelular microscópica de água doce, da família Oocystacae, com capacidade de auto-

reprodução (Figura 3). Reconhecida principalmente pela sua rica composição de nutrientes

essenciais para a manutenção da autodefesa natural do indivíduo, esta alga possui clorofila,

beta caroteno, vitaminas, proteínas, minerais, enzimas, entre outros (73–76). Sua atividade

adaptativa ou modificadora da resposta biológica é definida pela capacidade de reduzir no

organismo os níveis de hormônios relacionados com o estresse. Resultados produzidos pelo

nosso grupo demonstram que em presença de condições adversas, o hospedeiro que vem

recebendo Chlorella como complemento alimentar é capaz de reagir mais prontamente e com

maior vigor na indução de mecanismos essenciais da defesa imunológica (19–

23,25,26,28,30).

Figura 3. Diferentes formas da alga Chlorella. A. Visualização em microscópio óptico – Aumento de 20x (77). B.

Tanques de cultivo da alga (78). C. Alga em formato pulverizado e comprimido (79).

Em estudos anteriores, com o auxílio de modelos experimentais in vivo, nos

quais a hematopoese tem um papel fundamental, investigamos os efeitos da alga sobre os

mecanismos reguladores do sistema imunohematopoético, visando aumentar ou restabelecer

as defesas do próprio hospedeiro, capazes de inibir processos malignos e infecciosos (20–

22,24–28,30). Nossos resultados demonstram o efeito da alga na restauração da

mielossupressão produzida pela evolução destas doenças através da normalização do número

reduzido de precursores hematopoéticos para granulócitos e macrófagos na medula óssea.

Estes resultados são importantes, uma vez que a redução no número de progenitores

hematopoéticos na medula óssea representa um efeito agudo decorrente do rápido crescimento

de certos tumores e da evolução de certos quadros infecciosos. Uma observação importante

A B C

Introdução 31

nestes estudos é que a reversão pela alga da mielossupressão induzida pelo agente agressor é

acompanhada de aumento no tempo ou na taxa de sobrevida (20–28,30).

O aumento na taxa ou duração da sobrevida e a prevenção da mielossupressão

ocorreram paralelamente a um aumento significativo nos níveis in vitro de diferentes citocinas

pró-inflamatórias e hematopoéticas, IFN-, IL-2, TNF-α, IL-12, IL-1, fator estimulador do

crescimento de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), as quais são essenciais na recuperação

do hospedeiro (23,25,30,73,80). Estes achados corroboram trabalhos da literatura que

demonstram a capacidade da Chlorella em aumentar a expressão gênica de citocinas ativas no

sistema hematopoético (73,80). A atividade das células natural killer (NK), potentes indutoras

da produção de INF-, também está aumentada na presença de Chlorella (23,28,30).

A presença de radicais sulfidrila é outro atributo desta alga, fato que justifica

seu uso in vitro na remoção de metais tóxicos. Em estudos recentes sobre o efeito quelante de

Chlorella em animais expostos ao chumbo (Pb), observamos reduções significativas nos

níveis do metal no sangue e em órgãos alvo, como ossos e rins em animais expostos ao metal

e tratados com a alga. Além disso, a alga restaurou as concentrações elevadas de ácido 5-

aminolevulinico (ALA) no fígado e plasma, assim como a taxa de síntese de heme e de seus

precursores em animais expostos ao metal (20,24,30).

Em animais expostos ao Pb foram também analisados os efeitos do tratamento

com Chlorella sobre a interação entre as células do estroma da medula óssea e as células

hematopoéticas, utilizando a cultura líquida de longa duração de células da medula óssea

(LTBMC). A atividade funcional foi avaliada pela capacidade das células estromais não

aderentes de promoverem in vitro o crescimento e diferenciação de células progenitoras

comprometidas com a linhagem granulócito-macrófago (CFU-GM). Os resultados

demonstraram que o tratamento com Chlorella de camundongos expostos ao Pb restaura tanto

a reduzida capacidade das células estromais de produzirem CFU-GM, quanto os níveis

reduzidos de IL-6, induzidos pelo metal (30). Estes resultados sugerem que a capacidade de

Chlorella em reduzir o conteúdo de Pb nos tecidos do corpo, em associação com seu efeito

modulador sobre a atividade de citocinas hematopoéticas, pode inibir os efeitos

imunossupressores do Pb sobre a atividade hematopoética na medula óssea e desta forma

potencializar a vigilância imunológica.

Outro aspecto relevante dos efeitos de Chlorella consiste na modulação da

resposta ao estresse físico e psicogênico (21,22). O estresse ativa o eixo hipotálamo-hipófise-

adrenal (HHA) para produção de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e liberação de

glicocorticóides. Nesse sentido, Hasegawa e colaboradores (2000) demonstraram que a

Introdução 32

Chlorella pode prevenir os efeitos imunossupressores do estresse psicológico induzido em

camundongos que observam outros animais recebendo choque na pata (foot-shock), através da

inibição da produção de corticosteróides endógenos. O fato desta alga estimular a produção de

citocinas como IL-1 e TNF-, as quais deprimem a síntese de glicocorticóides, dão suporte a

estes achados (73,80).

Em outro trabalho, avaliamos o crescimento e diferenciação de granulócitos e

macrófagos na medula óssea de ratos tratados com Chlorella, infectados com a bactéria

Lysteria monocytogenes (LM) e expostos a estressores físicos e psicogênicos. Nossos

resultados demonstraram que o impacto das duas modalidades de estresse aumentou de forma

similar tanto a severidade quanto a duração da mielossupressão produzida pela infecção,

sendo que este efeito foi completamente revertido no grupo estressado/infectado tratado com

a alga. A investigação dos mecanismos subjacentes à proteção produzida pela Chlorella

demonstrou aumentos significativos na atividade estimuladora hematopoética do soro,

paralelamente à normalização dos níveis reduzidos de IFN-γ e dos níveis aumentados de IL-

10, observados após exposição aos dois tipos de estressores. A avaliação da sobrevida frente a

uma dose letal de LM revelou cura de 50% no grupo apenas infectado e de 20% no grupo

estressado/infectado. Estes resultados sugerem que o tratamento com Chlorella constitui

ferramenta eficaz na profilaxia da mielossupressão pós-estresse, mesmo com o agravamento

do quadro clínico decorrente da presença de um estresse adicional, no caso, a infecção (21).

Em um estudo desenvolvido recentemente em nosso laboratório avaliou-se a ação

profilática da Chlorella na modulação imunohematopoética, metabólica e de sinalização da

insulina em animais obesos por administração de dieta hiperlipídica (DH). A administração de

Chlorella restaurou a redução da hematopoese medular e o aumento na hematopoese extramedular

promovidos pela DH. A Chlorella aumentou os níveis de atividade estimuladora de colônias

(CSA) em todos os grupos estudados, sendo que o grupo DH+Chlorella produziu um aumento

adicional de 2 vezes em todos os períodos avaliados. O grupo DH apresentou diminuição no

número de progenitores de granulócitos-monocítico na medula, a Chlorella reverteu tal alteração.

Em relação ao metabolismo e sinalização de insulina, o grupo DH demonstrou glicemia

significativamente elevada em relação ao grupo controle, o tratamento com Chlorella foi capaz de

reduzi-la neste grupo. Além disso, o grupo DH+Chlorella mostrou maior tolerância à glicose e

insulina, paralelamente a melhora na fosforilação do receptor de insulina beta (IRβ), do substrato

para o receptor de insulina 1 (IRS-1) e das proteínas quinases serina/treonina (AKT) no fígado,

músculo esquelético e tecido adiposo. Como esperado, o grupo DH apresentava níveis elevados

de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6, TNF-α, TGF-β e INFγ) confirmando a presença de

Introdução 33

inflamação subclínica nesses animais. A Chlorella reduziu significativamente os níveis séricos

dessas citocinas. Além disso, o grupo DH apresentou diminuição dos níveis de IL-10, sendo que a

Chlorella reverteu tais valores (16,18).

Outros achados da literatura revelaram que a Chlorella apresenta um efeito

inibitório na produção de MMP-1 e MCP-1 induzida por ultravioleta (UV) B em cultura de

fibroblastos da pele (81), provavelmente devido ao seu potencial anti-oxidativo, que reduz o

estresse tecidual que poderia acarretar a um processo inflamatório.

1.5. Rhodiola rosea

Rhodiola rosea L., também conhecida como “golden root”, “rose root” ou

“arctic root” pertence à família Crassulaceae e caracteriza-se por seu crescimento em solo

arenoso e seco das regiões árticas de altitudes elevadas da Europa e Ásia (Figura 4). Atinge

em média 70 cm, produz flores amarelas e possui uma raiz fina, onde encontram-se presentes

seus principais constituintes químicos (82). É uma planta popular na medicina tradicional da

Europa e Ásia, onde é conhecida por suas atividades estimulantes sobre o sistema nervoso

central, anti-depressiva, indutora de melhora da performance física, anti-fadiga e profilática

contra afecções respiratórias comuns em regiões de altitudes elevadas (83,84). Além de R.

rosea, mais de 200 espécies de Rhodiola já foram identificadas, sendo que 20 delas são

utilizadas na prática médica tradicional asiática, incluindo R. alterna, R. brevipetiolata, R.

crenulata, R. kirilowii, R. quadrifida, R. sachalinensis e R. sacra (84,85).

Figura 4. Rhodiola rosea. A. Rodhiola rosea em solo arenoso e seco (86). B. Raiz da planta Rhodiola rosea (87). C.

Extrato de Rhodiola rosea (88).

R. rosea tem sido categorizada como uma planta adaptógena por pesquisadores

russos que observaram a sua habilidade em aumentar a resistência do hospedeiro frente uma

variedade de insultos químicos, físicos e biológicos (84). A origem do termo adaptógeno é

A B C

Introdução 34

datada de 1947 e creditada ao cientista russo Lazarev, que considera esta classificação para

qualquer substância que, de forma não-específica, aumenta a resistência do organismo sem

causar distúrbios em parâmetros biológicos normais (82,84,89). Inerente a esta definição está

o conceito de que a administração de um agente adaptógeno prepara o organismo de forma a

torná-lo mais capaz de responder apropriadamente frente a futuros insultos (84). Em

contrapartida, (89) propuseram um critério que precisa ser levado em consideração para

considerar uma substância adaptógena; são eles: 1- produzir uma resposta não-específica no

organismo, por exemplo, um aumento da resistência contra múltiplos agentes agressores, 2-

apresentar uma influência que conduza à normalização da resposta fisiológica, e 3- ser

incapaz de influenciar as funções normais do organismo mais do que aquela requerida para a

promoção de uma resistência não específica (82,84,89).

De maneira similar a outras plantas adaptógenas, como Eleutherococcus

senticosus (Siberian ginseng) e Panax ginseng (Korean ginseng), estudos demonstram que

extratos de R. rosea promoveram favoráveis mudanças neuroendocrinológicas relacionadas ao

estresse e à depressão, incluindo aumento no nível de neurotransmissores, melhora da

atividade central e da função cardiovascular (90).

Estudos em cultura de células, animais e humanos têm revelado importantes

atividades de R. rosea, tais como: anti-fadiga (91), anti-estresse (92,93), anti-hipóxica,

cardioprotetora (90), anti-câncer (94), antioxidante (95) e imunoestimulante (96).

Extratos padronizados de R. rosea têm sido encontrados em importantes

preparações comerciais utilizadas na Europa, Ásia e, mais recentemente, nos Estados Unidos,

com ações biológicas que incluem atividade antialérgica, antiinflamatória, aumento da

capacidade mental, dentre uma variedade de outras ações terapêuticas (85,97).

A esfera de aplicação terapêutica dos extratos de R. rosea é facilmente

compreensível e depende exclusivamente da sua vasta composição química (98). Estudos

fitoquímicos das raízes de R. rosea têm revelado a presença de flavonóides, proantocianidina

tirosol e seu glicosídeo salirosídeo, glicosídeos fenilpropanóides derivados do ácido cinâmico

– rosavin, rosin e rosarin, - sitosterol, antraglicosídeos, bem como outros glicosídeos, ácidos

orgânicos, óleos etéricos, açúcares, ácidos graxos, álcoois específicos e proteínas. Dentre esta

vasta composição, acredita-se que os principais compostos responsáveis pelas ações

farmacológicas conhecidas dos extratos de R. rosea são o fenilpropanóide tirosol, seu

glicosídeo salirosídeo (p-hydroxyphenylethyl-O-b-D-glucopyranoside) (aproximadamente 1%

massa seca) e os fenilpropanóides (aproximadamente 3% da massa seca) rosin (cinnamyl-O-

b-D-glucopyranoside), rosarin (cinnamyl- (6-O-a-L-arabinofuranosyl) -O-b-D-

Introdução 35

glucopyranoside) e rosavin (cinnamyl- (6-O-a L-arabinopyranosyl) -O-b-D-glucopyranoside),

aos quais são atribuídas as ações antioxidantes e neuroestimulantes (99). A figura 5 ilustra a

estrutura química dos principais constituintes fitoquímicos de R. rosea.

Figura 5. Estrutura química dos principais constituintes fitoquímicos de Rhodiola rosea. A. Rosavin. B. Rosin. C.

Rosarin. D. Salirosídeo (100).

Estudos realizados com diferentes extratos de raízes de R. rosea, padronizados

em rosavins totais e salirosídeo, caracterizaram-nos por sua ação antidepressiva e estresse-

protetora, aliviando desordens emocionais, mentais e físicas (92,93,98,101), reduzindo a

severidade da exaustão após atividade física intensa (102,103), elevando as concentrações de

norepinefrina, dopamina e serotonina no cérebro, e atuando como um agonista nicotínico

colinérgico no sistema nervoso central SNC (98). Atletas profissionais que utilizaram estes

A

B

C

D

Introdução 36

extratos para incremento da atividade física apresentaram estimulação dos processos

anabólicos na musculatura esquelética, aumento da resistência durante exercício físico

máximo e obtiveram uma subseqüente proteção do sistema cardiovascular (102,103). Além

disso, R. rosea é também um estimulante do sistema imunológico e muitas investigações tem

apontado seu papel anti-câncer (84) e sua ação citotóxica seletiva sobre diferentes tipos de

células tumorais (98).

Em um estudo conduzido por nosso laboratório avaliou-se a ação in vitro e in

vivo do extrato de Rhodiola rosea em associação com o dipeptídeo L-carnosina sobre a

reversão ou controle dos efeitos deletérios da radiação ultra-violeta sobre a pele. Nossos

resultados demonstram que durante a foto-exposição, culturas celulares in vitro apresentaram

importantes alterações nos parâmetros avaliados, especialmente após a exposição crônica,

dentre elas: redução na produção de IL-1a, TNF-α e IFN-y, redução nos níveis de β-endorfina

e encefalina, aumento na atividade de MMPs, inibição na atividade de TIMP-1, redução nos

níveis de colágeno e elastina e redução na atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD)

e catalase (CAT). No perfil de resposta das células tratadas com ERR, pudemos observar uma

importante função adaptógena do extrato, onde na maioria dos parâmetros, constatamos uma

modulação da resposta celular de forma dose dependente (104).

Introdução 37

1.6. Uso de pele ex vivo como modelo alternativo ao uso de animais em

pesquisa

No presente estudo conduzimos uma série de ensaios pré-clínicos para confirmar

a eficácia destes dois agentes naturais anteriormente descritos, a escolha dos modelos

experimentais para conduzir as avaliações foi direcionada pelo importante momento científico

brasileiro de incentivo a implantação e desenvolvimento de metodologias alternativas ao uso

de animais em pesquisa, seguindo a tendência mundial dos 3R’s (Substituição, Redução e

Refinamento - Replacement, Reduction and Refinement).

O princípio dos 3R’s foi desenvolvido há mais de 50 anos como um marco para

a pesquisa animal, sendo gradativamente incorporado na legislação mundial que regulamenta

o uso de animais em procedimentos científicos. Hoje, os 3R’s são cada vez mais vistos como

uma base para a realização de ciência de alta qualidade nos setores acadêmico e industrial

com foco no desenvolvimento de abordagens alternativas que evitem o uso de animais,

incluindo a necessidade de desenvolvimento de melhores modelos e ferramentas que reflitam

mais de perto a biologia humana e predigam a eficácia e a segurança de novos medicamentos

e, principalmente, cosméticos.

O compromisso brasileiro, com a validação de métodos alternativos, resultou na

criação da Rede Nacional de Métodos Alternativos (RENAMA) em julho de 2012 pelo

Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (MCTI) e em setembro de 2012 no Centro

Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos (BraCVAM), uma parceria entre o Instituto

Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS / Fiocruz) e a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA). Estas foram as primeiras parcerias na América Latina para

validar e coordenar uma substituição, redução, ou um refinamento do uso de animais em

testes laboratoriais.

Considerando que os fragmentos de pele sobressalentes das cirurgias plásticas

eletivas são rotineiramente descartados como resíduo infectante, a utilização destes constitui

uma alternativa experimental factível e sustentável para suprir a lacuna entre o in vitro e o

clínico, aproximando-se dos reais benefícios e segurança que um produto aplicado

topicamente pode exercer. Seguindo os 3R´s e buscando resultados que melhor mimetizem a

condição real da pele humana o presente estudo foi conduzido utilizando como sistema-teste

fragmentos de pele ex vivo, além de culturas celulares 2D. Vale ressaltar que nosso

laboratório possui ampla experiência na utilização de modelo de pele humana in vitro e ex

vivo para a avaliação de diferentes parâmetros envolvidos nas respostas biológicas

relacionadas a diversas desordens cutâneas (104–106).

Objetivo 38

2. Objetivos

Constituiu objetivo do presente trabalho a avaliação da habilidade moduladora

da planta Rhodiola rosea e da alga Chlorella nos mecanismos intracelulares associados com o

desenvolvimento de cicatrizes queloideanas. Os ensaios foram conduzidos utilizando modelos

experimentais in vitro com culturas de células primárias e com linhagem celulares adquiridas

comercialmente e modelos utilizando fragmentos de pele ex vivo. Para avaliar a capacidade

moduladora de ambas as espécies, analisamos os diversos parâmetros envolvidos no

desenvolvimento destas lesões associados com perfil inflamatório, cicatrização tecidual e

componentes da MEC. As quantificações foram realizadas nas culturas celulares e nas

culturas de pele ex vivo por meio de ensaio imunoenzimático para TGF-β, VEGF, IL-6,

MMP-1, TIMP-1, TIMP-2. A produção proteica de colágeno total foi quantificada utilizando

kit de Sircoll e a proliferação celular avaliada pela técnica de citometria de fluxo.

Material e Métodos 39

3. Material e Métodos

Essa pesquisa foi conduzida após aprovação pelo Comitê de Ética em 28 de

julho de 2012 sob CAAE nº 02915512.2.0000.5404, parecer 62382, para estudo com

fragmentos de pele proveniente de cirurgias plásticas eletivas (Anexo 1). O estudo somente

foi iniciado após autorização e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(TCLE) pelos voluntários (Anexo 2). O estudo está de acordo com a Resolução 466/12 –

CNS/MS e suas complementares e com a Declaração de Helsinque.

3.1 Sujeitos da pesquisa

Os fragmentos de pele humana foram obtidos de cirurgia plástica eletiva na

região abdominal (abdominoplastia) provenientes de 10 voluntários (n=10) que apresentavam

os seguintes critérios de inclusão e exclusão:

Critérios de inclusão:

1. Idade entre 30 a 50 anos;

2. Fototipo (Fitzpatrick) II, III e IV (71);

3. Presença de queloide na região abdominal.

Critérios de exclusão:

1. Marcas cutâneas, como estrias ou tatuagem, dermatoses ou outras que possam

interferir na resposta biológica da pele;

2. Utilização de qualquer medicamento ou cosmético que possa interferir no

resultado do estudo;

3. Exposição ao sol intensa ou a sessão de bronzeamento até 15 dias antes da

avaliação inicial e durante o estudo;

4. Tratamento estético e/ou dermatológico corporal até 3 semanas antes da

realização da cirurgia.

A tabela apresenta as características dos voluntários doadores dos fragmentos

de pele provenientes de cirurgia plástica eletiva.


Tabela 1. Características dos voluntários doadores dos fragmentos de pele provenientes de

abdominoplastia.

Voluntário Sexo Idade Tipo de Pele

(Fitzpatrick)

1 Feminino 38 II

2 Feminino 44 III

3 Feminino 42 III

3 Feminino 49 III

4 Masculino 46 II

5 Feminino 39 IV

6 Feminino 47 III

7 Feminino 42 III

8 Masculino 40 II

9 Feminino 46 III

10 Feminino 37 II

3.2 Processamento dos Fragmentos de pele

Após a realização da exérese eletiva pelo cirurgião responsável os fragmentos

de pele foram coletados em um frasco contendo soro fisiológico 0,9% e mantidos em

refrigeração até o início das análises experimentais (no máximo 3 horas). Na figura 6

apresentamos duas fotos com um dos fragmentos de pele provenientes de abdominoplastia

antes de iniciar o processo de assepsia. De todos os fragmentos foi coletada uma região de

tecido normal com uma distância mínima de dez (10) centímetros da cicatriz queloideana.

A hipoderme foi removida e a pele foi cortada com o auxílio de bisturi

cirúrgico em fragmentos de 1,0 cm2. Foram obtidos fragmentos da região do queloide e

fragmentos de uma região sem cicatriz de cada indivíduo.

Em seguida foi realizada a assepsia do fragmento utilizando DMEM high

glucose (Gibco, USA) suplementado com Penicilina (20000U/500mL - Gibco, USA),

Estreptomicina (20000µg/500mL - Gibco, USA), Gentamicina (200mg/500mL - Sigma,

USA) e Anfotericina B (50µg/500mL - Sigma, USA), por um período de 1 hora à 4ºC. Após a

assepsia os fragmentos foram incubados em placas de 24 poços (Corning, USA – Figura 7) e

tratados com Chlorella e ERR, conforme descrito no item 3.2, para posterior analise dos


parâmetros propostos. De todas as amostras de pele obtidas foram separados dez (10)

fragmentos que foram mantidos em condições de cultura (37ºC/ estufa úmida/ 5% CO2)

durante 5 dias para avaliação da viabilidade do tecido (item 3.2), as avaliações foram

realizadas nos dia 1, 2, 3, 4 e 5, em dois fragmentos por dia.

Figura 6. Fotos de um dos fragmentos de pele provenientes de abdominoplastia antes de iniciar o processo de

assepsia.

Figura 7. Fragmentos de pele normal plaqueados para posterior tratamento com Chlorella e ERR.

3.3 Avaliação da viabilidade dos fragmentos de pele em cultura

Para a avaliação da morte celular via atividade mitocondrial no tecido 1000μl

da solução de MTT (Sigma, USA - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de

difeniltetrazolium), na concentração de 0,3mg/mL em meio de cultura, foram adicionados aos

fragmentos de pele que foram cultivados por 1, 2, 3, 4 e 5 dias e em dois fragmentos logo

após o processo de assepsia (T0). Após 3 horas de incubação a solução de MTT foi removida

e foram adicionados 750µL de Isopropanol (Sigma, USA) em cada poço. A placa foi mantida

por 2 horas, em temperatura ambiente, sob leve agitação para a extração dos cristais de

formazan. Após o processo de extração foram coletadas duas alíquotas de 200µL de cada


fragmento que foram transferidas para placas de leitura de 96 poços (Cornig, USA). A

absorbância foi determinada a 570nm em monocromador. As porcentagens de viabilidade nos

diferentes tempos de avalição foram calculadas em comparação com a viabilidade de T0,

onde as médias dos valores de densidade óptica obtidas foram consideradas como 100% de

viabilidade.

3.4 Isolamento das culturas primárias

Para o isolamento das culturas primárias de fibroblastos normais e derivados de

queloides, os fragmentos, após o processo de assepsia descrito no item 3.1, foram cortados em

pequenas partes, com cerca de 3-4mm2, com auxílio de um bisturi. Os fragmentos foram então

incubados em garrafas de 25cm2 (Corning, USA) em DMEM com 20% de soro fetal bovino

(SBF – Sigma Aldrich, USA – Figura 8). O meio foi trocado a cada 3 dia e com 11 dias de

cultura, os fragmentos foram removidos. As células foram tripsinizadas no 15º dia e

expandidas em garrafas de 75cm2 (Corning, USA). A figura 9 demonstra a avaliação

microscópica dos fibroblastos isolados. As células foram utilizadas na segunda passagem para

a realização dos experimentos.

Figura 8. Isolamento de fibroblastos normais e derivados de queloides em garrafas de cultura.

Figura 9. Análise microscópica das culturas primárias de fibroblastos humanos. Cultura de fragmento de queloide

após 3 (A), 7 (B) e 11 (C) dias de incubação.


3.5 Caracterização das culturas primárias

As células isoladas, fibroblastos normais (FB) e fibroblastos derivados de

queloides (FBK), foram caracterizadas biologicamente através de estudos comparativos com

linhagens adquiridas comercialmente. As células HFF-1 (Human fibroblast foreskin – ATCC

SCRC-1041) e KEL FIB (Skin Keloid Fibroblast – ATCC CRL-1762) foram adquiridas do

Banco de células do Rio de Janeiro (BCRJ, Brasil). Os fibroblastos isolados e as linhagens

foram submetidos ao tratamento com Chlorella e ERR e, posteriormente, foram realizadas as

quantificações dos principais mediadores envolvidos na formação de cicatrizes queloideanas.

Os resultados obtidos foram comparados entre si com o objetivo de comprovar que o perfil

biológico das células isoladas correspondia ao perfil das linhagens comerciais.

3.6 Cultivo celular

As células FB, FBK, HFF-1 e KEL FIB, foram cultivadas e expandidas em

garrafa de cultura com 75cm2, em incubadora úmida a 37ºC em presença de 5% de CO2,

utilizando DMEM high glucose com 10% de SBF suplementado com antibióticos. O meio de

cultura foi substituído duas vezes por semana e ao atingiram aproximadamente 80-90% de

confluência, as células foram tripsinizadas (Tryple Express, Gibco, USA), neutralizadas com

o próprio meio de cultura, centrifugadas a 1500rpm por 10 minutos, contadas em câmera de

Newbauer, utilizando o corante vital azul de Trypan, e semeadas em placas de 96 poços

(Corning, USA) na densidade de 1x103 células/poço para avaliação de citotoxicidade (Item

3.7). Paralelamente, foram semeadas em placas de 6 e 24 poços (Corning, USA) na densidade

de 1x105 e células/poço por 24 horas, para posterior incubação com Chlorella e ERR.

3.7 Tratamento das Culturas Celulares

A alga seca Chlorella (Parachlorell beyerinckii CK-5), foi gentilmente cedida

pelo laboratório de pesquisa Chlorella Industry Co., Ltd. (Fukuoka, Japão).

O extrato seco de Rhodiola rosea (ERR) padronizado em rosavins totais

(1,5%) e salidroside (0,5%) foi obtido da indústria Chemyunion Química Ltda.

Ambos foram suspensos separadamente em DMEM e submetidos ao processo

de sonicação realizado 5 vezes com duração de 40 segundos cada etapa e intervalo de 20

segundos entre elas.

As culturas de células e de pele foram incubadas por um período de 72 horas

com as concentrações de 0,60; 0,30; 0,15 e 0,07mg/mL para Chlorella e 0,30; 0,15 e


0,07mg/mL para ERR preparadas em DMEM. Estas concentrações foram definidas pelo

ensaio de viabilidade celular/citotoxicidade descrito no item 3.7. Após o período de incubação

o sobrenadante foi coletado para posterior quantificação dos mediadores propostos.

3.8 Determinação da viabilidade celular/citotoxicidade

A viabilidade celular foi determinada por um método colorimétrico que utiliza

o corante MTT (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.). Esse ensaio é baseado na conversão do

brometo de tetrazolium amarelo (MTT) para formazan azul pela enzima succinato

desidrogenase mitocondrial nas células viáveis. Chlorella e ERR foram adicionados à placa

de 96 poços, já com as células cultivadas, em uma diluição seriada na faixa de 10,0 a

0,002mg/mL, utilizando o fator de diluição 2,0. A cultura foi incubada por um período de 48

horas. O MTT foi então adicionado na cultura na concentração de 5mg/mL (30µL/poço) e

incubado por mais 4 horas. O conteúdo do poço foi removido e 100μl de isopropanol foi

adicionado com o propósito de solubilizar os cristais de formazan formados. A absorbância de

cada poço foi determinada a 570 nm em um leitor de Elisa. A viabilidade celular foi expressa

em porcentagem e calculada conforme a equação abaixo:

% células viáveis = absorbância da amostra incubada com as amostras

absorbância do controle x 100

Adicionalmente, para garantir que os agentes naturais aqui estudados não

influenciavam na formação de cor do experimento, foram realizados controles experimentais

apenas com Chlorella e Rhodiola rósea sem a presença de células.

3.9 Quantificação das citocinas e fatores de crescimento IL-6, TGF-β1 e

VEGF

As citocinas e fatores de crescimento IL-6, TGF-β e VEGF foram quantificadas

em sobrenadante das culturas de células e pele humana utilizando kits de ensaios

imunoenzimáticos (ELISA sanduíche) disponíveis comercialmente (R&D Systems,

Minneapolis, MN). 100µL do anticorpo de captura monoclonal anti-IL-6, anti-TGF-β1 e anti-

VEGF foram adicionados à placa de 96 poços (Nunc) para incubação prévia por 18 horas em

temperatura ambiente (TA). Após este período os poços foram lavados com uma solução de


tampão de lavagem (PBS com 0,05% de Tween 20) e incubados com 300µL de uma solução

de bloqueio contendo PBS e 0,1% de albumina sérica bovina (BSA – Sigma Aldrich, USA)

durante 1 hora em TA. Os sobrenadantes provenientes das culturas e os padrões

recombinantes (IL-6, TGF-β e VEGF) foram adicionados e a placa foi incubada por 2 horas

em TA. O anticorpo monoclonal de detecção apropriado para cada parâmetro foi então

preparado e incubado por mais 2 horas em TA. Adicionou-se uma solução de estreptavidina-

peroxidase e incubou-se por 1 hora em TA. Finalmente, a solução de substrato (H2O2 e TMB

– tetrametilbenzidina) foi adicionada à placa e uma coloração azul se desenvolveu dentro de

um período de 20 minutos. A reação de coloração foi interrompida adicionando-se H2SO4 2N

e a leitura foi realizada em leitor de microplacas a 450nm. Os níveis de IL-6, TGF-β e VEGF

foram calculados a partir dos valores de referência obtidos com uma curva padrão construída

com concentrações conhecidas das citocinas recombinantes.

3.10 Quantificação de Colágeno Total

O colágeno total solúvel (tipo I a IV) foi mensurado utilizando Sircol Kit

(Biocolor, Belfast, Irland). Em tubos plásticos próprios para microcentrífuga, 1mL do corante

Sircol (vermelho sirius em ácido pícrico) foi adicionado em 100µl da amostra teste e agitado

durante 30 minutos em TA. O complexo colágeno-corante formado foi precipitado por

centrifugação (10.000 x g) por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o botão re-

suspendido em 1mL de reagente álcali (NaOH 0,5M) . Alíquotas de 200µL foram transferidas

para uma placa de 96 poços e as absorbâncias determinadas em 540nm. A concentração de

colágeno foi realizada com base na curva de calibração utilizando colágeno padrão fornecido

pelo fabricante do kit.

3.11 Mensuração da produção de MMP-1, TIMP-1 e TIMP-2

As concentrações de MMP-1, TIMP-1 e TIMP-2 foram mensuradas no

sobrenadante das culturas por meio de ensaio de ELISA sanduíche, utilizando kits disponíveis

comercialmente (R&D Systems, Minneapolis, MN). O ensaio de ELISA foi realizado

conforme descrito no item 3.8, utilizando anticorpos monoclonais apropriados para cada

parâmetro. Os níveis de MMP-1, TIMP-1 e TIMP-2 foram calculados a partir dos valores de


referência obtidos com uma curva padrão construída com concentrações conhecidas das

citocinas recombinantes.

3.12 Ensaio de Proliferação celular por Citometria de Fluxo

Para determinar o perfil proliferativo induzido pelo ERR e pela Chlorella,

utilizamos marcação com anti-BrdU e Iodeto de Propídeo (PI), a analise foi realizada por

citometria de fluxo (FACS Aria II).

Após o tratamento as células foram tripsinizadas com o uso de Tryple express,

contadas em câmara de Newbauer com o auxílio do corante vital azul de Trypan (Sigma

Aldrich, USA) e distribuídas em distribuídas em tubos cônicos de 15mL na densidade de

5x106 células/tubo. As células foram lavadas com 1mL de PBS e centrifugas a 1500rpm por 5

minutos. Em seguida foi adicionado 5mL de meio de cultura e as células foram incubadas por

1 hora à 37°C. Em seguida, foram adicionados 10 µL/mL de BrdU 1mM e as células foram

novamente incubadas por 1h à 37°C. Após incubação foi realizada a centrifugação das células

à 1500 rpm/5 minutos. As células foram ressupensas em 1 mL PBS + 0,5 mg/mL RNAse A e

incubadas por 30 minutos à 37°C. As células foram lavadas com 5 mL PBS e centrifugadas as

1000 rpm/5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em vortex. Em

seguida adicionou-se 1 mL de HCl 0,1N com 0,7% de Triton X-100 e os tubos foram

mantidos em gelo por 10 minutos. Novamente as células foram lavadas com 5 mL PBS e

centrifugadas as 1000 rpm/5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em

vortex. Em seguida adicionou-se 0,5 mL água ultra pura e as amostras foram mantidas por 2

minutos à 97°C. Em seguida adicionou-se 5 mL PBS com 0,5% de Tween 20. As células

foram centrifugadas à 1000 rpm/8 minutos sem aceleração e sem brake. O sobrenadante foi

descartado e o pellet ressuspenso em vortex. Em seguida adicionou-se 4 mL de PBS com

0,5% de Tween 20 e 5% de SBF. Desta suspensão de células 150 µL foi transferido para o

tubo de citometria e 1 µL de anti-BrdU foi adicionado, os tubos foram mantidos por 30

minutos no escuro. Em seguida foi adicionado 1 mL de PBS com 0,5% de Tween 20 e 5% de

SBF, as células foram centrifugadas à 3200 rpm por 2 minutos e o sobrenadante foi

descartado. Por fim as células foram ressuspensas em 200 µL de PBS contendo 10 µg/mL de

PI. Imediatamente os tubos foram avaliados por citometria de fluxo.


3.13 Análise estatística

De acordo com a distribuição normal dos dados um método paramétrico de

análise de variância (ANOVA) foi utilizado para a realização da análise estatística seguido do

teste Tukey de comparação múltipla. Em todos os grupos estudados, foram considerados

estatisticamente significativos aqueles cujos valores de P foram menor que 0,05.

Resultados 48

4. Resultados

Os resultados obtidos neste estudo serão apresentados de forma sub-dividida

em 3 itens:

Padronização das Concentrações de Tratamento e Avaliação da

Viabilidade Tecidual em Cultura: neste item são apresentados os

resultados obtidos nos ensaios de viabilidade celular/tecidual com a

utilização do corante vital MTT;

Chlorella: neste item os resultados são apresentados no formato de

artigo, considerando que estes dados já foram submetidos a uma revista

internacional para publicação. Além dos resultados obtidos após o

tratamento com Chlorella, constam também os resultados comparativos

entre as culturas primárias isoladas e as linhagens adquiridas

comercialmente;

Rhodiola rosea: Neste item os resultados são apresentados no modo

tradicional, com os gráficos e descrição de cada resultado.

Uma importante característica observada nos tratamentos com Chlorella e ERR

é a manutenção dos níveis basais de cada mediador avaliado na ausência de queloide, tanto

para as células como para a pele normal. Estes resultados são observados devido à capacidade

adaptogênica de ambas as espécies, não alterando parâmetros normais de um organismo.

Resultados 49

4.1. Padronização das Concentrações de Tratamento e Avaliação da

Viabilidade Tecidual em Cultura

4.1.1. Padronização das Concentrações de Tratamento – Ensaio de

Citotoxicidade

A possível ação citotóxica de Chlorella e ERR foi avaliada utilizando o método

de MTT em cultura de fibroblastos humanos incubados com diferentes concentrações de

ambos, obedecendo uma faixa de concentração de 10 a 0,002mg/mL.

Conforme podemos observar na figura 10, ambos apresentaram moderada

citotoxicidade quando utilizados na concentração de 20 mg/mL, sendo observada a morte de

aproximadamente 40% do total de células na cultura. Para Chlorella observamos

concentrações não citotóxicas à partir da diluição de 0,625mg/mL. Para ERR observamos

concentrações não citotóxicas à partir da diluição de 0,313mg/mL. Com base nos resultados

obtidos neste experimento, selecionamos para a realização dos ensaios as concentrações de

0,60; 0,30, 0,150 e 0,007mg/mL para os tratamentos com Chlorella, e 0,30, 0,150 e

0,007mg/mL para os tratamentos com ERR.

Resultados 50

A

B

Figura 10. Efeitos da Chlorella e do extrato de Rhodiola rosea (ERR) sobre a viabilidade celular de fibroblastos

humanos. Fibroblastos foram incubados com diferentes concentrações (10-0,002mg/mL) de Chlorella e ERR,

separadamente, durante 48 horas e a viabilidade celular foi avaliada pelo método de MTT. A. Chlorella. B. Extrato de

Rhodiola rosea. Os dados representam a média da porcentagem de células viáveis em relação ao controle obtidos de 3

experimentos independentes.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Chlorella (mg/mL)

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Extrato de Rhodiola Rosea (mg/mL)

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

Resultados 51

4.1.2. Avaliação da Viabilidade Tecidual em Cultura – MTT das

culturas de pele ex vivo

Na figura 11 apresentamos os resultados da viabilidade tecidual dos fragmentos

de pele obtidos de cirurgia plástica eletiva em condições de cultura (37ºC, 5%CO2, estufa

úmida) durante cinco dias.

Este ensaio foi realizado para assegurar a viabilidade da pele durante o período

experimental. Para a realização dos cálculos das porcentagens de viabilidade utilizamos como

parâmetro o resultado da densidade ótica, após exposição ao MTT, dos fragmentos de pele

que foram submetidos apenas ao processo de assepsia. A média destes valores foi considerada

como 100% de viabilidade do tecido e foi utilizado como base para os cálculos experimentais.

A escolha do período de avaliação foi feita considerando uma margem segura em relação ao

tempo que os fragmentos de pele foram mantidos em cultura para realização tratamento com

Chlorella e ERR e, posteriormente, as quantificações dos mediadores.

Conforme podemos observar no gráfico abaixo não há alteração significativa

na viabilidade celular do tecido durante o período avaliado.

Figura 11. Avaliação da viabilidade tecidual de fragmentos de pele humana mantidos em condições de cultura.

Fragmentos de pele humana foram mantidos em incubadora úmida à 37°C com 5% de CO2 por 5 dias. A

avaliação da viabilidade do tecido foi realizada em intervalos de 24 horas utilizando o corante vital MTT.

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

Fragmentos de Pele em Condições de Cultura (dias de cultura)

Resultados 52

4.2. Chlorella

As avaliações de TIMP-1, TIPM-2 e proliferação celular demonstraram que o

tratamento com as diferentes concentrações de Chlorella não altera o perfil de resposta destes

mediadores nos modelos experimentais de queloide (FBK, KS), por este motivo não constam

no artigo abaixo que foi submetido para publicação. Porém estes resultados podem ser

consultados nos Anexo 3 e 4 deste documento.

Comprovante de Submissão.

Resultados 53

Adaptogenic ability of Chlorella involves in vitro and ex vivo modulation of

keloid formation

Michelle S Silva, BSc1,2

Samara Eberlin, PhD2

Cristiane Okuda Torello, PhD1

Sueli Cristeina de Oliveira, BSc1

Fabiana Gomes Ferreira, BSc3

Camilla Biancalana de Aquino, BSc4

Mary Luci de Souza Queiroz, PhD1

1Department of Pharmacology/Hemocenter, University of Campinas, Campinas, SP, Brazil; 2Departament of

SkinVitro, Kosmoscience Group, Campinas, SP, Brazil; 3Departament of Science and Tecnology, Federal

University of São Paulo, São José dos Campos, São Paulo, Brazil; 4Department of Planitox Line, Planitox.The

Science Based Toxicologic Company, Campinas, São Paulo, Brazil.

Corresponding author: Mary LS Queiroz, Department of Pharmacology and Hemocenter, Faculty of Medical

Sciences, University of Campinas - UNICAMP, Rua Carlos Chagas 480, CEP 13083-878, Campinas, SP, Brazil,

Phone: +551935218751; Fax: +551932892968; E-mail: [email protected]

Author to requests for reprints: Michelle Sabrina da Silva, Department of Pharmacology and Hemocenter,

Faculty of Medical Sciences, University of Campinas - UNICAMP, Rua Carlos Chagas 480, CEP 13083-878,

Campinas, SP, Brazil, Phone: +551935218752; Fax: +551932892968; E-mail: [email protected]

Short running title: Chlorella modulating of keloid formation.

Keys words: keloid, Chlorella, fibroblast, adaptogenic.

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

Resultados 54

ABSTRACT: Keloid scars are defined as the end product of a chronic inflammatory process

that culminates in tissue overgrowth and hardening as a result of excessive collagen

deposition. Studies in the literature show that cytokines and growth factors increase the

metabolic activity of fibroblasts, thus activating intracellular signaling pathways leading to

exacerbated production of extracellular matrix components and consequent formation of these

keloid scars. In spite of the large number of treatments available, the results have been

inconsistent and unsuccessful. In this context, the search for alternative therapies has aroused

the interest of the pharmaceutical and cosmetic industries. In this study, we evaluate the in

vitro and ex vivo modulating ability of the alga Chlorella in the intracellular mechanisms of

the inflammatory response in the skin, aiming to prevent or minimize the clinical

manifestations of keloids scars. Previous results from our laboratory have demonstrated the

adaptogenic ability of this alga, which encouraged such investigation. Our results showed that

Chlorella modulates immunological and fibroproliferative parameters involved in keloid

formation. This activity demonstrated by the alga might be considered an important tool in the

attempt to restore the normal cellular metabolic activity, thus contributing to the reduction in

the appearance of keloids.

Resultados 55

INTRODUCTION

Keloids scars are fibrotic disorders that can be disfiguring and adversely affect the

quality of life causing physical and psychological stress [1]. Unlike hypertrophic scar, that do

not extend beyond the original wound, keloids can reach large areas of the body even when

derived from small tissue damage, especially following surgical procedures. Keloids can grow

for months and cause significant discomfort due to pain and local itching. Although there are

important prognostic factors to be evaluated, it is often difficult to predict the development of

unwanted scar [2]. In daily practice, treatment and prevention of these disorders are a

common challenge involving several medical specialties.

The repair and tissue regeneration constitute a dynamic and orchestrated process

characterized by inflammatory events, cell proliferation and tissue remodeling that

immediately starts after disruption of the epidermal barrier, involving various cell types,

soluble mediators, and extracellular matrix components (ECM) [3]. The natural evolution of

this process is the formation of a normotrofic scar resulting in skin texture and consistency

similar to the previous trauma. However, imbalance in the steps of wound healing process can

lead to pathological conditions such as hypertrophic and keloid scars [4].

It is stated that the unregulated proliferation and migration of fibroblasts derived from

keloids are intimately involved in the formation of these scars through the exacerbated

synthesis of ECM components. These cells also exhibit more intense migration to the center

of the lesions compared to normal fibroblasts [5]. The increase in migration capacity, the

imbalance between the activity of matrix metalloproteinases (MMPs) and their tissue

inhibitors (TIMPs) are decisive in development of fibrotic disorders formation, however the

knowledge of the pathophysiology of these lesions is not fully elucidated [6].

Among the techniques used to reduce excessive scar tissue, the cryotherapy induces

vascular damage [7], the surgical incision has equivocal results regarding carcinogenic

Resultados 56

induction [4] the use of laser type PDL (pulsed-dye laser) is expensive and presents

considerable risk of recurrence. [7]. Another therapeutic practice consists of pharmacological

interventions at subcellular and cellular levels, with the aim of correcting the abnormal

metabolism of collagen and excessive production of cytokines, such as TGF-β1. Although a

more promising methodological approach, the compounds available for this type of treatment

also have undesirable effects. Corticosteroids are the most widely used drugs and their

adverse effects consist mainly of cutaneous dyschromia, dermal atrophy, telangiectasia and

pain during injection [7]. Antineoplastic agents such as 5-fluorouracil and bleomycin, in

addition to the known systemic toxicity also lead to intense local pain, hyperpigmentation,

dermal atrophy and formation of gangrene [7-8]. The application of intralesional interferon

(IFN) is also accompanied by flu symptoms, besides the production of pain and the high cost

of this treatment [7]. Other approaches, including tacrolimus, imiquimod, tamoxifen,

botulinum toxin, Allium cepa extract and curcumin, have also been described, but the lack of

specific studies prevented their applications [7].

Chlorella, an unicellular green algae is recognized as a rich source of amino acids,

vitamins, minerals and dietary fiber, being considered a complete functional food with

antioxidant properties [9]. An important aspect of such specie consists in its adaptogenic

capacity, which implies the ability to restore the biological response, increasing

nonspecifically host resistance against different types of chemical, physical, biological and

psychogenic stress [10-24]. These properties have been demonstrated through the use of a

variety of representative experimental models of chronic inflammation [11-12],

immunosuppression [13-17], infection [18-22] and tumor [23-24].

Based on these findings, in the present study we evaluated the in vitro and ex vivo

modulating ability of the alga Chlorella in the intracellular mechanisms of the inflammatory

Resultados 57

response in the skin, aiming to prevent or minimize the clinical manifestations of keloids

scars.

Resultados 58

METHODOLOGY

Skin explants

The use of normal skin fragments and keloids explants from elective surgery was

conducted after approval by the Research Ethics Committee of the State University of

Campinas - SP, Brazil. Fragments of normal skin and keloids explants (10 subjects in each

group) obtained from patients undergoing elective plastic surgery (abdominoplasty) were

included in the study. The criteria for inclusion were skin type I to IV according to Fitzpatrick

[25] and aged between 18 and 55. The non-inclusion criteria were: use of corticosteroids,

immunosuppressive drugs, pregnancy or breastfeeding.

Human Fibroblasts Isolation

After the surgical procedure, normal and keloid fragments were maintained in 0.9%

NaCl during transport to the laboratory. For isolation of the cells the hypodermis was

removed and fragments were washed in DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Sigma

Aldrich, USA) serum free and maintained at 4°C in medium with penicillin/streptomycin 2%

(Gibco, USA) for one hour. The samples were fragmented in small pieces (2-3mm2) with

scalpel. Fragments were incubated in 25cm2 bottles with DMEM supplemented with 20%

FBS (Fetal Bovine Serum, Sigma Aldrich). Within 3 days of culture was possible to observe

fibroblast migrating from small pieces of skin to the bottle. Fragments were removed after 7

days of culture, after approximately 11 days incubation the bottle was trypsinized and

expanded into a 75cm2 bottle. Figure 1 demonstrates the microscopic evaluation of fibroblast

isolation. The isolated fibroblasts in the experiments were used in the second passage.

Resultados 59

Figure 01. Microscopic analysis of cultured human skin fibroblasts. Culture of keloid explant (20x) after 3 (A), 7 (B) and 11 (C) days of

incubation.

Characterization of the isolated cells

To characterize the isolated cells, normal human fibroblast (FB) and fibroblasts

derived from keloid (FBK), we performed comparative studies with cell lines commercially

available. HFF-1 (normal fibroblast foreskin - ATCC SCRC-1041) and KEL FIB (skin keloid

- ATCC CRL-1762) were purchased from the Rio de Janeiro Cell Bank (Brazil). The isolated

cells and the line cells were subjected to treatment with Chlorella for further analysis of the

mediators involved in keloid scar formation.

Chlorella and Treatment

The dried alga Chlorella (Parachlorell beyerinckii CK-5), previously identified

as Chlorella vulgaris CK-5 was kindly provided by Research Laboratories, Chlorella Industry

Co., Ltd. (Fukuoka, Japan). Chlorella was resuspended in culture medium and non-cytotoxic

concentrations were selected based on previous results of cytotoxicity assays (data not

shown).

Treatment Protocol

Cell lines, isolated cells and skin fragments (measuring 1cm2) were incubated with

concentrations of 0.60, 0.30, 0.15 and 0.07mg/mL of Chlorella. After 72 hours of incubation

Resultados 60

at 37°C in 5%CO2 in a humidified incubator the supernatants were collected for further

quantification of the proposed mediators. It is important to mention that our laboratory has

extensive experience in the use of human skin model in vitro and ex vivo to evaluate different

parameters involved in biological responses related to several skin disorders [26-28].

Quantification of growth factors, cytokine and ECM components

ECM components (collagen and MMP-1), growth factors (TGF-β1 and VEGF) and

interleucin 6 (IL-6) were quantified using a colorimetric method and an enzyme-linked

immunosorbent assay, respectively, according to the manufacturer’s instructions (Biocolor

Ltd, Belfast, N. Ireland; R&D Systems, Minneapolis, MN;). Three independent experiments

were conducted in triplicate.

Statistical analysis

For statistical analysis, a parametric method, the one-way analysis of variance (Anova)

followed by the Tukey test, was used to compare data among all groups. The level of

statistical significance was considered as P<0.05.

Resultados 61

RESULTS

Skin fragments (normal and keloid) and fibroblasts isolated from normal and keloid

human tissues obtained from plastic surgery were incubated with different concentrations

(0.60, 0.30, 0.15 and 0.07mg/mL) of Chlorella to evaluate its possible modulating effects on

the synthesis of mediators involved in tissue healing. For the purpose of better characterizing

the isolated cells and bringing more accuracy to the results, a comparative test was initially

performed using commercially available cell lines. As shown in figure 2, no differences were

observed between the metabolic profile of the isolated cells when compared to the normal and

keloid fibroblasts lineages.

Figure 02. Metabolic profile for collagen, TGF-β1, MMP-1, IL-6 and VEGF in isolated fibroblasts from

normal (FB) and keloid (FBK) tissues compared to cell lines HFF-1 and KelFib, respectively. A. Collagen

Resultados 62

production. B. TGF-β1 production. C. MMP-1 production. D. IL-6 production. E. VEGF production. P<0.01

and P<0.001 compared to respectively control (Anova, Tukey).

The effects of Chlorella treatment on the synthesis of mediators involved in tissue

healing using isolated fibroblasts derived from normal (FB) and keloid (FBK) skin, as well as

fragments obtained from normal (NS) and keloid (KS) tissue are presented in figures 3 to 7.

As we can see, the presence of the alga regulated the metabolism of cells originated from

keloid tissue by modulating the production of the following mediators, important in the tissue

healing process: collagen, TGF-β1, MMP-1 protease, IL-6 and VEGF.

In relation to collagen production (Figure 3A and 3B), a sharp increase (P <0.001) in

protein synthesis was observed in both FBK and KS, compared to normal controls. In FBK,

treatment with the three higher concentrations of Chlorella used restored to control levels the

synthesis of this mediator, and there was no differences in the response to these

concentrations. Conversely, the observed tendency to modulate the synthesis of this mediator

at the lower concentration (0.07mg/mL) was not statistically significant. In KS, treatment

with the four concentrations used partially reversed the accentuated increased collagen

synthesis, the effect being more significant at the three higher concentrations.

Figure 03. Effects of Chlorella in the production of collagen in fibroblasts and human skin explants. Cells

or skin fragments were incubated for 72 hours in the presence of different concentrations of Chlorella. The

Resultados 63

production of collagen was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB)

and keloid (FBK) skin. B. Normal (NS) and keloid (KS) skin fragments. #P<0.001 compared to respective

normal control; **P<0.01 compared to keloid control; ***P<0.001 compared to keloid control (Anova, Tukey).

Increased TGF-β1production was observed in the supernatant of both FBK and KS

cultures (P <0.001), compared to respectively controls. Treatment with the three higher

concentrations of Chlorella restored to normal levels the production of this mediator, and no

differences were observed in these responses. Conversely, the observed tendency of the alga

to modulate the synthesis of this mediator at the lower concentration (0.07mg/mL) in FBK

culture was not statistically significant (Figures 4A and 4B).

Figure 04. Effects of Chlorella in the production of TGF-β1 in fibroblasts and human skin explants. Cells


production of TGF-β1 was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB) and

keloid (FBK) skin. B. Normal (NS) and keloid (KS) skin fragments. #P<0.001 compared to respective normal

control; **P<0.01 compared to FBK control; *P<0.05 compared to keloid control; ***P<0.001 compared to

keloid control (Anova, Tukey).

Increased MMP-1 protease production was observed in the supernatant of both FBK

and KS cultures, compared to controls (P <0.001). In FBK cultures, treatment with the four

Resultados 64

concentrations of Chlorella partially restored the production of this mediator, and no

differences were observed in these responses. In KS cultures, the four concentrations of

Chlorella used partially reduced the production of MMP-1 protease. However, the effect

produced by the higher concentration (0.6mg/mL) was lower than that observed in the other

concentrations (Figures 5A and 5B).

Figure 05. Effects of Chlorella in the production of MMP-1 in fibroblasts and human skin explants. Cells


production of MMP-1 was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB) and


control; *P<0.05 compared to keloid control; ***P<0.001 compared to keloid control (Anova, Tukey).

In relation to IL-6 production, a sharp increase (P <0.001) in protein synthesis was

observed in both FBK and KS cultures, compared to normal controls. Treatment with the four

concentrations of Chlorella used partially, but significantly, reduced the synthesis of this

mediator, and no differences were observed in these responses (Figures 6A and 6B).

Resultados 65

Figure 06. Effects of Chlorella in the production of IL-6 in fibroblasts and human skin explants. Cells or

skin fragments were incubated for 72 hours in the presence of different concentrations of Chlorella. The

production of IL-6 was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB) and


control; ***P<0.001 compared to keloid control (Anova, Tukey).

VEGF production was also increased in both keloid experimental models when

compared to controls (P<0.001). Treatment with Chlorella restored to normal values VEGF

overexpression in all concentrations evaluated, and no differences were observed among the

concentrations used (Figures 7A and B).

Figure 07. Effects of Chlorella in the production of VEGF in fibroblasts and human skin explants. Cells or

skin fragments were incubated for 72 hours in the presence of different concentrations of Chlorella. The

production of VEGF was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB) and

keloid (FBK) skin. B. Normal (NS) and keloid (KS) skin fragments. *P<0.05 compared to respective normal

control; ***P<0.001 compared to normal control (Anova, Tukey).

Resultados 66

DISCUSSION

The pathogenesis of keloid scar formation has not yet been fully elucidated, and

treatment and prevention of these disorders are a common challenge involving several

medical specialties. In daily practice, treatment and prevention of these disorders are a

common challenge involving several medical specialties.

There is increasing evidence that many key molecules produced by fibroblasts and

keratinocytes play crucial roles during keloid scar development. In the present work we

demonstrate the ability of the alga Chlorella to restore the balance in the increased network

production of mediators involved in tissue healing.

In the literature, several hypotheses regarding the pathogenesis of keloid formation are

discussed, including changes in regulation of growth factors, immune dysfunction, and

exacerbated production of collagen, among others [5]. The results presented in this work

showed that Chlorella act in different immunological and fibroproliferative parameters, which

are involved in the formation of keloids.

Importantly, similarly to that observed in our in vivo studies [10-24], the treatment

with Chlorella of cells and fragments obtained from normal tissue did not interfere in the

normal profile of the synthesis, thus reinforcing its activity as a biological modulator.

In keloid experimental models, we observed an increase production of TGF-β1 and

collagen, which are directly related to the proliferation and differentiation of dermal

fibroblasts, besides promoting the accumulation of proteins in ECM that culminating in tissue

hardening [29-30]. The results obtained in our study showed that treatment with Chlorella is

able to completely reverse the overproduction of collagen and partially reverse the excess of

TGF-β1.

In relation to metalloproteinases production, Chlorella partially reverses the

exaggerated increase in production of MMP-1, which is crucial, considering that this excess

Resultados 67

of enzymatic production contributes to the unregulated fibroblast migration and increase

invasiveness of keloid. This result is in agreement with those presented by Allen et al and

Fujiwara et al. [31-32]. Both studies showed that overproduction of MMP-1 contributed to the

higher migratory and invasive activity of keloid fibroblasts. The modulation of MMP-1

production observed in our evaluations corroborate the results obtained by Chen et al. (2012)

which demonstrate the ability of Chlorella to reduce MMP-1 production induced by UVB

irradiation in human fibroblast culture [33].

Regulation of angiogenesis in keloids is complex and is controlled by a variety of pro-

angiogenic factors. VEGF is the most potent angiogenic factor due to its high specificity to

endothelial cells [34] and it is closely associated with keloid pathogenesis. Previous studies

have demonstrated that VEGF production is abundant in the underlying of keloids and that the

expression of VEGF is higher in keloid-derived fibroblasts compared with normal skin

fibroblasts [35]. In the present study we observed the same pattern of VEGF production in

both keloid models. Our results highlight the efficiency of the treatment with Chlorella in the

regulation of VEGF production at the same levels observed in normal fibroblast and skin. Our

findings showing increased VEGF production in keloid tissues corroborate other findings in

the literature [36], thus indicating the relevance of this mediator as an angiogenic factor

contributing to the invasive capacity of the keloid.

The inflammatory response in keloid lesions is also shown to be active through intense

IL-6 production at the inflammatory site, culminating in an exacerbated proliferation of

fibroblasts. The cytokine IL-6 is an important marker of inflammatory response in the tissue

healing process due to its role in adjustment healing time [37]. IL-6 deficiency results in a

delay in the processes of angiogenesis, re-epithelialization and macrophage infiltration [38-

39]. On the other hand, overexpression of IL-6 culminates in increased keratinization and is a

key factor in the proliferation of fibroblasts [40]. Our results demonstrate that Chorella is able

Resultados 68

to control the excessive production of IL-6 observed in keloid models, reflecting the

importance of the alga in modulation of excessive proliferation of fibroblast, a characteristic

of keloid scars. These results are in agreement with a study conducted by our research group

demonstrating a pivotal role of Chlorella in the balance of IL-6 production [12] in an

experimental model of chronic inflammation due to obesity.

Taken together, these pioneer findings showing the ability of Chlorella to modulate the

key factors involved in the formation of keloid scars by optimizing the process of tissue repair

and regeneration are encouraging. The observed ability of the alga to modulate fibroblast

proliferation induced by IL-6, to control excessive production of collagen by modulation of

TGF-β1 and to decrease the invasive and proliferative capacity of keloid scars by reducing the

production of MMP-1 and VEGF strongly suggest significant biological, diagnostic, and

therapeutic implications in the prevention of keloid scar formation.

SOURCES OF FUNDING: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) (Proc. 301006/2015-6).

CONFLICT OF INTEREST: No conflict of interest to declare.

Resultados 69

LIST OF ABREVIATIONS

DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's medium

ECM: extracellular matrix

FB: normal human fibroblast

FBK: fibroblast derived from keloid

FBS: fetal bovine serum

HFF: Human fibroblast foreskin

IFN: interferon

IL: interleukin

KelFib: skin keloid fibroblast

KS: keloid skin

MMP: metalloproteinase

NS: normal skin

PDL: pulsed-dye laser

TGF-β1: tissue growth factor beta 1

TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinase

UVB: ultraviolet B

VEGF: vascular endothelial growth factor

Resultados 70

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Resultados 71

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Resultados 73

4.3. Rhodiola rosea.

Os efeitos do tratamento com ERR na síntese dos mediadores envolvidos na

cicatrização tecidual utilizando fibroblastos isolados de pele normal (FB) e queloide (FBK),

bem como fragmentos obtidos de tecido normal (NS) e queloide (KS) são apresentados nas

figuras 12 a 19. Como podemos ver, a presença do extrato de Rhodiola rosea regulou o

metabolismo das células originadas do tecido queloideano modulando a produção dos

seguintes mediadores, importantes no processo de cicatrização do tecido: colágeno, TGF-β1,

MMP-1, IL-6 e VEGF. Além disso, foi capaz de modular o perfil de proliferação dos

fibroblastos derivados de queloide.

4.3.1 Quantificação de Colágeno Total.

Na figura 12 (A e B) apresentamos os resultados referentes à produção de

colágeno total nos fibroblastos derivados de kelóide (FBK) e na cicatriz queloideana (KS). Os

resultados foram comparados com os respectivos controles normais (FB e NS). Como

podemos observar a produção de colágeno total, tanto em FBK quanto em KS, apresentou um

aumento estatístico acentuado (P<0,001), em relação aos controles normais.

Nas células FBK, o tratamento com as três concentrações de ERR utilizadas

restaurou os níveis normais de síntese desse mediador e não houve diferença de resposta entre

as concentrações avaliadas (P<0,001). Em KS, o tratamento com as duas concentrações mais

baixas de ERR (0,150 e 0,07mg/mL) reverteu o aumento excessivo da produção de colágeno

observado no tecido queloideano, quando comparado a pele normal (P<0,001). A maior

concentração de ERR (0,3mg/mL) reverteu parcialmente este aumento (P<0,01).

Resultados 74

Figura 12. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de colágeno em fibroblastos e fragmentos de pele

humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes

concentrações de ERR. A produção de colágeno foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados

da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em

comparação com o respectivo controle normal; ** P <0,01 comparado ao controle queloide; *** P <0,001 em

comparação com o controle queloide (Anova, Tukey).

Resultados 75

4.3.2 Quantificação de TGF-β1.

Os resultados da produção de TGF-β1 obtidos após ensaio de quantificação nos

sobrenadante das culturas de FB, FBK, NS e KS tratadas com diferentes concentrações de

ERR estão apresentados na figura 13 (A e B).

Foi observado um aumento estatisticamente significativo na produção deste

mediador (P <0,001) nas culturas de FBK e KS, em comparação com os controles normais.

Nas culturas de FBK o tratamento com as duas concentrações mais baixas (0,150 e

0,07mg/mL) de ERR demonstrou uma habilidade em reverter totalmente o a produção

excessiva de TGF-β1, quando comparado com FB (P<0,001).

Na cultura de KS observamos uma redução parcial da produção excessiva de

TGF-β1 com a concentração mais alta de ERR (0,3mg/mL – P<0,01) e uma reversão total

com as duas concentrações mais baixas (0,150 e 0,07mg/mL – P<0,001).

Resultados 76

Figura 13. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TGF-β1 em fibroblastos e fragmentos de pele


concentrações de ERR. A produção de TGF-β1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados


comparação com o respectivo controle normal; *** P <0,001 em comparação com o controle queloide (Anova,

Tukey).

Resultados 77

4.3.3 Quantificação de MMP-1.

Na figura 14 (A e B) apresentamos os resultados referentes à produção de

MMP-1 nas culturas de células (FB e FBK) e de pele (NS e KS) após o tratamento com as

diferentes concentrações de ERR. Conforme podemos observar a produção da protease MMP-

1 encontra-se aumentada nos modelos experimentais que mimetizam o ambiente queloideano

(FBK e KS), em relação aos controles normais (FB e NS, respectivamente – P<0,001).

Nas culturas de FBK observamos uma reversão parcial da produção excessiva

de MMP-1 quando tratadas com as duas concentrações mais altas de ERR (P<0,001, em

relação à FB). Já nas culturas de KS todas as concentrações de ERR avaliadas foram capazes

de reduzir parcialmente a produção de MMP-1 (P<0,001), quando comprado a NS.

Resultados 78

Figura 14. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de MMP-1 em fibroblastos e fragmentos de pele


concentrações de ERR. A produção de MMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados



Tukey).

Resultados 79

4.3.4 Quantificação de IL-6.

Na figura 15 (A e B) apresentamos os resultados obtidos da quantificação de

IL-6 nas culturas de células (FB e FBK) e pele (NS e KS). Conforme podemos observar esta

citocina apresenta um perfil significativamente aumentado (P<0,001) nos modelos

experimentais que mimetizam o ambiente queloideano.

O tratamento das culturas de FBK e KS com ERR reverteu totalmente a

produção excessiva de IL-6 em todas as concentrações avaliadas (P<0,001), quando

comparado com os controles normais (FB e NS, respectivamente). Não foi observado

diferenças de respostas entre as concentrações avaliadas.

Resultados 80

Figura 15. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de IL-6 em fibroblastos e fragmentos de pele


concentrações de ERR. A produção de IL-6 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da

pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em comparação

com o respectivo controle normal; *** P <0,001 em comparação com o controle queloide (Anova, Tukey).

Resultados 81

4.3.5 Avaliação da Proliferação Celular.

A proliferação celular foi avaliada nas culturas de FB e FBK tratadas com as

concentrações de 0,150 e 0,70mg/mL, através da técnica de citometria de fluxo, utilizando

anticorpo anti-BrdU e iodeto de propídeo. Na figura 16 apresentamos os resultados obtidos, as

imagens A e B são representativas, correspondendo aos dot plots de um dos ensaios. Na

imagem C podemos observar o gráfico obtido após a analise dos resultados de citometria de

fluxo utilizando o software FlowJo.

Conforme podemos observar o tratamento com ambas as concentrações de

ERR foi capaz de reduzir as taxas excessivas de proliferação dos fibroblastos derivados de

queloide (FBK) quando comparados ao FB (P<0,001).

Resultados 82

Figura 16. Efeitos de Rhodiola rosea na proliferação de fibroblastos de pele humana. As células foram incubadas

por 72 horas na presença ou ausência de Rhodiolla rosea em diferentes concentrações. A produção de proliferação

celular foi mensurada através da marcação com anti-BrdU e Iodeto de propídeos (PI) e analisada por citometria de

fluxo (FacsCalibur). A e B. Dot plots representativos de pele normal. C. Fibroblastos obtidos de queloide, tratados

com ERR. . #P<0,001 em relação ao normal. ***P<0,001 em relação ao queloide (Anova, Tukey).

Resultados 83

4.3.6 Quantificação de VEGF.

A figura 17 representa a produção de VEGF em culturas de fibroblastos (FB e

FBK) e pele humana. A produção de VEGF, semelhante aos outros mediadores avaliados,

também foi aumentada nos dois modelos experimentais que mimetizam o ambiente

queloideano (FBK e KS), quando comparados aos controles normais (P <0,001).

Conforme podemos observar o tratamento com ERR reverteu aos níveis do

controle a produção excessiva de VEGF nas culturas de FBK e KS em todas as concentrações

avaliadas (P<0,001, quando com parado a FB e NS, respectivamente). Não foram observadas

diferenças significativas nos resultados das diferentes concentrações utilizadas.

Resultados 84

Figura 17. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de VEGF em fibroblastos e fragmentos de pele


concentrações de ERR. A produção de VEGF foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados



Tukey).

Resultados 85

4.3.7 Quantificação de TIMP-1 e TIMP-2.

Nas figuras 18 e 19 (A e B) apresentamos os resultados referentes à produção

de TIMP-1 e TIMP-2, respectivamente, nos fibroblastos derivados de kelóide (FBK) e na

cicatriz queloideana (KS). Os resultados foram comparados com os respectivos controles

normais (FB e NS). Como podemos observar ambos inibidores de metaloproteinase

apresentaram um aumento estatístico acentuado tanto em FBK quanto em KS (P<0,001), em

relação aos controles normais. Entretanto não houve alteração na produção de TIMP-1 e

TIMP-2 após o tratamento com as diferentes concentrações de ERR.

Resultados 86

Figura 18. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TIMP-1 em fibroblastos e fragmentos de pele


concentrações de ERR. A produção de TIMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados


comparação com o respectivo controle normal (Anova, Tukey).

Resultados 87

Figura 19. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TIMP-2 em fibroblastos e fragmentos de pele


concentrações de ERR. A produção de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados


comparação com o respectivo controle normal (Anova, Tukey).

Discussão 88

5. Discussão

A patogênese da formação de cicatrizes queloideanas ainda não foi totalmente

elucidada, e o tratamento e a prevenção desses distúrbios são um desafio comum envolvendo

várias especialidades médicas. Os queloides não só afetam a aparência da pele, mas também

afetam a saúde física e psicológica dos pacientes. Atualmente, há vários métodos de

tratamento queloide relatados, incluindo cirurgia, drogas, radioterapia, terapia a laser e

crioterapia, bem como terapia combinada que consiste associações dos métodos mencionados

acima (107).

Há evidências crescentes de que muitas moléculas-chave produzidas por

fibroblastos e queratinócitos desempenham papéis cruciais durante o desenvolvimento de

cicatrizes queloideanas (108). Na literatura, são discutidas várias hipóteses quanto à

patogênese dos queloides, incluindo mudanças na regulação de fatores de crescimento,

disfunção imune e produção exacerbada de colágeno, entre outros (3).

No presente trabalho, demonstramos a capacidade da alga Chlorella e do

extrato da planta Rhodiola rosea de restaurar o equilíbrio na produção dos mediadores

associados ao processo de cicatrização de tecidos e formação do queloide. Os resultados

apresentados neste trabalho mostraram que Chlorella e ERR atuam em diferentes parâmetros

imunológicos e fibroproliferativos, envolvidos na formação de queloides.

Corroborando os estudos realizados por nosso grupo (16–30), tanto a Chlorella

como o ERR atuaram como moduladores biológicos adaptogênicos. O tratamento das culturas

primárias de fibroblasto e fragmentos obtidos de tecido normal com ambas as espécies não

interferiu no perfil normal da síntese dos mediadores, tais como: TGF-β1, colágeno total,

MMP-1, VEGF, IL-6, TIMP-1 e TIMP-2

Numerosas vias de sinalização estão associadas a fisiopatologia da cicatriz

queloideana, incluindo a via de sinalização de TGF-β1. TGF-β é uma citocina pleiotrópica

envolvida em múltiplos aspectos do reparo de feridas e um importante regulador da fibrose

que estimula a proliferação e produção de colágeno em fibroblastos derivados de queloides

(109). Além disso, sabe-se que o TGF-β1 regula a expressão genética anormal em

queratinócitos derivados queloides, contribuindo para um perfil de expressão gênica que leva

a alterações no processo de adesão da epiderme e produção de proteínas responsáveis pela

junção celular (110).

Discussão 89

Os tipos mais frequentes de colágenos presentes na derme são colágeno tipo I

(cerca de 80%) e tipo III (aproximadamente 20%) (111). Na pele, a síntese de colágeno é

realizada por fibroblastos e os genes responsáveis pela produção de colágeno tipo I são

COL1A1, localizado no cromossomo 17, que codifica a cadeia α1 (I) e COL1A2, localizada

no cromossomo 7, que codifica a cadeia α2 (I) (112). O colágeno tipo III é produzido pelo

gene COL3A1, localizado no cromossomo 2 (113). Várias vias de sinalização, como MAP

kinase e NF-kB, induzem síntese de colágeno por transcrição de mRNA, sendo traduzidas no

retículo endoplasmático rugoso (RER), hidroxiladas e glicosiladas em procolágeno (114).

Posteriormente, são excretadas no meio extracelular por exocitose, onde as enzimas

proteolíticas clivam seus propeptídeos C e N, transformando-os em tropocolágeno. Então,

tropocolágenos se unem para formar fibrilas de colágeno, que dão origem a fibras de colágeno

(115). O colágeno de tipo I é considerado o colágeno maduro (116) por ser um heterotrímero

composto por duas cadeias idênticas α1 (I) e uma α2 (I) (117), responsável pela força e tensão

dos tecidos (116). O colágeno tipo III é um colágeno imaturo; É um homotrímero, composto

por três cadeias α1 (III) (118), sintetizadas durante os primeiros estágios do reparo tecidual

(116).

A síntese de colágeno pode ser induzida por TGF-β, que se liga ao receptor

ubíquo de serina tirosina quinase (TβRII), e então o receptor de TGF-βI (TβRI) é recrutado e

fosforilado por TβRII. O sinal se propaga através de proteínas do tipo SMADs, uma família

de proteínas intracelulares que por sua vez transportam informações para o núcleo,

estimulando a transcrição de genes (COL1A1, COL1A2 e COL3A1) e induzindo a produção

de colágenos tipo I e tipo III (119). A superexpressão de TβRI e TβRII e a fosforilação

aumentada de proteínas SMAD foram encontradas em fibroblastos derivados de queloides e

parecem induzir produção excessiva de colágeno (120). Estudos indicam que uma falha na

eliminação da super-expressão desses receptores durante a fase de remodelação pode levar ao

efeito autócrino persistente de TGF-β em fibroblastos de queloides, causando aumento da

síntese de colágeno.

Em modelos experimentais de queloides descritos na literatura foram

observados um aumento da produção de TGF-β1 e colágeno, que estão diretamente

relacionados à proliferação e diferenciação de fibroblastos dérmicos, além de promover o

acúmulo de proteínas no ECM que culminou no enrijecimento do tecido (121–124). Os

resultados obtidos em nosso estudo mostraram que o tratamento com Chlorella é capaz de

reverter completamente a excessiva produção de colágeno e reverter parcialmente o excesso

Discussão 90

de TGF-β1. Já o tratamento com ERR é capaz de reveter completamente a produção

exacerbada tanto de colágeno como de TGF-β1.

Em relação à produção de metaloproteinases, Chlorella e ERR revertem

parcialmente o aumento exagerado da produção de MMP-1, o que é crucial, considerando que

esse excesso de produção enzimática contribui para a migração de fibroblastos não regulada e

aumenta a invasividade do queloide. Este resultado está de acordo com os apresentados por

Allen et al e Fujiwara et al. (125,126), os quais mostraram que a superprodução de MMP-1

contribuiu para a maior atividade migratória e invasiva de fibroblastos queloides.

A MMP-1 é uma colagenase intersticial que faz parte de uma subfamília de

MMPs que podem degradar especificamente a tripla hélice de colágeno (112), tornando-a

termicamente estável e suscetível à proteólise adicional por gelatinases. Consequentemente, a

MMP-1 desempenha um papel central na patogênese da renovação anormal no processo de

cicatrização (127).

Pilcher e colaboradores mostraram que a clivagem do colágeno tipo 1 pela

MMP-1 é essencial para a migração de queratinócitos (128). Daniels e colaboradores

mostraram que a MMP-1 é necessária para a contração da matriz em um estudo usando um

inibidor de MMP de amplo espectro (129). Usando mioblastos de camundongo, Allen e

colaboradores mostraram que a produção excessiva de MMP-1 ou MMP-2 aumentou

significativamente a migração e invasão celular (125). Consequentemente, sugere-se que a

MMP-1 possa desempenhar um papel fundamental na migração e invasão de fibroblastos

derivados de queloides, acentuando a característica invasiva do queloide que culmina em uma

cicatriz que pode ir muito além das bordas da lesão inicial.

A modulação da produção de MMP-1 observada em nossas avaliações

corrobora os resultados obtidos por Chen e colaboradores (81) que demonstram a capacidade

da alga Chlorella em reduzir a produção de MMP-1 induzida pela irradiação UVB na cultura

de fibroblastos humanos.

A regulação da angiogênese em queloides é controlado por uma variedade de

fatores pró-angiogênicos. O VEGF é o fator angiogênico mais potente devido à sua alta

especificidade para as células endoteliais (130) e está intimamente associado à patogênese

queloidena. Estudos anteriores demonstraram que a produção de VEGF é abundante em

células e tecidos de queloides e que a expressão de VEGF é maior nos fibroblastos derivados

de queloides em comparação com os fibroblastos normais da pele (130,131). No presente

estudo observamos o mesmo padrão de produção de VEGF em ambos os modelos

experimentais que mimetizam o ambiente queloideano. Nossos resultados destacam a

Discussão 91

eficiência do tratamento com Chlorella e ERR na regulação da produção de VEGF nos

mesmos níveis observados nos fibroblastos e na pele normal. Nossos achados que

demonstram o aumento da produção de VEGF em tecidos de queloide corroboram os da

literatura (126,132), indicando a relevância desse mediador como um fator angiogênico que

contribui para a capacidade invasiva do queloide.

A resposta inflamatória nas lesões queloidenas também se mostra ativa através

da produção intensa de IL-6 no local inflamatório, culminando em uma proliferação

exacerbada de fibroblastos (110). A IL-6 é uma citocina multifuncional que regula a resposta

imune e tem sido intensamente estudada nos últimos anos (133). É secretada por células T e

macrófagos e também fibroblasto, que são capazes de induzir respostas imunes, incluindo

respostas ao trauma (134).

A citocina IL-6 é um marcador importante de resposta inflamatória no processo

de cicatrização do tecido devido ao seu papel no ajuste do tempo de cura (46). A deficiência

de IL-6 resulta em atraso nos processos de angiogênese, re-epitelização e infiltração de

macrófagos (49,135). Por outro lado, a super-expressão da IL-6 culmina no aumento da

queratinização e é um fator chave na proliferação de fibroblastos (136). Nossos resultados

demonstram que a alga Chorella e o ERR são capazes de controlar a produção excessiva de

IL-6 observada nos modelos de queloides, refletindo a importância da alga na modulação da

proliferação excessiva de fibroblastos, característica das cicatrizes queloideanas. Os

resultados referentes ao tratamento com Chorella estão de acordo com um estudo realizado

por nosso grupo de pesquisa que demonstrou um papel fundamental da Chlorella no

equilíbrio da produção de IL-6 (16) em um modelo experimental de inflamação crônica

devido à obesidade.

Paralelamente, o tratamento com ERR demonstrou uma habilidade em reduzir

a proliferação excessiva dos fibroblastos derivados de queloides, porém está capacidade não

foi observada no tratamento com Chlorella.

Em conjunto, esses achados pioneiros são encorajadores, pois mostram a

capacidade da alga Chlorella e do extrato da planta Rhodiola rosea em modular os principais

fatores envolvidos na formação de cicatrizes queloideanas, otimizando o processo de

reparação e regeneração de tecidos. A habilidade de modular a proliferação de fibroblastos

induzida pela IL-6, para controlar a produção excessiva de colágeno por modulação de TGF-

β1 e para diminuir a capacidade invasiva e proliferativa de cicatrizes queloideanas, reduzindo

fortemente a produção de MMP-1 e VEGF sugerem implicações biológicas e terapêuticas

significativas na prevenção da formação destas cicatrizes.

Discussão 92

Considerando o quão satisfatórios foram os resultados obtidos no presente

trabalho, as próximas etapas do estudo envolvem a avaliação da permeação cutânea de

Chlorella e Rhodiola rosea incorporados em diferentes formulações cosméticas e,

posteriormente, o estudo clínico da eficácia destas formulações.

Conclusão 93

6. Conclusão

Os resultados apresentados neste estudo nos permite concluir que:

O tratamento com Chlorella e ERR reverte totalmente a produção

excessiva de Colágeno total, IL-6 e VEGF nas culturas de fibroblastos e

pele derivados de queloides em todas as concentrações avaliadas.

O tratamento com Chlorella reverte parcialmente a produção excessiva

de TGF-β1 nas culturas de fibroblastos (nas concentrações de 0,6; 0,3 e

0,15mg/mL) e pele derivados de queloides (em todas as concentrações

avaliadas).

O tratamento com ERR reverte completamente a produção excessiva de

TGF-β1 nas culturas de fibroblastos e pele derivados de queloides nas

concentrações de 0,3 e 0,15mg/mL.

O tratamento com Chlorella e ERR reverte parcialmente a produção

excessiva de MMP-1 nas culturas de fibroblastos e pele derivados de

queloides em todas as concentrações avaliadas.

O tratamento com ERR reverte completamente a alta taxa proliferativa

observada em fibroblastos derivados de queloide em todas as

concentrações avaliadas.

O tratamento com Chlorella não altera a proliferação de fibroblastos

derivados de queloide.

O tratamento com Chlorella e ERR não altera o perfil de produção de

TIMP-1 e TIMP-2 em fibroblastos derivados de queloide.

Referências Bibliográficas 94

7. Referências Bibliográficas

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Apêndices e Anexos 111

8. Apêndices e Anexos

Apêndice 1 – Quantificação de TIMP-1 e TIMP-2 após o tratamento com Chlorella

Nas figuras 20 e 21 (A e B) apresentamos os resultados referentes à produção

de TIMP-1 e TIMP-2, respectivamente, nos fibroblastos derivados de queloide (FBK) e na

cicatriz queloideana (KS). Os resultados foram comparados com os respectivos controles

normais (FB e NS, respectivamente). Como podemos observar ambos inibidores de

metaloproteinase apresentaram um aumento estatístico acentuado tanto em FBK quanto em

KS (P<0,001), em relação aos controles normais. Entretanto não houve alteração na produção

de TIMP-1 e TIMP-2 após o tratamento com as diferentes concentrações de Chlorella.


Figura 20. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-1 em fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou

fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de Chlorella. A

produção de TIMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da pele normal (FB) e queloide

(FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal

(Anova, Tukey).


Figura 21. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-2 em fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou

fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de Chlorella. A

produção de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da pele normal (FB) e queloide

(FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal

(Anova, Tukey).


Apêndice 2 – Avaliação da proliferação celular após o tratamento com Chlorella.

A proliferação celular foi avaliada nas culturas de FB e FBK tratadas com as

concentrações de 0,600 e 0,150mg/mL, através da técnica de citometria de fluxo, utilizando

anticorpo anti-BrdU e iodeto de propídeo. Na figura 22 apresentamos os resultados obtidos,

após a analise dos dados de citometria de fluxo utilizando o software FlowJo.

Conforme podemos observar o tratamento com ambas as concentrações de

Chlorella não foi capaz de reduzir as taxas excessivas de proliferação dos fibroblastos

derivados de queloide (FBK) quando comparados ao FB.

Figura 22. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-2 em fibroblastos e fragmentos de pele humana. As

células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de

Chlorella. A produção de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da pele

normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em comparação com

o respectivo controle normal (Anova, Tukey).


Anexo 1 – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa para execução do projeto.


Anexo 2 – Termo de Consentimento livre e esclarecido - TCLE

Michelle Sabrina da Silva -...

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