MICRO Diagnose 02 e 03 Aula 1

DIAGNOSE DE VIROSES

DE PLANTAS

• DOENÇAS DE PLANTAS DE ETIOLOGIA VIRAL Grandes perdas últimas décadasAtividade humana (direta ou indireta).

• FATORESFacilidade de transporte de materiais (vírus e vetores)

• O mais importante passo para manejo de doenças de etiologia viral é a correta identificação!

INTRODUÇÃO

DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS

INTRODUÇÃO - Diagnose de fitoviroses


• IDENTIFICAÇÃO do agente causal – Medidas de Controle

• FITOPATÓGENOS - Sinais (externos)

Vírus?

• Testes para comprovação agente causal

DIAGNÓSTICO DE VÍRUS - Dificuldades

• Tamanho (pequenos)

• Pouca diversidade morfológica

• Sintomas similares (esp. distintas)

• Sintomas variáveis (mesma esp)

– cultivar

– condições ambientais


Testes de diagnose: rápidos, eficientes e baixo custo

MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DE VIROSES VEGETAIS

1- BIOLÓGICO: propriedades biológicas: morfologiae gama de hospedeiros, modos de transmissão

2- SOROLÓGICO: detecção da proteína capsidial

3- MOLECULAR: detecção do ácido nucléico


CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DOS MÉTODOS

- Rapidez

- Custo

- Precisão

MÉTODOS BIOLÓGICOS


Métodos Biológicos

Morfologia, Microscopia eletrônica

Gama de hospedeiros

Transmissão

- Observação de:Partículas viraisInclusões virais

Inoculação:

-Gama de hospedeiras(comparação sintomas)

-Vetores:

Nematóides,

Fungos,

Insetos

(aleirodídeos, afídeose cigarrinhas)


1. MICROSCOPIA ELETRÔNICA

- Morfologia (tamanho, forma, envelope)

- Inclusões características: Potyvirus, Caulimovirus

- Partículas virais: confirmar a etiologia viral

- Limitações: custo, equipamento e mão-de-obra.


TOBACCO MOSAIC VIRUS - TMV

POTATO VIRUS Y - PVY

CUCUMBER MOSAIC VIRUS - CMV

BEAN GOLDEN MOSAIC VIRUS - BGMV

INCLUSÕES CITOPLASMÁTICAS PVY

SINTOMAS


SINTOMAS DAS VIROSES VEGETAIS- Pequeno valor diagnóstico


SINTOMA - espécies diferentes de vírus.

MESMO VÍRUS –CMV – Mais de 1000 hospedeiras, sintomas diferentes


.

SINTOMAS SEMELHANTES

- Deficiências nutricionais

- Toxinas produzidas por insetos

- Toxidez por agroquímicos

- Alta temperatura

- Distúrbios de origem genética



.

SINTOMAS DAS VIROSES VEGETAIS

Doenças bem conhecidas


Vira-cabeça do tomateiro (Tomato spotted wilt virus - TSWV)

- Sintomas de acordo com a hospedeira

- Especificidade por determinada sp (ou var da mesmasp.)

Nicotiana spp.

Chenopodium spp

Datura spp.

- Inoculação mecânica, vetor ou enxertia do suco daplanta infectada

3. GAMA DE HOSPEDEIRAS


Planta Indicadora

-A planta indicadora apresentará um quadrosintomatológico característico

-Algumas plantas indicadoras exibem sintomascaracterísticos de determinados vírus

-A técnica se dá com a inoculação do suco daplanta a ser testada

Chenopodium quinoa

http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/5/Planta_indicadora_Chenopodium.JPG

Sintomas em plantas indicadoras de vírus transmitidos de forma mecânica


2. TRANSMISSÃO

- Vetores

- Inoculação Mecânica

- Enxertia



INOCULAÇÃO COM VETOR

CONSIDERAR:

- Espaço em casa de vegetação

- Experiência com inoculação por vetores evariabilidade do hospedeiro, vírus e ambiente


INOCULAÇÃO MECÂNICA

MÉTODOS SOROLÓGICOS


SOROLOGIA

Reação antígeno e anticorpo.


- Adaptado para amostra vegetais (Clark & Adams, 1977)

Sistema imunológico

ImunógenoAntígeno

Proteínas,polissacarídeos,glicoproteínas,

Anticorpos Ig ( A, D, E, G e M)

Sangue: remoção de glóbulos vermelhos e o líquido amarelo-palha

soro

anticorpos específicos e reconhece o antígeno que lhe originou


Teste de imunoadsorção com enzima ligada ao anticorpo (enzyme-linked imunosorbent assay ELISA)


• Antígeno• Anticorpo• Anticorpo conjugado a E (fosfatase alcalina)• Substrato E (Para-Nitro-Fenil-Fosfato ou

BCIP e NBT)

COMPONENTES

TIPOS DE ELISA • Direta: DAS (Double Antibody Sandwich)

• Indireta:

- Reação enzimática amplia a reação sorológica: Sensibilidade

ELISA DIRETA

Y

Y

Y

YE

= IgG específico

Lavar

Lavar

Lavar

Vírus imobilizado pelo IgG

( = vírus)

Vírus reage com IgG -E

IgG-E: detecção

YE= enzima conjugada ao IgG

Substrato da enzima


Y

Intensidade da cor em valores numéricos

ELISA INDIRETA

YE

Lavar

Lavar

Lavar

Vírus adsorvido

( = vírus)

IgG-E detecção colorimetricamente

E = enzima conjugada ao IgG produzido

em cabra (cabra anti-coelho)

Y Vírus imobilizado reage com IgG conjugado

Y =imunoglobulina IgG (produzido em coelho)

YY

Substrato da enzima


Intensidade da cor em valores numéricos

ELISADIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS

Indireto Anticorpo

Direto Partícula Viral

Elisa Direta- Extremamente sensível eespecífico para o vírus que lhedeu origem.

- Detecta a partícula viral

- Um conjugado para cadaantígeno

Elisa Indireta- Menos sensível, mais simples.

- Detecta anticorpos

- Conjugado pode ser usadocontra qualquer tipo devírus(IgG -cabras reconheceIgG- coelho )


COMPARAÇÃO

MÉTODOS MOLECULARESHibridização Molecular

PCR



DNA

NUCLEOTÍDEOS

COMPLEMENTARIEDADE

HIBRIDIZAÇÃO MOLECULAR

• Conceito:Formação de fitasduplas entre fitas simples deácidos nucléicos

• Complementaridade dassequências de nucleotídeos


• Amplificação do Sinal.

2

Ácido Nucléico Imobilizado

Ácido Nucléico Imobilizado

Sonda

Sonda

Sondas Radioativas

** ** * * *

nucleotídeo radioativo (P-32)

DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTASHibridização molecular

Membrana

Membrana

Sondas Não Radioativas Digoxigenina/PA

EY YYE EE YEYRevelar

NBT-BICP

Colorimetria

ECL

Quimioluminescência

TCGGCGT

TCGGCGT

AGCCGCA TG AA ATC

*

*

DNA viralDNA da planta

Sonda

Sonda

Nitrocelulose/náilon


PASSOS HIBRIDIZAÇÃO

- Dot-Blot- Tissue printing


PASSOS HIBRIDIZAÇÃO

1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512

MM

1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512

Sonda: 18S rRNA Sonda: TYLCV-IL

TX


DOT-BLOT

TISSUE- PRINTING1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

MM

TX

PCR (aqui)


1) Romper Paredes Celulares : liberar os constituintes celulares

Macerar N liq

2) Romper Membranas Celulares

Solventes CTAB, SDS

3) Proteger o DNA (DNAses)

Tam. pH 8 + EDTA

4) Separar AN de Ptna

Fenol: Clorof. (desnaturante)

EXTRAÇÃO DE DNA


5) Precipitar o AN

Isopropanol

6) Lavar e ressuspender AN

Alcool, H2O

EXTRAÇÃO DE DNA


Eletroforese em gel de agarose

Agarose + TBE + Brometo de et

Migração de mol.

Como visualizar o DNA?


PREPARANDO O SUPORTE PARA O GEL

PREPARANDO A AGAROSE + TBE

http://www.biochem.wisc.edu/medialab/clipart/eppendorf-tube.gif

APLICAÇÃO DE AMOSTRAS EM GEL DE AGAROSE

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Gel_electrophoresis_apparatus.JPG

VISUALIZAÇÃO EM UV

REVELAÇÃO

http://home.furb.br/rubensm/imagens/dna.jpg

The Nobel - in Chemistry 1993

"for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"

Kary B. Mullis USA


-Técnica baseada na amplificação de DNAdelimitada por dois primers

- O que são primers?Oligonucleotídeos (20-25 ntd)

Flanquear a região de interesse

- Qual a região de interesse?

- Qual a região de interesse?

- Begomovirus spp

-Tomato clorothic mottle virus?

http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://primeirobhp.vilabol.uol.com.br/dna10.jpg&imgrefurl=http://primeirobhp.vilabol.uol.com.br/dna.htm&usg=__ej4AqQQh-cAe_t9jj5H96VjaFdM=&h=640&w=480&sz=57&hl=pt-BR&start=13&um=1&tbnid=qSe6fFDfm9LZVM:&tbnh=137&tbnw=103&prev=/images%3Fq%3Ddna%26hl%3Dpt-BR%26um%3D1

PCR (Polymerase Chain Reaction)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

DESNATURAÇÃO

ANELAMENTO

EXTENSÃO


93-94ºC

40 - 60ºC

72ºC

Etapas:

1 – Separação das fitas

2 – Anelamento dos primers

3 – Extensão da fita

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

35 CICLOS COM 3 ETAPAS CADA

2n

PRIMEIRO CICLO SEGUNDO CICLO TERCEIRO CICLO

SEPARAÇÃO DAS

FITAS E

ANELAMENTO

DO PRIMER

SÍNTESE

DE DNA

SEPARAÇÃO DAS

FITAS E

ANELAMENTO

DO PRIMER

SÍNTESE

DE DNA

SEPARAÇÃO DAS

FITAS E

ANELAMENTO

DO PRIMER

SÍNTESE

DE DNA

FRAGMENTO

DE DNA

ETAPAS DO PROCESSO

1- Extração DNA e/ou RNA (Transcriptase-Reversa)

2- Preparação de um ‘Mix’.


3- Termociclador

4- Eletroforese em gel de agarose

5- Revelação do gel

1) DNA molde2) Primer3) Enzima Taq DNA polimerase4) Tampão5) Cloreto de Magnésio6) Nucleotídeos7) Água

O que necessitamos para uma amplificação do DNA?

Sequenciamento PCR - Específico em caso de primers universais

TERMOCICLADORES

Depois da PCR concluída – Gel de agarose

Eletroforese em gel de agarose

M - - + + + - - - - - - - - +


1 Kb

M 1 2 3 4 5 6 7 8

QUAL MÉTODO UTILIZAR ?

• Qual pergunta?Planta está infectada por vírus? Qual espécie viral?

• Sensibilidade do métodoQual quantidade viral o método pode medir ou detectar

• Acurácia e reproducibilidade

• Adaptabilidade as condições de cada laboratório

• Número de amostras que podem ser processadas Tempo – Número de operadores

• Grau de treinamento requerido

TÉCNICAS USADAS EM CONJUNTO.

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