Microbiologia Geral BQ FCUP.icbaS [Sebenta 2009.2010] Joana Pereira

MICROBIOLOGIA GERAL2009/2010

Licenciatura em Bioqumica

3 Ano

Joana Maria Soares Pereira

FCUP/ICBAS

2009/2010

Microbiologia geral

INTRODUO MICROBIOLOGIAHISTRIA E EXTENSO DA MICROBIOLOGIA

A MicrobiologiaO microorganismos apresentam beneficios para a sociedade, entre eles: Podem ser necessrios na produo de, po, queijo, cerveja, ingurte, antibiticos, vacinas, Vitaminas, Enzimas e muitos outros produtos importantes; So uma fonte de nutrientes na bases das cadeias e redes alimentares ecolgicas; So componententes indispensveis do nosso ecossistema. Eles tornam possiveis os ciclos do carbono, oxignio, azoto e enxofre que ocorrem nos sistemas aqutico e terrestre:

No entanto, os microorganirmos tambm apresentam desvantagens para os humanos, tendo prejudicado tanto a sade humana como a sociedade: As doenas microbianas indubitavelmente tiveram um papel importante em eventos histricos, como o declinio do Imprio Romano e a conquista do Novo Mundo; Em 1347, a peste negra atingiu a Europa brutalmente e apenas em 1351 a praga j tinha matado 1/3 da populao. Durante os 80 anos seguintes, a doena surgiu de novo e de novo, eventualmente matando 75% da populao Europeia. Acredita-se que este desastre mudou a cultura Europeia, preparando o Renascimento; Em 1900, as doenas infecciosas constituiam as principais causas de morte nos paises desenvolvidos e no desenvolvidos. No entanto, nos tempos correntes as doenas infecciosas apresentam uma maior importncia neste facto, em paises mais desenvolvidos.


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Entre 1900 e 2000, trs factores mudaram para que tal disparidade nas taxas de mortalidade causadas por doenas infecciosas baixasse: 1. Por volta dos anos 30/40 chegaram os antibiticos, por descoberta da Penicilina; 2. As vacinas tiveram um impacto tremendo no tratamento de doenas infecciosas; 3. Foram tomadas mediddas higinicas. Assim, facil compreender que paises menos desenvolvidos sejam bastante fustigados pelas doenas infecciosas, sendo estas a principal causa de morte, apresentando um panorama idntico ao do observado no nicio do sculo XX. As doenas infecciosas de maior importncia nos nossos tempos so: SIDA; Malria; Tuberculose.

Literalmente, podemos definir: Microbiologia estudo dos organismos e agentes demasiado pequenos para serem claramente observados a olho n, isto , o estudo dos microorganismos.

Como os objectos com menos de um mlimetro de dimetros no podem ser observados claramente e devem ser examinados com um microcscpio, a microbiologia foca-se principalmente em estudar organismos e agentes to ou mais pequenos: Bactrias (a); Virus (b); Alguns fungos (c); Algumas algas; Protozorios (d).

No entanto, alguns membros destes grupos podem ser visiveis a nivel n, particularmente algumas algas e fungos. Exemplos so fungos do po e as algas filamentosas.

A Descoberta dos MicroorganismosMesmos antes dos microorganismos serem observados, alguns investigadores suspeitaram da sua existncia e sua responsabilidade em doenas: O filsofo romano Lucretius (98-55 a.c.) e o mdico Girolamo Fracastoro (1478-1553) sugeriram que as doenas eram causadas por criaturas vivas invisiveis.

No entanto, a primeira pessoa a observar e descrever microorganismos com preciso foi o microscopista amador holands Antony van Leeuwenhoek (1632-1723):


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Leeuwenhoek trabalhava como alfaiate, mas passava a amaior parte do seu tempo livre a construir pequenos microscpios compostos por duas lentes de vidro convexas encaixadas entre duas placas de prata; Os seus microscpios conseguiam ampliar entre 50 a 300 vezes, e ele conseguia iluminar os seus espcimes liquidos colocando-os entre duas peas de vidro e lanando luz num angulo de 45; Isto proporcionou que Leeuwenhoek observasse bactrias e protozorios, que ento desenhava.

O Conflito da Gerao EspontneaNos primeiros tempos, as pessoas acreditavam na gerao espontnea, ou seja, que os organismos se podiam desenvolver espontanemaente de matria no viva. Esta imagem foi desafiada pelo mdico italiano Francesco Redi (1626-1697), que efectuou uma srie de experincias com carne em decomposio estudando a habilidade de produzir larvas:

Experincia a b c

Descrio Pedao de carne descoberta Pedao de carne coberta com papel Pedao de carne coberta com uma gaze fina

Resultados Moscas depositaram ovos na carne e larvas desenvolveram-se No houve produo espontnea de larvas No houve produo espontnea de larvas mas as moscas foram atraidas pelo conteudo e depositaram os seus ovos e as larvas produziram-se


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Assim, a gerao de larvas por carne em decomposio resultou da presena de ovos de mosca, e a carne no gera larvas espontneamente, como antes se previa. A descoberta dos microorganismos por Leeuwenhoek renovou a controvrsia: Alguns propuseram que os microorganismos surgiam pos gerao espontnea enquanto os organismos maiores no.

Em 1748, o padre ingls John Needham (1713-1781) reportou os resultados das suas experincias quanto gerao espontnea: Needham levou ebolio caldo de carne de carneiro e, depois, fechou os frascos hermeticamente; Eventualmente, muitos dos frascos tornaram-se turvos e continham microorganismos; Ele pensou que a matria orgnica continha uma fora vital que deveria conferir propriedades vitais matria no viva.

Alguns anos mais tarde, o padre e naturalista italiano Lazzaro Spallanzani (1729-1799) melhorou o design experimental de Needham: Selou primeiro os frascos de vidro, que continham gua e sementes; Se os frascos selados fossem colocados em gua em ebolio durante de uma hora, no havia crescimento enquanto os frascos se mantinham selados; Ele props que o ar carregava germes para o meio de cultura, mas tambm comentou que o ar externo deveria ser necessrio para o crescimento de animais existentes j no meio.

Aqueles que suportavam a hiptese da gerao espontnea mantinham que o aquecimento do ar em frascos selados destruia a sua habilidade de suportar vida. Vrios investigadores centraram-se em estudar tais argumentos: Thodore Schwann (1810-1882) permitiu que ar entrasse em frascos contendo uma soluo de nutrientes estreis depois do ar ter passado atravs de um tubo vermelho quente, e os frascos continuaram estreis; Subsequentemente, Friedrich Schroder e Theodor von Dusch permitiram a entrada de ar em frascos com meio esterilizado pelo calor depois deste passar atravs de l de algodo estril e nenhum crescimento ocorreu, apesar do algodo no ter sido aquecidos; Apesar destas experincias, o naturalista francs Felix Pouchet aclamava em 1859 ter realizado experincias que provavam que o crescimento microbiano podia ocorrer mesmo sem contaminao do ar.

Estas constataes provocaram Louis Pasteur (1822-1895) que se centrou e acabou com a discusso de uma vez por todas: Pasteur primeiro filtrou ar atravs de algodo e descobriu que objectos que continham esporos de plantas ficaram presos. Se o pedao de algodo fosse colocado em meio estril depois de ar ter sido filtrado atravs dele, havia crescimento de microorganismos; Depois, ele colocou solues nutritivas dentro de frascos, aqueceu os seus pescoos numa chama, e dobrou-os numa variedade de curvas, enquanto os mantinha abertos para a superficie. Pasteur levou as solues ebolio durante alguns minutos e permitiu que amornassem. Nenhum crescimento ocorreu apesar do conteudo dos frascos estar exposto ao ar;4


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Pasteur concluiu que no ocorreu nenhum crescimento porque o p e os germes teriam sido retidos nas paredes dos pescoos curvados. Se estes fossem quebrados, o crescimento comeava imediatamente.

Assim, Pasteur no apenas resolveu a controvrsia por volta de 1861 mas tambm mostrou como manter as solues estreis. O mdico ingls John Tyndall (1820-1893) ps mais um ponto final na hiptese da gerao espontnea em 1877 demonstrando que o p de facto carregava hermes e que, se o p estivesse ausente, o caldo manteria-se estril mesmo quando exposto ao ar.

O Papel dos Microorganismos no Desenvolvimento de DoenasA importncia dos microorganismos no desenvolvimento de doenas no foi imediatamente bvio para as pessoas, e demorou alguns anos para que os cientistas estabelecessem a ligao entre microorganismos e patologias: O reconhecimento do papel dos microorganismos dependeu fortemente do desenvolvimento de novas tcnicas para o seu estudo; Assim que se tornou claro que as doenas podiam ser causadas por infeces microbianas, os microbiologistas comearam a examinar a forma pela qual os hospedeiros se defendiam contra os microorganismos e a estudar como a doena podia ser prevenida Cresceu a Imunologia.

Reconhecimento da Relao entre Microorganismo e o Desenvolvimento de Doenas Apesar de Fracastoro e outros terem sugerido que microorganismos invisiveis produziam doenas, a maior parte acreditava que as doenas eram devidas a causas como foras supernaturais, vapores txicos designados miasmas, e a desiquilibrios entre os quatro humores que se pensavam estar presentes no corpo: A ideia de que um desiquilibrio entre os quatro humores (sangue, fleuma, bilis amarela e bilis negra) levava a doena foi durante muito tempo aceite desde os tempos do mdico grego Galen (129-199).5


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O suporte da teoria de que os germes estavam envolvidos no desenvolvimento de doenas, comeou a surgir no nicio do sculo XIX: Agostino Bassi (1773-1856) mostrou que um microorganismo pode causar uma doena quando demonstrou, em 1835, que a doena-da-seda era devida a uma infeco fungica; Em 1845, M. J. Berkeley provou que a grande praga da batata na Irlanad foi causada por fungos.

Seguindo o seu sucesso no estudo da fermentao, Louis Pasteur foi convidado pelo governo francs para investigar a doena-da-seda que estava a perturbar a industria da seda. Depois de alguns anos de trabalho, ele mostrou que a doena era devida a um parasita protozorio. A doena foi controlada pelo aumento de lagartas a partir de ovos produzidos por traas saudveis. Evidncias indirectas que os microorganismos constituiam agentes para a doena humana surgiram a partir do trabalho do cirurgio ingls Joseph Lister (1827-1912) sobre a preveno da infeco de feridas: Lister ficou impressionado com os estudos de Pasteur sobre o envolvimento dos microorganismos na fermentao e putrefaco e desenvolveu um sistema de cirurgia antisptica designada para prevenir a entrada de microorganismos nas feridas; Os instrumentos eram esterilizados, e era usado fenol nas vestimentas cirurgicas e, por vezes, pulverizado sobre a rea cirurgica; Como o fenol mata bactrias e preveniu as infecoes, provou-se indirectamente que os microorganismos estavam envolvidos nas infeces.

Evidncias directas do papel das bactrias em doenas surgiram do estudo do antraz pelo mdico alemo Robert Koch (1843-1910). Koch usou o citrio proposto pelo seu professor, Jacob Henle (18091885), para estabelecer a relao entre o Bacillus anthracis e o antraz:

Koch injectou ratos saudveis com material de animais doentes, e os ratos ficaram doentes; Depois de transferir antraz por inoculao atravs uma srie de 20 ratos, incubou uma pea de bao contendo o bacilo de antraz em soro bovino; Os bacilos cresceram, reproduziram-se e produziram esporos; Quando os bacilos ou esporos foram injectados em ratos, estes desenvolevram antraz.

O seu critrio para prvar a relao causal entre microorganismos e uma doena especifica so conhecidos como os Postulados de Koch, e podem ser resumidos a: 1. O microorganismo tem de ser encontrado em todos os individuos doentes e em nenhum saudvel; 2. O microorganismo suspeito deve ser isolado e cultivado em cultura pura; 3. Quando inoculado num animal saudvel, o microorganismo deve causar nele a mesma doena; 4. O mesmo microorganismo deve ser isolado do hospedeiro doente.Joana Maria Soares Pereira 6

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O Desenvolvimento de Tcnicas para o Estudo de Patognios Microbianos Durante os estudos de Koch sobre as doenas bacterianas, tornou-se necessrio isolar patognios microbianos suspeitos: 1. Primeiro, Koch cultivava bactrias nas superficies estreis de batatas levadas ebolio cortadas. Isto era insatisfatrio porque as bactrias nem sempre cresciam bem em batatas; 2. Ele tentou ento solidificar meio liquido com gelatina, e colnias de bactrias separadas desenvolviam-se depois da superficie ser listrada com uma amostra bacteriana. No entanto, a gelatina no foi um bom agente solidificante porque esta era digerida por muitas bactrias e derretia quando a temperarura ia acima dos 28 C; 3. Uma melhor alternativa foi sugerida pela esposa de Walther Hesse, um assistente de Koch. Esta sugeriu o uso de agar como agente solidificante, j que ela o usava com sucesso na produo de compostas. O agar no foi atacado pela maior parte das bactrias e no derretia at atingir uma temperatura de 100 C; 4. Um dos assistente de Koch, Richard Petri, desenvolveu a placa de petri, um recipiente para o meio de cultura slido.

Estes desenvolvimentos tornaram possivel o isolamento de culturas puras que continham apenas um tipo de bactrias e estimulou directamente o progresso em todas as reas da bacteriologia. Koch tambm desenvolveu meio adequado para o crecimento de bactrias isoladas do corpo humano: Devido sua semelhana com os fluidos corporais, extractos de carne e produtos da digesto proteica eram usados como fontes de nutrientes; O resultado era o desenvolvimento de meios de agar nutritivos, que ainda so usados hoje em dia.

O ESTUDO DA ESTRUTURA MICROBIANA

Pesquisa BacteriolgicaOs estudo dos microorganismos, mais comummente de bactrias, segue uma srie de passos at se poder estudar a espcie em questo: 1. Crescimento do microorganismo a paritr de uma amostra, em meios de cultura apropriados; 2. Isolamento em cultura pura, em meios selectivos e slidos; 3. Expanso em meio liquido, visto que a cultura pura apenas fornece uma pequena quantidade de microorganismos. A expanso premite a obteno de uma grande quantidade de espcie pura; 4. Caracterizao, via colorao, estudos bioquimicos, estudos genticos, etcJoana Maria Soares Pereira 7

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Meios de CulturaA maior parte do estudo da microbiologia depende da habilidade de crescer e manter microorganismos no laboratrio e isto possivel apenas se estiverem disponiveis meios de cultura adequados. Meio de cultura preparao liquida ou slida usada para o crescimento, transporte e armazenamento de microorganismos.

Para ser eficiente, o meio deve conter todos os nutrientes que os microorganismos requerem para crescer: Meios especializados so essenciais no isolamento e identificao de microorganismos, no teste de sensibilidade a antibiticos, anlise de gua e alimentos, na microbiologia industrial e noutras actividades; Apesar de todos os microorganismos necessitarem de fontes de energia, carbono, azoto, fosforo, enxofre e vrios minerais, a composio precisa de um meio satisfatrio depender da espcie que se quer cultivar pois os requerimentos nutricionais variam altamente.

Frequentemente, um meio usado para seleccionar e crescer microorganismos especificos ou para permitir a identificao de uma espcie em particular. Segundo a dificuldade de produo de um meio nutritivo adequado e, consequentemente, o isolamento de uma espcie, podemos encontrar diferentes tipos de microorganismos face s necessidades de nutrientes: Prototrficos microorganismos que so nutricionalmente auto-suficientes e que podem existir num substrato de sais inorgnicos simples e com uma fonte de energia. Ou seja, conseguem sobreviver num meio minimo; Auxotrficos microorganismos que no se desenvolvem em meio minimo, requerendo para o seu crescimento a adio de um composto especifico, como um aminocido ou uma vitamina; Fastidiosos microorganismos que necessitam de meios de cultura e condies atmosfricas especificas para o seu isolamento. So exigentes nutricionalmente necessitam de um meio muito rico, sendo normalmente fornecidos esse nutriente por adio de sangue ao meio de cultura; Parasitas intracelulares obrigatrios microorganismos que apenas sobrevivem no interior de clulas hospedeiras. Um exemplo so os virus, que no apresentam maquinaria para replicao, necessitando de infectar uma clula para que sobreviva; No cultivveis - parasitas que necessitam de condies dificilmente alcanveis no laboratrio.

Conforme descemos na lista, a dificuldade de isolamento do tipo em questo vai aumentando, pois vaise tornando mais dificil atingir condies especificas no laboratrio, como temperatura, presso, nutrientes, etc O conhecimento do habitat normal de um microorganismo normalmnete util na seleco de um meio de cultura aproriado porque os requerimentos nutricionais reflectem as vizinhanas naturais. Podemos dividir os meios em diferentes tipos de meios dependendo de vrios critrios:


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2009/2010Critrio Estado fsico Composio qumica Tipo de Meio Liquido Slido Definido Complexo Simples Selectivo Diferencial Enriquecido

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Objectivo

Meio Definido Alguns organimos, particularmente autotrfes fotolitotrficos como as cianobactrias e as algas eucaritas, conseguem crescer num meio relativamente simples contendo CO2 como fonte de carbono (normalmente adicionado como carbonato de sdio ou bicarbonato), nitrato ou amnia como fontes de azoto, sulfato, fosfato e uma variedade de minerais, especificos para cada espcie.Meio Meio para Cianobactrias NaNO3 K2HPO43H2O MgSO47H2O CaCl22H2O cido citrico Citrato de amnia frrico EDTA Na2CO3 Soluo com traos de metais pH 7,4 Meio para E. coli Glucose Na2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO47H2O CaCl2 FeSO47H2O pH 6,8-7,0 Quantidade (g/L) 1,5 0,04 0,075 0,036 0,006 0,006 0,001 0,02 1,0 ml/L

Tais meios nos quais todos os componentes so conhecidos so designados meios defenidos. Estes meios so usados amplamente em investigao, visto serem uteis para identificar o que os microorganismos a estudar metabolizam. No entanto, nem todos os meios definidos so to simples como os apresentados na tabela.

1,0 16,4 1,5 2,0 200,0 mg 10,0 mg 0,5 mg

Meio Complexo Meios que contm alguns ingredientes de composio qumica desconhecida so meios complexos: Bastante uteis, visto que um nico meio complexo pode ser suficientemente rico e complexo para igualar as necessidades nutricionais de diferentes organismos; Em adio, podem ser algumas vezes necessrios porque os requerimentos nutricionais de um microorganismo podem ser desconhecidos, e portanto um meio definido no pode ser conhecido. Esta situao ocorre com muitas bactrias fastidiosas, algumas das quais por vezes requerem um meio contendo soro ou sangue.

Os meios complexos contm componentes indefenidos como peptonas, extracto de carne e extracto de levedura:Joana Maria Soares Pereira 9

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Peptonas so hidrolizados proteicos preparados por digesto proteolitica parcial de carne, caseina, soja, gelatina e outras fontes proteicas. Servem como fontes de carbono, energia e azoto; Extractos de carne so extractos aquosos de carne magra e contm aminocidos, pptidos, nucletidos, cidos orgnicos, vitaminas e minerais; Extractos de leveduras so extractos aquosos de leveduras da cerveja e so uma excelente fonte de vitaminas B e de compostos carbonados e azotados.

Existem trs meios complexos usados normalmente: 1. Caldos de nutrientes; 2. Caldos de soja; 3. Agar MacConkey.Meio Caldo de Nutrientes Peptona (hidrolisado de gelatina) Extracto de carne Caldo de soja Triptona (digesto pancretica de caseina) Peptona (digerido de soja) Glucose Cloreto de sdio Fosfato de dipotssio Agar de MacConkey Digerido pancretico de gelatina Digerido pancretico de caseina Digerido petidico de tecido animal Lactose Sais biliares Cloreto de sdio Vermelho neutro Violeta cristal Agar Quantidade (g/L) 5 3 17 3 2,5 5 2,5 17, 1,5 1,5 10 1,5 5 0,03 0,001 13,5

Se um meio slido necessrio para cultivo de microorganismos, um meio liquido pode ser solidificado com a adio de 1,0 a 2,0% de agar: Agar um polimero sulfatado composto principalmente por D-galactose, 3,6-anidro-L-galactose e cido D-glucornico e normalmente extraido de algas vermelhas; O agar est bem adaptado como agente solidificante pois depois de ser derretido em gua em ebulio pode ser arrefecido at cerca de 40 a 42 C antes de solidificar e no derreter de novo at que a temperatura atinja cerca de 80 a 90 C; tambm um agente solidificante excelente pois os microorganismos no o conseguem degradar.

Outros agente solidificantes podem ser usados: Geis de silica so usados no crescimento de bactrias autotrficas em meio slido na ausncia de substncias orgnicas e para determinar fontes de carbono para bactrias heterotrficas por suplementao do meio com vrios compostos orgnicos.10


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Tipos de meios Meios como caldos de soja e agar de soja so designados meios simples pois suportam o crescimento de vrios microorganismos, sangue e outros nutrientes especiais devem ser adicionados a meios gerais para encorajara o crescimento de microorganismos fastidiosos, sendo esses meios especialmente fortificados designados meios enriquecidos (e.g. agar com sangue). Meios selectivos favorecem o crescimento de microorganismos particulares: Sais biliares ou corantes como fucsina bsica e violeta de crital favorecem o crescimento de bactrias gram-negativo pela inibio do crescimento de bactrias gram-positivo sem afectar os microorganismos gram-negativo; Agar Endo, agar eosina azul de metileno (EMB) e agar MacConkey, trs meios amplamente usados na deteco de E. coli e bactrias relacionadas em fornecimentos de gua, contm corantes que suprimem o crescimento bacteriano gram-positivo. O agar MacConley tambm contm sais biliares; As bactrias tambm podem ser seleccionadas por incubao com nutrientes que especialmente usam. Um meio contendo apenas celulose como fonte de carbono e fonte de energia bastante efecciente no isolamento de bactrias que digerem celulose; As possibilidades de seleco so infidveis e existem dezenas de meios selectivos especiais em uso.

Meios diferenciais so meios que distinguem entre diferentes grupos de bactrias e ainda permitem uma tentativa de identificao de microorganismos baseado nas suas caracteristicas biolgicas: Agar com sangue (Blood agar) tanto um meio diferencial e um meio enriquecido. Distingue entre bactrias hemoliticas e no-hemoliticas. Bactrias hemoliticas (e. g., vrios streptococcus e staphylococcus isolados das gargantes) produzem zonas limpas volta das colnias devido destruio dos eritrcitos. Permite a identificao de microorganismos patognicos; Agar MacConkey tanto um meio selectivo como diferencial. Como contem lactose e corante vermelho neutro, as colnias que fermentam lactose aparecem vermelhas e so facilmente distiguidas das colnias no fermentativas; Manitol-sal-agar tanto um meio selectivo como diferencial. constituido por manitol, extracto de carne, peptona, NaCl (7,5%), vermelho de fenol e agar. Como contem uma percentagem muito elevada de sal (normal 0,5%), selecciona bactrias capazes de sobreviver nestas condies, o que caracteristico do gnero Staphylococcus. Para alm disso, a presena de manitol, um polilcool que serve de fonte de carbono para algumas espcies de bactrias, permite o isolamento de espcies de Staphylococcus que fermentam este composto por mudana de cor do meio (vermelho amarelo) devida alterao de pH causada pelo fermentao. Esta alterao de cor caracteristica da espcie aureus deste gnero.

Escherichia coli EMB Meio Selectivo e diferencial

Blood agar Meio Enriquecido e Diferencial


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Gnero Staphylococcus

Staphylococcus aureus

Manitol-sal-agar Meio Selectivo e Diferencial

Isolamento de Culturas PurasEm habitats naturais, os microorganismos normalmente crescem em populaes complexas e misturadas contendo vrias espcies. Isto apresenta um problema porque um nico tipo de microorganismo no pode ser estudado adequeadamente numa cultura misturada. Assim necessria uma cultura pura: Uma populao de clulas com origem numa nica clula que permite a caracterizao de uma espcie individual; Tem uma importncia to elevada que permitiu o isolamento de vrios agentes patognios responsveis por variadas patologias bacterianas humanas.

Existem vrios modos de preparar culturas puras: Spread plate e streak plate; Pour plate; Crescimento e morfologia da colnia.

Spread Plate e Streak Plate Se uma mistura de clulas espalhada numa superficie de agar de modo a que todas as clulas possam crescer em colnias completamente separadas, um crescimento macroscopicamente visivel ou o agrupamento de microorganismos num meio slido, cada colnia representa uma cultura pura. Podemos chegar a este produto de dois modos diferentes: 1. Spread plate (espalhamento) um mtodo rpido e directo de atingir o resultado. Um pequeno volume de mistura microbiana diluida contend cerca de 30 a 300 clulas transferido para o centro da placa de agar e espelhado por todas a superficie com uma vareta de vidro dobrada esterilizada pelo calor e com lcool. As clulas dispersas desenvolvem-se em colnias isoladas. Como o nmero de colnios dever igualar o nmero de organismos viveis na amostra, as spread plates podem ser podem ser usadas para quantificar a populao microbiana;


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2. Streak plates (estriamento) a mistura microbiana transferida para a extremidade de uma placa de agar com um zaragatoa, ou ansa estriada, e depois estriada pela superficie em quatro zonas, de modo a criar uma concentrao decrescente de colnias. No mesmo ponto, clulas nicas so deixadas na superficie do agar e desnvolvem-se em colnias separadas. No permite a quantificao devido ao gradiente, a sua vantagem ser rpido.

Em ambas as tcnicas, o isolamento com sucesso de colnias depende da separao espacial das clulas nicas. Assim, se quisermos fazer quantificao fazemos spread plate, mas se quisermos apenas separar fazemos streak plate porque mais rpido. Pour Plate Extensivelmente usada com fungos e bactrias, a pour plate tambm fornece colnias isoladas: A amostra original diluida vrias vezes para reduzir a populao microbiana suficientemente para obter colnias separadas na placa; Depois pequenos volumens de vrias amostras diluidas so misturados com agar liquido, que foi arrefecido at cerca de 45 C, e as misturas so derramadas em placas de petri estreis; A maior parte das bactrias e fungos no so mortos pelo exposio breve ao agar quente. Depois do agar solidificar, cada clula est fixa num local e forma uma colnia individual; Placas contendo entre 30 a 300 colnias so quantificadas. O numeor total de colnias iguala o numero de microorganismos viveis na amostra diluida; As clnias que crescem na superficie podem ser usadas para inocular meio fresco e preparar culturas puras.


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Este mtodo usado em alguns casos porque alguns microorganismos cerescem melhor nestas condies. Crescimento e Morfologia das Colnias O desenvolvimento das colnias na superficie do agar ajuda na identificao de bactrias pois espcies individuais normalmente formam colnias com tamanho e aparncia caracteristicas:

Quando uma populao misturada foi plaqueada apropriadamente, por vezes possivel identificar a colnia desejada baseado na sua aparncia geral e isso permite o seu uso na obteno de colnias puras.

A estrutura microscpica das colnias normalmente to varivel como a sua aparncia visual. Na natureza, as bactrias e muitos outros microorganismos normalmente crescem na superficie de biofilmes, contudo, por vezes no formam colnias discretas. Assim, a compreenso do crescimento das colnias importante, e o crescimento das colnias em agar tem sido frequentemente estudado: Geralmente o crescimento mais rpido ocorre na extremidade da colnia; O crescimento mais lento no centro; A autolise celular ocorre nas pores centrais mais velhas da mesma colnia.

Estas diferenas no crescimento parecem dever-se a gradientes de oxignio, nutrientes e produtos txicos na colnia: Na extremidade da colnia, oxignio e nutrientes esto presentes; No centro da colnia mais espesso que a extremidade. Conquequentemente, oxignio e nutrientes no se difundem rapidamente para o centro, produtos txicos metablicos no consgeuem ser rapidamente eliminados e o crescimento do centro da colnia abrabdado ou parado; Devido a estas alteraes ambientais na colnia, as clulas no cnetro vo morrendo enquanto as clulas perifricas podem crescer a taxas mximas.

As bactrias que crescem em superficies slidas como o agar podem formar colnias complexas e com formas complicadas: Esses padres variam com a disponibilidade de nutrientes e com a dureza da superficie de agar; A difuso e disponibilidade de nutrientes, a quimiotaxia bacteriana e a presena de liquido na superficie parecem ter papel importane na formao de um padro.14


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Preparao e Colorao de EspecimensApesar dos microorganismos poderem ser directamente examinados com o microcpio ptico, normalmente devem ser fixados e coloridos de modo a aumentar a sua visibilidade, acentuar caracteristicas morfolgicas especificas e preseva-los para estudo futuro. Fixao As clulas coloridas vistas ao microcpio devem manter-se vivas o maior tempo possivel para que seja possivel observar a sua estrutura interna, assim, a fixao o processo pelo qual as estruturas internas e externas das clulas e microorganismos so preservadas e fixadas nas suas posies originais: Inactiva enzimas que podem romper a morfologia da clula e endurece as estruturas celulares para que estas no se alterem durante a colorao e a observao; Durante o processo, um microorganismo normalmente morto e ligado firmemente lmina de vidro.

Existem fundamentalmente dois tipos de fixao: 1. Fixao pelo calor preserva a morfologia geral, mas no as estruturas internas; 2. Fixao quimica deve ser usada para proteger subestruturas celulares e a morfologia de microrganismos maiores e mais delicados. Os fixadores qumicos penetram as clulas e reagem com componetes celulares, normalmente proteinas e lipidos, para os tornar inactivos, insoluveis e no mveis. Misturas fixadoras comuns contm componetes como o etanol, cido actico, cloreto de mercurio, formaldeido e glutaraldeido. Corantes e colorao simples Os principais tipos de corantes usados na colorao de microorganismos apresentam duas caracteristicas comuns: 1. Apresentam grupos cromforos, grupos com ligaes duplas conjugadas que atribuem a cor ao corante; 2. Podem ligar-se s clulas por ligaes inicas, covalentes ou hidrofbicas. Por exemplo, um corante carregado positivamente liga-se a estruturas celulares carregadas negativamente. Os corantes ionizveis podem ser dividido em duas classes gerais baseado na natureza do seu grupo carregado: 1. Corantes bsicos azul de metileno, fucsina bsica, violeta de cristal, safranina, verde malaquito apresentam grupos carregados positivamente e so geralmente liagdos a sais de cloro. Ligam-se a molculas carregadas negativamente como cidos nucleicos e vrias proteinas. Como as superficies das clulas bacterianas so tambm carregadas negativamente, os corantes bscios so normalmente usados em bacteriologia; 2. Corantes acidicos eosina, rosa de bengal e fucsina cida possuem grupos carregados negativamente como carboxilos (-COOH) e hidroxilos fenlicos (-OH). Os corantes acidicos, devido ao seu grupo carregado negativamente, liga-se a estruturas celulares carregados positivamente. O pH pode alterar a eficincia da colorao visto que a natureza e o grau da carga dos componetes celulares altera-se com o pH. Assim:Joana Maria Soares Pereira 15

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Os corantes aninicos coloram melhor sob condies acidicas, quando as proteinas e outras molculas carregam uma carga positiva; Os corantes bscios so mais eficientes a pHs mais altos.

Apesar das interaces inicas serem provavelmente o meio mais comum de ligao, os corantes tambm se ligam atravs de ligaes covalentes ou devido s suas caracterisitcas soluveis: O DNA pode ser colorido pelo procedimento de Feulgen, no qual o reagente de Schiff covalentemente ligado aos acares deosoxirribose depois de tratamento com cido hidroclrico; O preto do Sudo colora selectivamente lipidos pois lipossoluvel, no se dissolvendo em pores aquosas da clulas.

Frequentemente, os microorganismos podem ser coloridos muito satisfactoriamente por colorao simples, na qual um nico agente de colorao usado: O valor da colorao simples reside na sua simplicidade e facilidade de uso; Baseia-se na cobertura da amostra fixada com o corante por um periodo de tempo especifico, lavagem de excesso de corante com gua e secagem; Corantes bsicos como violeta de cristal, azul de metileno e carbolfucsina so frequentemente usado para determinar o tamanho, forma e arranjos das bactrias.


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Colorao diferencial Procedimentos de colorao diferencial dividem as bactrias em grupos separados baseado nas suas propriedades de colorao. Existem dois mtodos diferentes: 1. Colorao de Gram desenvolvida em 1884 pelo mdico dinamarqus Christian Gram, o mtodo de colorao mais usado em bacteriologia. um procedimento de colorao diferencial porque divide as bactrias em duas classes gram negativo e gram positivo baseado nas propriedades da parede celular; 2. Colorao lcool-cido permite a identificao de bacilos lcool-cido resistentes, como os agentes da tuberculose e da lepra. O procedimento da colorao de Gram o seguinte:

1. O esfregao corado com o corante bsico violetas de cristal, o corante primrio; 2. De seguida, tratado com uma soluo de iodo funcionando como um mordente, isto , o iodo aumenta a interaco entre a clula e o corante de modo a que a clula seja colorida mais eficientemente; 3. O esfregao depois descolorido por lavagem com etanol ou acetona. Este passo gera o aspecto diferencial da colorao de Gram: Bactrias Gram-positivo retm o violeta de cristal; Bactrias Gram-negativo perdem o violeta de cristal e ficam incolores. 4. Finalmente, o esfregao de novo colorido com outro corante simples bsico diferente do violeta de cristal. O mais comum o uso de safranina, que cora as bactrias gram-negativo de rosa a vermelho e deixa as gram-positivo com uma cor violeta escuro.

Clostridium perfringens Gram-positivo

Escherichia coli Gram-negativo

A colorao lcool-cido outro procedimento de colorao diferencial importante. Algumas espcies, particularmente as do gnero Micobactrium, no se ligam a corantes simples rapidamente e devem ser coradas por um mtodo mais severo, o mtodo de Ziehl-Neelsen: 1. O passo inicial o aquecimento do esfregao com uma mistura de fucsina bsica e fenol;Joana Maria Soares Pereira 17

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2. Assim que a fucsina bsica penetra na clula com a ajuda do calor e do fenol, as clulas lcoolcido resistentes retm o corante e no perdem a cor rapidamente com uma lavagem com lcool-cido e mantm-se vermelhas. Isto deve-se ao grande conteudo lipidico da parede celular das bactrias lcool-cido resistentes, em particular o cido miclico um grupo de lipido ramificados que responsvel pela resistncia ao lcool-cido; 3. As bactrias lcool-cido no resistentes so descoloradas pelo lcool-acido e assim, coradas de azul pelo corante secundrio azul de metileno. Este ultimo mtodo usado para identificar Mycobacterium tuberculosis e M. leprae, os patognio responsveis pela tuberculose e pela lepra, respectivamente.

Mycobacterium leprae lcool-cido resistente

Colorao de Estruturas Especificas Vrios procedimentos de colorao especiais foram desenvolvidos ao longo dos anos para estudar esttruturas bacterianas especificas com o microscpio ptico. Uma das mais simples a colorao negativa: Uma tcnica que revela a presena de cpsula difusas volta da bactrias; As bactrias so misturadas com Indian ink ou corante de Nigrosina e espalhadas como uma camada fina numa lmina. Depois da colorao, as bactrias aparecem como corpos claros no meio do fundo azul escuro j que as particulas de tinta e corante no conseguem penetrar tanto na clula bacteriana nem na parede; A extenso da regio clara determinada pelo tamanho da cpsula e da clula; Existe uma pequena distoro da forma bacteriana mas a clula pode ser contrastada para melhor visibilidade.

Bactrias do gnero Bacillus e Clostridium formam uma estrutura excepcionalmente resitente capaz de sobreviver por longos periodo num ambiente no favorvel. Esta estrutura dormente designada endosporo visto que se densenvolve dentro da clula. A morfologia e localizao do endosporo varia entre espcie e normalmente a sua identificao tem certo valor. Os endosporos podem ser esfricos a elipticos e menores ou maiores em dimetro que a bactria parente. Os endosporos no so corados eficientemente pela maior parte dos corantes, mas quando corados so fortemente resistentes descolorao. Esta propriedade a base da maior parte dos mtodos de colorao de esporos: No mtodo de Schaeffer-Fulton, os endosporos so inicialmente coloridos pelo aquecimento das bactrias com verde malaquito, que um corante muito forte que penetra os endosporos; Depois do tratamento com verde malaquito, o resto da clula lavada do corante e colorida com safranina; Esta tcnica fornece um endosporo verde no interior de uma clula rosada.


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O flagelo bacteriano um organelo fino (10-30 nm de dimetro) semelhante com um fio que permite a locomoo e que s pode ser observado directamente usando o microscpio electrnico. Para observar-lo com o microscpio ptico, o flagelo espessado por mtodos de colorao do flagelo: No mtodo de Leifson este revestido com mordentes como tannis acid e potassium alum, e corado com pararosanilina; No mtodo de Grey este revestido com mordentes como tannis acid e potassium alum, e corado com fucsina bsica.

Os procedimentos de colorao do flegelo fornece informao taxonomica sobre a presena e padro distribuio do flagelo.

Klebsiella pneumoniae Colorao negativa

Bacillus cereus Colorao de esporos

Spirillum volutans Colorao do flagelo

TAXONOMIA MICROBIANA

Clulas ProcariticasAs clulas procariticas apresentam uma morfologia simples e no apresentam um ncelo delimitado por uma membrana. Neste grupo esto imcluidas todas as bactrias. Mesmo uma examinao superficial do mundo microbiano mostra que as bactrias so um dos mais importantes grupos por qualquer critrio: Nmero de organismos; Ecologia geral; Importncia, ou importncia prtica, para os humanos.

Existem dois diferentes grupos de procariotas: Bacteria e Archaea. Ambas pertencentes s bactrias. Tamanho, forma e arranjo Ser de esperar que pequenos organismos, relativamente simples, como os procariotas, sero uniformes em forma e tamanho. Apesar de ser verdade que a maior parte dos procariotas so semelhantes em morfologia, existe uma grande variao devido a diferenas genticas e ecolgicas. Quanto s bactrias: Coccus clulas aproximadamente esfricas. Podem existir como clulas individuais, mas tambm associadas em arranjos caracteristicos que so frequentemente uteis na identificao bacteriana. Diplococcus surgem quando coccus se dividem e se mantm juntos formando pares.19


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Longas cadeias de coccus resultam quando as clulas se aderem depois de divises repetidas num plano. Divises em dois ou trs planos podem produzir aglomerados simtricos de coccus; Bacillus clulas com forma de bastonete. Diferem consideravelmente em tamanho. A forma da terminao do basto varia entre espcies e pode ser achatado, arredondado, bifurcado ou cilindrico. Apesar da maior parte dos bacillus ocorrerem sozinhos, eles podem manter-se unidos depois da diviso para formar pares ou cadeias; Vibries algumas bactrias com forma de bastonete podem ser curvadas para formar virgulas distintas; Espirilos tal como nos vibries, algumas bactrias podem ser curvadas para formar espirais rigidos; Espiroquetas tal como os vibries e os espirilos, algumas bactrias podem ser curvadas para formar espirais flexiveis; Pleomrficas algumas bactrias podem apresentar vrias formas.

Em todos os casos, a forma da clula bacteriana determinada pela parede celular.


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As bactrias variam em tamanho tanto como em forma: As mais pequenas tm cerca de 0,3 m de dimetro, aproximadamente o tamanho dos maiores virus (os poxvirus); Recentemente, foram reportadas clulas ainda mais pequenas. Nanobactrias ou ultramicrobactrias tm entre 0,2 m e 0,05 m de dimetro. Pensava-se que a clula possivelmente mais pequena podia ter entre 0,14 m e 0,2 m, mas algumas nanobactrias so menores; A Escherichia coli, um bacilo com um tamanho normal, tem cerca de 1,1 a 1,5 m de largura e 2,0 a 6,0 m de comprimento; Algumas bactrias tornam-se muito grandes. Algumas espiroquetas ocasionalmente atingem 500 m em comprimento, e algumas cianobatrias tm cerca de 7 m de dimetro, o mesmo dimetro dos eritrcitos; Uma grande bactria vive no intestino do peixe-cirurgio. A Epulopiscium fishelsoni pode alcanar uma dimenso de 600 por 80 m, um pouco menor que um hifen escrito; Mais recentemente, foi descoberta uma bactria ainda maior nos sedimentos do ocenao, a Thiomargarita namibiensis; Assim, algumas bactrias podem ser ainda maiores que a clula eucaritica comum, visto que uma clula animal ou vegetal tipica tem cerca de 10-50 m de dimetro.

Organizao Celular Procariota Uma variedade de estruturas encontrada nas clulas procariotas: Membrana plasmtica barreira selectivamente permevel, fronteira mecnica da clula, transportador de nutrientes e de resduos, localizao de vrios processos metablicos (respirao, fotossintese), deteco de sugestes ambientais para quimiotaxia; Vacolo gasoso permite a flutuao em ambientes aquticos;21


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Ribossomas 70s sintese proteica. Diferentes dos eucariotas; Corpos de incluso armazenamento de carbono, fosfato e outras substncias; Nucleoide localizao do material gentico (DNA); Espao periplasmico contem enzimas hidroliticas e proteinas de ligao para uptake e processamento de nutrientes; Parede celular fornece forma bactria e proteco contra a lise em solues diluidas; Cpsula resistncia fagocitose, aderncia a superficies; Fimbrias e pilosidades ligao a superficies e a outras bactrias; Flagelo movimento; Endosporo sobrevivncia em condies ambientais extremas; Plasmideo anel de DNA simples que pode conter genes importantes. DNA perifrico.

Nem todas as estruturas so encontradas em todos os gneros. Em adio, as clulas gram-positivo e as gram-negativo diferem, particularmente no que diz respeito s suas paredes celulares. Apesar destas variaes, as clulas procarioticas so consistentes na sua estrutura fundamental e componentes mais importantes: As clulas procarioticas so quase sempre revestidas por uma parde celular quimicamente complexa; Dentro desta parede, e separada desta pelo espao periplasmico, encontra-se a membrana plasmtica. Esta membrana pode ser invaginada para formar algumas estruturas membranares internas simples; Como a clula procaritica no apresenta organelos internos ligados membrana, o seu interior morfologicamente simples; O material gentico est localizado numa regio especifica, o nucleoide, e no est separado do citoplasma vizinho por membranas; Os ribossomas e corpos de incluso esto espalhados pela matriz citoplasmtica; Tanto as clulas gram-positivo e as gram-negativo podem usar flagelos para locomoo; Algumas clulas so revestidas por uma cpsula externa parede celular.

Estas clulas so morfologicamente mais simples que as clulas eucariotas.


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Clulas EucariticasAs algas, fungos e protozorios eucariotas so tambm microorganismos e so extensivamente estudados. Estes organismos normalmente so extraordinariamente complexos: Bastante interessantes e membros proeminentes dos ecossistemas; Fungos e, em alguma extenso, algas so excepcionalmente uteis em microbiologia industrial; Vrios fungos e protozorios so patognios humanos importantes.

A diferena mais bvia entre clulas eucariotas e procariotas est no seu uso de membranas: As clulas eucariotas apresentam um ncleo delimitado por membranas; As membranas tm um papel proeminente na estrutura de muitos organelos.

Organelos so estruturas intracelulares que desempenham funes especificas nas clulas, de modo anlogo s funes dos orgos no corpo. No satisfatrio definir organelos como estruturas revestidas por membranas pois isso iria excluir componentes como ribossomas e flagelos. Comparando clulas procarioticas com eucarioticas, estas ultimas so muito mais complexas: Esta complexidade deve-se ao uso de membranas internas para vrios propsitos; A diviso do interior da clula eucariotica por membranas torna possivel a distribuio de diferentes funes bioquimicas e fisiolgicas em compartiemntos separados de modo a que ocorram mais facilmente de modo simultneo e coordenado; Maiores superficies membranare tornam possivel uma maior actividade respiratria e fotossinttica porque estes processos localizam-se exclusivamente em membranas; O complexo membranar intracitoplasmtico funciona como um sistema de transporte para mover materiais entre diferentes localizaes celulares; Sistemas membranares abundantes so provavelmente necessrios nas clulas eucariotas devido ao seu maior volume e necessidade de regulao adequada, actividade metabolica e transporte.

Os principais organelos eucarioticos so:Joana Maria Soares Pereira 23

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Membrana plasmtica revestimento mecnico da clula, barreira selectivamente permevel com sistemas de transporte, medeia interaces clula-clula e a adeso a superficies, secreo; Matriz citoplasmtica ambiente para outros organelos, localizao de vrios processos metablicos; Microfilamentos, filamentos intermdios e microtubulos estrutura e movimentos da clula, formam o citoesqueleto; Reticulo endoplasmtico transporte de materiais, sintese de lipidos e proteinas; Aparelho de Golgi empacotamento e secreo de materiais para vrios propsitos, formao de lisossomas; Lisossomas digesto intracelular; Mitocndria produo de energia atravs do uso do Ciclo de Krebs, transporte de electres, fosofrilao oxidativa, e outras vias; Cloroplastos fotossintese; Ncleo armazenamento de informao gentica, centro de controlo da clula; Nuclolo sintese de RNA ribossomal, construo de ribossomas; Parede celular e pelicula d forma clula e protege-a; Cilios e flagelo moimento celular; Vacuolo armazenamento temporrio e transporte, digesto (vacuolos de nutrientes), balano osmtico (vacuolo contractil).

Evoluo Microbiana e DiversidadeA vida procaritica surgiu muito pouco depois da Terra arrefecer e muito provavelmente os primeiros procariotas era anaerobicos. As cianobactrias e a fotossintese, produtora de oxignio, desenvolveu-se provavelmente h cerca de 2,5 a 3,0 bilies de anoc e a diversidade microbiana aumentou bastante a partir do momento em que o oxignio se tornou disponivel.


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Os estudos de Carl Woese e dos seu colaboradores na sequenciao de rRNA de clulas procarioticas sugeriram que os procariotas se dividiram em dois grupos distintos bastante cedo:

BACTERIA

ACHAEA

EUCARYA

A rvore est dividida em trs ramos principais representando os trs grupos primrios: Bacteria, Archaea e Eucarya; Os grupos archaea e bactria divergiram primeiro, s depois os eucariotas se desenvolveram.

Estes trs grupos primrios so designados dominios e encontram-se abaixo dos neveis phylum e reino, sendo que os reinos tradicionais esto distribuidos entre estes trs dominios. Os dominios diferem bastante entre eles: Eucarya engloba os organismos eucarioticos com membrana lipidica costituida por diesteres de glicerol e com rRNA eucarioticos; Bacteria contem clulas procariotas com rRNA bacteriano e lipidos membranares que so glicerol diacil dieteres; Archaea composto por procariotas que contm isoprenoide glicerol diter ou diglicerol tetraeter nas sua membranas e rRNA archaea.

Parece provavel que as clulas eucarioticas modernas surgiram dos eucariotas h cerca de 1,4 bilies de anos.

Categorias TaxonmicasNa preparao de um esquema de classeificao, coloca-se o microorganismo dentro de um grupo pequeno e homogeneo que ele proprio um membro de grupos maiores que no se sobrepoem num arranjo hierarquico. A categoria une os grupos ao nivel a baixo, com base em propriedades compartilhadas: Na taxonomia procariota, os niveis mais usados, em ordem ascendente, so espcie, gnero, familia, ordem, classe e filo; Grupos microbianos em cada nivel apresentam nomes com terminaes ou sufixos caracteristicos de cada nivel.


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O grupos taxonmico bsico na taxonomia microbiana a espcie. No entanto, a definio de espcie para organismos superiores difere da usada pelos microbiologitas: Espcies de organismos superiores grupos de populaes que se podem cruzar reprodutivelmente isoladas de outros grupos. Esta definio satisfatria para organismos capazes de se reproduzir sexualmente mas no para a maior partes dos microorganismos porque estes no se reproduzem deste modo; Espcies de procariotas coleco de estirpes que partilham vrias propriedades estveis e diferem significativamente de outros grupos de estirpes.

No entanto, esta definio de espcies procariotas muito subjectiva e pode ser interpretada de vrias formas. Assim, foram propostas definies mais precisas: Uma espcie (genomospcies) uma coleco de estirpes que apresentam G+C semelhante e 70% ou mais de semelhana, o que julgado por experincia de hibridao de DNA; Idealmente, uma espcie tambm deveria ser fenotipicamente distinguida de outras espcies semelhantes.

Uma estirpe uma populao de organismos que distinguida pelo menos de uma outra populao numa categoria taxonmica especifica. Considera-se que ter descendido de um nico organismos ou de uma cultura pura isolada. As estripes dentro de uma espcie podem diferir ligeiramente de vrios modos: Biovars so estirpes procariotas variantes caracterizadas por diferenas fisiolgicas e bioquimicas; Morfovars so estirpes procariotas que diferem morfologicamente; Serovars so estirpes que apresentam propriedades antignicas distintivas.

Uma etsirpes de uma espcie designada de estirpe tipo e normalmente uma das primeiras estirpes a ser estudada e mais caracterizada que outras estirpes. No entanto, no tem de ser o membro mais representativo. Nomenclatura Cada espcie associada a um gnero, a categoria taxonmica acima da espcia. Um gnero um grupo bem definido de uma ou mais espcies que claramente separada de outro gnero.Joana Maria Soares Pereira 26

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Os microbiologistas designam os microorganismos usando o sistema binomial. O nome latinizado, em itlico, consiste em duas partes: Escherichia coli 1 parte 2 parte

1. A primeira parte, que escrita com letra grande, o nome genrico. Pode alterar se o microorganismo for atribuido a outro gnero devido a nova informao. Pode ser abreviado usando apenas a primeira letra (Escherichia E.); 2. A segunda parte, que no escrita com letra grande, o cognome especifico. Este cognome estvel. Classificao Fentica Vrios taxonomistas mantm que a classificao mais natural aquela com maior contedo informativo: Uma boa classificao deve remeter para a diversidade biolgica e ainda clarificar a funo de uma estrutura morfolgica.

Por exemplo, se a mobilidade e flagelos esto sempre associados em microorganismos particulares, sensato supor que os flagelos esto envolvidos em pelo menos alguns tipos de mobilidade. Quando visto desta forma, o melhor sistema de classificao ser o sistema fentico, que agrupa os organismos baseado em semelhanas mutuas das suas caracteristicas fenotipicas: Apesar de estudos fenticos poderem revelar possiveis relaes evolucionrias, no dependem de anlises filogenticas; Comparam vrios traos se assumirem que algumas caracteristicas so mais importantes filogeneticamente que outras, isto , traos no ponderados so empregues para estimar a semelhana geral; Deste modo, a melhor classificao fentica aquela construida comparando o maior numero de atributos possivel. Organismos que partilham vrias caracteristicas formam um grupo ou taxa comum.

Taxonomia Numrica O desenvolvimento de computadores tornou possivel a aproximao numrica conhecida como taxonomia numrica: Agrupamento por mtodos numerico de unidade taxonmicas em taxa com base nos seus estados caracteristicos; Informao acerca da propriedade do organismo convertida numa forma adequada para anlise numrica e depois comparada por computador; A classificao resultante baseada na semelhana geral, depois da comparao de vrias caracteristicas, sendo que todas tm o mesmo peso; Esta aproximao no podia ser efectuada antes do aparecimento de computadores devido ao grande numero de clculos envolvidos.


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Os resultados da anlise taxonomica numrica so normalmente sumariados num diagrama semelhante a uma rvore filogentica designado dendrograma: O diagrama normalmente colocado com um eixo graduado em unidades de similaridade; Cada ponto de ramificao corresponde ao valor de similaridade que relaciona os dois ramos.

Classificao Filogentica Sistemas filogenticos ou de classificao filtica so sistemas baseados nas relaes evolucionrias em vez de semelhanas gerais: O termo filogenia refere-se ao desenvolvimento evolucionrio das espcies; Este mtodo complicado para procariotas e outros microorganismos, principalmente devido falta de bons registos fsseis; A comparao directa de material gentico e de produtos de genes, como RNA e proteinas, supera vrios desses problemas.

Principais Caracteristicas usadas em TaxonomiaVrias caracteristicas so usadas na classificao e identificao de microorganismos. Por razes de clareza, as caracteristicas foram divididas em dois grupos:Clssicas Morfologia Fisiologia e Metabolismo Ecologia Gentica Moleculares Proteinas Conteudo do material gentico (G+C) Hibridao de cidos nucleicos Sequenciao de cidos nucleicos

Caracteristicas Clssicas A abordagem clssica da taxonomia faz uso de caracteristicas morfolgicas, fisiolgicas, bioquimicas, ecolgicas e genticas. Estas caracteristicas foram empregues em taxonomia microbiana durante vrios anos. As caracteristica morfolgicas so importantes na taxonomia microbiana por vrias razes:Joana Maria Soares Pereira 28

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A morfologia fcil de estudar e analisar, particularmente em microorganismos eucariotas e em procariotas mais complexos; Comparaes morfolgicas so valiosas porque caracteristicas estruturais dependem da expresso de vrios genes, so geneticamente estveis, e, pelo menos em eucariotas, normalmente no variam consideravelmente com alteraes ambientais.

Assim, semelhanas morfolgicas so um bom indicativo de relao filogenetica, e vrias caracteristicas morfolgicas diferentes so empregues na classificao e identificao de microorganismos:Caracteristica Forma celular Tamanho celular Morfologia da colnia Caracteristicas ultraestruturais Comportamento da estripe Cilios e flagelos Mecanismos de mobilidade Forma e localizao dos endosporos Morfologia e localizao dos esporos Incluses celulares Cor Grupos microbianos Todos os grupos principais Todos os grupos principais Todos os grupos principais Todos os grupos principais Bactrias, alguns fungos Todos os grupos principais Bactrias, espiroquetas Bactrias que formam endosporos Bactrias, algas, fungos Todos os grupos principais Todos os grupos principais

Apesar do microscpio optico ter vindo a ser uma ferramenta bastante importante, o seu limite de resoluo de cerca de 0,2 m, o que reduz a sua utilidade na observao de microorganismos e estruturas mais pequenas. Este problema foi ultrapassado com o uso de microscpios electrnicos de transmisso e corrimento, que apresentam maior resoluo. Caracteristicas fisiolgicas e metablicas so bastante teis porque esto directamente relacionadas com a natureza e actividade das enzimas e proteinas transportadoras microbianas. Como as proteinas so produtos de genes, a anlise destas caracteristicas fornece uma comparao indirecta do genoma microbiano. As principai caracteristicas fisiolgicas e metablicas usadas na identificao e classificao so: Fontes de carbono e de azoto; Constituintes da parede celular; Fontes de energia; Tipo nutricional geral; Temperatura ptima de crescimento; Luminescncia; Mecanismos de converso de energia; Mobilidade; Tolerncia osmtica; Relaes de oxignio; pH ptimo de crescimento; pigmentos fotossintticos; Requerimento e tolerncia salina; Metabolitos secundrios formados; Sensibilidade a inibidores metablicos e a antibiticos; Incluses de armazenamento.

Vrias propriedades so ecolgicas na natureza visto que afectam a relao dos microorganismos com o seu ambiente. Por vezes, so taxonomicamente valiosas porque mesmo microorganismos bastante relacionados podem diferir consideravelmente no que diz respeito a caracteristicas ecolgicas. Alguns exemplos de de propriedades ecolgicas taxonomicamente importantes so: Padres de ciclo de vida; Natureza de relao simbitica;29


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Habilidade de causar doena num hospedeiro particular; Preferncias de habitat, como requerimentos de temperatura, pH, oxignio e concentrao osmtica.

Anlise Gentica Como a maior parte dos eucariotas so capazes de se reproduzir sexualmente, a anlise gentica tem sido consideravelmente util na classificao destes organismos. Como j mencionado, as espcies so definidas em termos de possibilidade de reproduo sexuada. Apesar dos procariotas no se reproduzirem sexuadamente, o estudo da troca de genes cromossmicos atravs de transformao e conjugao por vezes util na sua classificao: A transformao pode ocorrer entre diferentes espcies procarioticas mas raramente entre gneros. A demonstrao da tranformao entre duas estirpes fornece evidncia de uma relao proxima visto que esta no pode ocorrer a no ser que os genomas seja minimamente semelhantes. Apesar da transformao ser util, os seus resultados por vezes so dificeis de interpretar porque uma ausncia de transformao pode resultar de outros factores. Estudos de conjugao tambm fornecem dados taxonomicamente uteis, particularmente com as bactrias entricas. Por exemplo, Escherichia pode sofrer conjugao com o gnero Salmonella e Shigella mas no com Proteus e Enterobacter. Estas observaes encaixam com outros dados mostrando queos primeiros trs detes gnero esto mais relacionados entre eles do que com Proteus e Enterobacter.

Os plasmideos so sem duvida importantes em taxonomia porque esto presentes na maior parte dos generos bacterianos, e podem conter genes que codificam trao fenotipicos: Como os plasmideos podem ter efeitos significantes na classificao se carregarem o gene para um trao de grande importncia no esquema de classificao, melhor basear a classificao em vrias caracteristicas; Quando a identificao de um grupo baseada em poucas caracteristicas e algumas so codificadas por genes dos plasmideos, podem resultar erros; Por exemplo, a produo de sulfeto de hidrognio e a fermentao da lactose so bastante importantes na taxonomia de bactrias entricas, no entanto, genes para as duas caracteristicas podem advir de plasmideos ou do cromossoma bacteriano.

Caracteristicas Moleculares Algumas das abordagens mais poderosas na taxonomia so feitas atravs do estudo de proteinas e cidos nucleicos. Comos estes so tanto produtos directos de genes ou mesmo os genes em si, a comparao de proteinas e cidos nucleicos fornece informao consideravel acerca da relao verdadeira. Comparao de Proteinas As sequncias de aminocidos das proteinas reflectem directamente as sequncias de mRNA e, assim, relacionadas com as estruturas dos genes que as codificam. Assim, a comparao de proteinas de diferentes microorganismos bastante util taxonomicamente. Existem vrios modos de comparar proteinas:


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1. A abordagem mais directa determinar a sequncia de aminocidos de proteinas com a mesma funo. As sequncias de proteinas com funes dissimilares normalmente alteram a velocidade diferentes, algumas seuncias alteram muito rapidamente enquanto outras so mais estveis. Todavia, se as sequncias de proteinas com a mesma funo forem semelhantes, os organismos que as possuem so provavelmente relacionados: As sequncias de citocromos e outras proteinas tranportadoras de electres, histonas, heat-shock proteins, proteinas de transcrio e traduo e uma variedade de enzimas metabolicas so usadas em estudos taxonomicos; 2. Como a sequenciao de proteinas lenta e dispendiosa, outros mtodos indirectos de comparao de proteinas so frequentemente empregues: A mobilidade electrofortica de proteinas util no estudo de relaes ao nivel das espcies e subespcies; Anticorpos so capazes de discriminar entre proteinas muito semelhantes; Tcnicas imunolgicas so usadas para comparar proteinas de diferentes microorganismos. 3. As propriedades fisicas, cinticas e regulatrias das enzimas tm sido empregues em estudos taxonmicos. como o comportamento enzimtico reflecte a sequncia de aminocidos, esta abordagem util no estudo de alguns grupos microbianos, e padres de regulao especificos de grupos foram j encontrados. Composio Bsica de cidos Nucleicos Os genomas microbianos podem ser directamente comparados e semelhanas taxonomicas podem ser estimadas de vrias formas. A tcnica mais simples a determinao da composio bsica do DNA: O DNA contem quatro bases purinas e pirimidinas: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T); No DNA em cadeia dupla, A emparelha com T e G emparelha com C; Assim, a razo (G+C)/(A+T) ou conteudo G+C, a percentagem de G+C no DNA reflecte a sequncia base e varia com alteraes na sequncia.

A composio base do DNA pode ser determinada de vrios modos. Apesar do conteudo G+C poder ser alcanado depois de hidrlise do DNA e anlise das suas bases com HPLC, mtodos fisicos so mais fceis e mais usados. O conteudo G+C normalmente determinado apartir da melting temperature (Tm) do DNA: No DNA de cadeia dupla, trs pontes de hidrognio juntam pares de bases GC, e duas ligaes ligam AT; Como resultado, DNA com maior conteudo de G+C ter maior numero de pontes de hidrognio e as suas cadeias sero separadas a temperaturas mais altas, isto , ter maior Tm; Este processo pode ser seguido espectrofotometricamente porque a absrovncia de luz UV a 260 nm pelo DNA aumenta durante a separao;31


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Quando uma amostra de DNA lentamente aqucida, a abosrvncia aumenta enquanto as ligaes de hidrognio so quebradas e atinge um plateau quando todo o DNA se torna numa nica cadeia; O ponto central da curva crescente fornece a Tm, uma medida directa do conteudo G+C.

Por outro lado, dado que a densidade do DNA tambm aumenta linearmente com o conteudo G+C, a percentagem de G+C pode ser obtida por centrifugao do DNA num gradiente de densidade de CsCL. O conteudo G+C de vrios microorganismos foi j determinado. O conteudo em G+C do DNA dos animais e das plantas superiores est entre 30 e 50%, enquanto o DNA dos microorganismos procarioticos e eucarioticos varia bastante no que diz respeito ao conteudo de G+C: O conteudo em G+C procariotico o mais varivel, variando entre 25 e 80%; Apesar desta variao, o conteudo em G+C das estirpes numa espcie particular constante; Se dois organismos diferirem no conteudo em G+C em mais de cerca de 10%, os seus genomas apresentam sequncias consideravelmente diferentes; Por outro lado, no seguro assumir que organismos com conteudo G+C bastante semelhantes tambm apresentam sequencias de bases de DNA semelhantes pois duas sequncias de bases bastante diferentes podem ser construidas a partir das mesmas propores de AT e GC; Apenas se dois microorganismos forem semelhantes filogeneticamente que o seu conteudo G+C sugere uma relao.

Os dados do conteudo de G+C so taxonomicamente valiosos pelo menos de dois modos: 1. Podem confirmar o esquema taxonomico desenvolvido usando outros dados. Se organismos no mesmo txon so demasiado diferentes em conteudo G+C, provavelmente esse txon deve ser dividido; 2. O conteudo G+C parece ser util na caracterizao de gneros procarioticos visto que a variao dentro de um gnero normalmente inferior a 10% enquanto a diferena entre gneros bastante superior. Hibridao de cidos Nucleicos A semelhana entre genomas pode ser comparada mais directamente pelo o uso dos estudos de hibridizao de cidos nucleicos: Se uma mistura de DNA de cadeia simples formada pelo aqucimento de DNA de cadeia dupla arrefecida e mantida a temperaturas inferiores a Tm em cerca de 25 C, sequncias com sequncias de bases complementares reassociam-se para formar molculas de DNA de cadeia dupla estveis, enquanto cadeias no complementares mantm simples; Como cadeias com sequncias semelhantes, mas no idnticas, se associam para formar hibridos de DNA de cadeia duplas menos estveis, a incubao da mistura a cerca de 30 a 50 C inferior a Tm permitir a formao de hibridos mais diversos;32


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A incubao a cerca de 10 a 15 C abaixo da Tm permite a formao de hibridos apenas com cadeias quase idnticas.

Numa das tcnicas de hibridizao mais usadas, filtros de nitrocelulose com cadeias de DNA no radioactivas ligadas so incubadas a temperatura adequada com fragmentos de DNA marcados radioactivamente. Depois dos fragmentos radioactivos hibridizarem com o DNA de cadeia simples ligado membrana, esta lavada para remover DNA no hibridizado e a radioactividade medida: A quantidade de radioactividade ligada ao filtro reflecte a quantidade de hibridao e, assim, a semelhana entre sequncias de DNA.

O grau de homolgia expresso em percentagem de radioactividade experimenatl retida no filtro comparada com a percentagem da reactividade do DNA homologo sobre condies semelhantes: Duas estirpes cujos DNA mostram pelo menos 10% de relao em condies optimas de hibridao e menos de 5% de diferena na Tm so consideradas membros da mesma espcie.

Se molculas de DNA so muito diferentes em sequncia, no formaro um hibrido estvel e detectvel. Assim, a hibridizao de DNA-DNA usada apenas para o estudo de microorganismos relacionados. Microorganismos relacionados mais distantemente so comparados por hibridizao DNA-RNA, usando RNA ribossomal ou de transferncia radioactivo: Relaes distantes podem ser detectadas porque genes de rRNA e tRNA representam apenas uma pequena proporo do DNA total do genoma e no evoluiram to rapidamente como outros genes microbianos; A tcnica semelhante empregue para a hibridizao DNA-DNA; DNA ligado a uma membrana incubado com rRNA radioactivo, incubado e contado.

Sequenciao de cidos Nucleicos Apesar da utilidade da determinao do conteudo G+C e dos estudos de hibridizao de cidos nucleicos, estruturas genomicas podem ser directamente comparadas apenas por sequenciao de DNA e RNA: dada maior ateno s sequncias de rRNAs de 5S e 16S isolados de subunidades 50S e 30S, respectivamente, de ribossomas procariotas;


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Os rRNAs so quase ideias para estudos da evoluo microbiana e de relao visto serem essenciais para organelos criticos encontrados em todos os microorganismos. O seu papel funcional o mesmo em todos os ribossomas; As suas estruturas alteram muito lentamente ao longo do tempo, presumivelmente devido ao seu papel constante e critico; Como rRNA contem sequencias variveis e estveis, tanto microorganismos relacionados distantemente ou proximamente podem ser comparados; Isto constitui uma vantagem importante pois organismos distantemente relacionados podem ser estudados usando apenas sequncias que alteram ligeiramente ao longo do tempo.


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ESTRUTURA, CRESCIMENTO E NUTRIO MICROBIANAESTRUTURA DAS BACTRIAS

Membrana Celular ProcariticaAs membranas so um requerimento absoluto para todos os organismos vivos. As clulas devem interagir de um modo selectivo com o seu ambiente, independentemente deste ser um ambiente interno de um organismo multicelular ou um ambiente externo menos protegido e mais varivel. As clulas no devem apenas ser capaz de adquirir nutrientes e eliminar desperdicios, mas tambm tm de manter o seu interior num estado constante, altamente organizado, quando existem alteraes externas. Assim: Membrana plasmtica engloba o citoplasma das clulas eucariticas e procariticas. Esta membrana o principal ponto de contacto com o ambiente da clula e, assim, responsvel pelas relaes com o exterior.

As membranas contm tanto lipidos com proteinas, apesar das propores exactas variarem amplamente. A membrana plasmtica bacteriana normalmente apresenta uma maior proporo de proteinas que as membranas eucariticas, possivelmente porque apresentam tantas e variadas funes, que nos eucariotas esto localizadas nas membranas dos organelos. A maior parte dos lipidos associados a membranas so estruturalmente assimtricos com terminaes polares e apolares (anfipticos): As terminaes polares interagem com gua e so hidrofilicas; As terminaes apolares hidrofbicas so insoluveis em gua e tendem a se associar entre si.

Esta propriedade dos lipidos permite que estes formem bicamadas nas membranas, sendo que as superficies externas so hidrofilicas enquanto as terminaes hidrofbicas so ocultadas no interior longe da gua vizinha. Para alm disso, a maior parte destes lipidos anfipticos so fosfolipidos, sendo os mais abudantes nas bactrias, por ordem decrescente: Fosfatidil-etanolamina; Fosfatidil-glicerol; Fosfatidil-serina; Cardiolipina.

No entanto, a membrana bacteriana no apresenta fosfatidil-colina nem esfingomielina, que so encontradas nas membrana eucariotas.


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As membranas bacterianas normalmente diferem das membranas eucarioticas por no apresentarem esterides como colesterol. Contudo, vrias membranas bacterianas contm molculas pentaciclicas semelhantes com esterides designadas hepanides e grandes quantidades destas molculas esto presentes no nosso ecossistema: Sintetizados a partir dos mesmo precursores dos esterides; Como os esterides nos eucariotas, provavelmente estabilizam a membrana bacteriana.

Quando dividimos a bicamada lipidica, observam-se espaos entre os lipidos, o que corresponde a estaos ocupados po proteinas membranares. O modelo mais aceite para a existncia desta estrutura membranar o modelo do mosaico fluido de S. Jonathan Singer e Garth Nicholson, distinguindo dois tipos de proteinas embebidas na membrana: Proteinas perifricas fracamente ligadas membrana e facilmente removiveis. So soluveis em solues aquosas e compoem cerca de 20-30% do total proteico membranar; Proteinas integrais constituem cerca de 70-80% do total proteico membranar e no so facilmente removiveis da membrana nem soluveis em solues aquosas.

As proteinas integrais, como os lipidos membranares, so anfipticas, sendo que as suas regies hidrofbicas so revistidas por lipidos enquanto as pores hidrofilicas se projectam na superficie membranar. Algumas destas proteinas ainda atravessam toda a membrana. As proteinas integrais so capazes de de difundirem lateralmente para novas localizaes, mas no fazem flip-flop nem rodam atravs da membrana. Por vezes, existem carboidratos ligados superficie externa das proteinas membranares e estes apresentam funes bastante importantes. Assim, a organizao geral da membrana bacteriana a seguinte:


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Deste modo, a membrana celular um sistema altamente organizado e assimtrico, que tambm flxivel e dinmico. Apesar das membranas aparentemente apresentarem um design bsico comum, existem vrias variaes tanto nas suas capacidade estruturais e funcionais. Estas diferenas so to grandes e caracteristicas que a quimica membranar pode ser usada na identificao bacteriana. Devido no existncia de organelos intracelulares, a membrana plasmticas das clulas procariticas tem de ser capaz de exercer variadas funes com sucesso, entre elas: Retem o citoplasma, particularmente em clulas sem parede celular, e separa-o do exterior; Serve como barreira permevel selectiva, permitindo que ies e molculas particulares passem, tanto para dentro como para fora da clula, e prevenindo o movimento de outras. Assim, previne a perda de componentes essenciais e permite o movimento de outros; Como vrias substncias no so capazes de atravessar a membrana plasmtica sem assistncia, a membrana paresenta transportadores que ajudam este movimento. Estes sistemas de transporte podem ser usados para uptake de nutrientes, excreo de desperdicios e secreo proteica; o local de vrios processos metablicos cruciais, como respirao, fotossintes, sintese de lipidos e de constituintes da parede celular, e provavelmente de segregao cromossmica, participando na diviso; Contem receptores especiais que ajudam os procariotas a detectar e responder a quimicos nas suas vizinhanas.

As principais funes da membrana bacteriana e componentes que proporcionam essas funes podem ser resumidas no seguinte quadro:Funo Permeabilidade selectiva Respirao Transporte de nutrientes Secreo Locomoo (quimiotaxia) Diviso Sintese de parede celular Componente Barreira fisica, sistemas de tranporte Cadeia respiratria, ATPase Sistemas de simporte e antiporte Sistemas de secreo I-IV Motor do flgelo, sensores Ligao do cromossoma FBP, bactoprenol

Assim claro que a membrana plasmtica essencial para a sobrevivncia dos microorganismos. Membranas e Lipidos das Archaeabacteria Os membros das Archaeabacteria so extremfilos e, assim, as membranas das Archaebacteria so uma carateristica importante destas bactrias. A membrana plasmtica destas bactrias difere das membranas bacterianas e eucarioticas gerais por apresentarem uma monocamada com molculas lipidicas a atravessar toda a membrana e por apresentarem cadeias de hidrocarbonetos ramificadas ligadas a glicerol por ligaes ter em vez de cidos gordos ligados por ligaes steres: Por vezes, dois grupos glicerol ligam-se para formar uma molcula tetrater extremamente longa; Normalmente, as cadeias laterias diter apresentam 20 carbonos, e as cadeias tetrater apresentam 40; As clulas so capazes de ajustar o comprimento geral dos tetraters ciclizando as cadeias para formar aneis pentaciclicos, e cadeias bifitanil podem conter um a quatro aneis ciclopentilo.37


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No entanto, lipidos polares esto tambm presentes nas membranas das Archaeacateria: Fosfolipidos; Sulfolipidos; Glicolipidos.

Mas cerca de 7 a 30% dos lipidos membranares so apolares, e derivam normalmente do esqualeno. Estes lipidos podem ser combinados de vrios modos para originar membranas com rigidez e espessura diferente: a) Dieteres C20 podem ser usados para formar membranas de bicamada regulares; b) Tetraeteres C40 podem ser usados para formar membranas de monocamada mais rigidas.

Como claro, as membranas das Archaeabacteria podem conter uma mistura de diteres, tetraeteres e outros lipidos. Como ser esperado da sua necessidade de estabilidade, a membrana de termfilos extremos como Thermoplasma e Sulfolobus so quase competamente compostas por monocamadas tetraeter.Joana Maria Soares Pereira 38

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Sistemas Membranares Internos Apesar do citoplasma procaritico no conter organelos membranosos complexos como mitocndrias ou cloroplastos, estruturas membranosas de vrios tipos podem, no entanto, ser observadas. Uma estrutura geralmente observada o mesossoma. Os mesossomas so invaginaes da membrana plasmtica em forma de vesiculas, tubulos ou lamelas. So tanto observadas em bactrias grampositivas como gram-negativas, apesar de serem mais comuns nas primeiras: So normalmente encontrados perto das paredes celulares que se formam na clula em diviso e por vezes parecem ligados ao cromossoma bacteriano; Podem estar envolvidos na formao da parede celular durante a diviso ou podem ter um papel importante na replicao e distribuio do cromossoma das clulas filhas; No entanto, acredita-se agora que os mesossomas so artefactos gerados durante a fixao quimica das bactrias por microscopia electrnica. Assim, representam possivelmente partes da membrana plasmtica que so quimicamente diferentes e mais atingidas pelos fixadores.

Ainda, vrias bactrias apresentam sistemas membranres internos diferentes dos mesossomas: Invaginaes das membranas plasmticas podem tornar-se extensivas e complexas em bactrias fotossintticas como as cianobactrias e as bactrias purpura ou em bactrias com um actividade respiratria bastante elevada como as bactrias nitrificantes; Podem ser agregados de vesiculas esfricas, vesiculas espalmadas ou membranas tubulares; A principal funo destes sitemas poder ser fornecer uma superficie membranar maior para uma actividade metablica melhorada.


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Parede Celular ProcariticaA parede celular a camada, normalmente rigida, que se encontra na face externa da membrana plasmtica. uma das partes mais importantes da clula procaritica e apenas mycoplasmas e algumas Archaeabatria que no a apresentam: A maior parte das bactrias apresentam paredes fortes que lhes confere forma e as protege da lise osmtica, caracteristica devida ao peptidoglicano; A parede celular de vrios patognios apresenta componentes que contribuem para a sua patogenicidade; A parede celular capaz de proteger a clula de substncias txicas e o local de aco de vrios antibiticos.

Aps Christian Gram desenvolver a colorao de Gram em 1884, tornou-se evidente que as bactrias podiam ser divididas em dois grupos principais com base na sua resposta colorao de Gram e a verdadeira diferena estrutural entre estes dois grupos tornou-se clara com o surgimento do micrscpio electrnico: Bactrias gram-positivas coram de purpura e a sua parede celular consiste numa camada unica de 20-80 nm de espessura homogenea de peptidoglicano por fora da membrana plasmtica; Bactrias gram-negativo coram de rosa ou vermelho e a sua parede celular mais complexa apresentando uma camada de peptidoglicano de 2-7 nm revestida por uma membrana externa de 7-8 nm.

Devido camada de peptidoglicano mais espessa, as paredes das clulas gram-positivo so mais fortes que as das bactrias gram-negativo. Todas as estruturas no exterior da membrana plasmtica so designadas como invlucro celular, o que inclui a parede e estruturas como a cpsula, quando presentes. Frequentemente, observado um espao entre a membrana plasmtica e a membrana externa em micrografias electrnicas de bactrias gram-negativas e, por vezes, um espao semelhante mas mais pequeno tambm observado entre a membrana plasmtica e a parede em bactrias gram-positivo, espao este designado espao periplasmtico: Evidncias recentes indicam que o espao periplasmtico preenchido por uma rede pouco densa de peptidoglicano, sendo mais possivelmente um gel do que um espao preenchido por fluido. A substncia que ocupa o espao periplasmtico o periplasma e clulas gram-positivo apresentam periplasma, mesmo no apresentando um espao periplasmtico bvio;40


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Estima-se que o tamanho do espao periplasmtico em bactrias gram-negativo varia entre 171 nm, indicando que pode constitui cerca de 20-40% no volume total da clula (cerca de 30-70 nm).

Quando as paredes celulares so destruidas cuidadosamente ou removidas sem danificar a membrana plasmtica, proteinas periplasmticas so libertadas. O espao periplasmtico de bactrias gramnegativo, contem: Vrias proteinas que participam na aquisio de nutrientes; Enzimas hidroliticas que atacam cidos nucleicos; Proteinas envolvidas no transporte de materiais para a clula; Bactrias quimolitoautotrficas e desnitrificantes normalmente apresentam proteinas transportadoras de electres; Enzimas envolvidas na sintese de peptidoglicano; Enzimas envolvidas na modificao de compostos txicos.

As bactrias gram-positivo no apresentam um espao periplasmtico visivel e na parecem apresentar tantas proteinas periplasmticas. Em vez disso, elas secretam vrias enzimas que seriam periplasmticas em bactrias gram-negativo. Tais enzimas secretadas so normalmente designadas exoenzimas. Algumas enzimas podem tambm ficar retidas no espao periplasmtico e ligadas membrana plasmtica. Assim, importante estudar a parede celular bacteriana porque: componente unico dos procariotas; alvo de mecanismos de defesa inata dos vertebrados; alvo de antibiticos; Permite distinguir gram-positivos de gram-negativos.

Paredes Celulares Gram-Positivo Normalmente, a parece celular espessa e homognea das bactrias gram-positivas principalmente composta por peptidoglicano, que normalmente contem uma ponte inter-peptidica. Contudo, as paredes celulares das clulas grampositivo tambm contm grandes quantidades de cidos teicicos, polimeros de glicerol ou ribitol ligados por grupos fosfato: Aminocidos como D-alanina ou acares como glucose esto ligados aos grupos glicerol e ribitol; Os cidos teicicos esto ligados ao peptidoglicano por uma ligao covalente com o hidroxilo 6 do cido Nacetilmurnico ou aos lipidos da membrana plasmtica. No ultimo caso designam-se cidos lipoteicicos;


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Os cidos teicicos extendem-se at superficie do peptidoglicano e, devido sua carga negativa, ajudam a fornecer parede celular gram-positiva a sua carga negativa; A funo destas molculas ainda desconhecida, mas devem ser importantes na manuteno da estrutura da parede; Os cidos teicicos no se encontram nas bactrias gram-negativo.

Paredes Celulares Gram-Negativo As paredes celulares gram-negativo so muito mais complexas que as paredes gram-positivo. A fina camada de peptidoglicano prxima da membrana plasmtica no constitui mais de 5-10% do total da parede. Por exemplo, em E. coli tem cerca de 2 nm de espessura e contem apenas uma ou duas camadas de peptidoglicano. Depois, a membrana externa encontra-se no exterior da fina camada de peptidoglicano:

A proteina membranar mais abundante a lipoproteina de Braun, uma pequena lipoproteina covalentemente ligada ao peptidoglicano que se encontra subjacente e embebida na membrana externa pela sua terminao hidrofbica, estabilizando a membrana externa. A membrana externa e o peptidoglicano esto to firmemente ligados a esta lipoproteina que podem ser isolados como uma unidade.Joana Maria Soares Pereira 42

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Outra estrutura que fortalece a parede gram-negativa e mantem a membrana externa no seu local o sitio de adeso: A membrana externa e a membrana plasmtica parecem estar em contacto directo em vrios locais da parede gram-negativa; Os sitios de adeso podem tanto ser locais de contacto directo ou possivelmente locais de fuso de membranas; Pensa-se que algumas substncias sejam capazes de se mover para dentro da clula atravs destas locais de adeso em vez de viajarem atravs do periplasma.

Os constituentes menos usuais da membrana externa so os lipopolissacarideos (LPSs). Estas grandes e complexas molculas contm lipidos e carboidratos e consistem em trs partes cuja estrutura a seguinte, com base no que se sabe sobre Salmonella: 1. Lipido A contem dois derivados acar glucosamina, cada com trs cidos gordos e fosfatos ou pirofosfatos ligados. Est encaixado na membrana externa e a restante molcula LPS projecta-se da superficie; 2. Polissacarideo central est ligado ao lipido A. Construido por 10 acares, a maior parte deles com uma estrutura no usual; 3. Cadeia lateral O ou antignio O uma cadeia polissacaridea que se extende do polissacarideo central. Tem vrios acares peculiares e varia em composio entre estirpes bacterianas. Apesar do antignio O ser reconhecido por anticorpos do hospedeiro, as bactrias gram-negativo podem contrariar as defesas do hospedeiro por alterao rpida da natureza das suas cadeias laterais O, o que impede a deteco. A interaco de anticorpow com LPS antes da parede celular ser alcanada tambm protege a parede celular de ataque directo. A importncia do LPS deve-se a vrias razes: Permite a resistncia defesa do hospedeiro devido facil alterao do antignio O; Como o polissacarideo apresenta acares e fosfatos carregados, o LPS contirbui para a carga negativa da superficie bacteriana; O lipido A um constituinte principal da membrana externa e o LPS ajuda a estabilizar esta membrana; O lipido A muito txico, assim, o LPS capaz de actuar como endotoxina e causa alguns dos sintomas que surgem nas infeces por bactrias gram-negativas.


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A funo mais importante da membrana externa servir como uma barreira protectora. Ela previne ou atrasa a entrada de sais biliares, antibiticos e outras substncias txicas que poderiam matar ou danificar as bactrias e previne a perda de constituintes como enzimas periplasmticas. Deste modo, a membrana externa mais permevel que a membrana plasmtica mas permite a passagem de pequenas molculas como glucose e outros monossacarideos. Isto deve-se presena de porinas especiais: Trs molculas de porina agrupam-se e dividem a membrana para formar um canal estreito atravs do qual molculas menores que 600-700 daltons conseguem passar; Molculas maiores como vitamina B12 devem ser transportadas atravs da membrana externa por carregadores especificos.


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Mecanismo de Colorao de Gram Apesar de vrias explicaes serem atribuidas aos resultados das reaces de colorao de Gram, parece provvel que as diferenas entre bactrias gram-negativo e gram-positivo se devem natureza fisica das suas paredes celulares: Se a parede celular for removida a bactrias gram-positivo estas tornam-se gram-negativo; O peptidoglicano por si s no colorido, em vez disso parece actuar como uma barreira que previne a perda de violeta de cristal.

Assim, a explicao do procedimento da colorao Gram o seguinte: As bactrias so primeiro coradas com violeta de cristal e depois tratadas com iodo para promover a fixao do corante; Quando bactrias gram-positivo so descoradas com etanol, o alcool contrai os poros do espesso peptidoglicano, pelo que o complexo iodo-corante retido durante o curto passo de descolorao e as bactrias mantm-se prpura; Em contraste, o peptidoglicano gram-negativo muito fino, no tanto cross-linked e apresenta poros maiores. O tratamento com alcool tambm extrai lipidos suficientes para que a parede gram-negativa aumente a sua porosidade. Assim, o alcool leva remoo do complexo violeta de cristaliodo prpura das bactrias gram-negativo.

Assim, as bactrias gram-positivo apresentam uma cor prpura enquanto as bactrias gram-negativo tm de sofrer um segundo passo de colorao no procedimento - normalmente com safranina, que confere uma cor rosa - para poderem serem visiveis:

Clostridium perfringens Gram-positivo

Escherichia coli Gram-negativo

Parede Celular lcool-cido Resistente As Mycobacterias so classificadas como bactrias gram-positivo, mas apresentam caracteristicas de organismos gram-

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