MICROPROPAGAÇÃO, EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA, …€¦ · FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA...

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE

MICROPROPAGAÇÃO, EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA,

CONSERVAÇÃO IN VITRO E DUPLICAÇÃO

CROMOSSÔMICA EM Cattleya tigrina A. RICH

THAYS SAYNARA ALVES MENEZES DE SÁ

2019

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO


PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE


MICROPROPAGAÇÃO, EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA, CONSERVAÇÃO IN

VITRO E DUPLICAÇÃO CROMOSSÔMICA EM Cattleya tigrina A. RICH

Tese apresentada à Universidade Federal de

Sergipe, como parte das exigências do Curso de

Doutorado em Agricultura e Biodiversidade,

área de concentração em Agricultura e

Biodiversidade, para obtenção do título de

“Doutora em Ciências”.

Orientadora

Profa. Dra. Maria de Fátima Arrigoni-Blank

SÃO CRISTÓVÃO

SERGIPE – BRASIL

2019

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL


Sá, Thays Saynara Alves Menezes de S111m Micropropagação, embriogênese somática, conservação in vitro

e duplicação cromossômica em Cattleya tigrina A. Richa / Thays Saynara Alves Menezes de Sá; orientadora Maria de Fátima

Arrigoni-Blank. – São Cristóvão, SE, 2019. 66 f.; il.

Tese (doutorado em Agricultura e Biodiversidade) – Universidade Federal de Sergipe, 2019.

O 1. Agricultura. 2. Orchidaceae. 3. Micropropagação. 4. Plantas

- Propagação. 5. Crescimento (plantas). 6. Citometria de fluxo. I. Arrigoni-Blank, Maria de Fátima, orient. II. Título

CDU: 631.53.03


MICROPROPAGAÇÃO, EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA, CONSERVAÇÃO IN

VITRO E DUPLICAÇÃO CROMOSSÔMICA EM Cattleya tigrina A. RICH

Tese apresentada à Universidade Federal de

Sergipe, como parte das exigências do Curso de

Doutorado em Agricultura e Biodiversidade,

área de concentração em Agricultura e

Biodiversidade, para obtenção do título de

“Doutora em Ciências”.

APROVADA em 21 de fevereiro de 2019.

Prof.ª Dr.ª Ana Catarina Lima de Oliveira

IFS

Prof.ª Dr.ª Andrea Santos da Costa

PPGAGRI

Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank

PPGAGRI

Prof. Dr. José Magno Queiroz Luz

UFU

Profa. Dra. Maria de Fátima Arrigoni-Blank

UFS

(Orientadora)

SÃO CRISTÓVÃO

SERGIPE – BRASIL

Aos meus pais Jailton e Silvana, por serem

fonte de perseverança e força, e ao meu

marido Alexandre por sempre acreditar em

mim, pelo carinho, confiança e paciência

Dedico

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por tudo que ele me proporcionou a cada dia, pela

capacidade de resolver todos os problemas e de transformar as dificuldades em lições de vida. Tudo posso naquele que me fortalece!

À Universidade Federal de Sergipe e ao Programa de Pós-Graduação em Agricultura e

Biodiversidade pela oportunidade de realização do doutorado.

À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.

Aos meus pais Jailton e Silvana, por todo incentivo, dedicação e amor, nos quais busquei

forças para que nunca desistisse dos meus ideais, agradeço, sem sequer encontrar palavras que

exprimam completamente o meu profundo sentimento de gratidão.

Ao meu irmão Thyeres, pelo carinho e amizade, que sempre me apoia, me incentiva e

me faz ver que tudo é possível com seu otimismo.

Ao meu marido Alexandre, que em todo esse período, esteve ao meu lado, com

paciência, me incentivando e me fortalecendo. Agradeço por me estimular a tornar mais esse

sonho realidade.

À Professora Dra. Maria de Fátima Arrigoni-Blank, minha orientadora, meu

agradecimento todo especial, por seu apoio, carinho, incentivo, amizade, paciência e

oportunidade desde a iniciação científica que foi essencial na formação do meu conhecimento

ao longo desses anos.

Ao Professor Dr. Arie Fitzgerald Blank, meu apreço pela contribuição com seu

conhecimento. Muito obrigada por tudo!

À minha coorientadora Dra. Andrea Santos da Costa pelos seus ensinamentos,

conhecimentos, conforto, risadas. Admiro muito a sua dedicação e seu profissionalismo, muito

obrigada por tudo!

À pesquisadora Dra. Janay de Almeida Santos-Serejo por sua disponibilidade e ajuda

nos experimentos de citometria de fluxo e por sempre está disponível para tirar minhas dúvidas.

À Dra. Rosana Barroso Feitosa Alcantara por sua amizade, irmandade, disponibilidade em

ajudar, conselhos, risadas, torcida e incentivo de sempre.

À Dra. Daniela Castro por sua amizade e ajuda primorosa nessa minha reta final.

Ao Professor Dr. Ricardo Scher e a sua equipe, pelos meses de experimento com citometria

de fluxo em seu laboratório.

Aos meus irmãos de coração Fran e Jeff que me acompanharam desde o início dessa jornada,

pela amizade e por tudo o que vocês representam em minha vida.

Ao amigo Moises Neto pelo seu apoio, incentivo, amizade e disponibilidade em ajudar.

Aos meus queridos amigos e companheiros do Laboratório de Cultura de Tecidos e

Melhoramento Vegetal pelo apoio e pelas muitas risadas que me faziam esquecer todas as

minhas angústias, em especial, Caroline Alves, Giulia Milenna, Sara Dayan, Dennis Crystian,

Jéssika Andrezza, Larissa Peixoto, Crislaine, Hanna, pelas longas tardes de conversa e por

estarem sempre dispostos a me ajudar. Foi um prazer conviver com vocês todos os dias.

Aos colegas do GPMACO, em especial, Fabiane, José Carlos, Luís Fernando, Katily

Luize, Vanderson Santos.

Ao secretário do PPGAGRI, Lucas, por toda atenção concedida.

A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse

trabalho, a minha eterna gratidão a vocês.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... i

LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... ii

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS ............................................... iii

RESUMO ......................................................................................................................... iv

ABSTRACT .................................................................................................................... v

1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 3

2.1 Orchidaceae................................................................................................................. 3

2.1.1 Gênero Cattleya........................................................................................................ 4

2.2. Cultivo in vitro............................................................................................................ 5

2.2.1. Embriogênese Somática........................................................................................... 5

2.2.2. Conservação in vitro................................................................................................ 7

2.3. Duplicação Cromossômica......................................................................................... 8

2.3.1 Endorreduplicação cromossômica em Orchidaceae................................................. 9

2.3.2. Substâncias antimitóticas......................................................................................... 10

2.3.3. Confirmação de poliploidia..................................................................................... 11

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... .. 13

4. ARTIGO 1: EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA DIRETA EM Cattleya tigrina A. RICH. 25

Resumo ......................................................................................................................... 25

Abstract ........................................................................................................................ 26

4.1. Introdução ............................................................................................................. 26

4.2. Material e Métodos ............................................................................................... 27

4.3. Resultados e Discussão ........................................................................................ 28

4.4. Referências Bibliográficas ................................................................................... 30

Figuras ........................................................................................................................ 33

Tabelas ........................................................................................................................ 34

5. ARTIGO 2: MICROPROPAGAÇÃO E CONSERVAÇÃO IN VITRO DE Cattleya

tigrina ........................................................................................................................... 35

Resumo ......................................................................................................................... 35

Abstract ........................................................................................................................ 36

5.1. Introdução ............................................................................................................. 36


5.3. Resultados e Discussão ......................................................................................... 38


6. ARTIGO 3: DUPLICAÇÃO CROMOSSÔMICA EM Cattleya tigrina A. RICH ...... 47

Resumo ......................................................................................................................... 47

Abstract ........................................................................................................................ 48

6.1. Introdução ............................................................................................................. 48


6.3. Resultados e Discussão ........................................................................................ 51


Tabelas ......................................................................................................................... 57

Figuras ......................................................................................................................... 59

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 61

ANEXOS ......................................................................................................................... 62

i

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Atlas remanescentes florestais de Mata Atlântica 2011-2012 e áreas de

amostragem ....................................................................................................... 5

ARTIGO 1

Figura Página

1 Iniciação de embriões somáticos diretos de explantes foliares de C. tigrina.

Embriões somáticos formados a partir da região foliar basal aos dez dias após

imersão em meio de cultura MS suplementado com 0,3 mg l-1 de 2,4-D (A),

protrusão de embriões somáticos diretos na região basal foliar (B),

diferenciação de embriões em estágio cordiforme (C), em forma de torpedo

(D), embriões na fase cotiledonar (E), mudas originadas de embriões

explantes foliares (F). ..................................................................................... 33

2 Evidência histológica da embriogênese somática direta no explante foliar de

C. tigrina. Formação de embriões globulares (glob) e fase torpedo (torp)

(seta) (A), embrião em estágio cordiforme (seta) (B), embrião somático com

cotilédone diferenciado (seta) (C), germinação direta de embrião somático

(D).…………………………………………………………………………... 33

3 Plantas de C. tigrina originadas de embriões somáticos durante o

enraizamento e aclimatização em 60 dias ...................................................... 34

ARTIGO 2

Figura Página

1 Plântulas de C. tigrina aos 730 dias de conservação in vitro em função das

diferentes concentrações de meio MS e temperatura à 25ºC (A) e

reguladores osmóticos e temperatura à 25ºC (B)........................................... 43

ARTIGO 3

Figura Página

1 Histogramas de citometria de fluxo de plantas de C. tigrina tratadas com

colchicina usando Citrus sunki como padrão interno de referência. A)

Controle; B) Tratamento com orizalina; C) Tratamento com colchicina 2,5

mM durante 24 horas... ................................................................................... 59

2 Análise estomática de uma planta controle (A e B) e com cromossomos

duplicados (C e D) de C. tigrina ..................................................................... 60

ii

LISTA DE TABELAS

ARTIGO 1

Tabela Página

1 Indução da embriogênese somática em folhas de Cattleya tigrina em função

de diferentes concentrações de 2,4-D. ............................................................ 34

2 Sobrevivência, altura de planta (cm) e comprimento de raiz (cm) de mudas de

Cattleya tigrina em função de diferentes misturas de substrato ..................... 34

ARTIGO 2

Tabela Página

1 Sobrevivência (%), presença de raiz (%) e número de brotos por plantas de C.

tigrina aos 90 dias de cultivo in vitro em função de volume do meio MS

líquido estacionário e semissólido .................................................................. 39

2 Sobrevivência (%), altura da planta (cm), número de brotos e comprimento da

raiz (cm) de C. tigrina em meio líquido em função de diferentes misturas de

substrato .......................................................................................................... 40

3 Sobrevivência (%), integridade das plantas (notas 1 a 5**), presença de raiz

(%) e altura (notas 1 a 4***) de C. tigrina aos 730 dias de conservação in vitro

em função das diferentes concentrações de meio MS e temperatura ............. 41

4 Sobrevivência (%),integridade das plantas (notas 1 a 5**), presença de raiz

(%) e altura de planta (notas 1 a 4***) de C. tigrina aos 730 dias de

conservação in vitro em função de reguladores osmóticos e temperatura ...... 42

ARTIGO 3

Tabela Página

1 Análise da citometria de fluxo de C. tigrina submetida ao tratamento com

colchicina...........................................................................................................

57

2 Índice de DNA (ID) de C. tigrina submetida ao tratamento com colchicina e

analisadas em citômetro de fluxo.......................................................................

57

3 Análise da citometria de fluxo de C. tigrina submetida a tratamento com

orizalina .......................................................................................................... ..

57

4 Densidade, funcionalidade e índice estomático nas folhas de plantas com

cromossomos duplicados e não duplicados de C. tigrina.............................

58

iii

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS

MMA - Ministério do Meio Ambiente

SMA - Secretaria do Meio Ambiente

APG III - Grupo de Filogenia das Angiospermas

2,4-D - ácido 2,4-diclorofenoxiacético

TDZ - thidiazuron

BAG - Bancos Ativos de Germoplasma

ANA - Ácido naftalenoacético

MS - Murashige e Skoog

DFFF - densidade de fluxo de fótons fotossintéticos

FAA - formaldeído: ácido acético: álcool etílico

pg- pictogramas

bp - pares de bases

iv

RESUMO

MENEZES-SÁ, Thays Saynara Alves. Micropropagação, embriogênese somática,

conservação in vitro e duplicação cromossômica em Cattleya tigrina A. Rich. São Cristóvão:

UFS, 2019. 74p. (Tese – Doutorado em Agricultura e Biodiversidade)*.

Cattleya tigrina A. Rich. da família Orchidaceae é endêmica do Brasil com distribuição nas

regiões Nordeste, Sudeste e Sul. Devido a sua exuberância, essa espécie encontra-se ameaçada

de extinção, em virtude da devastação das matas ou por grande atividade extrativista,

desempenhadas por colecionadores e comerciantes. Objetivou-se com o presente estudo

desenvolver tecnologias para a micropropagação, embriogênese somática, conservação in vitro

e duplicação cromossômica em C. tigrina. Para o estabelecimento in vitro, frutos maduros

foram coletados, as cápsulas foram abertas e as sementes foram isoladas e inoculadas em meio

de cultura MS, com metade dos macronutrientes, suplementadas com 30 g l-1 de sacarose, 7 g

l-1 de ágar e 1 g l-1 carvão ativado. Para a multiplicação in vitro, o delineamento experimental

utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4x2, sendo quatro volumes de

meio (10, 15, 20 e 25 mL) e duas consistências do meio de cultutra (líquido estacionário e

semissólido). Para a aclimatização, foram testados os substratos contendo casca de pinus,

carvão vegetal, vermiculita e pó de coco, suplementado com 1 g.L-1 de calcário. Na

embriogênese somática explantes de folhas jovens foram inseridos no meio de cultura MS

suplementados com diferentes concentrações de 2,4-D. Embriões somáticos de diferentes

estádios de desenvolvimento foram utilizados para estudos histológicos. Nos experimentos de

conservação in vitro, sob crescimento lento, foram testadas diferentes concentrações de sais do

meio MS e reguladores osmóticos [sacarose; sacarose:manitol; sacarose:sorbitol com duas

temperaturas (18 e 25°C). Na indução de poliploidia os explantes foram tratados com

colchicina, nas concentrações de 0, 2,5; 7,5 e 12,5 mM, por 24 e 48 horas, e com orizalina, nas

concentrações de 0, 10, 30 e 50 μM, por 3 e 6 dias. A confirmação da ploidia foi realizada

através da citometria de fluxo e análise estomática. Os resultados alcançados possibilitaram

inferir que, para a multiplicação in vitro das plantas, os meios de cultura líquido estacionário e

semissólido podem ser utilizados, sendo 10 mL para o meio líquido estacionário e 25 mL do

meio semissólido. A aclimatização pode ser realizada utilizando somente a casca de pinus. O

meio MS suplementado com 2,4-D (0,3 mg.L-1) induziu a embriogênese somática direta.

Análises histológicas indicaram que os embriões somáticos se originaram de células da camada

epidérmica da folha. A espécie pode ser conservada sob regime de crescimento lento por um

período de 730 dias, utilizando meio de cultura com 25% dos sais de MS e temperatura de 18ºC

ou 25ºC. Já para o experimento com reguladores osmóticos pode-se conservar com 20 g.L-1 de

sacarose à 25ºC. Na indução de poliploidia, todas as soluções e tempos de imersão de colchicina

foram efetivos, obtendo maior número de indivíduos poliploides, confirmados pela citometria

de fluxo e análise estomática. Orizalina não induziu a duplicação cromossômica nas

concentrações testadas.

Palavras-chave: multiplicação in vitro, análise estomática, 2,4-D, crescimento lento,

poliploidia, citometria de fluxo.

___________________

* Comitê Orientador: Maria de Fátima Arrigoni Blank – UFS (Orientador), Andréa Santos da Costa – UFS.

v

ABSTRACT

MENEZES-SÁ, Thays Saynara Alves. Micropropagation, Somatic Embryogenesis, in vitro

Conservation, and Chromosome Doubling in Cattleya tigrina A. Rich. São Cristóvão: UFS,

2019. 74p. (Thesis - Doctor of Science in Agriculture and Biodiversity)*

Cattleya tigrina A. Rich., of the family Orchidaceae, is endemic in Brazil, with its distribution

in the Northeast, in the Southeast and in the Southern regions. Due to its exuberance, this

species is threatened with extinction, due to the devastation of the forests and by great extractive

activities that are carried out by collectors and merchants. The objective of this study was to

develop technologies for micropropagation, somatic embryogenesis, in vitro conservation, and

chromosome duplication for the C. tigrina orchid. For the in vitro establishment, ripe fruits

were collected. The capsules were opened and the seeds were isolated and inoculated in an MS

culture medium, with half of the macronutrients supplemented with 30 g L-1 sucrose, 7 g L-1

agar, and 1 g L-1 activated carbon. For the in vitro multiplication, the experimental design was

completely randomized in a 4x2 factorial scheme, with four volumes of the medium (10, 15, 20

and 25 mL) and with two different consistencies of the culture medium (steady and semisolid

liquid). For the acclimatization, the substrates containing pine bark, charcoal, vermiculite, and

coconut powder, were supplemented with 1 g.L-1 of limestone and were tested. In the somatic

embryogenesis process, the young leaf explants were inserted into the MS culture medium that

was supplemented with different concentrations of 2,4-D. Somatic embryos at different stages

of the development were used for the histological studies. In the in vitro conservation

experiments, when under slow growth, with different concentrations of the MS salts and the

osmotic regulators, were tested (sucrose; sucrose: mannitol; sucrose: sorbitol) at two

temperatures (18°C and 25°C). For the induction of polyploidy, the explants were treated with

colchicine at concentrations of 0, 2.5, 7.5, and 12.5 mM for 24 and 48 hours, together with

oryzalin at concentrations of 0, 10, 30, and 50 μM for 3 and 6 days. The confirmation of ploidy

was performed by flow cytometry and stomatal analysis. The results obtained allowed for the

researchers to infer that for the in vitro multiplication of the plants, the liquid culture media was

stationary and that the semi-solids could be used at 10 mL for the liquid medium and at 25 mL

for the semisolid medium. Acclimatization was performed by only using the pinus bark. The

MS medium that was supplemented with 2,4-D (0,3 mg.L-1) induced the direct somatic

embryogenesis. The histological analyses indicated that the somatic embryos originated from

the cells of the epidermal layers of the leaf. The species can be conserved under a slow growth

regime for a period of 730 days, by using a culture medium with 25% of the MS salts and at

temperatures of 18°C or 25°C. For the osmotic regulator experiment, 20 g.L-1 of sucrose was

stored at 25ºC. At the induction of polyploidy, all of the colchicine solutions and the immersion

times were effective. These procedures obtained a greater number of polyploid individuals that

were confirmed by flow cytometry and stomatal analysis. Oryzalin did not induce chromosome

duplications at the concentrations tested.

Keywords: in vitro multiplication, stomatal analysis, 2,4-D, slow growth, polyploidy, flow

cytometry

___________________

* Supervising Committee: Maria de Fátima Arrigoni Blank – UFS (Advisor), Andréa Santos da Costa – UFS.

1

1. INTRODUÇÃO GERAL

A família Orchidaceae é uma das maiores famílias de plantas existentes, possuindo

elevado número de espécies e presente em todos os continentes, com exceção dos desertos e da

Antártida, tendo predominância na região tropical (RECH et al., 2011). Devido à beleza e

exuberância de suas flores, as orquídeas destacam-se como importante planta ornamental, de

interesse econômico e botânico, apresentando também importância para indústria medicinal,

cosmética e alimentícia (GALDIANO-JUNIOR et al., 2012).

A Cattleya, gênero pertencente à família citada, é conhecida como “rainha das

orquídeas”, figurando entre os gêneros preferidos dos colecionadores, orquidófilos e

decoradores, bem como de extrativistas (SOARES et al., 2011; FERREIRA et al., 2012), o que

faz de algumas espécies do gênero, entre elas C. tigrina, integrantes da lista de vulneráveis à

extinção, de acordo com a Resolução da Secretaria do Meio Ambiente (Resolução SMA

48/2004). A situação da espécie é preocupante pois, além da ameaça causada pelo extrativismo,

existe grande fragmentação do habitat natural, a Mata Atlântica (CNCFLORA- LISTA

VERMELHA, 2013), acentuando assim, a perda acelerada do material genético de populações

nativas e consequentemente da sua variabilidade genética.

Tendo em vista o interesse econômico e ecológico dessa espécie, associada à

vulnerabilidade e o número reduzido de plantas produzidas pela propagação natural, torna-se

fundamental estudos que objetivem à propagação e conservação dessa espécie. Com isso, a

elaboração de métodos alternativos para o cultivo de orquídeas é considerada uma importante

estratégia para conservação destas espécies, uma vez que é possível obter uma maior produção

de plantas para o mercado evitando a retirada de indivíduos da natureza (TAMAKI et al., 2011).

Dentro dessas alternativas, a cultura de tecidos aparece como uma ferramenta de êxito

da biotecnologia, que possibilita o estabelecimento de protocolos de multiplicação in vitro,

proporcionando a obtenção de plantas livres de patógenos, e em larga escala, eliminando o

extrativismo, além de permitir a conservação de germoplasma (CARVALHO, 2013).

Uma das técnicas da cultura de tecidos é a micropropagação, que apresenta importância

nas áreas de florestal, horticultura e ornamental. Essa técnica propicia vantagens como a

aquisição de maior número de plantas em curto tempo, com qualidade fitossanitária em espaço

reduzido produzindo mudas homogêneas (CARVALHO, 2013; SANTOS-SEREJO, 2013;

VILLA et al., 2014).

A obtenção de plantas na micropropagação pode ser realizada também através da

embriogênese somática, essa técnica consiste na regeneração de plantas a partir do cultivo in

vitro, no qual células somáticas ou haploides desenvolvem-se a partir de estruturas vegetativas

por meio de diferentes estádios embriogênicos, formando estruturas semelhantes a embriões

zigóticos, sem fusão de gametas (CASTRO et al., 2010; LEE et al., 2013). Poucos são os

protocolos de embriogênese somática desenvolvidos para o gênero Cattleya, por isso a

necessidade da realização de novos estudos.

Uma outra técnica da cultura de tecidos é a conservação in vitro, a qual constitui uma

aliada em programas de melhoramento e conservação de muitas espécies vegetais, podendo ser

realizada através do método da criopreservação ou do crescimento lento. Embora a técnica para

a conservação de germoplasma vegetal em longo prazo seja a criopreservação, a técnica de

crescimento lento é importante por permitir a conservação de material de fácil regeneração. O

método de crescimento lento consiste em reduzir o metabolismo da planta, aumentando ao

máximo os intervalos de subcultivos ou estendendo-o, sem afetar a viabilidade das plantas

(MARCO-MEDINA; CASAS, 2012).

Através da cultura de tecidos, também é possível induzir a duplicação cromossômica

em plantas, podendo proporcionar um aumento em tamanho das estruturas vegetativas

("gigantismo"), e beneficiar assim a orquicultura, uma vez que resulta em flores de maior valor

comercial, normalmente de maior tamanho, com conformação mais redonda e maior conteúdo

de substâncias que intensificam a cor e fragrância, quando comparadas com as orquídeas

2

diploides (DAO-LONG et al., 2012; SATTLER et al., 2016). A indução de poliploidia pode ser

feita utilizando substâncias antimitóticas, as quais atuam sobre as fibras do fuso acromático,

inibindo a divisão celular e permitindo a poliploidia in vitro nas plantas (DHOOGHE et al.,

2011). Dessa forma, a duplicação cromossômica tem o objetivo de tirar o foco das espécies

nativas ameaçadas de extinção, uma vez que pode proporcionar o desenvolvimento de

variedade mais atrativa.

Objetivou-se com o presente estudo desenvolver tecnologias para a micropropagação,

embriogênese somática, conservação in vitro e duplicação cromossômica em C. tigrina.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Orchidaceae A família Orchidaceae é a mais diversa dentre todas as famílias de angiospermas, sendo

estimadas 27.801 espécies distribuídas em mais de 899 gêneros e mais de 100.000 híbridos,

agrupadas em cinco subfamílias, dispersas por todo o mundo (CHASE et al., 2015; THE

PLANT LIST, 2018) e com maior diversidade na região tropical (RECH et al., 2011). Destaca-

se como importante planta ornamental, de interesse econômico e botânico, inclusive de

importância para indústria medicinal, cosmética e alimentícia (GALDIANO-JUNIOR et al.,

2012).

No Brasil ocorrem cerca de 2.553 espécies distribuídas em 238 gêneros, dessas, 1636

são endêmicas (BARROS et al., 2015a) e 34 integram a "Lista Oficial das Espécies Brasileiras

Ameaçadas de Extinção" (MMA, 2014). No Nordeste são encontradas 670 espécies e 140

gêneros, e em Sergipe, especificamente, ocorrem 35 gêneros e 75 espécies (BARROS et al.,

2015a).

A família engloba plantas perenes, terrícolas, rupícolas, epífitas ou hemiepífitas,

monopodiais ou simpodiais. As raízes são cilíndricas ou achatadas, delgadas ou espessadas. O

velame é formado por 2 a 3 camadas de células lignificadas que podem ser longas ou curtas.

Esse órgão pode auxiliar como proteção (mecânica e reflexão da radiação solar) e fonte de

reserva (água e nutrientes), sobretudo para raízes de orquídeas epífitas, que não dispõem da

proteção física do solo como espécies terrestres. As folhas podem ser alternas, articuladas ou

não, crassas, membranáceas ou coriáceas. As flores são trímeras, zigomorfas, ressupinadas ou

não, hermafroditas ou unissexuada, dependendo da espécie. Os frutos são cápsulas elipsoides

ou globosas, deiscentes ou não e polispérmicas (MONTEIRO, 2013).

As orquídeas são bastante diversificadas quanto ao tamanho, forma e cor das flores,

sendo cultivadas tanto para a produção de plantas de corte como de vaso, apresentando alto

valor comercial em todo mundo (SOARES et al., 2011), sendo ainda considerado o mais antigo

grupo entre as ornamentais cultivadas (MOREIRA et al., 2007).

A família Orchidaceae está dividida em 70 subtribos, 22 tribos e cinco subfamílias

baseadas no número e na posição da antera. Essas subfamílias, de acordo com a classificação

de Pridgeon et al. (2009) são: Apostasioidae, Cypripedioideae, Epidendroideae, Vanilloideae e

Orchidoideae.

A subfamília Epidendroideae é a mais ampla e diversificada da Orchidaceae com

aproximadamente 18.000 espécies distribuídas em 650 gêneros (KULAK et al., 2006). A

maioria das epífitas tem antera terminal incumbente e de duas a oito polínias rígidas, com

consistência ceroide ou cartilaginosa (SINGER, 2004).

Conforme o sistema de taxonomia vegetal APG III (Angiosperm Phylogeny Group -

Grupo de Filogenia das Angiospermas), a Epidendroideae é dividida em 16 tribos: Arethuseae,

Calypsoae, Collabieae, Cymbidieae, Dendrobieae, Epidendreae, Gastrodieae, Malaxideae,

Neottieae, Nervilieae, Podochileae, Sobralieae, Triphoreae, Tropidieae, Vandeae e

Xerorchideae, distribuindo-se por todo o globo, com exceção apenas das regiões polares.

Em Sergipe foram identificadas 75 espécies de orquídeas, sendo 65% pertencentes à

subfamília Epidendroideae, representada no estado por oito subtribos e 24 gêneros de um total

de 41 espécies (MONTEIRO et al., 2012).

A tribo Epidendreae é representada pela subtribo Laeliinae, cujas espécies estão entre

as preferidas dos colecionadores de orquídeas, pois inclui o gênero mais popular, a Cattleya

(PRIDGEON et al., 2009).

http://www2.biologie.fu-berlin.de/sysbot/poster/poster1.pdf

https://pt.wikipedia.org/wiki/Cattleya

4

2.1.1. Gênero Cattleya O gênero Cattleya foi estabelecido por John Lindney, em 1822, na obra “Collectanea

Botanica”, ao descrever a espécie brasileira Cattleya labiata Lindney (BRAEM, 1984). Possui

cerca de 102 espécies e inúmeras variedades e híbridos, distribuídas por diversas regiões

tropicais das Américas do Sul e Central. No Brasil encontram-se 77 espécies, com a maior parte

distribuída na região Sudeste (BARROS et al., 2015b).

O gênero é definido por apresentar flores grandes e labelo não fundido com a coluna,

por dispor de rizomas fortes e semi-lenhosos com nova brotação a cada estação de crescimento.

Existem dois grupos de espécies dentro do gênero: um com pseudobulbos fusiformes,

comprimidos, com uma folha apical (unifoliada), e outro com pseudobulbos cilíndricos com

duas folhas apicais (bifoliadas). Os botões florais estão rodeados por uma bráctea, a espata. A

inflorescência é terminal, apesar de que em algumas espécies as flores são produzidas em cima

de pseudobulbos desprovidos de folhas. Suas flores são compostas por três sépalas e três

pétalas, sendo uma modificada e bem mais elaborada, o labelo que envolve a coluna (formada

pela fusão dos estames e estigma). Existe apenas uma antera funcional e uma estrutura

modificada chamada rostelo, que impede a autofecundação durante a visita de um polinizador

(MONTEIRO, 2013).

O gênero Cattleya é bastante conhecido pela beleza e diversidade de suas flores. Está

representado por duas espécies no estado de Sergipe: C. labiata e C. tigrina (BARROS et al.,

2018).

A C. tigrina se distribui pelo bioma Mata Atlântica nos estados do Rio Grande do Sul,

Santa Catarina, São Paulo, região sul da Bahia, Sergipe e Pernambuco (Figura 1). Embora não

esteja na lista de espécies ameaçadas de extinção do MMA (2014), é uma espécie considerada

vulnerável à extinção de acordo com a Resolução da Secretaria do Meio Ambiente (Resolução

SMA 48/2004). A sua intensa exploração tem acarretado sua vulnerabilidade, em que está

associada à destruição do seu habitat, possibilitando a redução da variabilidade genética

(MORAES et al., 2009; SOARES et al., 2011; FERREIRA et al., 2012).

É uma espécie nativa brasileira, epífita, que vive nas árvores das matas e necessita de

umidade e, para sobreviver, retira seus nutrientes dos materiais orgânicos depositados no tronco

(VAN DEN BERG, 2008). Define-se pelos pseudobulbos cilíndricos, sulcados, com entrenós,

bifoliados. Folhas terminais, oblongo-ovadas, crassas, espata simples, inflorescência racemosa

simples, com cinco a oito flores que surgem entre as folhas. Flores com sépalas e pétalas

castanhas, maculadas de vináceo e labelo de cor magenta, lobos em tonalidade mais clara,

sépalas laterais, oblongo-lanceoladas, ápice agudo, margem lisa, sépala dorsal, subfalcadas,

pétalas elíptico-oblongas (BARROS et al., 2013). Sua época de floração acontece no verão,

entre os meses de novembro a fevereiro. Em Sergipe essa espécie ocorre em área de transição

de Mata Atlântica e Caatinga, na região centro-sul do estado (PRATA et al., 2013).

A técnica de cultura de tecidos relaciona-se ao cultivo in vitro de diferentes órgãos ou

células em meio de cultura com composição química definida em condições assépticas,

luminosidade e temperatura controlada (BHOJWANI; DANTU, 2013).

Dessa forma, a produção de orquídeas a partir de técnicas de cultivo in vitro é um

caminho viável para a produção de um grande número de plantas em pouco tempo. Nesse

contexto, a multiplicação in vitro tem sido indicada como uma alternativa para a produção de

mudas (ARAÚJO et al., 2009).

O êxito da multiplicação não necessita somente dos fatores inerentes ao tecido vegetal,

seja genético e fisiológico, mas como também das condições térmicas e luminosas na qual a

cultura é estabelecida e do meio nutritivo adequado que possibilita a indução, a multiplicação

e o crescimento das brotações. As condições nutricionais exigidas para o crescimento de um

tecido em estado in vitro diferenciam de espécie para espécie, o que torna fundamental o

desenvolvimento dos meios de cultura (LEITZKE et al., 2010).

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Figura 1. Atlas remanescentes florestais de Mata Atlântica 2011-2012 e áreas de amostragem.

Fonte:http://www.sosma.org.br/link/atlas201112/estados/mapa_estados_a3_portrait_NE_201

1_2012_comdesmat_300dpi.png (adaptação).

2.2. Cultivo in vitro

A consistência do meio de cultura desempenha consequência na morfogênese e no

desenvolvimento das brotações, sendo capaz de causar problemas no crescimento do explante.

Os meios de cultura podem ser líquidos ou semissólidos, para o líquido pode-se utilizar o meio

estacionário ou com agitação, esse último utilizado para fornecer oxigênio para respiração do

material vegetal (SIQUEIRA et al., 2013).

A utilização do meio líquido possibilita resultados similares ou até superiores do que o

meio semissólido para várias espécies vegetais. Os meios líquidos são rapidamente preparados,

mais baratos devido à redução do custo pela eliminação do ágar e promovem maior

homogeneidade, visto que a difusão dos componentes do meio é facilitada (SIQUEIRA et al.,

2013). Além do que, a utilização de meio líquido permite um maior contato do material

vegetativo com o meio, facilitando o aumento de produção e de eficiência na técnica de

propagação (PENCHEL et al., 2007; COSTA et al., 2016).

Vários exemplos de espécies multiplicadas em meio líquido podem ser citados, tais

como abacaxi (OLIVEIRA et al., 2007), bromélias (MENGARDA et al., 2009), maçã

(SIQUEIRA et al., 2013), banana (ANDRADE et al., 2011; COSTA et al., 2016), vetiver

(SANTOS et al., 2012) e as orquídeas Cattleya loddigesii (PASQUAL et al., 2009), Oncidium

leucochilum (SCHEIDT et al., 2009).

Outro meio de cultura para multiplicação in vitro de espécies são os meios semissólidos,

os quais podem provocar a criação de gradientes na distribuição de nutrientes com o

crescimento dos tecidos (CAMOLESI et al., 2010). Embora tenha um elevado custo e possua

um preparo mais lento, o meio de cultura semissólido tem sido o mais utilizado. O agente

solidificante frequentemente utilizado é o ágar, um polissacarídeo extraído de algas marinhas,

que se mantém estável nas temperaturas de cultura e não é assimilado por enzimas presentes no

explante (SIQUEIRA et al., 2013). Dentre os vários exemplos que constam na literatura com a

utilização de meio semissólido estão Brassocattleya Pastoral x Laeliocattleya Amber Glow

(VILLA et al., 2014) e Dendrobium nobile Lindl (SU et al., 2012), Cattleya harrisonina

(SCHNEIDERS et al., 2012) e Miltonia flavescens (LEMES et al., 2016).

2.2.1. Embriogênese Somática

A embriogênese somática é uma técnica de propagação in vitro, que consiste na

formação de embriões a partir de células somáticas através do princípio da totipotência das

células vegetais (PINTO et al., 2011). O termo somático refere-se ao fato do embrião

desenvolver-se assexuadamente através do tecido vegetativo, em que células somáticas

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diploides desenvolvem-se em plantas sem fusão de gametas, num processo morfogenético que

se aproxima da sequência da embriogênese zigótica, apresentando estádios de desenvolvimento

embrionário (WERNER et al., 2012).

Células capazes de reagir a sinais específicos do desenvolvimento são chamadas de

competentes, e determinadas para a embriogênese quando iniciam a transição do estado

somático para o embriogênico, a partir dessa transição podem restabelecer os estádios de

desenvolvimento de um embrião zigótico - estádios globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar

(WERNER et al., 2012). Nas monocotiledôneas, embriões somáticos aparecem como estruturas

globulares, que se desenvolvem equiparando-se a um coleóptilo e um escutelo (GEORGE,

1996).

A embriogênese somática inicia-se com a produção de células com competência

embriogênica, em seguida pela criação do embrião somático, maturação, conversão e

regeneração da planta (PINHEIRO et al., 2012). A competência embriogênica celular

possibilita responder a sinais específicos, como estádio fisiológico do explante, concentração

de reguladores vegetais e condições de cultura, uma vez que a indução de embriões somáticos

é o resultado para esses sinais (WERNER et al., 2012).

O desenvolvimento do embrião e a aquisição da competência embriogênica aparentam

ser monitorados por um ajuste da regulação temporal de genes específicos. Os genes podem ser

classificados em promotores e repressores da embriogênese somática; nos promotores já foram

descritos o pickle (pkl), BABY BOOM clavata1 (clv1) e clavata3 (clv3), LEC1 e LEC2

(QUIROZ-FIGUEROA et al., 2006; NAMASIVAYAM, 2007) e SERK (“somatic

embryogenesis receptor kinase”) (SCHMIDT et al., 1997).

O processo pode ser iniciado por duas vias: direta, na qual os embriões somáticos

originam-se diretamente de tecidos matrizes sem a formação de estádios intermediários de

calos, e, indireta, onde os embriões somáticos se formam a partir de calos (CHEN; HONG,

2012). O que difere esses dois padrões de desenvolvimento embriogênico é a resposta à ação

de reguladores de crescimento (VIEIRA; KOBAYASHI, 2000; PEREIRA et al., 2007). Os

embriões quando obtidos de forma indireta, por meio da fase de calos, podem sofrer variações

somaclonais, porém esse tipo de variação pode ser evitado a partir do desenvolvimento direto

(GHANTI et al., 2010).

A taxa de embriogênese somática de uma espécie, bem como o número de embriões

somáticos produzidos, depende da combinação de uma série de fatores inter-relacionados, entre

os quais se destacam tipos e concentrações adequadas de reguladores de crescimento, luz,

temperatura, presença de compostos antioxidantes, duração das etapas envolvidas no processo,

origem e idade fisiológica do explante a ser cultivado e do estado fisiológico da planta matriz

(GOMES et al., 2015).

Os embriões somáticos são usados para o estudo da regulação do desenvolvimento

embrionário, e também como uma ferramenta para a propagação vegetativa em larga escala

(CHEN; HONG, 2012), sendo responsável pelo alto desenvolvimento da floricultura e em

especial da orquicultura, visto que essas técnicas possibilitam diminuir os custos de produção,

pois podem produzir milhares de plantas idênticas (MINAMIGUCHI; MACHADO NETO,

2007).

Para o sucesso da embriogênese somática, o explante além de apresentar capacidade

embriogênica, necessita que suas células tenham capacidade de obter sinais endógenos e

exógenos, resultando na formação do embrião maduro (DAM et al., 2010). Níveis endógenos

de auxina e citocinina são fundamentais na regulação da embriogênese somática, sendo a auxina

o principal hormônio capaz de controlar a divisão celular e crescimento. Baixos níveis podem

causar à inibição da capacidade embriogênica do explante (CARNEIRO et al., 2014).

O 2,4-D é a auxina mais utilizada na indução de embriogênese somática em muitas

plantas. São consideradas as substâncias responsáveis pelo desencadeamento do processo de

diferenciação, alterando a determinação e atribuindo novas competências às células responsivas

nos explantes (WERNER et al., 2010).

7

A embriogênese somática tem muitas utilizações práticas, como o uso em estudos de

desenvolvimento embriológico, criação de bancos de germoplasma através da criopreservação

e propagação clonal em larga escala, além de ser usada para transformação genética (VON

ARNOLD et al., 2002). Protocolos eficazes para a embriogênese somática de orquídeas têm

sido descritos para alguns híbridos pertencentes aos gêneros Cymbidium (10 mg.L-1 de 2,4-D e

0,1 mg.L-1 de TDZ), Oncidium (1 mg.L-1 de TDZ e 0,3 mg.L-1 de cinetina) e Phalaenopsis (4,54

mg.L-1 de TDZ), Cattleya tigrina (0,3 mg.L-1 de 2,4-D) (CHANG; CHANG, 1998; CHEN;

CHANG, 2004a; CHEN; CHANG, 2004b; MENEZES-SÁ et al, 2018).

2.2.2. Conservação in vitro

Devido à intensa atividade extrativista de espécies nativas, destruição de habitats,

expansão das atividades agropecuárias, exploração predatória e ações antrópicas, torna-se

importante a aplicação de métodos para as práticas de conservação (REED et al., 2011). Por

isso, é de suma importância o estabelecimento de metodologias eficientes para conservação das

plantas.

A conservação das espécies vegetais pode ser realizada de duas formas: in situ e ex situ.

A conservação in situ acontece quando espécies são conservadas em seu ambiente natural, ou

seja, em reservas biológicas e parques. Já na conservação ex situ, as espécies são conservadas

fora de seu habitat natural, em bancos de germoplasma, jardins zoológicos e botânicos (LI;

PRITCHARD, 2009).

A criação de Bancos Ativos de Germoplasma (BAG), os quais abrigam coleções-base

para a conservação de variabilidade genética vegetal, apresentam-se como alternativa para

manutenção da biodiversidade (LARA et al., 2014). Possuem como objetivo o resgate de

populações que tenham importantes características biológicas a serem preservadas, ou espécies

localmente adaptadas ou em risco de extinção, possibilitando que muitos genótipos estejam

acessíveis para o uso sempre que necessário. A conservação in vitro pode ser utilizada como

uma técnica complementar na conservação ex situ de germoplasma e apresenta como vantagens

a manutenção dos genótipos em condições assépticas, a redução nos custos e mão-de-obra, a

otimização do espaço físico, além da facilidade de intercâmbio do material vegetal

(ENGELMANN, 2011).

Geralmente duas técnicas vêm sendo utilizadas na conservação de plantas in vitro: a

criopreservação e o crescimento lento. Na criopreservação, as plantas são conservadas em

temperaturas ultra-baixas por um longo tempo, e dessa forma, há uma supressão completa do

crescimento. Já na técnica de crescimento lento, as plantas são submetidas a condições que

reduzem ou suprimem o metabolismo das plantas in vitro, aumentando-se assim o intervalo

entre os subcultivos por pequeno a médio prazo, o que leva a uma diminuição da mão de obra,

do espaço e custos para a manutenção dessas plantas (MARCO-MEDINA; CASAS, 2012;

SANTOS et al., 2012).

Para retardar o crescimento de plantas na técnica de crescimento lento, pode-se recorrer

à redução da temperatura, da intensidade luminosa, das concentrações de sais do meio basal e

à adição de agentes osmóticos, como manitol, sorbitol e inibidores de crescimento como o ácido

abscísico (ABA) (MOOSIKAPALA; TE-CHATO, 2010).

Os açúcares álcoois tais como manitol e sorbitol, geralmente não são metabolizados

pelas plantas e tem sido, por essa razão, utilizados para mimetizar a condição de estresse

osmótico. Quando adicionados ao meio de cultura, tais açúcares reduzem o potencial hídrico

do sistema, limitando assim a absorção de água e nutrientes por parte do explante, retardando

o seu crescimento (MARINO et al., 2010; SILVA; SCHERWINSKI-PEREIRA, 2011).

A combinação de baixas temperaturas com a adição de agentes osmóticos no meio de

cultura tem sido apontada como alternativa eficiente para a conservação de germoplasma in

vitro (LIMA-BRITO et al., 2011). O decréscimo da temperatura é uma das estratégias utilizadas

para manter as plantas em crescimento mínimo por reduzir a ação das enzimas e do

metabolismo da planta (LIMA-BRITO et al., 2011; SILVA et al., 2016).

8

Para plantas de Vanilla, o meio de cultivo contendo 10 g.L-1 de sacarose e 15 g.L-1 de

manitol a 22ºC permitiu a conservação por até 365 dias (DIVAKARAN et al., 2006). Já em

Epidendrum chlorocorymbos a utilização da metade dos sais MS com 1% de sorbitol no meio

de cultivo, permitiu a conservação a 23ºC por 180 dias (LOPEZ-PUC, 2013). Para Agave spp,

o uso de 30 g.L-1 de sacarose suplementado com 50 g.L-1 de manitol e 50 g.L-1 de sorbitol no

meio de cultivo a 25ºC permitiu a conservação por até 300 dias (BALCH et al., 2012). Em

Passiflora giberti, as plantas cultivadas nos tratamentos nos quais o meio de cultivo foi

suplementado simultaneamente com sorbitol (40 g.L-1) e sacarose, apresentaram os menores

comprimentos (FARIA et al., 2006).

A redução das concentrações de sais do meio de cultivo é outra estratégia empregada

para a conservação sob crescimento lento. A utilização de 25% dos sais do MS possibilitou a

conservação in vitro das espécies Catasetum macrocarpum, Oeceoclades maculata e

Polystachya estrellensis por um período de 450 dias (MENEZES, 2014). Em Paphiopedilum a

adição de água de coco com metade dos sais MS ao meio de cultivo resultou na conservação a

25ºC por 60 dias (NG; SALEH, 2011).

Atualmente a técnica de criopreservação é a mais utilizada na conservação in vitro por

apresentar como vantagem o longo tempo de manutenção sem a necessidade de subcultivos.

No entanto, a técnica de crescimento lento ainda possui relevante importância devido à maior

facilidade de regeneração do material que está conservado em curto a médio tempo, uma vez

que a criopreservação apresenta grande dificuldade técnica e biológica nos processos de

congelamento e descongelamento, o que torna mais complexo o sucesso da regeneração do

material vegetal (SIMIONE, 2009).

2.3. Duplicação Cromossômica

Poliploides são organismos que apresentam dois ou mais conjuntos completos de

cromossomos formando seu genoma (MADLUNG, 2013). A poliploidia pode ocorrer

naturalmente em células de um tecido específico, em partes de um organismo ou em organismos

completos, sendo assim, considerada uma das características mais importantes na evolução dos

eucariotos (OTTO; WHITTON, 2007; SONG et al., 2012).

Os poliploides são identificados conforme sua origem em auto ou alopoliploides. Os

autopoliploides são gerados pela duplicação do número cromossômico de uma única espécie,

ocasionando em dois ou mais pares de cromossomos homólogos. Com relação aos

alopoliploides, acontece hibridização entre duas espécies diferentes seguida da duplicação

cromossômica, e assim, o pareamento preciso pode realizar somente entre os cromossomos do

mesmo genoma (SYBENGA, 1992).

Quanto ao procedimento de formação, os poliploides podem realizar-se por

poliploidização sexual ou somática. A poliploidização sexual compreende a união de dois

gametas não reduzidos, ocasionando organismos com dois ou mais grupos cromossômicos num

mesmo núcleo (SOLTIS et al., 2003). Nessa técnica, o erro na redução gamética atinge a

elaboração e a função do fuso acromático e a citocinese. A poliploidização somática se realiza

devido a erros da divisão celular, e assim, a célula duplica seu material genético sem terminar

a divisão, entrando em interfase com o dobro do material genético (OTTO; WHITTON, 2007).

A poliploidia é vista como uma das alterações citogenéticas mais marcante na

especiação vegetal e progresso da evolução. Apresenta-se como uma das maiores forças

evolutivas em plantas superiores, visto que a duplicação do genoma dentro do organismo

transforma-se numa fonte de inovação genética e com potencial para gerar especiação

(HEGARTY et al., 2013). A presença natural de poliploides em angiospermas é alta, sendo

provável que 100% já tenham sofrido algum evento de poliploidização no decorrer do seu

processo evolutivo (CUI et al., 2006; CHIES et al., 2014). A frequência de poliploides em

gimnospermas é muito rara, estando em torno de 5%, a medida que aproximadamente 95% das

pteridófitas indicam origem poliploide (AHUJA, 2005; WU et al., 2016).

9

Organismos poliploidizados manifestam novos fenótipos que podem ajudar para o

sucesso na natureza de novas plantas (OSBORN et al., 2003). Organismos poliploides são

fontes ricas de genes que podem proporcionar resistência a pragas e doenças, tolerância ao

estresse e variação genética, visto que a poliploidia possibilita uma maior adaptação a novos

nichos (CHEN, 2007).

Com a poliploidia ocorre um aumento de tamanho das estruturas vegetativas (efeito

“gigas”) das plantas, sendo importante para a orquicultura, já que o aumento da variabilidade

genética apresenta flores de maior valor comercial, maior tolerância ao estresse, com maior

tamanho, conformação mais redonda e maior conteúdo de substâncias que resultam na

intensificação da cor e fragrância, em consequência do aumento do volume nuclear quando

comparadas com as orquídeas diploides. Diante disso, o núcleo amplia para guardar o número

de cromossomos duplicados, e assim, as plantas poliploides apresentam ser maiores do que as

diploides (VICHIATO et al., 2007).

A duplicação cromossômica é importante no desenvolvimento de variedades comerciais

melhoradas e híbridos de orquídeas e, por causa das características vantajosas das flores

poliploides, cruzamentos entre plantas poliploides são frequentemente realizados por

melhoristas (VICHIATO et al., 2007).

Em orquídeas, a poliploidização é geralmente acompanhada pelo desenvolvimento no

tamanho das partes da planta. As plantas são baixas e grossas; com folhas verde escuro, grandes

e grossas; as flores apresentam maior intensidade na coloração, devido à ampliação da largura

das peças florais, as flores são geralmente retas, grossas e circulares (BORGES et al., 2014).

No entanto, para flor de corte, orquídeas diploides são selecionadas por possuírem

maior quantidade de flores na haste que as tetraploides. No gênero Cattleya as plantas triploides

demonstram um bom equilíbrio entre durabilidade e quantidade de flores. A obtenção de

plantas triploides provém do cruzamento de uma planta diploide com uma tetraploide

(GALDIANO-JÚNIOR, 2013).

2.3.1. Endorreduplicação cromossômica em Orchidaceae

A Orchidaceae é uma das famílias de angiospermas mais variáveis em relação ao

tamanho do genoma (LEITCH et al., 2009). Dentre as principais causas do aumento no tamanho

do genoma estão os eventos de poliploidização (BENNET; LEITCH, 2005). Esse fenômeno

aumenta o nível de ploidia em algumas espécies e consiste na duplicação de todo material

cromossômico (GUERRA, 2008). Pressupõe-se que cerca de 90% das angiospermas tenham

tido uma ou mais ocorrência de poliploidização (CUI et al., 2006).

A endopoliploidia é gerada por endorreduplicação, um processo em que a replicação do

DNA ocorre em ausência de mitose (MASONBRINK et al., 2013), ou seja, é um processo em

que o núcleo passa por vários ciclos de síntese de DNA sem ocorrer citocinese (mitose),

ocasionando células endopoliploides (DAVOLI et al., 2010; TAN et al., 2018). A

endorreduplicação acontece no decorrer da diferenciação celular, em tecidos vegetais

especializados, como elementos vasculares ou em células que apresentam altas taxas

metabólicas, como células do endosperma do embrião (LUKASZEWSKA; SLIWINSKA,

2007; LEE et al., 2009). Um aumento nos níveis de ploidia pode aumentar o metabolismo e a

redundância de genes, bem como acelerar o crescimento e suas funções (BAROW, 2006). A

endorreduplicação é um fator que contribui para o crescimento celular e desenvolvimento de

flores em várias espécies de orquídeas (LEE et al., 2004).

Diversos padrões de endopoliploidia têm sido observados em diferentes tecidos de

vários gêneros e espécies de orquídeas, onde a endopoliploidização ocorre simultâneamente

com a maturação ou envelhecimento (SABELLI; LARKINS, 2009). Em Vanda miss Joaquim,

diferentes padrões de endopoliploidia foram detectados em raízes aéreas em vários estágios de

diferenciação (LIM; LOH, 2003). Padrões de endopoliploidia diferem dentro de espécies de

orquídeas. Núcleos com conteúdo de DNA variando de 2C a 8C foram encontrados na parte

10

basal das folhas e ápices radiculares de Spathoglottis plicata, mas nenhuma endopoliploidia foi

observada nos segmentos de raiz com pelos radiculares (YANG; LOH, 2004).

A endorreduplicação do DNA acontece quando o ciclo celular sai do controle e ocasiona

a alteração da ploidia. Um componente importante no ciclo é o aumento da atividade da enzima

CDK/CYCLIN B, que fosforila várias proteínas, até mesmo proteínas da cromatina em início

da replicação (ORC), impossibilitando a entrada de complexos de múltiplas subunidades que

catalisam a replicação do DNA (JOHN; QI, 2008).

A síntese do DNA inicia após o crescimento de uma célula durante a fase G1,

alcançando uma dimensão adequada e uma atividade de CDK/CYCLIN regular para fosforilar

as proteínas SDL2 e SDL3 em complexos ORC, conduzindo a replicação do DNA (TANAKA

et al., 2007). A reduplicação pode acontecer durante o tempo que a atividade de CDK/CYCLIN

está em níveis controlados e insuficientes para começar a mitose e condicionar a fosforilação

inibitória em ORCs. O ciclo passa a fase de mitose e reinicia a fase S, isso acontece em todos

os reinos eucarióticos depois da diminuição da atividade de CDK/CYCLIN B (JOHN; QI,

2008).

O nível de endorreduplicação em orquídeas varia em função da espécie, do tecido, da

idade da planta e do meio ambiente (PARK; PAEK 2006; PARK et al., 2010). A

endorreduplicação foi relatada em muitos tipos de tecido vegetal. Para as orquídeas, em

particular, observou-se em folhas, ápices de raiz (JONES; KUEHNLE, 1998), perianto

(MISHIBA; MII, 2000) e partes florais (SILVA et al., 2014). Como a taxa de transição da

endorreduplicação pode ser reduzida por baixas temperaturas, pouco se sabe sobre a variação

de endopoliploidia entre as diferentes espécies de orquídeas (LEE et al., 2007).

Na família Orchidaceae foi verificada a ocorrência de endopoliploidia nos gêneros

Dendrobium (JONES; KUEHNLE, 1998), Cymbidium (FUKAI et al., 2002), Vanda (LIM;

LOH, 2003), Oncidium (LEE et al., 2004), Spathoglottis (YANG; LOH, 2004), Polystachya

(RUPP et al., 2010), Vanilla (LEPERS-ANDRZEJEWSKI et al., 2011), Phalaenopsis (CHEN

et al., 2011) e no gênero Cattleya nas espécies C. trianae, C. grandis, C. guttata, C. labiata, C.

cernua, C. tenius, C. elongata, C. crispata, C. rupestres, C. aclandiae, C. amethystoglossa, C.

pfisterii, C. rupestris, C. sincorana, C. loddigesii e C. granulosa (SOUZA et al., 2017).

2.3.2. Substâncias antimitóticas

A indução de poliploidia pode ser feita através de substâncias antimitóticas, as quais

agem sobre as fibras do fuso acromático durante a divisão celular, impossibilitando sua

polimerização ou proporcionando sua fragmentação, e dessa forma, não possibilita a separação

dos cromossomos na anáfase. Portanto, as células começam o ciclo celular seguinte com a

quantidade de DNA duplicado (PEREIRA et al., 2012).

A descoberta das substâncias antimitóticas como a colchicina e a orizalina provocam a

inibição da divisão celular, permitindo a duplicação cromossômica e a indução in vitro de

poliploidia nas plantas. A colchicina é um alcaloide extraído de sementes e bulbos de uma

liliácea (Colchicum autumnale), que atua no final da prófase mitótica, inibindo a formação do

fuso mitótico ou levando a formação de um fuso abortivo pela precipitação das proteínas

constituintes das fibras (DHOOGHE et al., 2011). Em altas concentrações ou tratamentos muito

demorados, dependendo do tipo de explante e penetrabilidade do tecido, tornam-se tóxica para

os vegetais (ALLUM et al., 2007).

Em orquídeas, a colchicina a 0,05% e 0,1% é vista como uma substância eficiente na

indução de poliploidia (SILVA et al., 2000; FAM et al., 2003). Em Cattleya intermedia o uso

de colchicina (0,05; 0,10 e 0,20 %), via cultura de meristema durante 4 ou 8 dias, indicou que

0,05 e 0,10% foi eficaz na produção de mixoploides e tetraploides (SILVA et al., 2000).

A colchicina é a substância mais usada para indução da poliploidia, tal como relatado

para Cattleya intermedia (SILVA et al., 2000), Dendrobium nobile (VICHIATO et al., 2007),

Oncidium flexuosum (UNEMOTO et al., 2009), Dendrobium chrysotoxum (ATICHART,

2013), híbridos de Pennisetum purpureum x Pennisetum glaucum (ABREU et al., 2006),

11

Pennisetum (CAMPOS et al., 2009), Brachiaria (SOUZA-KANESHIMA et al., 2010),

Paspalum notatum (QUESENBERRY et al., 2010), Musa sp. (COSTA et al., 2011), Citrus

(POVEDANO et al., 2012), Lolium multiflorum (PEREIRA et al., 2014) e Pogostemon cablin

(YAN et al., 2016).

Embora forneça resultados satisfatórios, a colchicina é um alcaloide altamente tóxico e

mutagênico, fato que tem estimulado a busca por drogas antimitóticas alternativas com eficácia

similar ou superior à colchicina (SCAGLIUS et al., 2009; PEREIRA et al., 2012).

Alguns herbicidas são caracterizados por produzirem um efeito análogo ao da colchicina

(DHOOGHE et al., 2011). Um desses herbicidas é a orizalina (3,5-dinitro-N-4, N-

dipropylsulphate), a qual tem sido utilizada para a poliploidização de plantas, representando

uma alternativa viável à colchicina e sendo utilizada inicialmente na poliploidização de lírio e

em outras plantas ornamentais (EECKHAUT et al., 2004; KHOSRAVI et al., 2008).

Os primeiros relatos do uso de orizalina para a poliploidização in vitro de espécies e

híbridos das orquídeas Dendrobium, Epidendrum, Odontioda e Phalaenopsis foram feitos por

Miguel e Leonhardt (2011). A poliploidização in vitro nessas plantas poderá representar um

papel determinante na geração de material melhorado, em que poderá deixar menos atrativa a

coleta predatória em seu local de ocorrência natural (MIGUEL; LEONHARDT, 2011).

2.3.3. Confirmação de poliploidia

A indução de duplicação cromossômica não é completamente eficaz e a mixoploidia

pode apresentar inconstância. Dessa forma, é essencial confirmar o nível de ploidia das plantas

condicionadas ao agente antimitótico. Muitos métodos podem ser utilizados para indicar o nível

de ploidia, como a observação dos caracteres anatômicos e morfológicos e/ou a determinação

do tamanho do genoma por citometria de fluxo (MAJDI et al., 2010).

A análise estomática apresenta uma metodologia fácil e simples, que possibilita a

identificação de poliploides e diploides, através da contagem e medição comparativa de

estômatos, visto que o comprimento dessas estruturas aumenta com o número de cromossomos

(VICHIATO et al., 2006).

O tamanho e a densidade dos estômatos e o número de cloroplastos por estômatos são

uns dos parâmetros anatômicos mais empregados para detectar poliploidia. Geralmente, plantas

diploides demonstram estômatos de tamanho mais reduzido do que as poliploides

correspondentes; já os números de cloroplastos por estômatos são maiores nos poliploides

(DHOOGHE et al., 2011).

Trabalhos com as espécies Dendrobium nobile (VICHIATO et al., 2006), Cattleya

intermedia (SILVA et al., 2000), Vanda (LIM; LOH, 2003), Cymbidium (KIM; KIM, 2003),

Dendrobium chrysotoxum (ATICHART, 2013) constataram que a análise estomática foi

eficiente na distinção entre plantas diploides e tetraploides nos diferentes níveis de ploidia

através da medição da área e densidade dos estômatos.

A citometria de fluxo é uma técnica que permite analisar o nível de ploidia das plantas,

definir haploides e diploides em culturas de anteras e ovários, analisar níveis de ploidia em

cruzamentos e o reconhecimento de híbridos (DOLEZEL et al., 2007).

Essa técnica abrange a verificação das propriedades ópticas, dispersão da luz e

fluorescência de partículas que se dissipam numa suspensão líquida (LOUREIRO; SANTOS,

2006). A análise se baseia na intensidade de fluorescência de núcleos corados com um

fluorocromo característico para o DNA (DOLEZEL et al., 2007). Dessa forma, o citômetro de

fluxo dispõe-se de fluídos, óptico e eletrônico, adaptados para conceder a medição de células

suspensas em um volume luminoso (ROBINSON, 2006).

A observação do conteúdo de DNA nos núcleos vegetais isolados e corados, permite

estimar o número de células que estão nas fases do ciclo celular (G1, S e G2) através de um

histograma. Esse histograma mostra um pico maior (número de núcleos na fase G0/G1) e um

pico menor (número de núcleos na fase G2), enquanto a divisão entre os dois picos apresenta

núcleos na fase S (DOLEZEL; BARTOS, 2005; DOLEZEL et al., 2007).

12

No início, os trabalhos com citometria de fluxo em plantas eram reduzidos devido às

dificuldades de conseguir células isoladas em suspensão com núcleos para processamento no

citômetro. Após o desenvolvimento de novos métodos, o processo de obtenção de material

nuclear passou a ser rápido e simples, o que permite verificar grande quantidade de amostras

num curto período de tempo. Além disso, podem ser utilizadas várias partes da planta como

raízes, folhas, frutos, sementes, pétalas, entre outros, e em quantias pequenas, não sendo

essencial as células estarem em divisão (DOLEZEL; BARTOS 2005; CLARINDO et al., 2008).

Apesar da quantidade de DNA ser expressa em picogramas (pg), os avanços na biologia

molecular em relação aos projetos de sequenciamento genético, forneceram uma tendência em

expressar esse conteúdo de DNA em quantidade de pares de bases (bp). Para identificar o valor

de C de uma espécie é necessário realizar uma análise conjunta com o padrão de referência, que

consiste em uma planta com valor de C já conhecido. O conteúdo de DNA nuclear é calculado

em função da relação da fluorescência entre as duas espécies (DOLEZEL; BARTOS, 2005).

O conteúdo de DNA nuclear de muitas espécies já é conhecido. Os resultados indicam

que a família Orchidaceae apresenta maior variedade nos conteúdos de DNA nuclear com

valores entre 0,60 e 38,83 pg de DNA. A oscilação entre as angiospermas está entre 0,0065 pg

em Genlisea margaretae (Lentibulariaceae) a 127,4 pg em Fritillaria assyriaca (Liliaceae)

(LEITCH et al., 1994; BENNET, 2007).

A citometria de fluxo é utilizada com eficiência para verificar a estabilidade genética de

plantas provenientes das técnicas de cultivo in vitro, identificação de haploides e verificação de

novos níveis de ploidias resultantes de cruzamentos, entre outros parâmetros (SOPALUN et al.,

2010). Essa técnica foi eficaz em Cattleya intermedia (SILVA et al., 2000), Dendrobium

chrysotoxum (ATICHART, 2013) e para o gênero Catasetum (SILVA et al., 2013).

13

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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25

4. ARTIGO 1

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA DIRETA EM Cattleya tigrina A. RICH.

Periódico publicado: Propagation of Ornamental Plants

RESUMO

Cattleya tigrina A. Rich. é endêmica no Brasil com distribuição nas regiões Nordeste, Sudeste

e Sul do país. Devido ao tamanho e à exuberância das flores, esta orquídea torna-se preferida

pelos decoradores, colecionadores e especialistas em orquídeas, levando ao desaparecimento

de espécies. Este estudo teve como objetivo induzir a embriogênese somática em segmentos

foliares de C. tigrina utilizando folhas jovens de plantas in vitro (aproximadamente 1 cm). O

material foi inoculado em meio MS suplementado com 2,4-D (0,0; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 e 0,9

mg l-1). Embriões somáticos de diferentes estágios de desenvolvimento foram utilizados para

estudos histológicos. Os substratos para aclimatização de embriões somáticos continham casca

de pinus, pó de coco e/ou vermiculita suplementada com calcário. O meio MS suplementado

com 0,3 mg L-1 de 2,4-D promoveu embriogênese somática direta com maior formação de

embriões. Análises histológicas indicaram que os embriões somáticos foram originados de

células da camada epidérmica da folha. A casca de pinus foi o substrato mais adequado para a

aclimatização e sobrevivência de mudas de C. tigrina.

Palavras-chave: anatomia, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), orquídea, embriões

somáticos.

26

ABSTRACT

DIRECT SOMATIC EMBRYOGENESIS IN Cattleya tigrina A. RICH.

Cattleya tigrina A. Rich. is endemic to Brazil and is distributed in the northeast, southeast, and

south regions of the country. Due to flower size and exuberance, this orchid becomes preferred

by decorators, collectors, and orchid specialists, leading to the disappearance of species. This

study aimed to induce somatic embryogenesis in leaf segments of C. tigrina using young leaves

of in vitro plants (approximately 1 cm) as explants. The material was inoculated in MS culture

medium supplemented with 2,4-D (0,0; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7, and 0,9 mg l-1). Somatic

embryos of different development stages were used for histological studies. The substrates for

acclimatization of somatic embryos contained pine bark, coconut coir, and/or vermiculite

supplemented with limestone. The MS medium supplemented with 0,3 mg l-1 of 2,4-D

promoted direct somatic embryogenesis with higher embryo formation. Histological analyses

indicated that somatic embryos were originated from cells of the leaf epidermal layer. Pine bark

was the most suitable substrate for the acclimatization and survival of C. tigrina seedlings.

Key-words: anatomy, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), orchid, somatic embryos.

4.1. Introdução

A família Orchidaceae é uma das maiores famílias de plantas existentes, possuindo

elevado número de espécie entre as monocotiledôneas (Rech et al. 2011). No Brasil ocorrem

2.553 espécies, agrupadas em 238 gêneros, com aproximadamente 1.636 espécies endêmicas

(Monteiro 2013). Destacam-se como importantes plantas ornamentais, de interesse econômico

e botânico, inclusive de importância para indústria medicinal, cosmética e alimentícia

(Galdiano-Junior et al. 2012).

Cattleya é conhecida como a “rainha das orquídeas” devido a sua beleza e tamanho de

suas flores. Este gênero é preferido por colecionadores, orquidófilos, decoradores e

especialistas em orquídeas, o que faz de algumas espécies estarem vulneráveis à extinção

(Soares et al. 2011, Ferreira et al. 2012).

Dessa forma, é extremamente relevante o estabelecimento de metodologias para a

multiplicação rápida e eficiente de espécies de plantas ameaçadas de extinção. Dentre os

diferentes métodos, a embriogênese somática pode ser uma ferramenta biotecnológica

importante, visto que é uma técnica de aplicabilidade da cultura de tecidos in vitro que

proporciona a obtenção de plantas em larga escala.

As células somáticas não são naturalmente embriogênicas, necessitando de uma fase

inicial de indução para que possam adquirir tal competência (Castro et al. 2010). A iniciação

pode ocorrer por via indireta, na qual os embriões somáticos se formam a partir de calos que

apresentam células em diferentes estádios de diferenciação, e direta, na qual os embriões

somáticos originam-se diretamente de tecidos de matrizes sem a formação de estádios

intermediários de calos (Chen e Hong 2012). O que difere esses dois padrões de

desenvolvimento embriogênico é a resposta à ação de reguladores de crescimento.

Técnicas de análise histológica são comumente usadas para elucidar e analisar a

viabilidade dos embriões, a formação inicial de estruturas e o desenvolvimento das diferentes

fases embriogênicas (Ulisses et al. 2016). Protocolos efetivos para embriogênese somática

direta de orquídeas foram descritos para alguns híbridos pertencentes ao gênero Cymbidium [10

mg l-1 ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e 0,1 mg l-1 de thidiazuron (TDZ)] (Chang e

Chang 1998), Oncidium (1 mg l-1 de TDZ e 0,3 mg l-1 de cinetina) (Chen e Chang 2004b),

Phalaenopsis (4,54 mg l-1 de TDZ) (Chen e Chang 2004a), Oncidium (1 mg l-1 de TDZ) (Chen

e Hong 2012) e Phalaenopsis (0,537 μM de ácido anaftalenoacético (ANA) e 13,62 μM de

TDZ) (Ulisses et al. 2016).

27

O 2,4-D é uma substância sintética semelhante à classe das auxinas e sua adição ao meio

de cultura é importante para a indução da embriogênese somática em muitas plantas cultivadas

in vitro. Na embriogênese somática, as auxinas e o 2,4-D são classificadas como substâncias

responsáveis por desencadear os processos de desdiferenciação e rediferenciação, alterando a

determinação e atribuindo novos competências às células responsivas nos explantes (Guerra e

Nodari 2006).

O objetivo do presente artigo foi estudar o efeito de diferentes concentrações de 2,4-D

na embriogênese somática e realizar uma análise histológica.

4.2. Material e Métodos

4.2.1. Material botânico e estabelecimento da cultura

Frutos maduros foram coletados para o estabelecimento de plântulas in vitro, com base

no estudo biogeográfico da ocorrência de populações de C. tigrina no estado de Sergipe

(Arrigoni-Blank et al. 2016).

As cápsulas de sementes foram lavadas com água e detergente neutro e desinfestadas

com álcool a 70% (v/v) durante 1 minuto numa câmara de fluxo laminar. Em seguida, o material

foi imerso em solução de hipoclorito de sódio a 5% por 20 minutos e submetido à três lavagens

com água destilada e autoclavada. As cápsulas foram abertas e as sementes foram isoladas e

inoculadas em meio de cultura MS (Murashige e Skoog 1962), com metade dos

macronutrientes, suplementadas com 30 g l-1 de sacarose, 7 g l-1 de ágar e 1 g l-1 carvão ativado.

Os frascos foram mantidos em sala de temperatura controlada (25 ± 2ºC), com

fotoperíodo de 12 horas e densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (DFFF) de 40 μmol m-2

s-1. Plântulas com 1 cm de comprimento foram utilizadas como fontes de explantes para

embriogênese somática.

4.2.2. Indução de embriões somáticos diretos com 2,4-D

Os explantes foram inoculados em meio MS suplementado com 2,4-D (0,0; 0,05; 0,1;

0,3; 0,5; 0,7 e 0,9 mg l-1) em delineamento experimental inteiramente casualizado com seis

repetições. Cada repetição consistiu de cinco frascos e dois explantes por frasco, distribuídos

aleatoriamente em contato com o meio de cultura. Os frascos foram mantidos no escuro por 15

dias, e após 90 dias foram avaliadas as variáveis, porcentagem de calos embriogênicos e número

de embriões por explante.

4.2.3. Análise histológica dos embriões somáticos

Embriões somáticos de diferentes estágios de desenvolvimento (globular, cordiforme,

torpedo e cotiledonar) foram utilizados para estudos histológicos. Os embriões foram

selecionados e fixados em FAA (etanol a 70%, ácido acético glacial a 5% e formaldeído a 5%)

por 72 horas e, em seguida, fixados em etanol a 70% até o momento da montagem em resina.

Estes fragmentos foram submetidos a séries crescentes de desidratação de etanol (70%,

80%, 90% e 100%) por 2 horas cada. O material foi transferido para uma solução de pré-

filtração contendo 50% de etanol e 100% de metacrilato (Historesin-Leica) por 24 horas.

Finalmente, os embriões foram colocados em uma solução de infiltração contendo 100% de

metacrilato por 24 hoars (Historesin-Leica) (TITON et al. 2007). O material foi seccionado

transversalmente na espessura de 8 μm usando um micrótomo semiautomático Leica RM 2235

e corado por 1 minuto com dupla coloração composta por Azul de Alcian e Safranina (1:1 v/v)

e montados em lâminas permanentes com verniz vitral. As seções foram fotografadas em

microscópio óptico equipado com câmera LEICA DM500 e visualizadas no computador com

o auxílio do programa LAS EZ®.

28

4.2.4. Desenvolvimento e germinação dos embriões somáticos

Os embriões somáticos foram individualizados e em seguida subcultivados em frascos

contendo a metade dos sais do meio MS. As plantas originadas a partir dos embriões somáticos

foram individualizadas em frascos. Os frascos foram levados para sala de crescimento com

temperatura controlada de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 12 horas de luz e densidade de fluxo de

fótons fotossintéticos (DFFF) de 40 µmol.m-2.s-1por 30 dias.

4.2.5. Aclimatização das plântulas oriundas da embriogênese somática

As plântulas foram retiradas dos frascos, procedendo-se a lavagem em água corrente

para eliminação do meio de cultura aderido às raízes. Em seguida foram transferidas para

bandejas plásticas com o diâmetro de 13,5 cm contendo os diferentes tratamentos. O

experimento foi conduzido em ambiente protegido com tela sombrite de 50% e sistema de

irrigação e nebulização intermitente, garantindo alta umidade relativa.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado com cinco substratos,

sendo: casca de pinus; pó de coco; casca de pinus: pó de coco (2:1 v/v); casca de pinus:

vermiculita (2:1 v/v); casca de pinus: pó de coco: vermiculita (2:1:1 v/v) com cinco repetições

e cada repetição com cinco mudas.

Aos 60 dias, após o transplantio, foram avaliadas as variáveis, porcentagem de

sobrevivência, altura da planta (cm) e comprimento da raiz (cm).

4.2.6. Análises estatísticas

Os dados da embriogênese somática foram submetidos à análise de variância e, quando

necessário, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As

variáveis em porcentagem foram transformadas em arco seno da raiz quadrada de (X/100). As

análises estatísticas foram realizadas usando o programa estatístico SISVAR (FERREIRA,

2011).

4.3. Resultados e Discussão

4.3.1. Desenvolvimento de embriões somáticos

Os explantes foliares de C. tigrina, na ausência de luz após 15 dias de inoculação,

emitiram diretamente embriões somáticos da base do pecíolo foliar em todos os tratamentos. A

ausência de 2,4-D resultou em menor quantidade de embriões somáticos. Isso permite inferir

que o tecido tem capacidade embriogênica, mesmo na ausência de 2,4-D (Naing et al. 2011).

As estruturas arredondadas diferenciaram-se em embriões globulares que se projetavam

para fora da superfície foliar aos 15 dias de cultivo na ausência de luz, indicando morfogênese

direta, já que não foi visualizada a presença de calo (Fig. 1A). Essas respostas foram similares

em Phalaenopsis amabilis (L.) Blume com diferentes associações e concentrações entre ANA

e 2,4-D, obtendo assim o surgimento dos embriões somáticos diretos aos 20 dias de cultivo na

ausência de luz (Chen e Chang 2006).

Um grande número de pró-embriões se diferenciou em embriões globulares e se

desenvolveram na superfície adaxial da folha, próxima à região do pecíolo foliar (Fig. 1B).

Após 20 dias de indução, os embriões globulares diferenciaram-se em embriões cordiforme

(Fig. 1C). Três a quatro dias depois, os embriões se converteram em torpedo (Fig. 1D),

mostrando a formação de cotilédones (Fig. 1E), e aos 40 dias após a inoculação, os embriões

se transformaram em plântulas jovens (Fig. 1F).

A embriogênese somática não iniciou de forma sincronizada, ou seja, os embriões

mantidos no mesmo meio de cultura e durante o mesmo período apresentaram diferentes

estágios de desenvolvimento. Assim, verificou-se uma assincronização para os estágios de

desenvolvimento dos embriões somáticos (globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar). Apesar

de ser comum, esse fenômeno é mais provável de ocorrer na embriogênese somática indireta.

29

As diferentes concentrações de 2,4-D variaram na porcentagem de embriogênese, com

uma média de 42,0 a 85,0% (Tabela 1). As maiores formações de embriões foram nas

concentrações mais baixas (0,05 a 0,5 mg l-1). Em Cattleya máxima, também baixas

concentrações de 2,4-D (0-0,3 mg l-1) apresentaram uma média de 42,0 a 96,3% embriões.

Sendo assim, pode-se supor que a exposição de explantes do gênero Cattleya em concentrações

superiores a 0,5 mg l-1 de 2,4-D proporciona uma diminuição da taxa embriogênica. Isso porque

o 2,4-D altera o equilíbrio endógeno de AIA necessário para induzir a embriogênese e

estabelecer o desenvolvimento embrionário (Agila et al. 2015). O 2,4-D favorece uma maior

quantidade de embriões e sua capacidade na ativação da via embriogênica pode estar

relacionada à sua eficiência de induzir genes de estresse que têm demonstrado contribuir para

a reprogramação celular das células somáticas em direção à embriogênese (Mahendran e Bai

2016).

O número de embriões somáticos variou de 5,5 (controle) a 14 (0,3 mg l-1 de 2,4-D)

(Tabela 1). Essa variável depende da combinação de vários fatores inter-relacionados, como

tipos e concentrações de reguladores de crescimento, duração das fases envolvidas no método,

origem e idade fisiológica do explante e idade fisiológica da planta-mãe (Guerra et al. 1999,

Ledo et al. 2002, Maciel et al. 2016). Assim, a qualidade dos embriões somáticos é geralmente

o critério mais significativo para o desenvolvimento de um protocolo de embriogênese

somática. A qualidade de um embrião somático refere-se à sua morfologia, similaridade

bioquímica com o embrião zigótico e capacidade de produzir plantas normais. Os embriões

somáticos de alta qualidade dispõem de uma morfologia idêntica ao zigótico e têm normalmente

uma simetria radial (Maruyama et al. 2007, Saldanha e Martins-Corder 2012).

4.3.2. Análise histológica de embriões somáticos

O processo de divisão constante das células iniciais formou embriões globulares e

embriões em estágio de torpedo (Fig. 2A). A diferenciação do embrião globular foi convertida

em embrião cordiforme (Fig. 2B). Embrião somático com cotilédone diferenciado (Fig. 2C). A

presença de folhas evidenciou a conversão direta de embriões somáticos e diferenciação de

plântulas na superfície de explantes foliares (Fig. 2D).

4.3.3. Aclimatização de plântulas originadas de embriões somáticos

A análise de variância evidenciou diferenças significativas para as misturas de

substratos aos 60 dias de aclimatização. Observa-se que a sobrevivência das plantas (100%) foi

significativamente maior no tratamento contendo somente casca de pinus (Tabela 2, Fig. 3).

Orquídeas epífitas, como as do gênero Cattleya, desenvolvem-se melhor em substrato com

textura relativamente grossa, que permite maior drenagem da água (Lone et al. 2008), como é

o caso da casca de pinus. Dessa forma, esse substrato pode ser indicado para o cultivo de

orquídeas epífitas, por proporcionar alto índice de sobrevivência e desenvolvimento das plantas,

bem como a elevada disponibilidade no mercado e o baixo custo.

Para a altura das plantas, o substrato composto apenas pelo pó de coco resultou no menor

crescimento (2,3 cm), não diferindo significativamente do substrato casca de pinus: pó de coco:

vermiculita (2: 1: 1 v / v) (2,6 cm) (Tabela 2). Resultados semelhantes foram relatados para

Miltonia flavescens, onde pó de coco mostrou o menor crescimento de plantas (Stefanello et al.

2009). Embora o pó de coco seja um substrato indicado e benéfico na produção de mudas de

várias espécies, na aclimatização de C. tigrina não teve o mesmo desempenho, resultando no

menor crescimento da planta, provavelmente esteja relacionado à má agregação física e à alta

retenção de água no substrato.

As diferentes misturas de substrato utilizadas na aclimatização, não influenciaram

significativamente no comprimento da raiz, com médias entre 1,5 a 1,7cm, indicando que os

substratos testados propiciaram condições similares para o desenvolvimento dessas (Tabela 2).

Esses substratos possibilitam a retenção de umidade e de aeração, melhorando as condições

físicas das plantas, permitindo o desenvolvimento e crescimento radicular (Amaral et al. 2010).

30

Resultados semelhantes foram obtidos em trabalho com o híbrido Cattleya labiata Lindl. X

Cattleya forbesii Lindl., onde diferentes combinações de substratos (xaxim, fibra de coco, casca

de pinus e casca de arroz carbonizada) não diferiram significativamente quanto ao comprimento

de raiz (Yamakami et al. 2006).

Agradecimentos: Os autores agradecem ao CNPq, CAPES, FAPITEC / SE e FINEP pelo apoio

financeiro para este estudo.

4.4. Referências Bibliográficas

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33

Figura 1. Iniciação de embriões somáticos diretos de explantes foliares de C. tigrina. Embriões

somáticos formados a partir da região foliar basal aos dez dias após imersão em meio de cultura

MS suplementado com 0,3 mg l-1 de 2,4-D (A), protrusão de embriões somáticos diretos na

região basal foliar (B), diferenciação de embriões em estágio cordiforme (C), em forma de

torpedo (D), embriões na fase cotiledonar (E), mudas originadas de embriões explantes foliares

(F).

Figura 2. Evidência histológica da embriogênese somática direta no explante foliar de C.

tigrina. Formação de embriões globulares (glob) e fase torpedo (torp) (seta) (A), embrião em

estágio cordiforme (seta) (B), embrião somático com cotilédone diferenciado (seta) (C),

germinação direta de embrião somático (D).

34

Figura 3. Plantas de C. tigrina originadas de embriões somáticos durante o enraizamento e

aclimatização em 60 dias.

Tabela 1. Indução da embriogênese somática em folhas de Cattleya tigrina em função de

diferentes concentrações de 2,4-D.

2,4-D (mg l-1) Embriogênese (%) Número de embriões

0,00 42,0 ± 0,2 c 5,5 ± 0,7 c

0,05 72,9 ± 0,2 ab 9,2 ± 2,1 b

0,10 80,0 ± 0,2 a 9,6 ± 1,9 b

0,30 85,0 ± 0,2 a 14,0 ± 2,4 a

0,50 83,3 ± 0,2 a 10,1 ± 2,8 b

0,70 63,3 ± 0,2 abc 8,5 ± 2,1 bc

0,90 53,3 ± 0,2 bc 7,5 ± 0,7 bc

CV(%): 18,30 19,26 Médias ± erros padrão seguidas das mesmas letras não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

CV: coeficiente de variação

Tabela 2. Sobrevivência, altura de planta (cm) e comprimento de raiz (cm) de mudas de

Cattleya tigrina em função de diferentes misturas de substrato.

Substratos Sobrevivência

(%)

Altura da planta

(cm)

Comprimento da

raiz (cm)

Casca de pinus 100,0 ± 0,0 a 2,8 ± 0,0 a 1,7 ± 0,2 a

Pó de coco 88,0 ± 0,1 b 2,3 ± 0,2 a 1,6 ± 0,2 a

Casca de pinus:Pó de coco (2:1) 84,0 ± 0,2 b 2,6 ± 0,1 a 1,6 ± 0,1 a

Casca de pinus vermiculita (2:1) 80,0 ± 0,2 b 2,6 ± 0,0 a 1,6 ± 0,1 a

Casca de pinus:Pó de

coco:vermiculita (2:1:1) 80,0 ± 0,2 b 2,6 ± 0,1 a 1,5 ± 0,1 a

CV (%) 7,32 5,81 9,38 Médias ± erros padrão seguidas das mesmas letras não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

CV: coeficiente de variação

35

5. ARTIGO 2

MICROPROPAGAÇÃO E CONSERVAÇÃO IN VITRO DE Cattleya tigrina

RESUMO

A Cattleya tigrina vem sofrendo grandes perdas, no seu habitat natural, devido a sua coleta

predatória, sendo assim inclusa na lista de vulneráveis à extinção. Diante disso, objetivou-se

com o presente trabalho estabelecer protocolo de micropropagação e conservação in vitro de C.

tigrina. Para multiplicação in vitro, o delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, em

esquema fatorial 4x2, sendo quatro volumes de meio (10, 15, 20 e 25 ml) e duas consistências

do meio (líquido estacionário e semissólido). Para a aclimatização, foram testadas misturas de

substratos contendo casca de pinus, carvão vegetal, vermiculita e pó de coco suplementado com

1 g l-1 de calcário. Os experimentos de conservação in vitro foram conduzidos em delineamento

inteiramente casualizado, onde foram testadas diferentes concentrações de sais do meio MS

(25, 50, 75 e 100%) e reguladores osmóticos (sacarose (20 g l-1); sacarose:manitol (10:5 g l-1)

sacarose:sorbitol (10:5 g l-1), em duas temperaturas (18 e 25°C). A multiplicação in vitro das

plantas pode ser realizada utilizando os volumes de 10 ml de meio líquido e 25 ml do meio

sólido. Para a aclimatização sugere-se o uso da casca de pinus. A espécie pode ser conservada

sob regime de crescimento lento por um período de 730 dias, utilizando 25% dos sais MS na

temperatura de 18ºC ou 25ºC ou 20 g l-1 de sacarose à 25ºC.

Palavras-chave: multiplicação in vitro, aclimatização, crescimento lento, sais MS, reguladores

osmóticos.

36

ABSTRACT

MICROPROPAGATION AND THE IN VITRO CONSERVATION OF Cattleya tigrina

Cattleya tigrina has suffered great losses in its natural habitat, due to its predatory collection.

Thus, it is now being included in the list of vulnerable to extinction. Therefore, the objective of

this work was to establish a micropropagation protocol and an in vitro conservation of C.

tigrina. For the in vitro multiplication, the design was completely randomized in a 4x2 factorial

scheme, with four medium volumes (10, 15, 20, and 25 ml) and two medium consistencies

(steady and semisolid liquid). For the acclimatization, mixtures of the substrates containing pine

bark, charcoal, vermiculite, and coconut powder, which were supplemented with 1 g l-1

limestone, were tested. The in vitro conservation experiments were conducted in a completely

randomized design, where different concentrations of the MS salts (25, 50, 75, and 100%) and

the osmotic regulators (sucrose (20 g l-1); sucrose: mannitol (10: 5 g l-1); sucrose: sorbitol (10:

5 g l-1) were at two different temperatures (18°C and 25°C). The in vitro plant multiplication

was performed by using the volumes of 10 ml of the liquid medium and 25 ml of the solid

medium. For the acclimatization, the use of pine bark was employed. The species can be kept

under a slow growth regime for a period of 730 days, by using 25% of the MS salts at

temperatures of 18°C or 25°C, or with 20 g l-1 sucrose at 25°C.

Keywords: in vitro multiplication, acclimatization, slow growth, MS salts, osmotic regulators.

5.1. Introdução

O gênero Cattleya Lindley possui cerca de 103 espécies, inúmeras variedades e híbridos,

distribuídas por diversas regiões tropicais das Américas do Sul e Central. No Brasil encontram-

se 77 espécies com maior ocorrência na Região Centro-Oeste, Sul e Central. A exuberância das

flores torna as espécies desse gênero as preferidas entre decoradores, colecionadores,

orquidófilos e extrativistas (SOARES et al., 2011; FERREIRA et al., 2012; BARROS et al.,

2015), fazendo com que algumas espécies, entre elas C. tigrina, esteja inclusa na lista de

vulneráveis à extinção pela Secretaria do Meio Ambiente (Resolução SMA 48/2004).

Um outro fator merece atenção, é a fragmentação da Mata Atlântica, habitat dessa

espécie, o que pode ocasionar a perda acelerada do material genético de populações nativas e,

portanto, da sua variabilidade genética. Pesquisas que pretendam melhorar o processo de

propagação e desenvolvimento de orquídeas são importantes para multiplicá-las e assim evitar

sua extinção. Diante disso, as técnicas da cultura de tecidos, micropropagação e conservação in

vitro, são de grande importância para a espécie.

A micropropagação tem sido empregada para ampliar a produção de mudas, diminuindo

seu custo e colaborando para salvar diversas espécies de orquídeas da extinção (VILLA et al.,

2014). Na maioria dos protocolos de micropropagação de orquídeas, observa-se a dominância

no uso do meio de cultivo acrescido do ágar, com ou sem adição de reguladores de crescimento.

A utilização de meios de cultura semissólidos tem sido realizada em diversas espécies como

Dendrobium nobile Lindl (SU et al., 2012), Brassocattleya Pastoral x Laeliocattleya Amber

Glow (VILLA et al., 2014) e Miltonia flavescens (LEMES et al., 2016).

Outra maneira de se propagar in vitro é através do uso de meio líquido, o qual apresenta

facilidade na preparação e manipulação, redução dos custos pela eliminação do ágar e a

possibilidade de utilizar uma menor quantidade de meio de cultura (SU et al., 2012).

A utilização de meio líquido possibilita maior contato da planta com o meio, permitindo

maior produtividade e eficiência. Para isso, pode ser utilizado o meio estacionário ou com

agitação (PENCHEL et al., 2007; COSTA et al., 2016). Os usos desse meio foram avaliados

em algumas espécies como: banana (ANDRADE et al., 2011; COSTA et al., 2016), vetiver

(SANTOS et al., 2012) e as orquídeas Cattleya loddigesii (PASQUAL et al., 2009) e Oncidium

leucochilum (SCHEIDT et al., 2009).

37

As plantas multiplicadas in vitro passam pelo processo de aclimatização caracterizado

como uma adaptação gradativa das plantas. Em orquídeas, é recomendável a utilização de

substratos de textura grossa e boa drenagem para possibilitar às raízes o acesso livre à luz e ao

ar (DRONK et al., 2012).

O desenvolvimento de metodologias para a conservação in vitro são consideradas

fundamentais para espécies em risco de extinção. Embora a técnica mais adequada para a

conservação de germoplasma vegetal em longo prazo seja a criopreservação, a técnica de

crescimento lento é importante por permitir a conservação de material de fácil regeneração, e

tem sido utilizada com sucesso para a conservação de diversas espécies, tais como o vetiver

(Chrysopogon zizanioides L.), por um período de 270 dias em meio MS com 25% dos sais e

temperatura de 18°C (SANTOS et al., 2012), Epidendrum chlorocorymbos, por 180 dias em

meio com metade dos sais e 1% de sorbitol (LOPEZ-PUC, 2013), patchouli (Pogostemon cablin

Benth.), com 180 dias em meio com 10 g l-1 de sacarose e 5 g l-1 de manitol (ARRIGONI-

BLANK et al., 2015), erva-cidreira (Lippia alba) quimiotipo carvona por imersão em óleo

mineral é viável por 270 dias (PEIXOTO et al., 2017).

Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi estabelecer um protocolo de

micropropagação e conservação in vitro de C. tigrina.


5.2.1. Local e material vegetal

Os espécimes de C. tigrina cadastrados no SisGen sob o número A53BE37, foram

coletados e mantidos em estufa agrícola no Departamento de Engenharia Agronômica da

Universidade Federal de Sergipe e os experimentos conduzidos no Laboratório de Cultura de

Tecidos e Melhoramento Vegetal. Frutos maduros (cápsulas) foram coletados e utilizados para

estabelecer as culturas in vitro.

5.2.2. Estabelecimento in vitro

As cápsulas com sementes foram lavadas com água e detergente neutro e, em câmara

de fluxo laminar, desinfestadas em álcool 70% (v/v) por 1 minuto seguido de solução de

hipoclorito de sódio 5% por 20 minutos e tríplice lavagem com água destilada e autoclavada.

Após a desinfestação as cápsulas foram abertas, as sementes isoladas e colocadas em

frascos de 250 mL contendo meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) com metade

dos sais e acrescido de 30 g l-1 de sacarose, 7 g l-1 de ágar e 1 g l-1 de carvão ativado. O pH do

meio foi ajustado para 5,8 0,1 e o meio submetido a autoclavagem por 15 minutos (121 1oC

e pressão de 1,05 atm.).

Os frascos foram mantidos em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 ±

2ºC, fotoperíodo de 12 horas de luz e densidade de fluxo de fótons fotossintéticos de 40 µmol.m-

2.s-1. Ao alcançarem tamanho entre 1 e 2 cm, as plântulas foram utilizadas para os experimentos

de multiplicação em meio líquido e conservação in vitro.

5.2.3. Multiplicação in vitro e aclimatização

Para multiplicação in vitro, o delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, em

esquema fatorial 4x2, sendo quatro volumes de meio (10, 15, 20 e 25 ml) e duas consistências

do meio (líquido estacionário e semissólido). Cada tratamento foi composto por seis repetições,

sendo cada parcela constituída por cinco frascos e dois explantes. Em todos os experimentos o

meio de cultura utilizado foi o MS acrescido de 30 g l-1 de sacarose e pH ajustado para 5.8±0,1.

Para o meio semissólido foi utilizado 7 g l-1 de ágar. Os meios foram submetidos à

autoclavagem (121±1ºC e 1,05 atm) por 15 minutos.

Em câmara de fluxo laminar, plantas com 1 cm de altura foram inoculadas em frascos

de 250 ml, contendo os volumes de meio pré-determinados para cada tratamento. Os frascos

foram mantidos em sala de crescimento com temperatura controlada de 25±2oC, fotoperíodo de

38

12 horas, densidade de fluxo fotônico fotossintético de 40μmol.m-2.s-1, fornecida por lâmpadas

fluorescentes brancas a frio.

Após 90 dias de cultivo foram avaliadas as variáveis: sobrevivência (%), presença de

raiz (%) e número de brotos.

Para aclimatização, as plântulas micropropagadas foram retiradas dos frascos,

procedendo-se a lavagem em água corrente para eliminação do meio de cultura aderida às

raízes. Em seguida, foram transferidas para bandejas plásticas com o diâmetro de 13,5 cm

contendo os diferentes substratos. O experimento foi conduzido em ambiente protegido com

tela sombrite de 50% e sistema de irrigação e nebulização intermitente garantindo alta umidade

relativa.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado com oito misturas de

substratos, sendo: S1) Casca de pinus triturada; S2) Pó de coco; S3) Casca de pinus triturada:

Pó de coco (2:1 v/v); S4) Casca de pinus triturada: Vermiculita (2:1 v/v); S5) Casca de pinus

triturada: Carvão vegetal (2:1 v/v); S6) Casca de pinus triturada: Pó de coco: Carvão vegetal:

Vermiculita (2:1:1:1 v/v); S7) Casca de pinus triturada: Carvão vegetal: Vermiculita (2:1:1 v/v),

com seis repetições e cada repetição com cinco mudas. Nos tratamentos contendo pó de coco

foi adicionado 1 g l-1 de calcário dolomítido. Aos 120 dias após o transplantio foram avaliadas

as variáveis sobrevivência (%), altura das plantas (cm), número de brotos e comprimento de

raiz (cm).


A conservação in vitro sob crescimento lento foi realizada em dois experimentos. No

primeiro experimento o delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em esquema

fatorial 4x2, sendo quatro concentrações de sais do meio MS (100%, 75%, 50% e 25%) e duas

temperaturas (18 e 25ºC) com cinco repetições compostas por seis tubos com um broto cada.

No segundo experimento o delineamento experimental foi o inteiramente casualizado

em esquema fatorial 3x2, sendo três combinações de fontes de carbono e reguladores osmóticos

[sacarose (20 g l-1); sacarose (10 g l-1):manitol (5 g l-1); sacarose (10 g l-1):sorbitol (5 g l-1)] e

duas temperaturas (18 e 25ºC) com cinco repetições compostas por seis tubos de ensaio com

um broto cada.

Nos dois experimentos, as plantas foram inoculadas em tubos de ensaio e mantidas em

sala de crescimento com temperatura controlada de 25± 2ºC, fotoperíodo de 12 horas de luz e

densidade de fluxo de fótons fotossintéticos de 40 µmol.m-2.s-1, ou BOD à temperatura de 18ºC.

Aos 730 dias de cultivo foram avaliadas a sobrevivência (%), presença de raiz (%),

integridade das plantas onde: 1= folhas e brotos totalmente verdes; 2= início de secamento das

folhas; 3= entre 30 e 50% de folhas mortas; 4= mais de 50% de folhas mortas e 5= folhas e

brotos totalmente mortos. A altura das plantas foi avaliada com a escala de notas: 1= igual ao

tamanho inicial; 2= até o dobro do tamanho inicial; 3= até o triplo do tamanho inicial e 4= mais

que o triplo do tamanho inicial, de acordo com a escala de notas adaptada de Lemos et al.

(2002).

5.2.5. Análises estatísticas

Os resultados foram submetidos à análise de variância e, quando necessário, as médias

foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o programa SISVAR

(FERREIRA, 2011), com exceção para as concentrações de sais do meio MS, onde foi utilizada

regressão polinomial. As variáveis em porcentagem foram transformadas em arco seno da raiz

quadrada de (X/100).


5.3.1. Multiplicação in vitro e aclimatização

39

Para a sobrevivência de plantas e presença de raiz aos 90 dias de cultivo in vitro, os

resultados podem ser explicados por uma equação linear, sendo para o meio semissólido uma

linear crescente, enquanto que para o meio líquido, uma linear decrescente à medida que

aumentou o volume do meio, proporcionando uma redução na taxa de sobrevivência e presença

de raiz (Tabela 1). Provavelmente a baixa sobrevivência e enraizamento de plantas, exceto no

volume de 10 mL, pode ter sido em virtude dos explantes ficarem imersos no meio, dificultado

as trocas gasosas. A utilização do meio de cultura no estado líquido estacionário apresenta

restrições em razão da dificuldade com a aeração, sendo sugerida a utilização de volumes

menores, de modo que o material vegetal não fique imerso no meio de cultura (ANDRADE et

al., 2011). Para essas variáveis, o meio semissólido mostrou-se mais adequado, proporcionando

valores de sobrevivência e plantas enraizadas acima de 90% (Tabela 1).

Tabela 1. Sobrevivência (%), presença de raiz (%) e número de brotos por plantas de C. tigrina

aos 90 dias de cultivo in vitro em função de volume do meio MS líquido estacionário e

semissólido.

Volume (mL) Consistência do meio

Líquido estacionário Semissólido

---------------------- Sobrevivência (%) -----------------------

10 75,0 a 93,3 a

15 71,6 b 98,3 a

20 68,3 b 98,3 a

25 35,0 b 98,3 a

Equação (Y) = 105,66667 – 2,466667x 91,83333 + 0,3000x

R2 = 73,8 R2 = 60,0

CV (%) 20,83

--------------------- Presença de raiz (%) ---------------------

10 75,0 a 93,3 a

15 71,6 b 98,3 a

20 68,3 b 98,3 a

25 35,0 b 98,3 a

Equação (Y) = 105,66667 – 2,466667x 91,83333 + 0,3000x

R2 = 73,8 R2 = 60,0

CV (%) 20,83

---------------------- Número de brotos -----------------------

10 5,5 a 1,5 b

15 4,5 a 2,2 b

20 2,3 a 1,8 a

25 2,3 a 2,7 a

Equação (Y) = 7,8575 + 0,23850x 1,49066 + 0,0012x + 0,0017x²

R2 = 89,7 R2 = 63,2

CV (%) 41,67 *Médias seguidas das mesmas letras nas linhas não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

O número de brotos por explante variou de 2,3 a 5,5 quando foi utilizado o meio líquido,

sendo o menor volume utilizado o que possibilitou o maior número de brotos. Quando

comparado ao meio semissólido, este teve um desempenho inferior, obtendo não mais que 2,7

brotos/explante (Tabela 1). Dessa forma, o uso de ágar como agente solidificante do meio pode

estar contribuindo para a existência de uma barreira junto aos processos de difusão e de

absorção de nutrientes, proporcionando um baixo número de brotações por planta

(GALDIANO-JÚNIOR et al., 2012).

40

Na aclimatização das plantas, as diferentes misturas de substrato utilizadas não

influenciaram na sobrevivência, apresentando 100% de plantas vivas (Tabela 2). Dessa

maneira, essa elevada taxa de sobrevivência pode estar relacionada ao fato de todos os

substratos utilizados serem de textura relativamente grossa, permitindo as trocas gasosas entre

as raízes e o meio ambiente (ZANDONÁ et al., 2014). Esses resultados são semelhantes aos

encontrados para Miltonia flavescens Lindl. cultivada em substratos à base de pó de coco e

casca de pinus (STEFANELLO et al., 2009).

Tabela 2. Sobrevivência (%), altura da planta (cm), número de brotos e comprimento da raiz

(cm) de C. tigrina em meio líquido em função de diferentes misturas de substrato. Substratos Sobrevivência (%) Altura da planta

(cm)

Nº brotos Comprimento da

raiz (cm)

S1 100,0 a 5,5 ab 1,0 b 6,1 a

S2 100,0 a 5,6 a 1,1 ab 5,8 ab

S3 100,0 a 5,6 a 1,4 ab 5,5 ab

S4 100,0 a 5,4 ab 1,3 ab 5,2 ab

S5 100,0 a 5,3 b 1,5 a 4,4 ab

S6 100,0 a 5,3 b 1,3 ab 4,3 b

S7 100,0 a 5,4 ab 1,4 ab 4,5 ab

CV (%) 0,00 2,29 20,14 18,11 *Médias seguidas das mesmas letras não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. aAdição de 1 g l-1 de calcário. S1) Casca

de pinus triturada; S2) Pó de coco; S3) Casca de pinus triturada: pó de coco (2:1); S4) Casca de pinus triturada:vermiculita (2:1); S5) Casca de pinus triturada:carvão vegetal (2:1); S6) Casca de pinus triturada:Pó de coco:carvão vegetal:vermiculita (2:1:1:1); S7) Casca de pinus triturada:

carvão vegetal: vermiculita (2:1:1).

Analisando a altura das plantas, observa-se uma média de 5,6 cm, não havendo um

destaque relevante para qualquer mistura de substrato (Tabela 2). Dessa forma, as boas

propriedades físicas do pó de coco e casca de pinus mostram-se promissoras para o bom

crescimento da planta, proporcionando boas condições para seu crescimento e

desenvolvimento. Os substratos utilizados apresentam uma estrutura física vantajosa,

proporcionando alta porosidade, alto potencial de retenção de umidade, poder de tamponamento

para valores de pH (COSTA et al., 2012; ZANDONÁ et al., 2014).

Quanto ao número de brotos, o substrato S5 (1,5) foi superior em relação ao substrato

S1 (1,0), porém não diferiram estatisticamente dos demais tratamentos (Tabela 2). Por ser uma

planta de hábito de crescimento epífito, o seu lento crescimento e desenvolvimento podem estar

relacionados com o baixo número de brotos produzidos (ENDRES-JÚNIOR et al., 2015).

Para o comprimento da raiz, a maior média (6,1 cm) foi proporcionada pelo substrato

S1, não diferindo dos demais substratos, exceto para o substrato S6, com menor comprimento

de raiz (4,3) (Tabela 2). A presença de raízes pode indicar que as plantas estão vegetando

normalmente ou que as condições de cultivo não estão ocasionando restrições que possam

prejudicar seu crescimento e desenvolvimento (CAMOLESI et al., 2010).


5.3.2.1. Redução de sais do meio MS e temperatura de cultivo

Aos 730 dias de cultivo sob crescimento lento, a sobrevivência das plântulas apresentou

valores médios de 80%, independente das temperaturas e concentração de sais do MS (Tabela

3). Por ser a C. tigrina uma espécie epífita, que apresenta endorreduplicação, é provável que as

adaptações fisiológicas e morfológicas possam ser ajustadas, a depender da quantidade de

nutrientes disponíveis in vitro ou ex vitro, permitindo a sua conservação por um período maior,

sem a necessidade de troca de meio (SILVA et al., 2017). Diante disso, essa espécie tolera

diferentes concentrações de sais (CECCARELLI et al., 2006) e temperaturas (BAROW, 2006),

onde pode-se observar no seu habitat natural que essa espécie se nutre de detritos das folhas e

excrementos de animais e/ou insetos, os quais são lavados de cima das árvores (KERSTEN,

41

2010). Essa disponibilidade de nutriente é variável durante todo o ano, fazendo com que essa

espécie se adapte a menor ou maior oferta de nutrientes.

Tabela 3. Sobrevivência (%), integridade das plantas (notas 1 a 5**), presença de raiz (%) e

altura (notas 1 a 4***) de C. tigrina aos 730 dias de conservação in vitro em função das

diferentes concentrações de meio MS e temperatura. Sais MS (%) Temperatura (ºC)

25 18 .................. Sobrevivência (%)...................

25 90,0 a 86,7 a

50 90,0 a 86,6 a

75 86,7 a 73,3 a

100 83,3 a 73,3 a

Equação (Y) 93,3333+0,0933x

R2=89,09

93,3333-0,2133x

R2=80,00

CV(%) 20,85 --------------- Integridade das plantas ---------------

25 1,8 a 2,2 a

50 2,0 a 2,8 b

75 2,3 a 3,4 b

100 2,7 a 3,4 b

Equação (Y) 1,5000+0,0118x

R2=95,03

1,9500+0,0165x

R2=89,71

CV(%) 16,49 --------------- Presença de Raiz (%) ---------------

25 100,0 a 100,0 a

50 100,0 a 100,0 a

75 100,0 a 100,0 a

100 100,0 a 100,0 a

Equação (Y) ns ns

CV(%) 0,00 -------------------- Altura (cm) --------------------

25 2,3 a 2,3 a

50 2,9 a 2,6 a

75 2,9 a 2,9 a

100 2,5 a 2,6 a

Equação (Y) 1,2916+0,0506x -0,00038x2

R2=98,23

1,5083+0,0366x -0,0002x2

R2=87,80

CV(%) 15,74 *Médias seguidas da mesma letra nas linhas não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. **Notas de

integridade das plantas: 1=folhas e brotos totalmente verdes; 2=início do secamento das folhas; 3=entre 30 e 50% de folhas

mortas; 4= mais de 50% de folhas mortas e 5=folhas e brotos totalmente mortos. ***Notas altura: 1= altura semelhante a inicial

(1-2 cm); 2= até o dobro da altura inicial; 3= até o triplo da altura inicial e 4= mais que o triplo da altura inicial.

A integridade das plantas é um indicativo do estado nutricional das plantas durante o

processo de conservação. Nota-se que em ambas as temperaturas, à medida que aumentaram as

concentrações de sais, as folhas apresentaram início de secamento e 30 e 50% de folhas mortas

(Tabela 3). Pode-se propor que a senescência das folhas se deu através do longo período das

plantas in vitro, mas aparentemente, nenhum dano fisiológico foi causado.

A presença de raiz foi observada em todo os tratamentos, independente da temperatura

e concentrações de sais no meio de cultivo (Tabela 3). A presença de raízes pode ser um

indicativo de que as plantas estão se desenvolvendo satisfatoriamente e que as condições de

cultivo in vitro não limitará a retomada do seu crescimento (CAMOLESI et al., 2010).

42

Com relação à altura das plantas, as duas temperaturas de cultivo apresentaram

desempenho semelhante, com valores que não ultrapassaram 2,9 cm (Tabela 3), sendo benéfico

para a conservação, cujo objetivo principal é reduzir o crescimento das plantas mantendo sua

viabilidade durante um período mais longo.

5.3.2.2. Reguladores osmóticos e temperatura de cultivo

Para a variável sobrevivência, aos 730 dias de conservação in vitro em função de

diferentes fontes de carbono, reguladores osmóticos e temperaturas, as sobrevivências variaram

de 86,7 a 96,7% (Tabela 4). Os açúcares álcoois tais como manitol e sorbitol, geralmente não

são metabolizados pelas plantas e têm sido usados para simular a condição de estresse osmótico,

quando adicionados ao meio de cultura, diminuindo o potencial hídrico (SILVA;

SCHERWINSKI-PEREIRA, 2011).

Tabela 4. Sobrevivência (%), integridade das plantas (notas 1 a 5**), presença de raiz (%) e

altura de planta (notas 1 a 4***) de C. tigrina aos 730 dias de conservação in vitro em função

de reguladores osmóticos e temperatura.

Temperatura Reguladores osmóticos (g.L-1)

(ºC) Sacarose (20) Sacarose:Manitol (10:5) Sacarose:Sorbitol (10:5)

........................... Sobrevivência (%) ...........................

18 93,3 aA 86,7 aA 93,3 aA

25 90,0 aA 96,7 aA 90,0 aA

CV(%) 11,15

................................ Integridade das plantas ................................

18 1,4 bA 1,8 aA 1,5 aA

25 1,0 aA 1,5 aB 1,9 bB

CV(%) 21,95

......................... Presença de raiz (%) .........................

18 100,0 aA 100,0 aA 100,0 aA

25 100,0 aA 100,0 aA 100,0 aA

CV(%) 0,00

............................... Altura (cm)...............................

18 2,0 aA 1,9 aA 2,0 aA

25 2,5 bA 2,2 aA 2,1 aA

CV(%) 12,15 *Médias seguidas de letras minúsculas na coluna e letras maiúsculas na linha dentro de cada variável, não diferem

estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. **Notas de integridade das plantas: 1=folhas e brotos

totalmente verdes; 2=início do secamento das folhas; 3=entre 30 e 50% de folhas mortas; 4= mais de 50% de

folhas mortas e 5=folhas e brotos totalmente mortos. ***Notas altura: 1= altura semelhante a inicial (1-2 cm); 2=

até o dobro da altura inicial; 3= até o triplo da altura inicial e 4= mais que o triplo da altura inicial.

Dessa maneira, pode-se propor que o gênero Cattleya, por ser de metabolismo CAM

(HE et al., 2013), provavelmente as concentrações de manitol e sorbitol não limitaram a

absorção de água e nutrientes, não influenciando, portanto, na sobrevivência das plantas.

Em relação à integridade das plantas, para ambas as temperaturas, as plantas

apresentaram folhas e brotos totalmente verdes (Tabela 4). O uso de temperaturas mais baixas

que as usadas no cultivo in vitro, diminui o metabolismo da planta, ocasionando uma redução

na atividade das enzimas (LIMA-BRITO et al., 2011), o que provavelmente foi decisivo na

viabilidade das plantas durante a conservação in vitro.

Durante o período de conservação, 100% das plantas apresentaram raízes (Tabela 4). A

presença de raízes pode ser um indicativo de boas condições de cultivo, tornando-se positivo

43

para a retomada de crescimento sempre que for necessário e benéfico para eventual

aclimatização das mesmas (CAMOLESI et al., 2010).

Quanto à altura, as plântulas apresentaram pouco crescimento, objetivo principal do

crescimento lento, independente da temperatura e reguladores osmóticos, exceto em sacarose a

25ºC (Tabela 4). Isso infere que essa planta de metabolismo CAM, epífita e endoreduplicada,

adaptada a diversas condições, apresenta crescimento lento como comprovado pela literatura

(KERSTEN, 2010).

Na conservação in vitro é fundamental a redução do crescimento da planta para evitar

consecutivos subcultivos, sem perder a capacidade propagativa da espécie visando a retomada

do crescimento. O teste de viabilidade é um indicativo de sucesso para o desenvolvimento de

um protocolo de conservação.

Diante disso, após o período de 730 dias de conservação in vitro, todas as plântulas

foram transferidas para o meio de cultivo MS completo e retomaram seu crescimento normal.

Esse procedimento é necessário para demonstrar que as plantas conservadas in vitro

mantiveram o vigor e potencial de propagação. O teste de viabilidade demonstrou que as

diferentes concentrações de sais MS e os reguladores osmóticos usados na conservação não

inviabilizaram a capacidade responsiva da cultura.

Os resultados alcançados possibilitaram inferir que, para a multiplicação in vitro das

plantas, os meios de cultura líquido estacionário e semissólido podem ser utilizados, sendo 10

mL para o meio líquido estacionário e 25 mL do meio semissólido. A aclimatização pode ser

realizada utilizando somente a casca de pinus. A espécie pode ser conservada sob regime de

crescimento lento por um período de 730 dias, utilizando meio de cultura com 25% dos sais de

MS e temperatura de 18ºC ou 25ºC (Figura 1A). Já para o experimento com reguladores

osmóticos pode-se conservar com 20 g.L-1 de sacarose à 25ºC (Figura 1B).

Figura 1. Plântulas de C. tigrina aos 730 dias de conservação in vitro em função das diferentes

concentrações de meio MS e temperatura à 25ºC (A) e reguladores osmóticos e temperatura à

25ºC (B).

44


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47

6. ARTIGO 3

DUPLICAÇÃO CROMOSSÔMICA EM Cattleya tigrina A. RICH

RESUMO

A duplicação cromossômica induzida em orquídeas pode beneficiar sua produção por resultar

em flores de maior valor comercial, tamanho e teor de substâncias que intensificam a cor e a

fragrância quando comparadas com orquídeas diploides. Esse trabalho teve como objetivo

induzir e confirmar a poliploidização artificial, utilizando para isso a citometria de fluxo e

análise estomática. Os explantes foram tratados com colchicina nas concentrações de 0; 2,5; 7,5

e 12,5 mM, por 24 e 48 horas e com orizalina, nas concentrações de 0, 10, 30 e 50 μM, por três

e seis dias. Para as análises de citometria de fluxo, uma amostra de tecido foliar foi retirada de

cada planta, triturada para liberação dos núcleos e corada com iodeto de propídio. Além da

citometria de fluxo, a ploidia das plantas tratadas com antimitóticos foi avaliada por meio da

análise dos estômatos. Para isso utilizou-se folhas jovens onde foram avaliadas a densidade,

funcionalidade e índice estomático. A colchicina proporcionou indução de poliploidia

satisfatória em C. tigrina em todas as concentrações e tempos de exposição, obtendo maior

número de indivíduos poliploides na concentração de 12,5 mM em 48 horas. Orizalina não

induziu a duplicação cromossômica nas concentrações testadas.

Palavras-chave: Orchidaceae, poliploidia, citometria de fluxo, análise estomática.

48

ABSTRACT

CHROMOSOME DOUBLING IN Cattleya tigrina A. RICH

Chromosome doubling, once it is induced in orchids, may benefit their production, as it results

in flowers of greater commercial value and size, as well as displaying a content of substances

that intensifies their color and fragrance, when compared to diploid orchids. This work was

aimed at inducing and confirming artificial polyploidization, by using flow cytometry and

stomatal analysis. The explants were treated with colchicine, at concentrations of 0, 2.5, 7.5,

and 12.5 mM for 24 and 48 hours, together with oryzalin at concentrations of 0, 10, 30, and 50

μM, for three and six days. For the flow cytometric analyses, a leaf tissue sample was withdrawn

from each plant, then crushed to release the nuclei, and stained with propidium iodide. In

addition to flow cytometry, the ploidy of the antimitotic treated plants was evaluated by stomata

analysis. For this, young leaves were used where the density, functionality, and the stomatal

index were evaluated. Colchicine provided satisfactory inductions of polyploidy in the C.

tigrina orchids, at all of the concentrations and at all of the times of exposure. This obtained a

greater number of polyploid individuals in the concentration of 12.5 mM at 48 hours. Oryzalin

did not induce chromosome duplications at the concentrations tested.

Key-words: Orchidaceae, polyploidy, flow cytometry, stomatal analysis.

6.1. Introdução

As espécies da família Orchidaceae destacam-se como importantes plantas ornamentais,

de interesse botânico, econômico, alimentício, medicinal e cosmético (Galdiano-Junior et al.

2012). Espécies pertencentes ao gênero Cattleya Lindley são conhecidas como “rainha das

orquídeas” devido à sua beleza, o que faz ser apreciada por todos e com isso, algumas espécies

desse gênero, como a C. tigrina, estão na lista de vulneráveis à extinção (MMA. 2014).

A devastação da Mata Atlântica e a coleta predatória gera a perda do material genético

das espécies em geral, bem como das orquídeas, podendo interferir na variabilidade genética.

Dessa maneira, tornar-se relevante o estudo da duplicação cromossômica com o intuito de

diminuir o foco das espécies nativas ameaçadas de extinção, uma vez que pode proporcionar o

aumento das estruturas vegetativas da espécie e com isso o desenvolvimento de variedades mais

atrativas.

Além disso, a poliploidização possibilita aumentar a base genética, recuperando a

fertilidade de híbridos interespecíficos, alcançando rumos de reprodução em um pequeno

espaço de tempo (Ishigaki et al. 2009; Souza-Kaneshima et al. 2010; Pereira et al. 2014). As

plantas poliploides podem ocorrer naturalmente devido a alguns procedimentos citológicos,

como a produção de gametas não reduzidos, no entanto, podem ser conseguidos sinteticamente

através da indução da duplicação cromossômica de células somáticas mediante o uso de agentes

antimitóticos (Lee et al. 2008). Os agentes antimitóticos atuam ligando-se às proteínas que

formam as fibras do fuso (tubulinas), impedindo sua polimerização e suprimindo a formação

das fibras, o que impossibilita a separação dos cromossomos na anáfase e resulta na formação

de células com um complemento cromossômico duplicado (Dhooghe et al. 2011).

A colchicina, o agente antimitótico mais comumente utilizado para indução de

duplicação cromossômica, é um alcaloide extraído da planta Colchicum autumnale, que apesar

de apresentar alta toxicidade tanto às plantas quanto ao ser humano, atua eficientemente

somente nas células que estão em divisão. Por não atingir todas as células do material tratado,

é comum o aparecimento de mixoploides (Carvalho et al. 2005). Portanto, a colchicina precisa

ser aplicada em quantidades maiores, o que é altamente tóxico.

Outro antimitótico usado é a orizalina, que tem sido utilizado com sucesso para a

poliploidização de plantas ornamentais, apesar de pouco explorado em orquídeas (Miguel e

49

Leonhardt 2011). A indução de poliploides com colchicina e orizalina tem sido utilizada em

várias espécies vegetais, como Cattleya intermedia (Silva et al. 2000), Dendrobium nobile

(Vichiato et al. 2007; Vichiato et al. 2014), Oncidium flexuosum (Unemoto et al. 2009),

Dendrobium scabrilingue (Sarathum et al. 2010), Dendrobium chrysotoxum (Atichart 2013) e

Dendrobium, Cymbidium, Epidendrum, Odontioda, Phalaenopsis (Miguel e Leonhardt 2011).

No entanto, nenhum estudo relatou a aplicação desses agentes antimitóticos para a indução de

poliploides in vitro em C. tigrina.

O nível de poliploidia altera uma série de características anatômicas como espessura e

comprimento das folhas, tamanho dos estômatos, tamanho e textura de flores e período de

floração (Xu et al. 2010). Sendo que a duplicação cromossômica pode ser comprovada tanto

utilizando a citometria de fluxo, que quantifica o conteúdo de DNA dos núcleos (Dolezel e

Bartos 2005; Younis et al. 2013), quanto pela análise estomática, que inclui a análise do

tamanho e densidade de estômatos, diâmetro polar e equatorial que possibilita a identificação

entre poliploides e diploides, uma vez que a área dos estômatos aumenta com o aumento do

número de cromossomos (Vichiato et al. 2006).

Devido à relevância da C. tigrina, este trabalho teve como objetivo induzir a poliploidia

e confirmar a poliploidização artificial por citometria de fluxo e análise estomática.


6.2.1. Material botânico e estabelecimento da cultura

Frutos maduros foram coletados para o estabelecimento de plântulas in vitro, com base

no estudo biogeográfico da ocorrência de populações de C. tigrina no estado de Sergipe

(Arrigoni-Blank et al. 2016).

As cápsulas de sementes foram lavadas com água e detergente neutro e desinfestadas

com álcool a 70% (v/v) durante 1 minuto numa câmara de fluxo laminar. Em seguida, o material

foi imerso em solução de hipoclorito de sódio a 5% por 20 minuto e submetido a três lavagens

com água destilada e autoclavada. As cápsulas foram abertas e as sementes foram isoladas e

inoculadas em meio de cultura MS (Murashige e Skoog 1962), com metade dos

macronutrientes, suplementadas com 30 g L-1 de sacarose, 7 g L-1 de ágar e 1 g L-1 carvão

ativado.

Os frascos foram mantidos em sala de temperatura controlada (25 ± 2ºC), com

fotoperíodo de 12 horas e densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (DFFF) de 40 μmol m-2

s-1. Plântulas com 2 cm de comprimento, foram utilizadas como fontes de explantes para a

indução de poliploidia.

6.2.2. Indução de poliploidia in vitro

Duzentas e quarenta plântulas in vitro de C. tigrina, obtidas através do estabelecimento

in vitro, foram submetidas a tratamentos com colchicina (C22H25NO6) e orizalina (3,5-dinitro-

N4, N4, dipropilsulfanilamida).

A colchicina foi utilizada nas concentrações finais de 0; 2,5; 7,5 e 12,5 mM e a orizalina,

nas concentrações de 0, 10, 30 e 50 μM. A inoculação foi realizada em Erlenmeyer com 100

mL de meio líquido MS sob agitação (60 rpm), por 24 e 48 horas para colchicina e 3 e 6 dias

para orizalina utilizando borbulhamento de ar constante, por meio de bombas aeradoras de

aquário doméstico.

Foi utilizado o delineamento experimental inteiramente casualizado em esquema

fatorial 4x2, sendo quatro concentrações de colchicina ou orizalina em dois períodos de

exposição. Após o tratamento, as plantas foram submetidas a uma tríplice lavagem com água

destilada e transferidas para o meio de multiplicação (MS suplementado com 30 g L-1 de

sacarose e 7 g L-1 de ágar) para mais um subcultivo por 90 dias.

Todas as brotações foram individualizadas e cultivadas em meio MS suplementado com

30 g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de ágar por um período de 60 dias. As plantas foram mantidas em

50

sala de crescimento, com densidade de fluxo de fótons fotossintéticos de 40 μmol. m-2. s-1,

fotoperíodo de 12 horas e temperatura de 25±2ºC.

Após 60 dias de cultivo dos brotos individualizados, foi avaliado o nível de ploidia

através da análise de citometria de fluxo e da análise estomática.

6.2.3. Análise de citometria de fluxo de plantas tratadas com antimitóticos

Para a determinar o conteúdo de DNA, foram utilizadas folhas jovens das plantas de C.

tigrina e de "Sunki Maravilha” (Citrus sunki Hort ex Tan.). O Citrus sunki possui 2C = 0,745

pg de DNA e foi utilizado como padrão de referência interno. Amostras de folhas de plantas de

C. tigrina tratadas com antimitóticos e do padrão de referência foram maceradas juntas em 1

ml de tampão Galbraith (1983) gelado para a liberação dos núcleos. A suspensão dos núcleos

foi filtrada através de um filtro CellTrics® 30 µm (Partec) e acondicionada no escuro até a

coloração dos núcleos. Os núcleos corados pela adição de 25 μL de uma solução de 1mg/1mL

de iodeto de propídeo (Sigma) foram armazenados no escuro, dentro de um recipiente com gelo

triturado. As amostras foram analisadas utilizando o citômetro Attune™ NxT Acoustic

Focusing Cytometer e os histogramas obtidos com o software Attune cytometer. Para cada

amostra, os dados de fluorescência foram adquiridos de pelo menos 10 mil núcleos.

Os coeficientes de variação foram obtidos no próprio programa de análise e o conteúdo

de DNA nuclear em (pg) das plantas foi estimado utilizando-se a fórmula:

Amostra 2C (pg) = canal do pico G1 da amostra

canal do pico G1 de 𝐶𝑖𝑡𝑟𝑢𝑠 𝑠𝑢𝑛𝑘𝑖 𝑥 Conteúdo 2C de DNA

6.2.4. Análises anatômicas de plantas submetidas à indução de duplicação de

cromossomos

As amostras foram coletadas da região mediana da primeira folha completamente

expandida de plantas cultivadas in vitro. Secções paradérmicas da folha foram submetidas à

clarificação em hipoclorito de sódio (1% de cloro ativo) e lavagem em água destilada. Os cortes

foram corados com dupla coloração composta por Azul de Astra e Safranina (1:1 v/v), e

posteriormente, foram montadas em lâminas semipermanentes com água glicerinada.

Para análise da densidade (número de estômatos / área), funcionalidade (diâmetro polar

dos estômatos/diâmetro equatorial dos estômatos) e índice estomático [(número de estômatos /

número de estômatos + número de células epidérmicas) x100], foram utilizadas 30 secções

paradérmicas, as quais foram fotografadas em microscópio óptico equipado com câmera

LEICA DM500 e visualizadas no computador com o auxílio do programa LAS EZ®.

Todas as medições foram feitas pelo programa de análise de imagens UTHSCSA

ImageTool® (University of Texas, San Antonio, USA), utilizando-se calibrações feitas com

régua microscópica fotografada nos mesmos aumentos das fotomicrografias.

Os dados foram submetidos à análise de variância e, quando necessário, as médias foram

comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o programa SISVAR®

(Ferreira 2011).

51


6.3.1. Indução de poliploidia in vitro

Nos tratamentos com colchicina, 1.141 plântulas foram obtidas de 240, com 557 plantas

com cromossomos duplicados e 584 plantas com cromossomos não duplicados. Nos

tratamentos com orizalina, foram obtidas 916 plântulas de 240, mas nenhuma planta duplicada

foi observada. C. tigrina apresentou um conteúdo médio de DNA de 3,21 pg em plantas

diploides e 6,69 pg em plantas autotetraploides. A taxa de sobrevivência foi de 100% para

plantas submetidas a tratamentos com colchicina, independentemente das concentrações ou

tempo de exposição.

O crescimento inicial das plantas aos 45 dias, em relação ao controle diploide, foi lento

para as plantas com cromossomos duplicados. Pode-se inferir que devido ao processo de

enderreduplicação existente nessa espécie, o qual possibilita seu crescimento lento e com uma

nova duplicação cromossômica, ocorreu a diminuição do crescimento em relação ao controle

diploide.

A colchicina nas concentrações de 2,5 mM induziu (128 plantas), 7,5 mM (197 plantas)

e 12,5 mM (232 plantas) mM com cromossomos duplicados quando aplicada por 24 e 48 horas,

como confirmado por citometria de fluxo (Tabela 1) (Figura 1) e análise estomática (Figura 2).

Considerando os resultados analisados, as mudas submetidas a tratamentos com

colchicina, independentemente das concentrações e do tempo de exposição, foram duplicadas.

A concentração de 12,5 mM em 24 e 48 horas apresentou maior número de plantas duplicadas

(Tabela 1).

6.3.2. Análise de citometria de fluxo de plantas tratadas com antimitóticos

A C. tigrina é uma espécie que apresenta endopoliploidia, sendo possível observar no

mesmo tecido células de três diferentes ploidias no seu ambiente natural. Assim, a planta

controle apresentou a maioria das células diploides e tetraploides (Figura 1A). Com a indução

da duplicação cromossômica, as plantas passaram a apresentar a maioria das células tetraploides

e octoploides (Figura 1C).

As plantas com cromossomos duplicados apresentaram folhas espessas, com coloração

mais intensa em relação as folhas das plantas diploides. Pode-se inferir que isso esteja

relacionado ao aumento das enzimas e dos pigmentos celulares, acentuando a coloração das

folhas. Sendo assim, esse pode ser o fator principal para uma coloração mais intensa verificada

nas folhas da planta tetraploide (Leech et al. 1985; Guerra et al. 2014). Esses parâmetros

também foram referenciados em outras espécies como banana (Musa sp.) (Pio et al. 2014),

limão cravo (Citrus limonia) (Allario et al. 2011) e citros (Latado et al. 2007).

Houve diferença significativa entre as concentrações e a estimativa da quantidade de

DNA. Todos os histogramas obtidos indicaram 3 picos distintos e em todos eles o resultado foi

semelhante. As plântulas controle, ou seja, sem passar por substâncias antimitóticas,

apresentaram menores índices de DNA. As plântulas cultivadas nos demais tratamentos em

substâncias antimitóticas tiveram maiores conteúdos de DNA (Tabela 2). Em todos os

histogramas foi possível observar que os três picos mostraram valores que são múltiplos entre

si (Tabela 2), demostrando assim que está ocorrendo endorreduplicação, o que leva a inferir

que as ploidias sejam 2C no primeiro pico, 4C no segundo e 8C no terceiro. Na Figura 1 estão

os histogramas dos tratamentos analisados e todos eles apresentam três picos da C. tigrina e um

pico do padrão de referência interno (representado pelo primeiro pico), que foi usado para

calcular os índices de DNA.

O processo de endorreduplicação possivelmente foi indicado durante a evolução para o

benefício de plantas e desenvolvimento dos órgãos. De acordo com as diversas situações

identificadas em várias espécies, em relação à planta, órgão ou fisiologia celular, muitos papéis

funcionais foram descritos para buscar esclarecer a importância da endorreduplicação

(Chevalier et al. 2011). A endorreduplicação acontece durante a diferenciação de células que

52

são bastante especializadas em sua morfologia, como é o caso das folhas suculentas da C.

tigrina que armazenam grande quantidade de água internamente.

Nos tratamentos com orizalina, a sobrevivência das plantas foi de 100%, independente

das concentrações e tempo de exposição. Com isso, a orizalina não prejudicou a sobrevivência

das plantas.

A orizalina induz a duplicação dos cromossomos em concentrações menores que as

usadas para a colchicina devido à elevada afinidade das dinitroanilinas pela tubulina e à

estabilidade do complexo orizalina-tubulina (Ganga e Chezhiyan 2002; Pio et al. 2014). No

presente estudo, as concentrações do agente antimitótico testadas parecem ter sido muito baixas,

não sendo efetivas na promoção da duplicação dos cromossomos (Tabela 3). Orizalina não

forneceu plantas duplicadas nos tempos e tratamentos testados (Figura 1B), portanto, no futuro,

novos estudos serão necessários para essa espécie, testando concentrações mais altas e variando

os tempos de imersão.

A C. tigrina respondeu diferentemente aos agentes antimitóticos testados, na qual a

capacidade de duplicação cromossômica das substâncias (colchicina e orizalina) foram

diferentes, sendo que as concentrações de colchicina favoreceram a duplicação. Diante dos

resultados encontrados, pode-se dizer que a duplicação cromossômica varia conforme o tipo,

espécie, genótipo, tempo de exposição, idade e técnica de aplicação (Dhooghe et al. 2011;

Wannakrairoj e Wondyifraw 2013). Isso pode ser verificado em Dendrobium nobile (Vichiato

et al. 2007; Vichiato et al. 2014), Oncidium flexuosum (Unemoto et al. 2009), Dendrobium

scabrilingue (Sarathum et al. 2010).

Na análise de citometria de fluxo, a ploidia das plantas pode ser determinada de maneira

segura, visto que o conteúdo de DNA não é motivado por fatores externos, como conteúdo de

água no tecido da planta, desenvolvimento de lâmina foliar e intensidade luminosa (Pio et al.

2014).

Durante o desenvolvimento de algumas plantas, o ciclo celular normal pode ser

modificado por um ciclo celular diferente, em que não realiza a mitose (Chevalier et al. 2011).

Este ciclo alterado chamado de ciclo de endorreduplicação baseia-se em um ou vários ciclos de

síntese de DNA na ausência de mitose, possibilitando o processo de expansão celular e

colaborando para o crescimento de órgãos vegetais (Lukaszewska e Sliwinska 2005). Este

evento pode ocorrer em várias células da planta, principalmente aquelas submetidas ao

envelhecimento ou diferenciação (Sabelli e Larkins 2009).

Endopoliploidia em plantas tem sido observada em vários tecidos diferentes (Loureiro

et al. 2007). Em plantas superiores é uma característica comum, sendo analisada em tecidos e

órgãos da espécie. Na família Orchidaceae foi constatada a ocorrência de endopoliploidia no

gênero Cattleya, nas espécies C. trianae, C. grandis, C. guttata, C. labiata, C. cernua, C. tenius,

C. elongata, C. crispata, C. rupestres, C. aclandiae, C. amethystoglossa, C. pfisterii, C.

rupestris, C. sincorana, C. loddigesii e C. granulosa, resultando na presença de picos 2C, 4C e

8C confirmadas por citometria de fluxo (Souza et al. 2017).

6.3.3. Análises anatômicas de plantas submetidas à indução de duplicação de

cromossomos

A análise estomática é um método que permite a identificação de plantas poliploides e

diploides por meio da contagem e verificação comparativa dos estômatos, uma vez que o

comprimento dos estômatos aumenta com o número de cromossomos (Campos et al. 2009, Pio

et al. 2014). O aumento no nível de ploidia é diretamente proporcional ao tamanho e número

dos estômatos. Essa técnica foi considerada um dos indicadores para estimar a taxa de

poliploidia em várias espécies, como Cattleya intermedia (Silva et al. 2000), Vanda (Lim e Loh

2003), Cymbidium (Kim e Kim 2003), Dendrobium nobile (Vichiato et al. 2006) e Dendrobium

chrysotoxum (Atichart 2013).

No presente estudo a análise estomática mostrou-se eficiente para determinação da

ocorrência ou não de duplicação cromossômica e foi observada uma correspondência com os

53

resultados obtidos pela citometria de fluxo. A maioria das plantas classificadas como tendo os

cromossomos duplicados pela citometria de fluxo foram confirmadas pela análise estomática.

Assim, por ser de menor custo, essa análise pode ser utilizada para pré-seleção de possíveis

poliploides, reduzindo o número de amostras para a análise por citometria de fluxo.

A funcionalidade dos estômatos em plantas com cromossomos duplicados (1,25) foi

significativamente maior, e a densidade estomática (3,30 mm2) foi menor em comparação com

as plantas que não tiveram seus cromossomos duplicados (1,09) (Tabela 4). Esses dados

corroboram com os resultados obtidos com estudos de outras espécies, como Dendrobium

nobile e Musa spp., em que as plantas poliploides têm menor densidade de estômatos em relação

ao controle (Vichiato et al. 2006, Pio et al. 2014).

Observou-se que o índice estomático em plantas diploides (6,96) foi maior com relação

as plantas com cromossomos duplicados (Tabela 4). Dessa forma, o índice estomático

(frequência de estômatos) nas folhas diploides de C. tigrina pode estar relacionado com o menor

tamanho dos estômatos e com o menor tamanho das células epidérmicas.

As plantas obtidas dos tratamentos que continham o agente antimitótico colchicina

apresentaram estômatos maiores e menos frequentes quando comparado com as plantas do

controle (Figura 2), e foi considerado que tinha ocorrido a duplicação dos cromossomos, sendo

essa observação confirmada através da citometria de fluxo.


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57

Tabela 1. Análise da citometria de fluxo de C. tigrina submetida ao tratamento com colchicina.

Colchicina

(mM)

Total de

plantas

Plantas com cromossomos

duplicados (%)

Plantas com cromossomos

não duplicados

Número Média Número Média

0 89 0 (0,00%) 0,00 a 89 2,96 a

2,5 por 24 h 177 55 (31,07%) 1,83 a 122 4,06 a

7,5 por 24 h 167 97 (58,08%) 3,23 a 70 2,33 a

12,5 por 24 h 166 100 (60,24%) 3,33 b 66 2,20 a

0 85 0 (0,00%) 0,00 a 85 2,83 a

2,5 por 48 h 130 73 (56,15%) 2,43 a 57 1,90 b

7,5 por 48 h 145 100 (68,96%) 3,33 a 45 1,50 b

12,5 por 48 h 182 132 (72,52%) 4,40 a 50 1,66 b

CV (%) 27,83 12,37 * Médias seguidas pela mesma letra na coluna, entre 24 e 48 horas, não diferem pelo teste de Tukey (p <0,05).

Tabela 2. Índice de DNA (ID) de C. tigrina submetida ao tratamento com colchicina e analisadas em

citômetro de fluxo.

Colchicina (mM) ID ID ID

Pico 1 Pico 2 Pico 3

0 3,23 b 6,40 b 12,68 b 2,5 por 24 h 6,11 a 12,18 a 24,32 a 7,5 por 24 h 6,21 a 12,34 a 24,52 a 12,5 por 24 h 6,32 a 12,37 a 24,55 a 0 3,23 b 6,40 b 12,68 b 2,5 por 48 h 6,20 a 12,29 a 24,43 a 7,5 por 48 h 6,20 a 12,40 a 24,44 a 12,5 por 48 h 6,25 a 12,46 a 24,49 a

CV(%) 8,43 7,36 7,24 * Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem pelo teste de Tukey (p <0,05).

Tabela 3. Análise da citometria de fluxo de C. tigrina submetida a tratamento com orizalina

Número de plantas

Orizalina

(μM)

Número total

de plantas

cromossomos

duplicados (%)

cromossomos não

duplicados (%)

0 62 0 (0,00%) 62

10 por 3 dias 115 0 (0,00%) 115

30 por 3 dias 161 0 (0,00%) 161

50 por 3 dias 166 0 (0,00%) 166

0 68 0 (0,00%) 68

10 por 6 dias 136 0 (0,00%) 136

30 por 6 dias 102 0 (0,00%) 102

50 por 6 dias 106 0 (0,00%) 106

58

Tabela 4. Densidade, funcionalidade e índice estomático nas folhas de plantas com

cromossomos duplicados e não duplicados de C. tigrina.

Nível de ploidia Densidade

(mm2)

Funcionalidade

(Diâmetro polar/diâmetro

equatorial)

Índice

estomático

Cromossomos não duplicados 7,61 a 1,09 b 6,96 a

Cromossomos duplicados 3,30 b 1,25 a 4,28 b

CV (%) 3,48 7,79 3,85

*Médias seguidas das mesmas letras, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

59

Figura 1. Histogramas de citometria de fluxo de plantas de C. tigrina tratadas com colchicina

usando Citrus sunki como padrão interno de referência. A) Controle; B) Tratamento com

orizalina; C) Tratamento com colchicina 2,5 mM durante 24 horas.

60

Figura 2. Análise estomática de uma planta controle (A e B) e com cromossomos duplicados

(C e D) de C. tigrina.

61

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Com base nos resultados apresentados nesse trabalho, conclui-se que a embriogênese

somática permite a propagação in vitro da orquídea C. tigrina, garantindo a possibilidade de

obtenção de mudas viáveis através de embriões somáticos. Portanto, outra maneira de se

propagar essa espécie in vitro foi através da multiplicação de plântulas de C. tigrina em meio

MS líquido estacionário.

Os experimentos realizados neste estudo apontaram que a conservação in vitro sob

crescimento lento, para a espécie C. tigrina, gerou resultados satisfatórios, o que a torna uma

eficiente estratégia para a conservação de seu germoplasma.

A duplicação cromossômica mostrou-se promissora para o aumento da variabilidade

genética. Tais resultados podem auxiliar no desenvolvimento de variedade mais atrativa que

desviaria o foco da espécie nativa vulnerável à extinção, beneficiando assim a orquicultura.

62

ANEXOS

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