Microscopia básica2

8/14/2019 Microscopia bsica2

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MINISTRIO DA EDUCAO E DO DESPORTOUNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRASDEPARTAMENTO DE AGRICULTURA

REVISO DE MICROSCOPIA

Com a ajuda do microscpio no h nada to pequeno que possa escapar s

nossas investigaes; portanto h um novo e visvel mundo descoberto a serentendido. Robert Hookie (Micrographia, 1664).

Edilene C.S. MarchiProf. Daniel Melo de CastroDisciplina DBI Anatomia vegetal

2005


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Tipos de microscopia

Histrico

Desde a antiguidade povos como os egpcios, gregos e romanos

conheciam a arte de talhar e polir cristais de rochas e usam essas primeiras lupasprimitivas como objetos decorativos. No entanto, somente em meados do sculo

XIII, um monge chamado Alejandro Spina divulgou o segredo e a construo da

fabricao de lentes corretivas. Os primeiros estudos cientficos datam do sculo

XVII conduzidos por Johanes Kepler que estudou os fenmenos ticos e a

formao de imagens no olho.

Atansio Kircher (1601-1680) foi o primeiro a usar a palavra

microscopium nome dado ao microscpio daquela poca (Gato, 2005).

Muitos atribuem a inveno do microscpio a Galileu, porm foi Antonievan Leeuwenhoek, (1632-1723), quem realmente aperfeioou o instrumento e o

utilizou na observao de seres vivos. Seu microscpio era dotado de apenas

uma lente de vidro, permitindo um aumento de at 300 vezes. Com este

instrumento Leeuwenhoek estudou os glbulos vermelhos do sangue e constatou

a existncia dos espermatozides (Embrapa, 2005).

Robert Hooke, em 1665 publicou seu livro intitulado Micrographia

onde descreveu o microscpio e como ele havia descoberto a circulao do

sangue nos peixes. Em seu microscpio, Robert Hooke incorporou o ajuste finoe acrescentou mais uma lente (Embrapa, 2005).

Aps o aprimoramento, os microscpios ficaro constitudos por 2

sistemas de lentes de cristal (oculares e objetivas) que produzem ampliaes de

imagem que vo em geral de 100 a 1000 vezes (Embrapa, 2005).

Em 1932, surgiu o microscpio eletrnico permitindo aumentos de 5 mil

a 500 mil vezes. A diferena bsica entre os microscpios tico e eletrnico

que neste ltimo no utilizada a luz, mas sim feixes de eltrons. No

microscpio eletrnico no h lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lenteseletromagnticas. Estas lentes ampliam a imagem gerada pela passagem do feixe

de eltrons no material e a projetam em uma tela onde formada uma imagem

de pontos mais ou menos brilhantes. No entanto, impossvel observar material

vivo neste tipo de microscpio. O material a ser estudado passa por um

complexo processo de desidratao, fixao e incluso em resinas especiais,


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muito duras, que permitem cortes ultrafinos por meio das navalhas de vidro de

ultramicrtomo (Embrapa, 2005).

Na histria da microscopia, 200 anos foram necessrios para que o

microscpio deixasse de se ser um instrumento extico e pouco acessvel para

ser usado em uma escala mais ampla. Ento, a partir do sc. XIX, graas aos

estudos realizados por microscopistas puderam afirmar o conceito de clula

como verdade cientfica, surgindo a cincia da biologia celular (Melo, 2002).

Unidades de medida utilizada em microscopia

Em geral, podem-se dividir as unidades de estruturas biolgicas em

macroscpicas e microscpicas, sendo essa ltima invisvel a olho humano nu.

As unidades de medida em microscopia compreende o micrmetro (m), em

microscopia tica e (m) e o angstrom (), na microscopia eletrnica.

As unidades de medida geralmente usadas em microscopia so as seguintes:Unidade de medida Smbolo Valor

Micrmetro m 0,001 mm (milsima parte do milmetro)Nanmetro nm 0,001m (milsima parte do micrmetro)Angstrom 0,0000001 mm (10-7 mm)

O aumento total do objeto observado calculado multiplicando-se os valores doaumento da objetiva e da ocular.Ocular Objetiva Aumento Dimetro do Campo

10 x 10x (pequeno aumento 100x 1.500m10 x 40x (grande aumento a seco) 400x 375m10 x 100x (imerso em leo) 1.000x 150m

Microscopia de luz

Microscpios so aparelhos nos quais lentes de vidro so associadas de

tal forma que se consiga reproduzir para o olho humano, uma imagem

aumentada e detalhada de objetos, clulas, tecidos e rgos, que vista

desarmada no seria possvel de se observar mais detalhes (Taboga, 2001).

O microscpio de luz assim chamado devido sua fonte luminosa que

uma luz branca oriunda de um filamento de tungstnio (Melo, 2002). O conjunto

de lentes formado pelas objetivas e oculares. A objetiva, a primeira lente e a

que est mais prxima do objeto, capta a luz filtrada pelo condensador e projeta


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Micromtrico imprime ao tubo ou platina movimentos de amplitude muito

reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do

microscpio; Revlver disco adaptado zona inferior do tubo, que suporta

duas a quatro objetivas de diferentes ampliaes: por rotao possvel trocar

rpida e comodamente de objetiva (Reis, 2003).

Figura 2. Partes constituintes do microscpio de luz, em que (A) compem osistema tico e (B) o sistema mecnico (Reis, 2003).

No microscpio tico, a luz que chega aos nossos olhos para formar a

imagem, atravessa primeiro o objeto em estudo. Por isto, o material a ser

observado no pode ser opaco. Muitas vezes, para se obter material biolgico

translcido o suficiente para ser bem observado ao microscpio, preciso

preparar convenientemente o material que quer estudar. Para isto so feitos

cortes muitos finos, de preferncia com uma mquina, chamada micrtomo. O

material a ser cortado recebe um tratamento de desidratao e incluso em

parafina que facilita o manuseio e permite que sejam cortadas fatias muito finas

(Embrapa, 2005).

Na microscopia de luz existem vrios tipos de aparelhos, os quais

apresentam sistemas de lentes e filtros que selecionam um ou outro tipo de luz,

diversificando as imagens formadas. Estes aparelhos so chamados microscpios

especiais e so chamados: microscpio de campo claro, campo escuro,

fluorescncia, invertido, confocal (microscopia de varredura confocal) e de

polarizao.


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a. Microscopia de campo claro

O microscpio de campo claro o mais comum microscpio de luz

(Melo, 2002). Nesse microscpio, o campo de viso aparece iluminado e os

objetos que esto sendo observados apresentam-se mais escuros (Reis, 2003).

Segundo Weiss et al. (1991), a microscopia de campo claro apresenta

algumas vantagens como menor toxicidade por necessitar de menores

concentraes de corantes; baixo contraste, devido ao uso de baixas

concentraes de cromforos naturais ou especialmente corantes vitais, pode ser

grandemente aumentados; observaes feitas no comprimento de onda de

mxima absoro aumentam o contraste. Entretanto, apresenta algumas

limitaes como objetos de fase exibem mnimo contraste em foco e mostra

contraste oposto por cima e abaixo do foco.

b. Microscopia de campo escuro

Microscpio utilizado para visualizar materiais muito pequenos como

plncton, bactrias e cristais (Melo, 2002). As imagens obtidas no campo escuro

apresentam grande contraste e este pode ser ampliado pelo uso de sinal de vdeo

(Weiss et al., 1991).

Baseia-se no princpio de que a luz dispersa pela superfcie dos

materiais que possuem diferentes ndices de refrao. A luz dispersada entra na

objetiva e o objeto aparece iluminado e brilhante sobre um fundo escuro. Tal

consegue-se pela utilizao de um tipo especial de condensador que ilumina o

objeto obliquamente (Reis, 2003). A luz atinge o espcime a ser analisado e

somente os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema, isto ,

objetivas e oculares, formando a imagem (Taboga, 2001) (Figura 3).

Figure 3. Esquema da configurao do

microscpio de campo escuro(Davidson e Abramowitz, 2005).


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um tipo de microscopia utilizada na observao de microorganismos

no corados, suspensos em lquidos, preparaes a fresco e em gota pendente

(Reis, 2003), plnctons, bactrias, gros de plen (Taboga, 2001).

c. Microscopia de contraste de fase

Esse tipo de microscopia foi desenvolvida pelo holands Zernik, na

dcada de 50, baseada nos princpios de difrao da luz, isto , o caminho do

feixe luminoso, na formao da imagem por esse tipo de microscpio, sofre um

retardo ptico, permitindo assim que se possa observar materiais biolgicos sem

a colorao (Taboga, 2001). Portanto, o microscpio de contraste de fase dispe

de certos recursos especficos para estudar clulas vivas e no coradas (Melo,

2002), particularmente til para o estudo da mitose em clulas cultivadas in vitro

(Reis, 2003), e exames rpidos de culturas de clulas, sangue, bactrias, algas,

protozorios de ambientes aquticos, contedo estomacal de animais, anlise de

materiais cermicos, txteis e minerais (Taboga, 2001). Ento, grande parte dos

detalhes de clulas vivas no so detectados no microscpio de campo luminoso

devido ao fato de as estruturas celulares serem transparentes e incolores, no

apresentando contraste suficiente. Contudo, o microscpio de contraste de fase

tem um sistema ptico especial que torna possvel a distino de materiais

biolgicos que diferem ligeiramente no que se refere aos seus ndices de

refrao. A luz que passa atravs de materiais com densidades ligeiramente

diferentes refratada ou desviada do seu trajeto original. Variaes mnimas de

fase, devidas s diferenas de ndice de refrao dentro do objeto, so ampliadas

e transformadas em mudanas de amplitude (intensidade) as quais so

visualizadas como diferenas de contraste na imagem (Reis, 2003) (Figura 4).

Figura 4. Aspecto de clulas vivas observadas com microscpio ptico decampo luminoso (a) e microscpio ptico de contraste de fase (b) (Reis, 2003).


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O microscpio de contraste de fase apresenta sistemas de anis metlicos

postos no caminho da luz. Um na lente condensadora e outro nas objetivas. Uma

singular particularidade que as objetivas de fase apresentam a designao Ph,

oriunda da palavras phase, diferenciando-a das demais. Esses anis, aps

centralizados, promovem o retardo ptico, permitindo assim a visualizao do

espcime sem colorao (Taboga, 2001) (Figura 5).

Figure 5. Esquema da configurao domicroscpio de contraste de fase (Davidsone Abramowitz, 2005).

d. Microscopia de contraste interferencial

A microscopia interferencial mais conhecida a chamada de

microscopia de Normarski. A gerao do contraste a uma alta abertura detrabalho limitada em uma profundidade de campo raso, resultando na

habilidade de tornar a seo com alto contraste de 200 a 300 nm de espessura

(Weiss et al. et al., 1991). Esse tipo de contraste interferencial trabalha com a

defasagem dos comprimentos de ondas. Assim, a defasagem gera uma

deformao na imagem, permitindo o contraste interferencial, aumentando a

superfcie do material analisado. A aplicao dessa microscopia permite a

observao de materiais biolgicos sem colorao, sendo til no monitoramento

de culturas celulares, estudo de morfologia, taxonomia de pequenas larvas e

caros e outros ectoparasitos (Taboga, 2001).

Esse tipo de microscopia utiliza-se de prismas pticos posicionados na

passagem da luz. Esses prismas modificam as fases luminosas que contrastaro

com o meio em que se encontra o material a ser observado. Esse microscpio


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requer uma construo especfica, apesar de no utilizar lentes objetivas

especiais, ele necessita de um revlver com ranhuras para alojar os prismas de

interferncia, ento as cores de interferncia promovero a visualizao da

imagem (Taboga, 2001) (Figura 6).

Figure 6. Esquema da configurao domicroscpio de contraste de faseinterferencial (Davidson eAbramowitz, 2005).

e. Microscopia de fluorescncia

A microscopia de fluorescncia , provavelmente, a mais verstil epoderosa tcnica para localizar protenas dentro da clula pela microscopia de

luz (Lodish et al., 2003).

Fluorescncia a propriedade de algumas substncias para, aps serem

excitadas com radiao de baixo comprimento de onda, emitirem radiao de

maior comprimento de onda. Algumas substncias absorvem a energia da

radiao ultravioleta emitindo depois radiao dentro do espectro de luz visvel.

Microorganismos corados por um corante fluorescente aparecem como objetos

luminosos quando observados com luz ultravioleta. com os recursos desta

tcnica que se evidenciam, por exemplo, os antgenos quando associados a

anticorpos acoplados a molculas fluorescentes, e quantifica-se pelo processo de

fluorometria os objetos de estudo da citoqumica normal e patolgica (Taboga,

2001).


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O mais fluorescente corante chamado de fluorocromo, capaz de emitir

luz visvel (Lodish et al., 2003). Dois exemplos de fluorocromo o corante

alaranjado de acridina que se liga aos cidos nuclicos conferindo uma

fluorescncia amarelo esverdeada ao DNA e avermelhada ao RNA, e a eosina,

que apesar de no ser um fluorocromo se comporta como tal, aumenta a

fluorescncia natural da elastina (Taboga, 2001). Os fluorocromos, quando

conjugados com anticorpos, torna possvel a identificao de clulas individuais

que reagem com o anticorpo (aplicao designada de imunofluorescncia) (Reis,

2003). Os fluorocromos podem se combinar com estruturas celulares, tornando-

as fluorescentes, tornando-as passveis de identificao e localizao, como

protenas ou estruturas celulares (Melo, 2002).

O microscpio de fluorescncia utiliza um sistema ptico que interage

pouco com a luz. Utiliza-se uma luz de mercrio de alta presso, cujos picos

variam entre 312 e 579 nm. Nessa microscopia tambm h filtros especiais

chamados de filtros de excitao e filtros de barragem (Taboga, 2001). Os filtros

de excitao localizam-se logo aps a sada de luz antes do condensador,

selecionando o comprimento de onda desejado. J, os filtros de barragem

localizam-se entre a objetiva e a ocular, aps o objeto, deixando passar somente

a luz fluorescente, ento o material fluoresce contra um fundo escuro (Taboga,

2001) (Figura 7).

Figure 7. Esquema da configuraodo microscpio de fluorescncia(Davidson e Abramowitz, 2005).

Na microscopia de fluorescncia pode-se detectar compostos

naturalmente fluorescentes, como a clorofila, lignina de paredes celulares,

elastina e colgeno (Taboga, 2001).


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Figura 8. Esquema geral de um microscpio de varredura confocal, mostrandoas principais partes constituintes (Fellers e Davidson, 2005).

Graas sensibilidade dos detectores fotoeltricos e o controle eletrnicoda intensidade dos sinais, imagens pouco evidentes na microscopia de

fluorescncia so observadas com mais nitidez na microscopia confocal

(Taboga, 2001) (Figura 9).

Figura 9. Comparao de imagens obtidas do microscpio de fluorescncia (a, be c) e do confocal de varredura (d, e, f) (Fellers e Davidson, 2005).

Na letra a e d, tem-se uma espessa seo de tecido de medula humana.

Nota-se um significante grau de detalhe estrutural nas imagens obtidas com a

microscopia confocal de varredura. Na letra b e c, tem-se fibras musculares de

ratos. Na imagem obtida pela microscopia confocal percebe-se uma topografiaestriada no visvel na imagem b (microscopia de fluorescncia). Nas letras c e

d, tem-se gro de plen de girassol. Existe uma dramtica diferena entre as

imagens obtidas pelas duas tcnicas, a microscopia confocal revela diferena de

cor e um envelope envoltrio (Fellers e Davidson, 2005).


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g. Microscopia de polarizao

Esse microscpio apresenta dois prismas, ou filtros, chamados de

polarizador e analisador. Esses filtros se posicionam entre a fonte de luz e o

condensador (filtro polarizador) e entre a objetiva e a ocular (filtro analisador)

(Figura 10). Os filtros polarizadores promovem a seleo de apenas um plano de

direo de vibrao de ondas luminosas, conhecido por plano da luz polarizada

(PPL). Sob o efeito do PPL, os componentes macromoleculares birrefringentes

(anisotrpicos) apresentam brilho colorido ou no, promovendo um realce destes

materiais em detrimento a outros no birrefringentes (isotrpicos), que se

distinguem em fundo escuro (Taboga, 2001).

Figure 10. Esquema da configuraodo microscpio de luz polarizada(Davidson e Abramowitz, 2005).

Os materiais biolgicos mais estudados na microscopia de polarizao

citam-se clulas musculares estriadas, espermatozides, paredes celulares,

amido, colgenos e DNA (Taboga, 2001). Em estudos com o colgeno, pode-se

aumentar sua birrefringncia utilizando-se de corantes como, Xylidine Ponceaus

ou Picrossrus. Um outro corante, que se presta a estudos anisotrpicos, o azul

de toluidina, permitindo estudos de ordem e agregao molecular da cromatina,

da matrix extracelular e outros componentes (Taboga, 2001).

Microscopia eletrnica

A construo do microscpio eletrnico foi de suma importncia para a

observao de organelas e estruturas celulares que at ento eram desconhecidas,

pois se encontravam abaixo do limite de resoluo do microscpio tico (Melo,

2002).


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Como foi mencionado anteriormente, o poder de resoluo do

microscpio ptico est limitado pela abertura numrica e pelo comprimento de

onda da radiao. No sendo possvel aumentar a abertura numrica, a soluo

passou pela utilizao de radiao de menor comprimento de onda () (Reis,

2003).

Em 40 anos a microscopia eletrnica foi inventada, sendo que 2

princpios bsicos, propostos no incio do sculo XX, foram primordiais para a

construo do microscpio eletrnico (Melo, 2002). O primeiro, estabelecido,

em 1924, por Louis de Broglie, um fsico francs, demonstrou que os eltrons

tm propriedades ondulatrias, semelhana da luz visvel, ultravioleta e raios x.

O comprimento de onda de um eltron em movimento depende da sua

velocidade e esta da energia de acelerao que lhe imposta (Reis, 2003). O

segundo foi do ingls Bush, que em 1926, demonstrou que um campo

magntico, adequadamente estruturado, poderia ser usado como lentes de

aumento para um feixe de eltrons (Melo, 2002). Ento, o comprimento de onda

de um eltron dado por:

Nesta frmula representa o comprimento de onda, h a constante de Planck(6,62559 x 10

-34

J.s-1), m a massa da partcula e v a velocidade da partcula.

Os eltrons podem ser acelerados por uma diferena de potencial, sendo

a velocidade diretamente proporcional a essa diferena de potencial (tabela 1).

Tabela 1. Comprimento de onda de um eltron em funo da diferena de

potencial aplicada.

Diferena de potencial (V) - Comprimento de onda (m)

150 0,150000 0,0053100000 0,00381000000 0,00087

Para efeitos de clculo, valores aproximados para o comprimento de onda dos

eltrons podem ser obtidos pela seguinte frmula:


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onde V a diferena de potencial em volts.

Os eltrons acelerados por diferena de potencial de 50 000 a 100 000

volts tm um comprimento de onda cerca de 100 000 vezes menor que o da luz

visvel. Graas ao reduzido valor de possvel aumentar o poder de resoluo.

O limite de resoluo do microscpio eletrnico de transmisso atinge 0,4 a 0,5

m (excepcionalmente 0,2 m) o que representa, relativamente ao microscpio

ptico, um poder resolvente cerca de 500 vezes maior. Em objetos biolgicos o

limite de resoluo situa-se perto de 1 m (10 ) (Reis, 2003).

O primeiro microscpio foi construdo em 1932, na Alemanha, na

Universidade Tcnica de Berlim, por Max Knoll e Ernst Ruska (Melo, 2002).

Outros nomes como Porter, Claude e Fullam introduziram, em 1945, tcnicas de

microscopia utilizando tetrxido de smio para observar clulas; Pearse e Baker,

em 1950, forma os pioneiros na observao de cortes de material biolgico com

espessura muito pequena, chamados de cortes ultrafinos, com cerca de 0,1 a 0,2

nm de espessura e Palade Porter, Sjostrand e Blum que promoveram avanos nos

processo de fixao e microtomia (Melo, 2002).

As lentes do microscpio eletrnico so de natureza eletromagntica,

sendo constitudas por uma bobina, formada por milhares de voltas de fio,

atravs da qual passa uma corrente eltrica. Enquanto que no microscpio ptico

a focagem da objetiva faz-se pelo deslocamento mecnico da lente ou do objeto,

no microscpio eletrnico a focagem feita por variao da corrente que passa

na bobina, a qual afeta a distncia focal da objetiva. A variao da ampliao

feita por variao da distncia focal das lentes intermdias (Reis, 2003).

Existem vrios tipos de microscpios eletrnicos, que variam de acordo

com suas especificidades: o de transmisso (MET), o de varredura (MEV), o de

alta voltagem e de tunelamento quntico e de fora atmica.

a. Microscopia eletrnica de transmisso

No microscpio eletrnico de transmisso, forma-se uma imagem

bidimensional do interior desta sobre uma tela, pela passagem de um o feixe de


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eltrons atravs de cortes extremamente finos da amostra. A imagem formada

diretamente a partir da impresso do feixe de eltrons na tela de observao,

aps a passagem pela amostra (Melo, 2002). Os eltrons quando so emitidos

so absorvidos pelos tomos de ar, ento, um tubo inteiro, entre a fonte de

eltrons e o detector, mantido sob um grande vcuo (Lodish et al., 2003). O

pequeno comprimento de onda de eltrons significa que o limite de resoluo do

microscpio de transmisso de 0,0002 m, sendo maior do que o de varredura

(Melo, 2002).

A parte essencial do microscpio eletrnico de transmisso uma coluna

vertical a qual percorrida por um feixe de eltrons (Figura 11). Na parte

superior da coluna existe uma fonte de eltrons, o canho eletrnico. No canho

eletrnico existe um gerador de eltrons que freqentemente um filamento de

tungstnio. A voltagem aplicada entre o filamento e o nodo situa-se entre 40

000 e 100 000 V e provoca a acelerao dos eltrons (Figura 12) (Reis, 2003).

Figura 11. Aspecto exterior de um microscpio eletrnico de transmisso (JEOLmod. JEM1230).

Figura 12. Esquema do canho eletrnico.

Para alm do canho eletrnico, a coluna constituda por uma ou mais

lentes condensadoras, uma lente objetiva, uma ou mais lentes intermedirias


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(sem correspondente no microscpio ptico e que servem para variao da

ampliao), uma lente projetora, um porta-objetos em platina mvel que

controlado do exterior, um cran (por vezes dois) e uma cmara fotogrfica

(Figura 13) (Reis, 2003). As imagens ampliadas pelas lentes projetoras so

lanadas para um anteparo fluorescente, uma chapa fotogrfica ou um monitor

de TV (Taboga, 2001).

Figura 13. Aspecto da coluna do microscpio eletrnico de transmisso (TEM);A -Seco da coluna (Philips, EM 200); B Aspecto exterior (Leo, Libra 120)(citado por Reis, 2003).

A imagem final obtida pode ser interpretada como eletrodensa, ou escura,

quando os eltrons encontram elementos como o ferro, smio, chumbo ou ouro e

eletrolcida ou clara, quando os eltrons encontram-se com hidrognio, carbono,

nitrognio ou oxignio. Os materiais vegetais na maioria das vezes secomportam como materiais eletrolcidos implicando na necessidade de contraste

com metais pesados para se conseguir uma boa imagem (Taboga, 2001).


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b. Microscopia eletrnica de varredura

O microscpio eletrnico de varredura revela imagens topogrficas da

superfcie com grande riqueza de detalhes (Taboga, 2001). Este aparelho forma

uma imagem tridimensional da superfcie de amostras no seccionadas e a

imagem visualizada em um monitor acoplado ao microscpio, nesse caso, os

eltrons varrem apenas a superfcie externa do material biolgico (Melo, 2002)

(Figura 14 e 15). Ento, esse microscpio permite somente uma observao da

superfcie da amostra. A imagem formada a partir de eltrons secundrios que

partem da amostra quando a mesma atingida pelo feixe de eltrons. Os eltrons

secundrios so captados e, aps passagem por um amplificador, so

transformados em imagem visvel em um monitor. As fotografias so obtidas

indiretamente, a partir da imagem gerada no monitor. O limite de resoluo

nesse microscpio de 0,02 m sendo menor do que o de transmisso (Melo,

2002).

Figura 14. Aspecto tridimensional deuma diatomcea observada commicroscpio eletrnico de varredura(ampliao 5000x) (Reis, 2003).

Figura 15. Aspecto do microscpioeletrnico de varredura.

A microscopia eletrnica de varredura pode fornecer imagens

tridimensionais de objetos relativamente grandes, como vermes e insetos, quanto

de clulas livres, como tecidos animais e vegetais, embries, fragmentos

geolgicos em anlises de granulometria e textura de solos (Taboga, 2001). No

entanto, o pr-tratamento das amostras essencial para se conseguir uma boa

observao da superfcie podendo causar algumas alteraes fsicas. Por


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exemplo, na observao de bactrias e outros organismos vivos, o vcuo obtido

da coluna de eltrons pode provocar alteraes morfolgicas (Englert et al.,

2001).

c. Microscopia eletrnica de alta voltagem

a microscopia eletrnica que acelera seus eltrons entre 500 e 1000

KV, ento, seus microscpios so conhecidos como de alta voltagem ou de alta

acelerao. Seu funcionamento e estrutura so semelhantes ao do microscpio

eletrnico convencional, porm, so aparelhos extremamente grandes, chegando

a ocupar edifcios de 3 andares (Taboga, 2001).

A utilizao desse microscpio revolucionou a biologia estrutural

permitindo que pudesse, por exemplo, observar a organizao tridimensional dos

componentes do citoesqueleto (Taboga, 2001).

d. Microscopia eletrnica de tunelamento quntico

A microscopia eletrnica de tunelamento quntico tem a capacidade de

ampliar a potncia visual do olho humano cerca de 1 milho de vezes.

Desenvolvida nos anos 80, essa tcnica aumenta em 100 vezes a capacidade dos

microscpios eletrnicos (Taboga, 2001).

O microscpio eletrnico de tunelamento quntico resultou dos esforos

de dois cientistas suos, Benning e Rohrer, prmio Nobel de fsica, em 1986.

Seu princpio pressupe que todos os corpos apresentam caractersticas

ondulatrias emitem energia. O aparelho possui uma agulha que dista da amostra

em 1 (10-6 mm). Pelo caminhamento da agulha na superfcie da amostra se

forma uma corrente energtica chamada de tunelamento. Os eltrons do material

so atrados para a agulha formando um tnel. Ento, quando a agulha passa

sobre um tomo, a corrente aumenta e quando ela percorre sobre os espaos

entre os tomos ela diminui. Os sinais de aumento e diminuio so transmitidospara a tela de um computador formando imagens semelhantes a vales e

montanhas (Taboga, 2001).


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e. Microscopia eletrnica de fora atmica

A inveno do microscpio de fora atmica contribuiu

significativamente para a nanotecnologia e recebeu o prmio Nobel em 1986. O

microscpio de fora atmica assemelha-se ao de tunelamento quntico, porm

apresenta um microespelho e um feixe de laser sobre a agulha (Taboga, 2001).

O princpio de funcionamento de um microscpio de fora atmica

baseado na reflexo da luz de um feixe de laser por um espelho. Aps a reflexo,

a luz do laser passa por uma lente e incide sobre um fotodetector (Figura 16).

Figura 16. Esquema do princpio de funcionamento do microscpio de forca

atmica (http://www.fis.puc-rio.br).

A incidncia do feixe de laser no fotodetector provoca o aparecimento de

uma diferena de potencial (ddp) em suas extremidades. Esta ddp depende da

rea iluminada pelo feixe de laser que por sua vez depende da altura da ponta de

prova. A posio da ponta de prova varia conforme o relevo da superfcie em

estudo e com isso a ddp gerada pelo fotodetector traduz os deslocamentos da

ponta durante a varredura. Estes deslocamentos so medidos com a amplificao

da ddp gerada no fotodetector. O fotodetector funciona como uma bateria

varivel (dependendo da incidncia de luz) e seu sinal serve de entrada para oamplificador operacional cujo ganho, A, definido pelas resistncias R1 e R2. A

sada do amplificador operacional conectada a um computador ou a um

registrador grfico (plotter) para a coleta de dados (http://www.fis.puc-rio.br).

Isto permite uma menor agressividade sobre a amostra e a deteco de

superfcies, por exemplo, de uma bactria viva, em que as informaes so


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transmitidas para a tela do computador, incluindo movimentos e forma. Nesse

aparelho tambm possvel avaliar a estrutura atmica de biomolculas

(Taboga, 2001).

Nessa microscopia, as amostras podem ser observadas sem qualquer

tratamento superficial, sendo capaz de obter informaes complementares em

situaes reais sem interferncia ou artefatos (Englert et al., 2001).

As tcnicas de microscopia eletrnica de varredura e a de fora atmica,

em trabalhos conduzidos por Englert et al., (2001), foram ferramentas

complementares na observao de diferenas morfolgicas em bactrias com e

sem bio-filme.

Fotomicrografia

O uso da fotografia para capturar imagens advindas de um microscpio

data da inveno do processo de fotografia. As primeiras fotografias foram

memorveis devido qualidade que apresentavam, mas a tcnica era muito

trabalhosa e sobrecarregava com longas exposies e era considerado um

processo difcil. O primeiro meio para fotomicrografia foi o filme que at a

dcada passada era o principal, porm com os avanos da cmera eletrnica e a

tecnologia computacional a imagem digital tornou-se mais barata e mais fcil

para o uso do que a fotografia convencional (Abramowitz, 2005).

A qualidade da fotomicrografia seja digital ou gravada em filme, depende

da qualidade do microscpio. O filme um severo juiz de quo bom o

microscpio tem sido priorizado para capturar a imagem. essencial que se

tenha um microscpio bem configurado usando Khler iluminao e que o

campo e o diafragma condensador estejam ajustados corretamente e que a altura

do condensador esteja otimizada. Ento, propriamente ajustado, o microscpio

mostrar imagens do campo todo de viso com boa iluminao e fornecer o

melhor contraste e resoluo (Abramowitz, 2005) (Figura 17).


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Figura 17. Exemplo de um microscpio capaz deobservar e fotografar simultaneamente as imagensatravs do microscpio com sistema de fotomicrografia

incorporado (microscpio biolgico trinocular QUIMISQ-106F).(

Fotomicrografia por meio do uso de filmes

Filmes fotogrficos utilizados em fotomicrografia so revestidos com

uma emulso sensvel a luz de sais de prata e ou corantes (tintas). Quando a luz

incidida para expor a emulso, centros ativos combinam para formar uma

imagem latente que deve ser desenvolvida pelo uso de qumicos fotogrficos, em

ambiente escuro.

O filme dividido em categorias dependendo se branco e preto ou

colorido. Os filmes fotogrficos so divididos em transparncias de campopositivo (as cores so aquelas da imagem que esta sendo observada) e cores

negativas (cores complementares da imagem que esta sendo observada).

Filmes positivos apresentam sufixo chrome e negativos color. Os filmes,

geralmente, vem acompanhados de informaes como ISO, e se o filme para

dia com luz (Daylight) ou um para interiores com menor iluminao. A

temperatura de lmpadas de tungstnio encontradas nos microscpios esto entre

2900 e 3200 K dependendo da voltagem aplicada no filamento da lmpada. Os

fabricantes de filmes oferecem filmes balanceados para esta iluminao eusualmente indicam se o filme indicado para interiores ou uso cientfico.

Filmes balanceados para dias com luz (Daylight) o mais comum filme

disponvel e pode tambm ser usado no microscpio desde que seja adicionado

um filtro conversor de luz apropriado para a rota da luz. Filmes polaroides so

usados na fotomicrografia, e so encontrados em trs tamanhos 35 mm


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Polachrome (colorido ou transparente), pacotes Polapan (preto e branco) em 3

1/4 x 4 e filmes 4 x 5 individuais.

Fotomicrografia digital

O principal mecanismo de gravar as imagens vistas atravs do

microscpio, por muito anos, foi a produo de fotomicrografia por meio do uso

de filmes, porm na ltima dcada, os cientistas tm comeado a capturar as

imagens por meio de cmeras eletrnicas (Abramowitz, 2005).

As cmeras digitais operam capturando a imagem projetada diretamente

em um chip de computador sem o uso de filmes. Nestes ltimos anos, o nmero

de pixels de informaes capazes de serem capturados e estocados pela melhor

cmera digital prximo, mas ainda pequeno, comparando com a resoluo do

filme tradicional (Davidson e Abramowitz, 2005).

A seleo da cmera digital deve ser realizada com muito cuidado,

incluindo exame de espcimes fixados ou vivos, necessidade de imagens em

escala de cinza ou cor verdadeira, sensibilidade a baixo nvel de luz como

fluorescncia, resoluo, velocidade de aquisio de imagem, uso em

investigaes qualitativas e quantitativas, taxa de alimentao de vdeo para o

computador ou VCR. Em geral, dois tipos de cmeras esto disponveis para uso

na microscopia so as cmeras tubo (famliaVidicon ) ou CCD (dispositivo

duplo de mudana) (Davidson e Abramowitz, 2005).

Um critrio para seleo de uma cmera eletrnica para microscopia

inclui sensibilidade da cmera, eficincia quntica, resposta espectral,

capacidade de alcance dinmico, velocidade de aquisio de imagem e leitura

externa, resposta, velocidade de resposta em relao a mudanas na intensidade

da luz, acercea geomtrica e adaptabilidade de leitura ao microscpio. Um

importante critrio para a mais nova cmera digital CCD a resoluo, sendo a

preferida para pesquisa (Davidson e Abramowitz, 2005).O alcance dos chips disponveis est entre 64 x 64 pixels at 2048 x 2048

e acima quando se trata de condies bem especificas. Sua grande capacidade de

resoluo de imagem a torna a cmera digital uma poderosa rival para as

cmeras de filme (Davidson e Abramowitz, 2005).


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