Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 1

Microscopia Confocal: Teoria e técnica

• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula

• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.

• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 2

Práticas

• Microscopia de transmissão• Microscopia de fluorescência wide-field• Microscopia confocal

BibliografiaLakowicz, J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2nd Edition. 1999. Kluver

Academic/Plenum Publishers, New York.Lichtman, J.W., Conchello, J-A. Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2(12):910-

919, 2005.Conchello, J-A., Lichtman, J.W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods, 2(12):920-931/

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 3

Microscopia Confocal: Teoria e técnica

• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula

• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.

• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.

Ondas mecânicas em um meio elástico

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 4

Meio:Massa (inércia)Elasticidade

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 5

Energia Radiante – Radiação eletromagnética.

Carregam energias elétrica e magnética

Propriedades do meio de propagação:•Armazenar energia elétrica (capacitância)•Armazenar enérgia magnética•(indutância)

VácuoPermitividade F/mPermeabilidade H/m 1-

0

ms1

c 8

0

1003 με

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 6

Energia Radiante – Radiação eletromagnética.

s

km

s

mc

c

000.300459.792.299

Velocidade da onda

Frequência (ciclos por s, Hz)

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 7

Espectro da radiação eletromagnética

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 8

Onda: Refração

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 9

Fóton

JhE

Hzc

m

sJh

azulazulfóton

azulazul

azul

19,

14

9

34

1007,4*

10*143,6

10488

1062606896,6

 photon is the quantum of the electromagnetic interaction and the basic "unit" of light and all other forms of electromagnetic radiation and is also the force carrier for the electromagnetic force.

νEfóton

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 10

Microscopia Confocal: Teoria e técnica

• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula

• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.

• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 11

Interação radiação EM-matéria: reflexão

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 12

Interação radiação EM-matéria: refração

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 13

Interação radiação EM-matéria: difração

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 14

Luminescência – Fluorescência e fosforescência

0térmicaemis1

1exc0

SEνS

SνS

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 15

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 16

Luminescência – Fluorescência e fosforescência

Diagrama de Jablonski

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 17

Fluoróforos de interesse em Biologia

Fluoresceína

Rodamina

Quinina

Acridina

exc

250nm

350nm

em =450nm

exc=530nm

em=556nm

exc=490nm

em=514nm

exc=495nm

em=526nm

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 18

Fontes de “luz”: Laser x HBO

Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente (fase relativa constante), em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de

onda definido (monocromático)

Espectro do He-Ne laser

Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp)

Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation)

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 19

Microscopia Confocal: Teoria e técnica

• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula

• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.

• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 20

Dimensões na Biologia

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 21

Microscopia - Objetivas

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 22

Abertura numérica e aumento

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 23

Resolução

1,51n

sinnΝΑ

1

θ

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 24

Difração limita a resolução – Airy disks

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 25

Resolução e refração do meio

1,51n

sinnΝΑ

1

θ

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 26

Resolução51,11

)sin(*

n

nAN

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 27

Aumento e Resolução

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 28

Microscopia de luz refletida

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 29

Microscopia de luz transmitida

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 30

Iluminaçao – Sistema Köhler

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 31

Técnicas especiais: Contraste por Interferência DiferencialDIC

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 32

Técnicas especiais: Contraste por Interferência DiferencialDIC

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 33

Imagem de Fluorescência em Microscopia “Wide Field”

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 34

Fluorescência

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 35

Microscopia de fluorescência “wide field”

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 36

Imagem de Fluorescência em “Wide Field”“Filter Cube”

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 37

Imagem de Fluorescência

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 38

Microscópio de epifluorescência “Wide Field”

UV Filter Cube set #487902 (Exciter Filter: G 365, Beam Splitter: FT 395, Barrier Filter: LP

420). This cube is used to visualize UV-excitable fluors like DAPI.

Blue Filter Cube set #487910 (Exciter Filter: BP 450-490, Beam Splitter: FT 510, Barrier Filter: BP 515-565). Fluorescein, GFP and Oregon Green can be visualized using this filter set.

Green Filter Cube set #487915 (Exciter Filter: BP 546±12, Beam Splitter: FT 580,

Barrier Filter: LP 590). Green-excitable fluors like rhodamine and Cy3 can be visualized using

this filter set.

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 39

Espectro da HBO

Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 40

Zeiss Axiovert 100 M

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 41

Microscópio Confocal

Microscópio de fluorescência a laser com iluminação puntiforme

Microscópico de varredura

Fatiamento óptico produz qualidade de imagem superior à da epifluorescência

Resolução no eixo Z

Resolução temporal reduzida.

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 42

Microscópio Confocal: aplicaçoes

As que demandam resoluçao espacial XYZ

Investigação de colocalização de moléculas que possam ser identificadas por indicadores fluorescentes

Análise da interação entre moléculas (FRET)

Análise da migraçao de moléculas (FRAP)

etc

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 43

Microscopia confocal

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 44

Princípio da Microscopia confocal

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 45

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 46

Imagem multiespectral

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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 48

Resoluções lateral e axial

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 49

Resolução e “Airy pattern”

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Compromissos

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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 52

Aplicações do microscópio confocal

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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 54

Espectros das FP

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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 56

Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 57

Inclusões

• Análise espectral – META (lambda stack - AOTF)• Proteínas fluorescentes

(http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmocz/index.htm)