Microscopia Ultravioleta

eMicroscopia deFluorescência

Alunas: Alessandra, Aline, Isabele, Sara

O que é um microscópio?

É uma ferramenta de laboratório, que permite a visualização de estruturas imperceptíveis ao olho humano. O tipo de microscopia mais comum é a óptica ou microscopia de luz.

Microscopia Óptica

A microscopia óptica, ou de luz, possibilita a visualização de estruturas, através da incidência de luz sobre a amostra e da ampliação de lentes: objetivas e oculares. Os tipos de microscopios ópticos podem ser: Simples (lupa) e Composto (campo claro, ultravioleta, fluorescência, campo escuro, polarização e contraste de fase).

Microscopia ultravioleta e fluorescência

Nestes dois tipos de microscopia de luz, utiliza se a luz ultravioleta ao invés de luz branca comum, como fonte de luz. A luz ultravioleta possui um comprimento de onda muito menor que a luz branca, o que permite uma resolução duas vezes melhor que a microscopia comum de campo claro.

Células Vegetais

Estrutura do Microscópio Ultravioleta e Fluorescência

A estrutura do microscópio ultravioleta e fluorescencia é constituida por:

• Fonte de luz ultravioleta, proveniente da vaporização do Mercúrio

• Filtros (excitação/ barreira)• Espelhos dicróicos aluminizados• Condensador• Diafragma• Lentes objetivas e oculares feitas de

quartzo;• Tubo conversor de imagem,• Camera fotográfica, • e Botões de focalização: macro e micrométricos.

Luz Ultravioleta

A luz ultravioleta é invisível ao olho humano, não pode ser captada pela retina e é prejudicial; impossibilitando-a de ser observada diretamente, no entanto existe um processo chamado fotográfia de fluorescência, no qual a luz ultravioleta é absorvida pela amostra, e em seguida filtrada e convertida, chegando na câmera fotográfica como luz comum (visível aos olhos humanos) após isto a imagem é transmitida para um computador

Princípio físico da Microscopia de Fluorescência

. Excitação Eletrônica

Trajetória da luz ultravioleta no microscópio O mercúrio quando recebe uma descarga elétrica emite luz ultravioleta (UV),essa luz passa sobre um filtro de excitação e depois incide sobre um espelho dicróico que reflete a luz ultravioleta (luz azul) até a amostra, quando chega ate as moleculas da amostra, a luz ultravioleta excita os elétrons do material tornando-o luminoso, em seguida esta luminosidade é coletada pela objetiva e volta com o comprimento de onda maior e menos energético,ou seja como luz visível (verde), passando pelo espelho dicróico e pelo filtro de barreira (capaz de eliminar outros comprimentos de onda de luminosidade prejudiciais ao olho humano) formando assim a imagem.

Fluoróforos

São corantes fluorescentes que quando entram em Contato com a amostra, e acoplam se nas estruturas existentes no interior da célula, e emitindo luz visível quando expostas à luz ultravioleta.

Pra que serve esses fluoróforos?

. Os fluoroforos tornam possível a visualização de pontos específicos da célula

Núcleos corados com reddot (fluoróforo)

Como isso ocorre?

Essa técnica de fluorescência funciona da seguinte maneira, aplica se fluoróforos na amostra, e estes ligam se a estruturas presentes no interior da celula. Quando a amostra absorve luz ultravioleta os elétrons destes fluoróforos excitam se, emitindo fluorescencia (luminosidade), permitindo assim a visualização das estruturas desejadas.

Núcleo de linfócitos humanos coloridos com DAPI com o cromossoma 13 (verde) e 21 (vermelho)

Fluorescência Múltipla

Nesta técnica aplica-se tipos diferentes de fluoróforos separadamente numa mesma amostra capturando as imagens de forma sequencial, e ao final deste processo é feita a junção das imagens através de recursos computadorizados.Utiliza se fluoróforos específicos para estruturas especificas da célula, e feixes de luz adequados a fluoróforos específicos, previamente selecionados no filtro de excitação

Exemplo: Imagem epifluorescente de três componentes em uma divisão de uma célula cancerosa humana. O DNA está manchado de azul, uma proteína chamada INCENP aparece em verde, os microtúbulos são vermelhos. E a imagem final dos três componentes juntos.

Fluorescência natural

A Fluorescência natural ocorre quando a amostra não necessita de corante para emitir luz após ser exposta a luz UV. Exemplo: clorofila

Aplicações da Microscopia ultravioleta e Fluorescencia

• É utilizado na investigação científica, para estudo de evidências.

• Utilizado também no estudo de organelas e estruturas celulares, reações enzimáticas, eventos fisiológicos e bioquímicos nas células vivas, análise de viabilidade celular, de função celular.

• E na imunofluorescência, como a reação de antígenos no interior celular dentre outros estudos.

•A existência de múltiplos indicadores fluorescentes contribui para o estudo de uma multiplicidade de produtos químicos fisiologicamente importantes como DNA, cálcio, magnésio, sódio, pH e enzimas.