Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer ...

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

Pós-Graduação em Oncologia

ROBERTO RODRIGUES CAPELA DE MATOS ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO DOS

CARIÓTIPOS COMPLEXOS DA LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA DA INFÂNCIA

Orientador: Profa. Dra. Maria Luiza Macedo Silva

RIO DE JANEIRO

2014

Ministério da Saúde

Instituto Nacional de Câncer

Coordenação de Pós-graduação

i



ROBERTO RODRIGUES CAPELA DE MATOS ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO DOS


Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer

como parte dos requisitos para obtenção do título

de Mestre em Oncologia

Orientador: Profa. Dra. Maria Luiza Macedo Silva

RIO DE JANEIRO

2014




ii

M425e Matos, Roberto Rodrigues Capela de.

Estudo citogenético molecular para a caracterização dos

cariótipos complexos da leucemia mielóide aguda da infância.

/ Roberto Rodrigues Capela de Matos. – Rio de Janeiro:

INCA, 2014.

xvi, 78 f.: il.

Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional

de Câncer José Gomes da Silva, 2014.

Orientadora: Maria Luiza Macedo Silva.

1. Leucemia Mieloide Aguda. 2. Células-Tronco

Hematopoéticas. 3. Análise Citogenética. 4. Citogenética –

métodos. 5. Criança. I. Silva, Maria Luiza Macedo Silva

(orient.). II. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes

da Silva. III.Título.

CDD 616.99419

iii



AUTOR: ROBERTO RODRIGUES CAPELA DE MATOS

ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO DOS


ORIENTADOR: Profa. Dra. Maria Luiza Macedo Silva

Aprovada em: ___/___/___

EXAMINADORES:

Prof. Dr. Fernando Regla Vargas

Prof. Dr. André Luiz Mencalha

Profa. Dra. Mariana Emerenciano Cavalcanti de Sá

Profa. Dra. Elaine Sobral da Costa – Suplente externo

Profa. Dra. Claudia Esther Alicia Rocio Hassan – Suplente interno

RIO DE JANEIRO

2014




iv

À minha querida tia Vera, “in memorian”,

que, em tudo, me apoiou até o fim,

e a todas as crianças com Câncer...

Dedico

v

AGRADECIMENTOS

À Deus, por ser meu refúgio e minha fortaleza;

Aos meus pais Marize e Roberto, pelo apoio em minha formação acadêmica;

À minha orientadora Drª Maria Luiza, por seus ensinamentos em mais um

trabalho, por me incentivar e acreditar em mim, e principalmente por me

introduzir neste campo desafiador que é a citogenética humana;

À Drª Eliana Abdelhay, por sua excelente didática, presteza, e por toda a

estrutura física e suporte material, para a realização deste trabalho;

Às crianças, adolescentes e seus responsáveis, protagonistas deste

trabalho;

Ao Programa de Pós-graduação em Oncologia do INCA, pela

oportunidade;

Ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em Oncologia do INCA,

por sua contribuição em minha formação acadêmica;

Aos membros da banca examinadora, pela gentileza de aceitar o convite;

Ao pessoal da secretaria de Pós-Graduação do INCA, por toda sua

paciência e presteza;

Ao Dr. Raul Ribeiro, por toda a ajuda em discussões dos resultados e nos

manuscritos apresentados neste trabalho;

Ao Dr. Thomas Liehr, pela colaboração com nosso laboratório através do

intercâmbio CAPES (PROBRAL/DAAD - no. 419/14);

Aos médicos hematologistas das instituições que forneceram o material,

colaborando com este estudo, e com nosso projeto;

Aos meus amados amigos Mariana, Amanda, Daniela, Deborah, Thiago e

Luana, que são minha segunda família, pela convivência maravilhosa no dia

a dia, por toda ajuda, seja esta, em discussões científicas ou naquele ombro

amigo;

Aos colegas do CEMO, pela convivência alegre e agradável do dia a dia;

À minha querida noiva Alice, que além de me apoiar contribuiu na

elaboração das figuras deste trabalho, e a seus pais, Maria Auxiliadora e

José Jacinto, pelo apoio.

vi

“Ser pequeno é não desanimar com as faltas próprias,

pois as crianças caem com frequência,

mas são demasiado pequenas para

machucar-se seriamente”

“Je promets de mettre à terre une pluie de roses,

et de passer ciel à faire du bien sur la terre”

“Prometo fazer cair sobre a terra uma chuva de rosas,

e passar o céu fazendo o bem sobre a terra”

Thérèse de Lisieux

vii


ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO

DOS CARIÓTIPOS COMPLEXOS DA LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA DA

INFÂNCIA

RESUMO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Roberto Rodrigues Capela de Matos

As leucemias são um grupo heterogêneo de doenças que se caracterizam pela proliferação clonal de células hematopoéticas, que sofreram alterações genéticas, manifestadas durante sua diferenciação. Na leucemia mielóide aguda, o evento leucemogênico ocorre em uma célula-tronco, comprometida com a linhagem mielóide, impedindo a maturação e a diferenciação das células. As leucemias mielóides agudas são morfologicamente subclassificadas em 8 subtipos, que variam entre M0 e M7 de acordo com o grau de maturação celular. Na leucemia mielóide aguda podem ser encontradas alterações citogenéticas associadas com os subtipos da classificação FAB, como por exemplo, a t(8;21)(q22;q22) associada ao subtipo M2, a t(15;17)(q22;q21) ao M3, e a inv(16)(p13;q22) ao M4, as quais estão associadas a um prognóstico favorável. Por outro lado, pacientes que apresentam -5 ou a del(5q), -7, a del(7q), a inv(3q)/t(3;3)(q21;q26), a t(6;9)(p23;q34), del(9q), t(9;22)(q34;q11), rearranjo do gene MLL e, cariótipos complexos, com estas anormalidades e/ou outras aberrações crípticas, são selecionados para protocolo de alto risco, incluindo o transplante de medula óssea. A citogenética é uma importante ferramenta de estudo na leucemia mielóide aguda, e embora algumas aberrações já sejam classificadas, ainda, 10-12% dos pacientes com leucemia mielóide aguda, apresentam cariótipos com três ou mais aberrações, muitas vezes crípticas. Uma vez que tem sido sugerida uma possível correlação entre a combinação das aberrações detectadas, em um cariótipo complexo, e a resposta clínica, fica clara a necessidade de um refinamento na caracterização deste tipo de perfil cariotípico. Neste contexto, o presente estudo pôde refinar a caracterização de cariótipos complexos, bem como suas anormalidades crípticas, a partir de amostras de pacientes pediátricos diagnosticados com leucemia mielóide aguda, através da aplicação técnicas de citogenética molecular, fluorecense in situ hibridization, Multiplex-FISH e o multicolor chromosome banding. Este trabalho pôde contribuir com a literatura, descrevendo duas novas anormalidades cromossômicas crípticas, presentes em cariótipos complexos, onde uma teve importância na citogenética inicial e a outra apresentou impacto na evolução clínica e estratificação de risco do paciente. Deste modo, nosso trabalho mostrou a importância da combinação das três técnicas de citogenética molecular, em refinar os cariótipos complexos dos pacientes pediátricos com leucemia mielóide aguda, na tentativa de identificar biomarcadores que sejam potenciais alvos terapêuticos.




viii


MOLECULAR CYTOGENETIC STUDIES FOR THE CHARACTERIZATION

OF COMPLEX KARYOTYPES IN CHILDHOOD ACUTE MYELOID

LEUKEMIA

ABSTRACT

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Roberto Rodrigues Capela de Matos

Leukemias represent a heterogeneous group of diseases that are characterized by the clonal proliferation of hematopoietic cells, which, during their differentiation, have undergone genetic alterations. In acute myeloid leukemia, the leukaemogenic event occurs in a myeloid lineage stem cell, preventing maturation and cell differentiation. Acute myeloid leukemias are sub classified in 8 subtypes, which varies between M0 and M7 according to cell maturation degree. In acute myeloid leukemia, cytogenetic alterations are associated with FAB subtypes. For example, the t(8;21)(q;22q;22) is associated to FAB M2 subtype, the t(15;17)(q22;q21) is associated to M3, and inv(16) is associated to M4 subtype, being all before mentioned, related to a good prognosis. On the other hand, patients which presents -5 or del(5q), -7, or del(7q), inv(3q)/t(3;3)(q21;q26), t(6;9)(p23;q34), del(9q), MLL rearrangements and, complex karyotypes, with these and/or other críptical aberrations, are stratified into high risk protocols, including bone marrow transplantation. Cytogenetic analysis is an important tool in acute myeloid leukemia, and although some chromosomal aberrations are already classified, still 10-12% of acute myeloid leukemia patients presents karyotypes with three or more aberrations, being many of these críptical aberrations. Once the literature suggests a possible correlation between the combination of the detected aberrations, in a complex karyotype, and patient’s clinical outcome, it becomes clear the relevance of a refinement in the characterization of such karyotypic profile. In this context, by the application of molecular cytogenetic techniques such as fluorecense in situ hibridization, Multiplex-FISH and multicolor chromosome banding, in samples from pediatric acute myeloid leukemia patients, the present study was able to refine the characterization of the complex karyotypes, and its críptical abnormalities. In addition, this work could contribute to the literature by describing two new cryptic chromosomal abnormalities in complex karyotypes. One was important for initial cytogenetic diagnosis, and the other had an impact both on patient’s risk stratification and, on her clinical outcome. Thus, our work showed the importance of the above mentioned molecular cytogenetic techniques combined in refining complex karyotypes from pediatric acute myeloid leukemia patients, regarding an attempt to identify biomarkers that could be potential therapeutic targets.




ix

ÍNDICE

ITEM

Resumo ..................................................................................................................... vii

Abstract ..................................................................................................................... viii

Lista de tabelas .......................................................................................................... xi

Lista de figuras .......................................................................................................... xii

Lista de abreviaturas e siglas .................................................................................... xiii

1. Introdução .............................................................................................................. 1

1.1 Leucemias....................................................................................................1

1.2 Leucemia Mielóide Aguda ..........................................................................3

1.3 Classificação, diagnóstico laboratorial e padrão citogenético da LMA........4

1.3.1 Leucemia Mielóide Aguda minimamente diferenciada

– LMA-M0.....................................................................................8

1.3.2 Leucemia Mielóide Aguda sem maturação – LMA-M1.................9

1.3.3 Leucemia Mielóide Aguda com maturação – LMA-M2.................9

1.3.4 Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) – LMA-M3.......................10

1.3.5 Leucemia Mielomonocítica Aguda – LMA-M4..............................11

1.3.6 Leucemia Monoblástica Aguda – LMA-M5..................................11

1.3.7 Eritroleucemia Aguda – LMA-M6.................................................12

1.3.8 Leucemia Megacarioblástica Aguda – LMA-M7...........................13

1.4 A relevância da caracterização citogenética tumoral................................16

1.5 Fatores prognósticos e classificação de risco da LMA..............................20

1.6 Cariótipos complexos na LMA...................................................................23

2. Objetivos .............................................................................................................. 25

2.1 Objetivos específicos.................................................................................25

3. Material e Métodos .............................................................................................. 26

3.1 Desenho Experimental..............................................................................26

3.2. Amostra e considerações éticas...............................................................27

3.3 Critérios de inclusão e exclusão................................................................27

3.4 Estudo cromossômico por bandeamento G..............................................27

3.5. Estudo por citogenética molecular............................................................28

3.5.1 FISH e M-FISH.............................................................................28

3.5.2 MCB.............................................................................................29

4. Resultados ........................................................................................................... 31

4.1 Pacientes, período e local de estudo.........................................................31

x

4.2 Cromossomos e subtipos morfológicos encontrados no estudo...............32

4.3 Anormalidades envolvendo o cromossomo 8............................................33

4.3.1 Envolvimento dos cromossomos 1, 8 e 11..................................33

4.3.2 t(8;21) associada a outras anomalias cromossômicas................34

4.3.3 Translocações three-way envolvendo o cromossomo 8..............34

4.3.3.1 Envolvimento dos cromossomos 8, 21 e 22...................34



4.4 Anormalidades envolvendo o cromossomo 16..........................................37

4.4.1 inv(16) .........................................................................................37

4.4.2 del(16) .........................................................................................38

4.4.3 t(16;21) ........................................................................................39

4.5 Anormalidades envolvendo o cromossomo 11..........................................40

4.5.1 Envolvimento dos cromossomos 9 e 11......................................40

4.5.2 Envolvimento do cromossomo 11 com rearranjo do gene MLL...41

4.5.2.1 Rearranjo do gene MLL com

envolvimento do cromossomo 10...................................41

4.6 Anormalidade variante da t(15;17) ........................................................... 42

4.7 Envolvimento dos cromossomos 5 e 7

associados a outras anomalias cromossômicas.......................................43

5. Discussão ............................................................................................................ 46

6. Conclusão ............................................................................................................ 53

7. Referências .......................................................................................................... 54

8. Anexos ................................................................................................................. 66

8.1 Anexo I.......................................................................................................66

8.2 Anexo II......................................................................................................70

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1 Classificação morfológica, imunológica e citoquímica da LMA............5

Tabela 1.2 Classificação da Leucemia Mielóide Aguda proposta pela

Organização Mundial da Saúde (2008)................................................7

Tabela 1.3 Sumário das anormalidades cromossômicas numéricas e

estruturais da LMA................................................................................19

Tabela 1.4 Estratificação de risco, recaída e sobrevida da LMA............................22

Tabela 4.1 Dados clínicos dos pacientes diagnosticados com LMA apresentando

cariótipos complexos – Sexo, Idade, Leucócitos, Plaquetas e Estado

Clínico...................................................................................................31

Tabela 4.2 Pacientes diagnosticados com LMA apresentando cariótipos complexos

– bandeamento G, FISH e MCB...........................................................45

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Medula óssea hipercelular com diversos blastos mielóides..................2

Figura 1.2 Sintomas de Leucemia..........................................................................2

Figura 1.3 Esquematização da maturação das células hematopoéticas e suas

respectivas linhagens de acordo com a classificação FAB. .................4

Figura 1.4 Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M0....................................................8

Figura 1.5 Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M1....................................................9

Figura 1.6 Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M2...................................................10

Figura 1.7 Leucemia Promiélocítica Aguda – LMA-M3..........................................10

Figura 1.8 Leucemia Mielomonocítica Aguda – LMA-M4.......................................11

Figura 1.9 Leucemia Monoblástica Aguda – LMA-M5...........................................12

Figura 1.10 Eritroleucemia Aguda – LMA-M6..........................................................13

Figura 1.11 Leucemia Megacarioblástica Aguda – LMA-M7....................................14

Figura 1.12 As anormalidades genéticas na genéticas

na Leucemia Mielóide Aguda................................................................15

Figura 3.1 Multicolor Chromosome Banding..........................................................30

Figura 4.1 Subtipos FAB associados às diferentes faixas etárias

encontradas no presente estudo...........................................................32

Figura 4.2 Comparação entre o número de cromossomos envolvidos nas

anormalidades apresentadas neste estudo..........................................32

Figura 4.3 Comparação entre número de subtipos morfológicos

presentes neste estudo.........................................................................33

Figura 4.4 Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 4.............33

Figura 4.5 Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 11...........34











xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABL C-Abl Oncogene 1, Non-Receptor Tyrosine Kinase

ALM Activating Loop Mutations

BACs Bacterial Artificial Chromosomes – Cromossomos artificiais

bacterianos

BCR Breakpoint Cluster Region

CBF Core-Binding Factor

CBFβ Core-Binding Factor, Beta Subunit

CC Cariótipo(s) Complexo(s)

CCD Charge Coupled Device / Dispositivo de carga acoplada

CEP Centromere probes / Sondas para centrômero

CD Cluster Diferentiation / Antígeno de diferenciação

CEBPA CCAAT/enhancer-binding protein alpha

CEMO Centro de Transplante de Medula Óssea

CGH Comparative Genomic Hybridization / Hibridização

Genômica Comparativa

DAPI 4,6-Diamino-2-Fenilindol

DEK DEK Oncogene

DNA Desoxorribonucleic acid / Ácido Desoxorribonucleico

DOP-PCR Degenerate oligonucleotide primed – polymerase chain reaction /

Reação da polimenrase em cadeia com oligonucleotídeos

degenerados

EVI1 Ecotropic Virus Integration Site 1 Protein Homolog

FAB French-American-British Classification / Classificação

Franco-americano-britânica

FISH Fluoresence in situ Hybridization – Hibridização

in situ por fluorescência

FLT3 FMS-like Tyrosina Kinase 3

HLA-DR Antígeno humano do complexo de histocompatibilidade de

classe 2

INCA Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da SIlva

IPPMG Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira

xiv

ISCN International System for Chromosome Nomenclature /

Sistema Internacional de Nomenclatura Cromossômica

ITD Internal Tandem Duplication

KCl Cloreto de Potássio

LMA Leucemia Mielóide Aguda

LPA Leucemia Promielocítica Aguda

LSI Locus Specific - lócus específico

M Molar

M3v Subtipo M3 variante

M4Eo Subtipo M4 com eosinofilia

MAL Mal, T-Cell Differentiation Protein

mb megabases

MCB Multicolor Chromosome Banding / Bandeamento

cromossômico multicor

M-FISH Multiplex-FISH

mL Mililitro

MLL Mixed Lineage Leukemia gene/ Gene de linhagem

leucêmica mista

MLLT (1/3/4/10/11) Mixed-Lineage Leukemia; Translocated To (1/3/4/10/11)

mm Milímetro

MPO Mieloperoxidase

MRC Medical Research Council

MYH11 Myosin, Heavy Chain 11

NPM Nucleophosmin

NUMA Nuclear Mitotic Apparatus Protein

NUP214 Nucleoporin 214kDa

OTT One-Twenty Two Protein

PCP Partial Chromosome Painting - Pintura Cromossômica Parcial

Ph Cromossomo Philadelphia

pH Potencial Hidrogeniônico

PLZF Promyelocytic Leukemia Zinc Finger

PML Promyelocytic Leukemia Protein

xv

PTPN11 tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11

RARα Retinoic Acid Receptor Alpha / Receptor de Ácido Retinóico Alfa

RAS GTPase activating protein

RPN1 Ribophorin-1

RQ-PCR Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction

RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction /

Transcriptase reversa seguida de reação em cadeia da

polimerase

RUNX1 Runt-Related Transcription Factor 1

RUNX1T1 Runt-Related Transcription Factor 1; Translocated To 1

SB Sudan Black B

SKY Spectral Karyotype / Cariótipo Espectral

SNP Single Nucleotide Polymorphism array

SMD Síndrome Mielodisplásica

SSC Solução salina de citrato

ST Sobrevida Total

TdT Terminal deoxynucleotidyl Transferase

WCP Whole Chromosome Painting - Pintura cromossômica total

WHO World Health Organization / Organização Mundial da Saúde

WT1 Wilms Tumor 1

μg/mL micrograma/mililitro

μl Microlitro

μg Micrograma

μm Micrômetro

(gene) / (gene) Fusão gênica entre os genes descriminados

Termos citogenéticos - Simbologia da nomenclatura:

c constitucional

del Deleção

der Derivativo

dic Dicêntrico

dup Duplicação

xvi

inv Inversão cromossômica

ter Região cromossômica terminal

mar Cromossomo marcador

p Braço curto do cromossomo

q Braço longo do cromossomo

subtel Região Subtelomérica

t translocação

(-) sinal negativo Perda de material genético

(+) sinal positivo Ganho de material genético

( ) parênteses Delimita os cromossomos alterados e os pontos de

quebra

[Nº], nº entre [ ] Representa o número de células com determinada alteração

(,) vírgula Separa nº de cromossomos, cromossomos sexuais e

anormalidades cromossômicas

(;) ponto e vírgula Separa cromossomos e as regiões cromossômicas quando os

rearranjos estruturais envolvem mais de um cromossomo

(/) barra inclinada Separa os clones de um cariótipo

(?) interrogação Identificação questionável de cromossomo ou estrutura

cromossômica

X e Y Cromossomos sexuais

(:) dois pontos Quebra

(::) dois pontos Quebra e união

duplos

-> de – à

1

1. Introdução

1.1 Leucemias

As leucemias são um grupo heterogêneo de doenças que se caracterizam

pela proliferação clonal de células de linhagem hematopoética, que sofreram

alterações genéticas, as quais se manifestam em uma determinada fase durante a

sua diferenciação. Tais alterações afetam genes importantes para o controle de

mecanismos naturais de proliferação, diferenciação/maturação e apoptose. Estas

células neoplásicas, originadas na medula óssea, podem se infiltrar no sangue

periférico e tecidos tais como amígdalas, linfonodos, pele, baço, rins e sistema

nervoso central, entre outros. (GILLILAND; JORDAN; FELIX, 2004; INCA, 2013).

Dependendo do curso clínico, as leucemias podem ser classificadas como crônicas

ou agudas. As leucemias podem ser de origem mielóide, quando acometem a

linhagem dos mieloblastos, ou linfóide, quando acometem a linhagem linfoblástica

(LO-COCO & AMMATUNA, 2006).

Do mesmo modo que outros tipos de câncer, a leucemia pode resultar da

consequência de múltiplas etapas mutacionais de diversos genes nas células

progenitoras, no microambiente medular (ALBERTS et al., 2004).

A princípio, o primeiro evento – mutação – culmina em uma hematopoese

clonal. São oriundas desta etapa, alterações clonais comumente associadas à perda

de genes supressores de tumor. Contudo, sabe-se que isoladamente, este único tipo

de mutação não é suficiente para o desenvolvimento da leucemia, sendo para isso,

necessária a aquisição de anormalidades cariotípicas e/ou mutações nas células da

medula óssea. Neste último estágio, prévio ao estabelecimento da doença, é

evidenciada a parada maturativa, seguido por um aumento da população blástica na

medula (GILLILAND; JORDAN; FELIX, 2004).

A medula óssea, de pacientes portadores de leucemia, normalmente se

apresenta hipercelular, e no sangue periférico é então observada uma leucocitose,

predominando as células imaturas (Fig., 1.1), sugerindo que as células alteradas

possuem vantagem na sobrevivência. Conforme vai aumentando a população

destas células imaturas, na medula óssea, elas acabam por substituir mielócitos,

megacariócitos, eritrócitos ou seus progenitores, culminando na perda da função da

medula óssea e levando a complicações como hemorragias, infecções e anemia. Ao

exame físico, o paciente pode apresentar palidez, febre, esplenomegalia,

2

sangramento nasal, hemorragias conjuntivais, sangramentos gengivais, equimoses

(Fig., 1.2A) e petéquias (Fig., 1.2B). No entanto, a confirmação do diagnóstico só é

feita no exame da medula óssea (mielograma) (BENNETT et al., 1976;

BLOOMFIELD; FOON; LEVINE, 1993). A susceptibilidade à infecções e as

hemorragias são os principais fatores que podem levar a óbito.

Figura 1.1 – Medula óssea hipercelular com diversos blastos mielóides. Fonte: http://www.flickr.com/photos/lunarcaustic/2938630316/in/set-72157603324290191

Figura 1.2 – Sintomas de Leucemia. (A) Pele apresentando equimose; (B) Pele com a presença de petéquias. Fonte: http://www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=344

O principal evento causador da leucemia ainda é desconhecido, porém alguns

fatores podem estar associados com o desenvolvimento desta neoplasia no ser

humano, como a exposição a radiações, agentes químicos, viroses e

hereditariedade. Com o advento das técnicas moleculares, houve progressos no

entendimento das transformações malignas a nível molecular como os mecanismos

de ativações de oncogenes e suas consequentes alterações no DNA, as quais se

ressaltaram como fatores de risco em potencial para elucidar os mecanismos

etiopatológicos das leucemias. Do mesmo modo, aberrações de determinadas

3

expressões de proto-oncogenes também já estão bem estabelecidas como fatores

que podem induzir o aparecimento da leucemia mielóide aguda, por exemplo

(SANDLER & ROSS, 1997; ESTEY & DÖHNER, 2006).

1.2 Leucemia Mielóide Aguda

A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença heterogênea caracterizada

pela transformação e expansão de uma célula-tronco progenitora de origem mielóide

(HEAD, 2004). Através desta, no microambiente da medula óssea, ocorrerá um

acúmulo excessivo de precursores mielóides, os quais perderam a competência

para diferenciação e de resposta a reguladores normais de proliferação. A LMA é

uma doença mais comum em adultos, correspondendo a cerca de 80% dos casos

de leucemias agudas em pacientes com uma média de idade de 70 anos, com uma

incidência de 4 casos a cada 100.000 indivíduos. Em pacientes pediátricos, chega a

marca de 7.6 milhões de novos casos por ano, o que corresponde a 20% das

leucemias agudas nesta faixa etária e a cerca de 5% de todos os tipos de cânceres

pediátricos, apresentando dois picos de incidência, um logo ao nascer, diminuindo

até o 1 ano de vida e outro na adolescência (HEAD, 2004; KASPERS; REINHARDT,

2011).

Ainda é desconhecido o mecanismo que leva a célula progenitora mielóide a

perder o controle da proliferação celular, causando a expansão do clone leucêmico.

Estas aberrações genéticas podem ser oriundas de diferentes possíveis eventos

mutacionais, como translocações cromossômicas, deleções, dentre outras

(ROWLEY, 1999).

A LMA pode se apresentar como uma doença de novo ou pode ser

secundária à: uma evolução de mielodisplasia, uma crise blástica de leucemia

mielóide crônica, tratamentos que utilizam agentes alquilantes, inibidores de

topoisomerase e/ou radiação ionizante (RUND & BEN-YEHUDA, 2004).

Estudos demonstram que há uma importante diferença geográfica em relação

à incidência de leucemias pediátricas, inclusive relatados entre diferentes grupos

étnicos e raciais. Por exemplo, Arceci e Aplenc (2004), relataram que crianças

negras sofrem a incidência de 5.8 casos por milhão, comparados a 4.8 casos por

milhão em crianças brancas. Em relação às diferenças geográficas no aparecimento

da LMA, já foi descrita uma alta incidência da doença nas crianças de origem latina,

4

hispânica e asiática, sendo a leucemia promielocítica aguda o subtipo mais

encontrado entre as crianças de origem hispânica e latina (JÁCOMO; DE

FIGUEIREDO-PONTES; REGO, 2008) Tais diferenças podem conter informações

importantes, as quais poderão ajudar no esclarecimento dos mecanismos etiológicos

da LMA.

1.3 Classificação, diagnóstico laboratorial e padrão citogenético da LMA

Devido a heterogeneidade desta neoplasia, foram criadas classificações com

o intuito de uniformizá-la. Inicialmente, a classificação francesa-americano-britânica

(FAB) (BENNETT et al., 1976; BENNETT et al., 1985) foi a primeira classificação

utilizada para as LMA. Esta utiliza critérios morfológicos e citoquímicos, considera

um percentual >30% de blastos na medula óssea e divide as LMA em 8 subtipos que

variam entre M0 e M7 de acordo com o grau de maturação celular (Fig., 1.3), cada

qual com suas respectivas peculiaridades (Tabela 1.1).

Figura 1.3 – Esquematização da maturação das células hematopoéticas e suas respectivas linhagens de acordo com a classificação Franco-Americana-Britânica (FAB). Fonte: Modificado de <http://hastane.deu.edu.tr/merkezlab/dokuman/ismia/web/www.irvingcrowley.com/cls/maturation.htm> M0, M1, M2, M3, M4, M5, M6 e M7 – Subtipos morfológicos FAB da LMA

Tabela 1.1 – Classificação morfológica, imunológica e citoquímica da LMA

5

Subtipo FAB

Identificação / % Citoqúmica & Imunofenotipagem

M0 LMA com diferenciação

mínima (2%)

SB e EN (-), TdT(+/-), aMPO (+), CD33 ou CD13 (+), CD7+/-, CD14, CD15+/-, CD34

M1 LMA sem maturação

(10-20%)

MPO(+) e SB (+),aMPO (+),TdT, CD13 ou CD33, HLA-DR +, CD14, CD15, CD34, CD4+/-

M2 LMA c/ maturação

(27-29%)

MPO (+) SB (+), EN (-):, CD14(+/-);CD11(+), CD33 e/ou CD13 (+), aMPO(+), HLA-DR +,CD14, CD4

M3 Leucemia promielocítica

aguda (5-19%)

MPO (+), SB (+), CD14(-);CD11(+);CD15(+);HLA(-), CD33/CD13 (+), aMPO (+)

M4 Leucemia mielomonocítica

(16-25%)

MPO (+) SB (+) e EN (+)CD14(+);CD11(+/-);HLA(+), CD33/CD13 (+), CD13, CD33, CD15, CD36, HLA-DR +/-, CD4, CD34+/-, TdT+/-

M4Eo (variante

M4)

Leucemia mielomonocítica c/ eosinófilos anormais

(5-10%)

MPO (+) SB (+) EN (+)CD14(+/-);CD11(+); HLA (+), CD33/CD13 (+/-), CD15, CD36,CD34+/-, TdT+/-

M5 Leucemia monocítica

aguda (10-22%)

CD11c, CD13, CD33, CD36, HLA-DR +, CD15, CD14, CD4, CD34, CD7+/- ,MPO (-) SB (-),EN (+)

M6 Eritroleucemia (2-5%) Eritrócito: Glicoproteina A+, CD71, CD45+/-, Mieloblasto: os mesmos da M1, SB (+), MPO (+), EN (-)

M7 Leucemia megacariocítica

Aguda (4-8%)

CD36, CD41, CD42, ou CD61+, CD34, CD13, CD33+/-, HLA-DR+, SB (-), MPO(-), EN (+)

M0, M1, M2, M3, M4, M4Eo, M5, M6 e M7 – Subtipos morfológicos FAB da LMA, CD – Cluster

Differentiation, SB – Suddan Black, MPO – mieloperoxidase, aMPO – anti-mieloperoxidase, TdT

Terminal deoxynucleotidyl Transferase, EN – Esterase não-específica, HLA-DR – Antígeno humano

do complexo de histocompatibilidade de classe 2. Adaptado de Bennett et al., 1976

Porém, mesmo que a classificação FAB reconheça a heterogeneidade da

LMA, e que a mesma ainda seja utilizada, ela nem sempre consegue abranger toda

a diversidade clínica e genética da doença. Contudo, a morfologia que leva em

consideração o tipo de célula predominante, seu grau de maturação e o

delineamento mais preciso da linhagem hematopoética, não poderia ser descartada,

mas sim deveria ser incorporada nos sistemas de classificação atuais (HEEREMA-

MCKENNEY & ARBER, 2009).

Portanto, uma nova classificação para as neoplasias hematopoéticas

mielóides e linfóides foi estabelecida pela Organização Mundial da Saúde (WHO)

(Tabela 1.2), atualizando as propostas da classificação FAB e levando em

consideração a importância do padrão citogenético e sua associação na doença.

Esta requer, a avaliação dos blastos leucêmicos através de análises moleculares e

de citometria de fluxo (HARRIS et al., 1999).

6

Os resultados combinados destes 4 métodos de avaliação (aspectos clínicos,

biológicos, imunofenotípicos e genéticos) não apenas melhor diferenciam a LMA da

leucemia linfoblástica aguda, mas também categorizam os subtipos das leucemias

agudas. Definindo mais claramente as distintas entidades envolvidas na LMA,

através da introdução de informações citogenéticas e moleculares, podemos

caracterizar melhor o subtipo de leucemia de um paciente, e ajudar a prever o

comportamento clínico da doença, seu prognóstico, bem como indicar o tratamento

mais adequado (REGO & FALCÃO, 2002; CUCUIANU, 2005).

As duas diferenças mais significantes entre a classificação FAB e a WHO são:

(a) Um limite de blastos inferior para o diagnóstico de LMA. A WHO estabelece uma

suspeita de diagnóstico de LMA quando o percentual de blastos, na medula óssea,

chega a 20%, ao invés dos, pelo menos, 30% estipulados pela FAB. (b) Pacientes

com anormalidades citogenéticas clonais recorrentes, t(8;21)(q22;q22),

t(16;16)(p13;q22), inv(16)(p13;q22), ou a t(15;17)(q22;q12), devem ser

diagnosticados com LMA, independente do percentual de blastos (ABDUL-HAMID,

2011).

7

Tabela 1.2 – Classificação da Leucemia Mielóide Aguda proposta pela Organização Mundial da Saúde (2008)

Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e precursores relacionados à neoplasia

LMA com anormalidades genéticas recorrentes

LMA com t(8;21)(q22;q22); RUNX1/RUNX1T1

LMA com inv(16)(p13.1q22) ou t(16;16)(p13.1;q22); CBFβ/MYH11

Leucemia Promiélocítica Aguda com t(15;17)(q22;q12); PML/RARα

LMA com t(9;11)(p22;q23); MLLT3/MLL e demais rearranjos do gene MLL

LMA com t(6;9)(p23;q34); DEK/NUP214

LMA com inv(3)(q21q26.2) ou t(3;3)(q21;q26.2); RPN1/EVI1

LMA com mutação em NPM1

LMA com mutação em CEBPA

LMA com displasia de múltiplas linhagens

- Seguida de Síndrome Mielodisplásica (SMD)

- Sem antecedente de SMD

LMA e SMD associadas a tratamento

- Associada a agentes alquilantes/radiação

- Associada a inibidores de topoisomerase-II

Sarcoma mielóide

Proliferações mielóides relacionadas à Síndrome de Down

- Mielopoese anormal transitória

- Leucemia mielóide associada à Síndrome de Down

Neoplasia de células dendríticas plasmocitóides blásticas

LMA – Leucemia Mielóide Aguda, t – translocação, inv – inversão, p – braço curto do cromossomo, q

– braço longo do cromossomo, SMD – Síndrome Mielodisplásica. Fonte: Adaptado de Dohner et

al., 2010

Trabalhos na literatura têm apontado que aproximadamente 85% das crianças

com LMA apresentam alterações cromossômicas na medula óssea e/ou no sangue

periférico, no momento do diagnóstico (RAIMONDI et al., 1999; MANOLA, 2009); já

nos pacientes adultos acometidos pela doença, estas alterações são detectadas em

aproximadamente 60% dos casos (MRÓZEK; HEEREMA; BLOOMFIELD, 2004).

8

Na LMA podem ser encontradas alterações citogenéticas dos tipos numéricas

e/ou estruturais. As alterações numéricas abrangem monossomias e nulissomias, o

que resulta em um cariótipo com menos de 46 cromossomos ou, trissomias,

tetrassomias, dentre outras, demonstrando um cariótipo hiperdiplóide, com mais de

46 cromossomos (MANOLA, 2009). As anomalias estruturais são principalmente as

translocações e inversões. Algumas anormalidades cromossômicas estão

associadas com os subtipos da classificação FAB. A t(8;21)(q22;q22) está associada

ao subtipo M2, a t(15;17)(q22;q21) associada ao M3 e a inv(16) à M4, por exemplo

(RAIMONDI et al., 1999; MANOLA, 2009).

1.3.1 Leucemia Mielóide Aguda minimamente diferenciada – LMA-M0

Este subtipo é considerado raro, acometendo cerca de 2-10% dos pacientes

com LMA. Estes pacientes apresentam 40% de leucocitose e mais de 50% de

leucocitopenia. Sua citologia apresenta 3% ou menos dos blastos positivos para a

reação de mieloperoxidase (MPO) e “sudan black B” (SB), positividade para os

marcadores mielóides CD13, CD14, CD15 ou CD33, CD34 e negatividade para os

marcadores de linhagem de células B ou T (BENNETT et al., 1991; DA SILVA et al.,

2006). Os blastos são indiferenciados (Fig., 1.4A). O M0 apresenta um alto

percentual de cariótipos complexos (20%) e desbalanceados. Também é comum

observar anormalidades envolvendo os cromossomos 5 e 7 em 15-20% dos casos,

anormalidades envolvendo o cromossomo 8 e a região 11q23 em 10-15% e cariótipo

normal em 25% dos casos, sugerindo mutações pontuais. A t(9;22)(q34;q11) (Fig.,

1.4B) pode ser encontrada em 5% dos casos (BOHLANDER, 2005).

Figura 1.4 – Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M0. A) Blastos característicos do M0. Fonte: Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial apresentando a t(9;22)(q34;q11). As setas em vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Modificado de Bohlander, 2005. <http://AtlasGeneticsOncology.org/Anomalies/t0922p24q11ID1331.html>

9

1.3.2 Leucemia Mielóide Aguda sem maturação – LMA-M1

O subtipo M1 está presente em cerca de 10-20% dos casos de LMA, porém é

raro na infância, representando apenas 1-2% dos casos. Dos pacientes acometidos

por este subtipo, 50% apresentam leucocitose no momento do diagnóstico. Quanto à

citologia, no sangue periférico, a célula predominante é normalmente um mieloblasto

pouco diferenciado (Fig., 1.5A). Bastões de Auer são encontrados em

aproximadamente 50% dos blastos do M1. Mais de 3% dos blastos são positivos

para a reação de MPO e SB, indicando diferenciação dos granulócitos (BENNETT et

al., 1976), e os antígenos mielóides frequentemente positivos são: CD13, CD14,

CD15, CD33 e CD34. Quanto à caracterização citogenética, o M1 apresenta uma

alta frequência de aberrações cromossômicas clonais, mostrando uma associação

com a trissomia dos cromossomos 4, 11, 13 e 21. A t(6;9)(p23;q34) (Fig., 1.5B) está

associada a este subtipo, presente em 1% dos casos totais de LMA (BACHER, U. et

al., 2005; DA SILVA et al., 2006).

Figura 1.5 – Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M1. A) Blastos característicos do M1. Fonte: Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial demonstrando translocação t(6;9)(q23;q34). As setas em vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Modificado de Huret, 1998. <http://atlasgeneticsoncology.org/Anomalies/t0609.html>

1.3.3 Leucemia Mielóide Aguda com maturação – LMA-M2

O subtipo M2 está presente em cerca de 27-29% dos casos. As

características e sintomas presentes neste subtipo são similares às do M1. Em

relação a citologia, a característica que distingue a LMA-M2 da M1 é justamente a

maturação, maior ou a nível do estágio de promielócito (Fig. 1.6A). A medula óssea

é hipercelular, e o tipo celular mais comum é o mieloblasto. Os antígenos,

diferenciais, frequentemente observados em casos de LMA-M2 são CD13 e CD15

(ABDUL-HAMID, 2011). A anormalidade citogenética específica associada a este

subtipo é a t(8;21)(q22;q22) presente em 10-15% dos casos, sendo a segunda

alteração citogenética estrutural mais encontrada na LMA da infância (Fig., 1.6B). A

fusão gênica RUNX1-RUNX1T1 (ou AML1/ETO), que resulta da t(8;21)(q22;q22),

também é associada a este subtipo (DA SILVA et al., 2006).

10

Figura 1.6 – Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M2. A) Blastos característicos do M2. Fonte: Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial demonstrando a translocação t(8;21)(q22;q22). As setas em vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Capela de Matos, R.R. – Laboratório de Citogenética – CEMO - INCA

1.3.4 Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) – LMA-M3

A LPA corresponde a cerca de 5-19% dos casos de LMA. Quanto à citologia,

a LPA apresenta prevalência de promielócitos anormais hipergranulares (Fig., 1.7A),

com muitos bastonetes de Auer por célula. O subtipo M3v (M3 variante) se

caracteriza por fina granulação e pequeno número de bastões de Auer. As reações

para MPO e SB, são bem marcadas, tanto para M3 quanto para M3v. Os

marcadores imunofenotípicos mais frequentes são: CD13, CD15, CD1, CD33, CD2 e

CD19, com negatividade para HLA-DR e CD34 (ABDUL-HAMID, 2011). Os

pacientes com LPA podem vir a desenvolver coagulação intravascular disseminada,

a mais séria complicação clínica da LMA-M3. Estudos citogenéticos têm revelado

que quase a totalidade dos casos de LPA (>95%) apresentam a translocação

t(15;17)(q22;q21) (Fig., 1.7B), levando à fusão gênica PML/RARα ou RARα/PML. As

translocações variantes comumente descritas são: t(11;17)(q23;q12) levando à

fusão RARα/PLZF; a t(5;17)(q23;q12) levando à RARα/NPM; t(11;17)(q13;q12)

levando à RARα/NUMA (SCHOCH, 2006). Anormalidades adicionais são comuns,

observadas em 35-45% dos casos de LPA, sendo a mais frequente a trissomia do

cromossomo 8.

Figura 1.7 – Leucemia Promiélocítica Aguda – LMA-M3. A) Blastos característicos do M3. Fonte: Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Translocação t(15;17)(q22;q21) – cariótipo parcial. As setas em vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Capela de Matos, R.R. – Laboratório de Citogenética – CEMO – INCA

11

1.3.5 Leucemia Mielomonocítica Aguda – LMA-M4

Este subtipo, presente em 16-25% dos casos de LMA, se distingue dos M1,

M2 e M3 devido a um aumento na proporção de células monocíticas na medula

óssea e/ou sangue periférico (Fig., 1.8A). O paciente acometido por este subtipo

apresenta hiperplasia gengival com sangramento na gengiva, anemia e

trombocitopenia. A contagem leucocitária apresenta normalmente um aumento das

células monocíticas. Quanto à citologia, a soma de células mielocíticas, incluindo

mieloblastos, promielócitos e granulóctios maduros é >20% e <80% das células não-

eritróides. Com uma leve discrepância, alguns casos raros de LMA-M4 são

caracterizados por um aumento de eosinófilos na medula óssea, e estes são

classificados como M4Eo (M4 Eosinofílica) (BERGER et al., 1985; DA SILVA et al.,

2006). O M4 apresenta reações positivas para SB, MPO, além de esterase

específica e não específica. O perfil imunológico demonstra positividade para CD13,

CD33, CD11b e CD14. Quanto à citogenética, a anormalidade característica mais

frequente é a inv(16)(p13;q22) (Fig., 1.8B) acometendo de 6-12% dos pacientes

pediátricos e de 8-12% dos adultos com LMA. Suas conhecidas variantes são a

del(16)(q22) e a t(16;16)(p13;q22) (HURET, 1999).

Figura 1.8 – Leucemia Mielomonocítica Aguda – LMA-M4. A) Blastos característicos do M4. Fonte: Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial apresentando a recorrente inv(16)(p13;q22). A seta em vermelho indica a inversão cromossômica. Fonte: Capela de Matos, R.R. – Laboratório de Citogenética – CEMO - INCA

1.3.6 Leucemia Monoblástica Aguda – LMA-M5

Este subtipo corresponde a aproximadamente 10-22% dos casos. Os

sintomas comuns do subtipo M5 são: fraqueza, sangramento e uma erupção

cutânea eritematosa difusa. Há uma alta frequência de infiltração extramedular nos

pulmões, cólon, meninges, linfonodos, bexiga e laringe, além de hiperplasia

gengival. Quanto à citologia, o critério diferencial para o diagnóstico laboratorial é

que 80% ou mais de todas as células não-eritróides, na medula óssea, sejam células

monocíticas (Fig., 1.9A). Existem dois tipos distintos, o 5a, com índice de maturação

12

menor que 4%, e o 5b, com índice de maturação maior que 4%. O M5a apresenta o

número de granulócitos menor que 20%, monócitos maior que 80% e monoblastos

maior que 80%. O tipo M5b apresenta o número de granulócitos menor que 20%,

monócitos maior que 80% e monoblastos menor que 80%. MPO e SB se

apresentam fracos no monoblasto, e a imunofenotipagem mostra o perfil com

positividade para CD11b e CD14. Em relação à citogenética, normalmente,

pacientes acometidos por este subtipo, e pelo previamente descrito (M4), são

estratificados como alto risco devido a forte associação da LMA M5 e M4 com

deleções ou translocações envolvendo a região 11q23 (loci do gene MLL), e neste

contexto, destaca-se a translocação recorrente t(9;11)(p22;q23), presente em 8-10%

dos casos em pacientes pediátricos e de 1-2% em adultos (Fig., 1.9B), levando à

fusão gênica MLL-MLLT3 (DA SILVA et al., 2006; ABDUL-HAMID, 2011).

Figura 1.9 – Leucemia Monoblástica Aguda – LMA-M5. A) Blastos característicos do M5; Fonte: Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial apresentando a recorrente t(9;11)(p22;q23). As setas em vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Capela de Matos, R.R. – Laboratório de Citogenética – CEMO - INCA

1.3.7 Eritroleucemia Aguda – LMA-M6

O M6 é um subtipo raro de leucemia, especialmente na infância,

representando apenas de 2-5% dos casos de LMA. As manifestações clínicas mais

comuns são sangramento, anemia com eritrócitos e hemácias anormais. Há,

normalmente, diminuição na contagem de leucócitos e plaquetas. Seu diagnóstico

pode ser determinado quando mais de 50% de todas as células nucleadas da

medula óssea são eritróides (ABDUL-HAMID, 2011). Neste subtipo morfológico,

eritroblasto se apresenta anormal (Fig., 1.10). O perfil imunofenotípico das células

blásticas expressa CD13, CD33, anti-MPO, com ou sem a expressão de marcadores

de precursores determinantes para as células blásticas dos demais subtipos de

LMA, como: CD34 e HLA-DR. Quanto à caracterização citogenética, assim como os

subtipos morfológicos M0 e M1, o M6 não está associado à anomalias

13

cromossômicas específicas, porém apresenta uma alta incidência de cariótipos

complexos, chegando a cerca de 61% dos casos (BACHER et al., 2005).

Figura 1.10 – Eritroleucemia Aguda – LMA-M6. A) Blastos característicos do M6. Fonte: Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo complexo M6. Fonte: Modificado de <http://www.meds.com/leukemia/facts/facts_m6.html>

1.3.8 Leucemia Megacarioblástica Aguda – LMA-M7

O subtipo M7 é raro, presente em apenas 2% dos pacientes pediátricos. É

caracterizado pela ocorrência de megacarioblastos com fibrose medular associada.

Seu diagnóstico inicial demonstra pancitopenia. Quanto à citologia, o M7 apresenta

mais de 30% de blastos na medula, e um número elevado de fibroblastos (Fig.,

1.11A) e/ou reticulina. A reação para MPO é negativa, e o perfil imunofenotípico

demonstra positividade para CD41, CD42 e CD61. Em relação à caracterização

citogenética, não há uma anormalidade cromossômica específica associada ao

subtipo M7. Comumente, o cariótipo dos pacientes acometidos por este subtipo da

doença se apresentam anormais, com aberrações complexas e anormalidades

envolvendo os cromossomos 5 e 7. Porém, no que diz respeito estritamente aos

pacientes pediátricos, a t(1;22)(p13;q13) (Fig., 1.11B) vem sendo reportada na

literatura em aproximadamente 50% dos casos. Ainda nesta faixa etária, em cerca

de 10% dos pacientes o cariótipo é normal, sugerindo possíveis mutações pontuais

(CUNEO; CAVAZZINI; CASTOLDI, 2003).

14

Figura 1.11 – Leucemia Megacarioblástica Aguda – LMA-M7. A) Blastos característicos do M7. Fonte: Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial apresentando a t(1;22)(p13;q13). Fonte: Modificado de Huret, 1997. <http://atlasgeneticsoncology.org/Anomalies/t0122.html>

Apesar da LMA ser uma doença bastante hetrerogênea, seus vários subtipos

parecem compartilhar caminhos similares que levam a leucemogênese. Atualmente,

um modelo bem aceito é o modelo multistep, no qual a LMA se origina a partir da

cooperação entre duas classes de mutações genéticas, responsáveis por regular a

diferenciação e a auto renovação hematopoética. As mutações de tipo II (como as

translocações) alteram a habilidade de diferenciação das células precursoras,

enquanto que as mutações de tipo I (FLT/ITD ou mutações pontuais no c-KIT),

fornecem um sinal proliferativo, levando ao surgimento da LMA. Uma vez que 80%

das crianças com LMA apresentam alterações estruturais genômicas associadas à

doença, e 76% daquelas que apresentam cariótipo normal têm ao menos uma

mutação conhecida, em seu perfil mutacional, observa-se que atualmente 90% dos

pacientes pediátricos com LMA tem pelo menos uma anormalidade genômica

conhecida (Fig., 1.12) (PUI et al, 2011).

15

Figura 1.12 – As anormalidades genéticas na Leucemia Mielóide Aguda – O painel da esquerda mostra as alterações cariotípicas mais comuns. O Perfil de mutação naqueles sem anomalias citogenéticas (cariótipo normal) é mostrado no painel da direita. Fonte: Modificado de Pui et al., 2011. del – deleção, (-) – monossomia, (+) – trissomia, t – translocação, inv – inversão, q – braço longo do cromossomo

16

1.4 A relevância da caracterização citogenética tumoral

Recentes dados da literatura, à exemplo da revisão de Braoudaki e

Tzortzatou-Stathopoulou (2012), tem demonstrado que a análise citogenética de

genes envolvidos em translocações específicas à doença, é considerada uma das

mais poderosas ferramentas, levando a uma melhor compreensão das causas dos

rearranjos cromossômicos e dos mecanismos subjacentes à transformação

leucêmica. Mais precisamente, a análise citogenética vem propiciando

conhecimentos notáveis quanto à heterogeneidade de uma população celular, além

de permitir a detecção de diversas anormalidades genéticas e cromossômicas em

diversos tipos de malignidades mielóides, incluindo a LMA, e os demais tipos de

leucemias. Por exemplo, para tais neoplasias, a presença ou ausência de

aberrações cromossômicas é um fundamental fator prognóstico (BRAOUDAKI &

TZORTZATOU-STATHOPOULOU, 2012).

Porém, até chegar ao presente nível de conhecimento, foi a uma longa

jornada, pois o potencial da citogenética tumoral estava limitado aos recursos

tecnológicos e científicos da primeira metade do século XX. Se fazia necessário o

aprimoramento das técnicas de obtenção cromossômica e também das técnicas de

análise cariotípica. Este aprimoramento pode ser acompanhado de modo

esquemático, dividindo o desenvolvimento da análise dos cromossomos em 5 fases.

A citogenética tumoral deu seus primeiros passos com a descoberta de

métodos para obtenção de células metafásicas, em culturas celulares in vitro, e se

estendeu até 1969, levando à descoberta do cromossomo philadelphia (Ph) na

leucemia mielóide crônica (NOWELL & HUNGERFORD, 1960). Nesta fase, devido

aos cromossomos serem corados por corante de Giemsa, sem tratamento prévio,

era muito difícil a distinção confiável entre os pares não-homólogos.

A fase 2 teve seu marco com o desenvolvimento da técnica de bandeamento

(1969–1971), a qual tornou possível dar uma identidade precisa aos pares de

cromossomos, bem como caracterizar as alterações cromossômicas de diversas

doenças. Foi então descrita a primeira translocação no câncer humano, a

t(8;21)(q22;q22), em pacientes com LMA (ZECH, 1969) e a natureza do

cromossomo Ph como produto de uma translocação recíproca, envolvendo os

cromossomos 9 e 22, a t(9;22)(q34;q11) (ROWLEY, 1999).

A fase 3 se iniciou com o uso de sondas específicas de DNA marcadas com

material fluorescente, que permitiam identificar genes ou lócus gênicos específicos.

Estas sondas originaram a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH)

17

(VAN PROOIJEN-KNEGT et al., 1982). O advento desta técnica permitiu a

identificação de anormalidades cromossômicas que envolvem segmentos de DNA

ainda menores, por exemplo revelando os pontos de quebra envolvidos na inversão

pericêntrica do cromossomo 16, ajudando a melhor caracterizar o subtipo M4,

encontrado em pacientes com LMA (KUNDU & LIU, 2001). Porém, o grande impacto

causado pela implementação desta técnica é que ela não necessita de metáfases de

boa qualidade, permitindo a identificação de aberrações cromossômicas,

diretamente em células em intérfase, obtidas a partir de suspensões, de tecido

congelado ou fixado e incluso em parafina, além da análise em preparações

cromossômicas.

A fase de número 4 começou quando, com a valiosa ideia da combinação de

mais de três fluorocromos, foram desenvolvidas sondas para cromossomos inteiros,

gerando assim um padrão específico de cor para cada um dos 23 pares de

cromossomos (SPEICHER; BALLARD; WARD, 1996; SCHRÖCK et al., 1996). Esta

técnica chamada de cariótipo espectral (SKY) ou FISH multiplex (M-FISH), desde

sua implementação, tem se mostrado uma importante ferramenta na detecção de

translocações, e principalmente, para detectar anomalias cromossômicas

complexas. Previamente, a amplificação de regiões nos braços longos dos

cromossomos 11 (11q), 21 (21q) e 22 (22q), as quais podem desempenhar um papel

importante na leucemogênese, não eram possíveis de ser detectadas em pacientes

com LMA que apresentavam cariótipos complexos (MRÓZEK et al., 2002).

A fase 5 surgiu juntamente com o M-FISH e esta fez uma grande diferença na

caracterização cariotípica. Pelo uso de sondas que foram confeccionadas a partir da

microdissecção de pedaços de todos os cromossomos humanos e posteriormente

marcadas com cinco fluorocromos diferentes, são gerados padrões de cores, para

as bandas e sub-bandas, de cada um dos 24 cromossomos, pela sobreposição

destes vários fragmentos de DNA (WEISE et al., 2008). Denominada Multicolor

Chromosome Banding (MCB), esta técnica tem se mostrado muito importante na

caracterização de cariótipos complexos, e/ou cariótipos com anormalidades crípticas

nas LMA (MACEDO SILVA et al., 2005; SILVA et al., 2008; MARQUES-SALLES et

al., 2009). Isto junto ao fato desta técnica permitir a identificação, com exatidão, dos

pontos de quebra dos cromossomos envolvidos nas alterações cromossômicas,

muitas delas crípticas.

Contudo, em meio a todo o avanço proporcionado pelas técnicas de FISH

multicor, estas apresentam uma limitação bastante pontual, pois necessitam de

18

metáfases de boa qualidade para uma análise fidedigna. Esta limitação foi superada

através da implementação da hibridização genômica comparativa (CGH), técnica

baseada na comparação do DNA genômico normal com o DNA genômico

neoplásico. Nesta, as amostras de DNA são, cada qual, marcadas com fluorocromos

verde e vermelho, respectivamente, misturados em quantidades iguais e

posteriormente é feita a co-hibridização.

O advento desta técnica trouxe avanços na compreensão da biologia de

diversas doenças, como a exemplo da citogenética aplicada a tumores sólidos, que

apresentam limitações na qualidade das metáfases (KEARNEY, 2001). Porém, as

técnicas de FISH não podem ser deixadas para trás, uma vez que para os rearranjos

que não envolvem perdas genômicas, a exemplo das translocações balanceadas e

as inversões, o uso da CGH é limitado, pois não é capaz de detectar rearranjos

estruturais nos quais não ocorrem perdas ou ganhos de material cromossômico, não

fornecendo, portanto, informações sobre os segmentos cromossômicos envolvidos

nestes rearranjos.

Descrito na década de 90, o array CGH utiliza pequenas regiões específicas

do genoma humano. Estes arrays cobrem todo o genoma, com apenas um clone

para cada megabase (mb) de DNA. Esta técnica é aplicada tanto na pesquisa em

genética clinica quanto em genética tumoral. Estes arrays também foram aplicados,

devido a sua flexibilidade, na detecção de perdas de heterozigosidade de

nucleotídeos únicos ou de alterações no número de cópias de determinados

segmentos cromossômicos. Estes foram nomeados Single Nucleotide Polymorphism

(SNP) array e diferentemente do array CGH, no array SNP é hibridizada apenas uma

amostra genômica, possibilitando então a identificação de alterações no número de

cópias pela comparação com a hibridização de um controle independente

(EMANUEL & SAITTA, 2007).

19

Tabela 1.3 – Sumário das anormalidades cromossômicas numéricas e estruturais da LMA

Anormalidades cromossômicas numéricas na LMA

Anormalidade Número de cromossomos Métodos citogenéticos moleculares para

detecção Prognóstico

Alta hiperdiploiodia 51-67 Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Favorável

del (7q) - Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Desfavorável

-5 45 Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Desfavorável

+8 47 Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Favorável

+21 47 Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Desfavorável

Anormalidades cromossômicas estruturais na LMA

Anormalidade Fusão gênica Métodos citogenéticos moleculares para

detecção Prognóstico

t(8;21) (q22;q22) AML1/ETO or RUNX1/RUNX1T1 FISH, RT-PCR Favorável

Inv(16)(p13;q22) CBFβ/MYH11 FISH, MCB, RT-PCR, RQ-PCR Favorável

t(9;22)(q34;q11) BCR/ABL1 FISH, RT-PCR, RQ-PCR Desfavorável

t(15;17)(q22;q21) PML/ RARα FISH, RT-PCR Favorável

11q23 MLL FISH, MCB, RT-PCR Intermediário / Mau

t(11;19)(q23;p13.3) MLL/MLLT1 FISH, MCB, RT-PCR Desfavorável

t(6;11)(q27;q23) MLL/MLLT4 FISH, MCB, RT-PCR Desfavorável

t(9;11)(p22;q23) MLL/MLLT3 FISH, MCB, RT-PCR Favorável

t(10;11)(p12;q23) MLL/MLLT10 FISH, MCB, RT-PCR Desfavorável

9q Desconhecido FISH, RT-PCR Desfavorável

t(1;22)(p13;q13) OTT/MAL FISH, MCB Desfavorável del – deleção, (-) – monosomia, (+) – trissomia, p – braço curto do cromossomo, q – braço longo do cromossomo, t – translocação, FISH – Fluorescense in situ Hibridization, MCB – Multicolor Chromosome Banding, CGH – Comparative Genomic Hybridization, RQ-PCR – Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-PCR – Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction. Fonte: Adaptado de Braoudaki & Tzortzatou-Stathopoulou, 2012

20

Neste contexto, a técnica de bandeamento G consegue revelar um cariótipo

complexo, porém não pode apontar a origem dos rearranjos envolvidos, enquanto

que o M-FISH pode identificar os rearranjos cromossômicos presentes, porém não

consegue precisar informações sobre os desbalanceamentos genômicos. Além

disto, o ponto forte do M-FISH (ou SKY) está em definir translocações e

cromossomos marcadores em cariótipos complexos, enquanto que a CGH pode

revelar amplificações e/ou deleções escondidas. Portanto, as tecnologias M-FISH,

MCB e CGH se provaram parceiros eficazes, e ferramentas poderosas na

descoberta de genes (BISHOP, 2010; GREISMAN; HOFFMAN; HI, 2011).

Em suma, devido a heterogeneidade desta doença e seu número cada vez

maior de significância prognóstica individualizada, é importante o uso combinado do

maior arsenal de técnicas citogenéticas disponível, de modo a melhor caracterizar e

desvendar rearranjos cromossômicos complexos (Tabela 1.3).

1.5 Fatores prognósticos e classificação de risco da LMA

A caracterização – e extensões – da LMA, descritas acima, possuem

relevância prognóstica. Acima de aspectos clínicos como idade, sexo, contagem

leucocitária, extensão da doença e morfologia das células, as anormalidades

cromossômicas dominam a nível de fatores prognósticos, em todas as faixas etárias

(KASPERS & REINHARDT, 2011). Devido a ampla e crescente evolução das

técnicas utilizadas na detecção destas anormalidades, cada vez mais é possível

identificar e caracterizar alterações moleculares como possíveis mediadoras da

leucemogênese (Tabela 1.3). Neste contexto, nos últimos 20 anos, o prognóstico

das crianças com LMA melhorou, chegando atualmente a uma taxa de sobrevida

livre de recidiva em 5 anos de quase 40%, para o conjunto de pacientes (HEAD,

2004; BRAOUDAKI & TZORTZATOU-STATHOPOULOU, 2012; PELOQUIN; CHEN;

FATHI, 2013).

A citogenética per se pode dividir os pacientes com LMA em três amplos

grupos de risco (Tabela 1.4), abordando o impacto sobre o risco de recaída, a

sobrevida livre de doença e a sobrevida total: favorável (baixo risco), intermediário, e

desfavorável (alto risco). O grupo com LMA favorável inclui o das leucemias Core

Binding Fator (CBF) t(8;21)(q22;q22) (RUNX1-RUNX1T1), inv(16)(p13;q22)

(MYH11/CBFβ), bem como a t(15;17)(q22;q21) (PML/RARα). O grupo com LMA

desfavorável inclui pacientes que apresentam monossomia do cromossomo 7,

monossomia do cromossomo 5, del(5q), t(6;9)(q23;q34), t(9;22)(q34;q11) e o

21

cromossomo 3 anormal, e cariótipos complexos com estas supracitadas e/ou outras

anormalidades crípticas. O grupo de risco intermediário inclui as demais

anormalidades vistas comumente na LMA, como a trissomia do cromossomo 8 e a

trissomia do cromossomo 21, além de anormalidades associadas à região 11q23

(MLL), bem como pacientes com cariótipo normal (RADHI; MESHINCHI; GAMIS,

2010; KASPERS & REINHARDT, 2011).

Um relevante estudo apontou que cerca de 45% das LMA apresentam

cariótipo normal pela análise da citogenética convencional, sendo necessário então

estudos moleculares para detectar rearranjos ocultos (invisíveis ao nível de

cromossomo, por causa do tamanho, que pode variar de 1 a 2 mb) ou aberrações

moleculares, como por exemplo, mutações pontuais que não podem ser detectadas

na análise por citogenética convencional (YAMAMOTO et al., 2001; CUNEO et al.,

2002; GAMERDINGER et al., 2003; KLAUS et al., 2004).

Ainda como um grupo de anormalidades mal definido, os cariótipos

complexos são possíveis indicadores de mau prognóstico, inclusive em pacientes

pediátricos, o que em parte se deve à raridade da doença, porém ainda assim são

poucos os dados publicados (BETTS et al., 2007). Neste contexto,

concomitantemente, terapias atuais ainda são falhas para tratar pacientes que

apresentam cariótipos complexos. A principal causa da falha no tratamento é a

recaída, ilustrando a ineficiência das abordagens terapêuticas atuais em erradicar o

clone maligno na maioria dos pacientes, até mesmo naqueles que receberam

transplante de medula óssea (TMO) alogênico (SCHOCH et al., 2001).

Portanto, na medida em que as técnicas de citogenética molecular tais como

FISH, M-FISH e MCB são aprimoradas, e a detecção molecular vem sendo

incorporada, as anormalidades citogenéticas podem ser melhor compreendidas e

diferenciadas por seus respectivos impactos sobre o prognóstico (RADHI;

MESHINCHI; GAMIS, 2010). Matos e colaboradores (2013), por exemplo,

demonstraram que abordagens de citogenética molecular puderam precisar

detalhadamente a caracterização de uma anomalia citogenética críptica, nunca

previamente revelada por quaisquer ensaios prévios, que teve importância na

citogenética inicial, na evolução clínica e estratificação de risco do paciente.

Portanto, com pacientes sistematicamente testados e uniformemente tratados,

explorando anormalidades complexas e revelando suas especificidades

moleculares, marcadores prognósticos podem ser identificados, para serem então

possíveis alvos terapêuticos (MATOS et al., 2013).

22

Tabela 1.4 – Estratificação de risco, recaída e sobrevida da LMA

Estratificação de risco

Anormalidades genéticas tipo II Anormalidades genéticas tipo I

Favorável t(8;21) (RUNX1/RUNX1T1), t(15;17) (PML/RARα), t(16;16), inv(16)

(MYH11/CBFβ)

Cariótipo normal: com mutação de NPM1 ou uma mutação isolada de CEBPA na ausência de FLT3 mutado

Intermediário Cariótipo normal, +8, t(9;11) Mutação em c-KIT concomitante à t(8;21), t(16;16), inv(16): mutação FLT3-ITD com mutação de NPM1

Desfavorável Cariótipos complexos, -5, -7, 5q-, 7q-, anormalidades na região 11q23 (MLL)

Cariótipo normal com mutação FLT3-ITD na ausência de mutação em NPM1

Recaída e sobrevida

Risco de Recaída (RR) % Sobrevida Total (ST) %

Favorável Pacientes pediátricos 32 78

Todas as idades (≤55) 35 65

Intermediário Pacientes pediátricos 40 55

Todas as idades (≤55) 51 41

Desfavorável Pacientes pediátricos 61 42

Todas as idades (≤55) 76 14 t – translocação, inv – inversão, q – braço longo do cromossomo, (+) – trissomia, (-) – ausência, (%) – por cento, (RR) – Risco de Recaída, (ST) – Sobrevida Total. Fonte: Adaptado de Radhi; Meschinchi; Gamis, 2010; Arceci & Aplenc, 2011

23

1.6 Cariótipos complexos na LMA

A citogenética é considerada um dos mais importantes parâmetros de

prognóstico na LMA, e embora algumas aberrações cromossômicas já sejam bem

descritas e associadas à subtipos citomorfológicos, ainda, 10-12% de todos os

pacientes acometidos pela LMA, apresentam cariótipos com múltiplos rearranjos

cromossômicos, muitas vezes crípticos, envolvendo três ou mais anormalidades

cromossômicas (MARCHESI et al., 2011; AL-ACHKAR et al., 2013).

Qualquer cariótipo com pelo menos três aberrações cromossômicas,

independentemente do seu tipo e os cromossomos individuais envolvidos, pode ser

referido como cariótipo complexo (CC) (MRÓZEK, 2008; OROZCO & APPELBAUM,

2012; AL-ACHKAR et al., 2013).

Alguns trabalhos tem mostrado que a presença de CC nos blastos da medula

óssea, de pacientes com LMA, tem representado um possível indicador de mau

prognóstico, podendo influenciar negativamente na evolução clínica do paciente. A

literatura também tem demonstrado que na maior parte dos casos, a doença tem

sido resistente ao tratamento inicial, com recaída prematura dos pacientes (BETTS

et al., 2007; MARCHESI et al., 2011).

Além disto, pesquisadores do Medical Research Council (MRC) demostraram,

em um recente trabalho, que a cada anormalidade adicional presente no cariótipo,

aumentam-se os riscos de não se atingir a remissão completa (RC) e o risco de

mortalidade do paciente (OROZCO & APPELBAUM, 2012).

Outros relatos tem demonstrado que a incidência de CC aumenta com a

idade, uma vez que a frequência de CC é significantemente menor em pacientes

pediátricos com LMA quando comparados a adultos também acometidos por esta

neoplasia. Neste contexto, um estudo envolvendo pacientes pediátricos relatou que

a taxa mais alta de CC foi observada em crianças com menos de 3 anos, porém

poucos dados de significância prognóstica foram publicados sobre pacientes nesta

faixa etária (MRÓZEK, 2008; MANOLA, 2009).

Os cariótipos complexos são mais comuns na LMA secundária –

aproximadamente duas vezes mais frequentes do que na LMA de novo – embora

para ambas seja um possível indicador de mau prognóstico – proveniente de um

acúmulo progressivo de aberrações cromossômicas oriundas de tratamento prévio

(agentes alquilantes ou radiação), ou de uma outra doença hematológica (BETTS et

al., 2007; OROZCO & APPELBAUM, 2012). Neste contexto, a literatura também

relata que há um alto percentual de chance de pacientes com SMD, e que

24

apresentam CC, evoluírem para LMA, e ainda mais, que a complexidade do cariótipo

está associada a baixa taxa de sobrevida total (ST) na SMD, bem como a esta

evolução para LMA (VALCÁRCEL et al., 2013).

Como relatado acima, os CC têm sido relacionados, na literatura, com uma

evolução clínica desfavorável, e faz-se importante ressaltar que estes cariótipos

podem carrear, de modo críptico, uma anomalia cromossômica específica,

responsável por um prognóstico adverso, dentre suas alterações (DE FIGUEIREDO

et al., 2012; NEY-GARCIA et al., 2012). Uma vez que tem sido sugerida uma

possível correlação entre a combinação das aberrações detectadas – em um CC – e

a resposta clínica, fica clara a necessidade de um refinamento na caracterização

deste tipo de perfil cariotípico.

25

2. Objetivo

Caracterizar cariótipos complexos e/ou inconclusivos a partir de amostras de

pacientes pediátricos diagnosticados com Leucemia Mielóide Aguda.

2.1 Objetivos específicos:

a) Refinar a caracterização dos cariótipos complexos e/ou inconclusivos

utilizando as técnicas de citogenética molecular: FISH, M-FISH e MCB.

b) Detectar e descrever as anormalidades crípticas, e não crípticas,

encontradas nos cariótipos complexos.

c) Avaliar a eficácia das técnicas de citogenética molecular (FISH, M-FISH e

MCB), na caracterização dos cariótipos complexos e/ou inconclusivos.

26

3. Material e métodos

3.1 Desenho Experimental

Medula óssea/ sangue periférico

Colchicina

Hipotonia e fixação dos cromossomos

Sem mitose Com mitose

FISH Bandeamento G

Cariótipos

Complexos,

Suspeita de

Anormalidades

Crípticas

M-FISH, MCB

Preparação

Cromossômica

Cultura celular

Lâmina teste

27

3.2. Amostra e considerações éticas

O presente estudo teve caráter multicêntrico, utilizando amostras

provenientes de diferentes instituições hospitalares de vários estados brasileiros,

incluindo no Rio de Janeiro, o Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da

Silva (INCA), o Hospital Federal da Lagoa, o Instituto de Puericultura e Pediatria

Martagão Gesteira (IPPMG), e o Hospital dos Servidores do Estado (HSE), na Bahia,

o Hospital ONCOSUL e a Santa Casa de Misericórdia de Itabuna e, em Santa

Catarina, o Hospital Pequeno Príncipe.

Os dados clínicos, os relatos de caso para acompanhamento, bem como os

exames citoquímicos, de imunofenotipagem e morfológicos foram cedidos por

intermédio dos hematologistas responsáveis – na instituição de admissão – pelos

respectivos pacientes.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do INCA,

Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil, sob o cadastro #088/07 e atualizado no último

relatório parcial, em 22/08/2013.

3.3 Critérios de inclusão e exclusão

De acordo com os critérios de inclusão deste estudo foram selecionadas as

amostras com diagnóstico de LMA, nas quais a análise por bandeamento G revelou

cariótipo complexo e/ou inconclusivo, representadas por:

• Amostras que apresentaram metáfases ou cromossomos com

morfologia inadequada para análise;

• Amostras que apresentaram cromossomos marcadores;

• Amostras que apresentaram alterações cromossômicas não possíveis

de serem caracterizadas pela citogenética convencional.

Nos critérios de exclusão estavam:

• Os cariótipos de pacientes com idade superior a 18 anos;

• Os cariótipos de pacientes que, após a análise citogenética com uma

boa morfologia, foram normais.

3.4 Estudo cromossômico por bandeamento G

Os estudos cromossômicos foram realizados em aspirado de medula óssea

e/ou sangue periférico, seguindo os critérios descritos por Silva e colaboradores

28

(2008). Para obtenção de mitoses, foram cultivadas 5 x 106 células em 5mL de meio

de cultura composto de RPMI 1640 (Sigma-Aldrich®) (80%) e soro bovino fetal

(HyClone) (20%) em tubos tipo Falcon de 15mL. As células foram incubadas durante

24 horas em estufa de CO2 a 37°C. Após 22-23 horas, foi adicionada uma solução

de colchicina (Difco) numa concentração de 0,05μg/mL. Ao término do período de

incubação, seguiu-se a retirada da cultura e o preparo das lâminas. Após o período

de 24 horas de incubação, as células foram centrifugadas e o precipitado obtido foi

submetido a choque hipotônico, utilizando uma solução de KCl a 0,07M em banho-

maria a 37ºC. Após 15 minutos, as células foram fixadas três vezes em solução de

Carnoy (3 metanol : 1 ácido acético glacial). Na primeira fixação, o material foi

deixado à temperatura ambiente por 20 minutos. Na última fixação, o material foi

ressuspenso em um pequeno volume de fixador para o preparo de lâminas,

pingando-se uma gota da suspensão em lâmina limpa e umedecida. Uma lâmina de

cada tubo Falcon foi observada em microscopia para verificação dos resultados, e

então o material foi estocado na geladeira para posterior análise cromossômica.

Para análise cromossômica, as lâminas de 2-10 dias de preparo foram

incubadas em uma solução de tripsina (Sigma-Aldrich®) 0,1% aquecida a 37°C em

tempos que variaram de 1 segundo a 1 minuto. Em seguida as lâminas foram

lavadas com soro fisiológico e coradas em solução de Giemsa (Merck) a 2% em

tampão fosfato (pH 6,8), por 10 minutos. O padrão cariotípico dos pacientes foi

determinado pela análise de uma média de 20 células metafásicas em microscopia

ótica. Um caso foi considerado anormal quando mais de três células apresentaram a

mesma anomalia cromossômica. A documentação dos cariótipos foi realizada no

computador por um programa analisador de imagem (Ikaros - MetaSystem),

utilizando-se para isso, uma câmera CCD acoplada ao microscópio Olympus BX51.

Os cariótipos foram identificados e classificados de acordo com os sistemas

internacionais para nomenclatura de citogenética humana de 2009 (SHAFFER;

SLOVAK; CAMPBELL, 2009).

3.5. Estudo por citogenética molecular

3.5.1 FISH e M-FISH

Para investigação de rearranjos moleculares, pela técnica FISH, foram

utilizadas sondas comerciais de sequência homóloga de DNA para locus específicos

(LSI) AML1/ETO dual color, dual fusion, CBFβ/MYH11 dual color, break-apart,

29

PML/RARα dual color, dual fusion, e dual color, break-apart para o gene MLL

(Vysis®/Abbott®) e, sondas whole chromosome painting (WCP), partial chromosome

painting (PCP), subteloméricas (subtel), centroméricas (CEP), e sondas

confeccionadas a partir de cromossomos bacterianos artificiais (BAC) específicas

para aberrações e/ou translocações complexas não recorrentes. Além disso, nos

casos que fora detectada a presença de cromossomos marcadores ou de rearranjos

crípticos, foram utilizados diferentes conjuntos de sondas para a técnica do M-FISH,

que consiste na utilização simultânea de pelo menos três diferentes ligantes ou

fluorocromos para a marcação específica de DNA. A técnica de FISH foi aplicada no

restante do material das culturas, mantidas em fixador, sob refrigeração. Depois de

preparadas, as lâminas foram mantidas por dois dias à temperatura ambiente, pré-

tratadas por imersão em 2X SSC, pH 7,0 a 37°C por 30 minutos e desidratadas em

série de etanol 75%, 85% e 100% por dois minutos em cada álcool. Para a

hibridização, 10μl desta mistura (7μl de tampão de hibridação; 2μl de água; 1μl de

sonda) foram colocadas sobre as lâminas e cobertas com lamínulas de vidro de

25x25mm, sendo mantidas aquecidas em placa térmica a 43°C por dois minutos. A

seguir, as lamínulas foram imediatamente vedadas com borracha selante e

incubadas em câmara úmida (50% formamida/2X SSC) a 37°C por 12-16 horas.

Após o período de incubação, as lâminas foram lavadas em três banhos de 50% de

formamida/2X SSC pH 7,0 por 10 minutos cada, seguido da imersão em 2X SSC, pH

7,0 por 10 minutos e por último em 2X SSC 0,1% NP-40 (Vysis®) ou IGEPAL

(Sigma®) por 5 minutos, a 45°C. Para a análise, foi utilizada a contra coloração com

DAPI II. A análise pelo FISH foi feita em microscópio de fluorescência Olympus

BX51 munido de lâmpada HBO 100W e filtros apropriados. A documentação foi

realizada através de uma câmera CCD e do analisador de imagem (Isis da

MetaSystem).

3.5.2 MCB

Para a investigação de rearranjos crípticos e a confirmação de cariótipos

anormais, a técnica de MCB foi aplicada a partir de sondas, que foram

confeccionadas pelo Dr. Thomas Liehr. Estas sondas são geradas pelo processo de

microdissecção de regiões específicas dos cromossomos, como descrito

previamente (LÜDECKE et al., 1989; SENGER et al., 1990). Cada uma das sondas

é baseada em um número de fragmentos cromossômicos que varia de 15 a 20, que

são retirados de cada cromossomo, intencionalmente, de forma imprecisa, para que

30

eles se sobrepusessem. Com isso, são geradas 169 sondas de regiões específicas

que cobrem todo o genoma humano (Fig., 3.1A-B) (LIEHR & CLAUSSEN, 2002;

LIEHR et al., 2002; WEISE et al., 2008).

O DNA isolado é então amplificado pela técnica DOP-PCR (TELENIUS et al.,

1992). A reação de PCR original é feita em um volume de 50μl da amostra inicial.

Desta amostra, um volume de 0.5μl é re-amplificado e um volume de 50μl é obtido

no final. Depois esse processo é repetido e, então, é feita a marcação das sondas

com 5 diferentes fluorocromos: SpectrumOrange, Rhodamine 110, TexasRed,

Cyanine 5 e Cyanine 5.5. Essa marcação também é feita pela técnica de DOP-PCR.

Com isso, de 2 a 10 bibliotecas de sondas são criadas para cada cromossomo.

Quando sobrepostas, essas sondas criam um padrão de pseudocores para cada um

dos 24 cromossomos humanos (Fig., 3.1C). A técnica de MCB é baseada na

mudança da taxa de intensidade de fluorescência ao longo dos cromossomos.

O processo de hibridização, a pós-lavagem e a detecção do sinal foram feitos

de acordo com os experimentos realizados para a técnica de FISH. Os resultados da

hibridização foram documentados em um microscópio de fluorescência da Zeiss

Axioplan equipado com o sistema de análise de imagem Ikaros e Isis de imagem

digital para FISH (MetaSystem), utilizando uma câmera XC77 CCD.

Figura 3.1 – Multicolor Chromosome Banding. A) Padrão de bandeamento cromossômico multicolorido utilizando as sondas de MCB para os 24 pares de cromossomos humanos; B) Processo de microdissecção cromossômica utilizado na preparação das sondas de MCB; C) Esquema ilustrativo do padrão de pseudocores criado pela sobreposição de fragmentos cromossômicos marcados pelos 5 fluorocromos identificados no rodapé da figura.

31

4. Resultados

4.1 Pacientes, período e local de estudo

Amostras de sangue periférico e/ou medula óssea de 98 pacientes pediátricos

com diagnóstico de LMA, foram encaminhadas para o laboratório de citogenética

(divisão de laboratórios do CEMO-INCA), no período que compreende de Maio de

2007 a Setembro de 2013. Dentre estas, 12 amostras de crianças (12%), foram

diagnosticadas citogenéticamente como cariótipos complexos ou cariótipos

inconclusivos. Tais cariótipos foram então selecionados para estudos moleculares. A

citogenética molecular, através da técnica de FISH, foi realizada no laboratório de

citogenética do INCA, enquanto que as análises por M-FISH e MCB foram feitas no

laboratório de citogenética molecular do instituto de genética humana da

universidade de Jena, na Alemanha, como parte de uma colaboração (CAPES –

PROBRAL/DAAD – projeto # 419/14).

Dentre os pacientes deste estudo, houve predominância do sexo masculino

sobre o feminino na proporção de 2:1. A mediana de idade foi de 6,5 anos. A figura

4.1 relaciona Subtipos FAB associados às diferentes faixas etárias encontradas no

estudo. A mediana da contagem de leucócitos foi de aproximadamente 30.000, e a

mediana da contagem de plaquetas foi de aproximadamente 95.000. A tabela 4.1,

abaixo, ilustra os dados clínicos dos pacientes referidos neste estudo.

Tabela 4.1 – Dados clínicos dos pacientes diagnosticados com LMA apresentando

cariótipos complexos – sexo, idade, leucócitos e plaquetas

Paciente Subtipo

morfológico Sexo Idade Leucócitos Plaquetas

Estado

clínico

1 M1 M 8 anos 4.600 90.000 Óbito

2 M4 M 5 anos 68.900 11.000 Em remissão

3 M5 F 13 anos 6.400 318.000 Óbito

4 M4/M5 M 10 meses 53.800 27.000 Óbito

5 M4/M5 M 6 anos 18.000 26.000 Recada da

doença

6 M4 F 1 a e 2 m 140.000 19.000 Óbito


8 M5 M 1 ano e 6m 6.900 208.000 Em remissão

9 M1/M2 F 9 anos 5.400 51.000 Óbito

10 M1/M2 F 13 anos 22.000 96.000 Óbito



M – sexo masculino, F – sexo feminino, a – anos, m – meses de idade, M1, M2, M3, M4, M5 – Subtipos morfológicos FAB da LMA

32

Figura 4.1 – Subtipos FAB associados às diferentes faixas etárias encontradas no presente estudo. M1, M2, M3, M4, M5 – Subtipos morfológicos FAB da LMA

4.2 Cromossomos e subtipos morfológicos encontrados no estudo

Todos os cromossomos autossomos do cariótipo humano foram envolvidos

nas anormalidades apresentadas neste estudo, exceto pelos cromossomos 4 e 14.

Quanto aos cromossomos sexuais, 3 casos apresentaram monossomia do

cromossomo Y e 1 caso apresentou monossomia do cromossomo X. O cromossomo

mais envolvido nas aberrações cromossômicas deste estudo foi o 21, presente em 5

/12 casos, seguido pelo cromossomo 8 presente em 4/12 casos (Fig., 4.2). Os

subtipos de LMA mais prevalentes, envolvidos nas anormalidades, foram o M2, M4 e

M5 associados a 4 casos cada um (Fig., 4.3).

Figura 4.2 – Comparação entre o número de cromossomos envolvidos nas anormalidades apresentadas neste estudo. del – deleção cromossômica, X e Y – cromossomos sexuais

33

Figura 4.3 – Comparação entre número de subtipos morfológicos presentes neste estudo. M1, M2,

M3, M4, M5 – Subtipos morfológicos FAB

4.3 Anormalidades envolvendo o cromossomo 8

4.3.1 Envolvimento dos cromossomos 1, 8 e 11

Através da análise citogenética convencional, por bandeamento G, suspeitou-

se de uma translocação complexa t(1;8;11)(q21;p21;q23) em 25 das 30 metáfases

analisadas, no caso 4 (Fig., 4.4A). Através da aplicação da técnica de FISH com a

utilização da sonda LSI dual color, break-apart para o gene MLL (Vysis®/Abbott®),

foi possível observar o sinal sobreposto verde e vermelho no cromossomo 11

normal, e no braço longo do cromossomo derivativo 11, os sinais estavam

separados com material cromossômico extra entre eles (Fig., 4.4B). A análise por

MCB revelou o cariótipo: 46,XY, der(1)t(1;8)(q21;p21), der(8)t(1;8)(q31;p21),

der(11)ins(11;1)(q23;q21q31) (Fig., 4.4C). Na recaída, o paciente apresentou o

cariótipo: 46,XY, t(11;19)(q23;p13) em 23 metáfases analisadas.

Figura 4.4 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 4. A) Cariograma. Os colchetes, em vermelho, demostram as regiões cromossômicas envolvidas no rearranjo. B) FISH, em cariótipo parcial, com a sonda dual color, break-apart para o gene MLL, demonstra um padrão diferente de sinais para o cromossomo 11 normal e, o derivativo do 11. C) MCB para os cromossomos 1, 8 e 11. der – derivativo, # –número, MCB – Multicolor Chromosome Banding

34

4.3.2 t(8;21) associada a outras anomalias cromossômicas

Pela técnica de banda G, a amostra do paciente 11 apresentou 3

anormalidades adicionais, além da recorrente t(8;21), caracterizando o cariótipo

complexo: 45,X,-Y,del(2)(q33),t(8;21)(q22;q22),del(9)(q22), em 13 metáfases das 20

analisadas (Fig., 4.5A). Neste caso, complementarmente, a aplicação da técnica de

FISH com a sonda LSI AML1/ETO dual color, dual fusion (Vysis®/Abbott®), foi

suficiente para confirmar a fusão RUNX1/RUNX1T1 (Fig., 4.5B).

Figura 4.5 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 11. A) Cariograma demonstrando a t(8;21), além de deleções nos cromossomos 2 e 9. B) FISH, com aplicação da sonda LSI AML1/ETO dual color, dual fusion, indicando a fusão RUNX1/RUNX1T1, como representado pela sobreposição dos sinais verde e vermelho.

4.3.3 Translocações three-way envolvendo o cromossomo 8

4.3.3.1 Envolvimento dos cromossomos 8, 21 e 22

No momento do diagnóstico, o caso 5 revelou o cariótipo complexo: 45,X,-

Y,del(8)(q22),add(22)(q22),add(22)(q22) em 22 metáfases analisadas (Fig., 4.6A),

apontando três cromossomos marcadores. A aplicação da técnica de FISH através

da sonda para centrômero (CEP) Y (Vysis®/Abbott®), confirmou a perda do

cromossomo Y (Fig., 4.6B). A técnica de M-FISH confirmou a identidade de cada

cromossomo anormal. (Fig., 4.6C). Contudo, o cariótipo final somente pôde ser

devidamente caracterizado através da técnica de MCB, aplicada aos cromossomos

1 e 22, e FISH complementar com a aplicação de um conjunto de sondas LSI e de

sondas WCP para os cromossomos 8, 21 e 22:

45,X,-Y,t(8;22;21)(q22;q13.3;q22.12),der(22)t(1;22)(q23;q13.3) (Fig., 4.6D-G). Na

recaída, o paciente apresentou o cariótipo: 45X,-Y, del(6)(q21),t(8;22;21)

(q22;q13;q22),der(22)t(1;22)(q23;q13) em 23 metáfases analisadas.

35

Figura 4.6 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 5. A) Cariograma. As setas, em cinza, demostram as regiões cromossômicas envolvidas no rearranjo, bem como a perda do cromossomo Y. B) FISH, em núcleos interfásicos confirmando a monossomia do Y. C) M-FISH. As setas em cinza indicam os rearranjos cromossômicos. D) MCB demonstrando a t(1;22)(q23;q13.3). E-G) FISH, com sondas WCP e sondas subtelloméricas, confirmando a origem e destino de cada cromossomo envolvido neste rearranjo. # – número, der – derivativo, t – translocação, subtel – sonda subtelomérica, wcp – sonda WCP, qter – região terminal do braço cromossômico longo, MCB – Multicolor Chromosome Banding


A análise por banda G da amostra da paciente 10, revelou o cariótipo 46,X,-

X,del(8q22),+der(13q3?) em 23 metáfases analisadas (Fig., 4.7A), caracterizando

um cariótipo complexo. A análise por FISH, com a sonda LSI AML1/ETO dual color,

dual fusion (Vysis®/Abbott®), confirmou a fusão RUNX1/RUNX1T1 no cromossomo

derivativo 8 e revelou um sinal do RUNX1T1 no cromossomo derivativo 13 (Fig.,

4.7B1). Complementarmente, com uma sonda subtelomérica para a região terminal

do cromossomo 13 (Kreatech®) foi possível observar o sinal da região 13qter no

cromossomo derivativo 21 (Fig., 4.7B2). Para caracterizar os pontos de quebra deste

36

rearranjo complexo, foram conduzidos estudos por MCB, além da aplicação de

sondas WCP, para os cromossomos 8 13 e 21, definindo o cariótipo final como:

46,X,-X,t(8;13;21)(q22;q33;q22) (Fig., 4.7C).

Figura 4.7 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 10. A) Cariótipo parcial. A seta em vermelho, indica perda de parte de material cromossômico no cromossomo 8, e a seta verde indica material cromossômico adicional no cromossomo 13. B1) FISH com a sonda AML1/ETO demonstrando o envolvimento dos cromossomos 8, 13 e 21 no rearranjo. B2) FISH utilizando uma sonda subtelomérica para o cromossomo 13, revela que parte deste cromossomo foi crípticamente translocada para o cromossomo 21. C) MCB e FISH com sondas WCP indicam a origem e o destino de cada material cromossômico, dos cromossomos envolvidos neste rearranjo. MCB – Multicolor Chromosome Banding, WCP – Whole Chromosome Painting


O estudo por citogenética convencional do paciente 12, mostrou o cariótipo

complexo 46,X-Y,del(8q22)+der(17q?24) em 22 metáfases analisadas (Fig., 4.8A). A

técnica de FISH com a aplicação da sonda LSI AML1/ETO dual color, dual fusion

(Vysis®/Abbott®) confirmou a fusão RUNX1/RUNX1T1 no cromossomo derivativo 8,

e revelou um sinal do gene RUNX1T1 no cromossomo derivativo 17 (Fig., 4.8B).

Para precisar os pontos de quebra, foi então utilizada a técnica de MCB e com o

auxílio de sondas de WCP específicas para os cromossomos 8, 17 e 21, o cariótipo

final foi caracterizado como: 46,X-Y,t(8;17;21)(q22;q21;q22) (Fig., 4.8C).

37

Figura 4.8 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 12. A) Cariograma. As setas em vermelho indicam perda de parte do material cromossômico no cromossomo 8, e material cromossômico adicional no cromossomo 17. B) FISH em cariótipo parcial, com a aplicação da sonda AML1/ETO, ilustra a fusão RUNX1/RUNX1T1 no cromossomo derivativo 8, e demonstra parte do gene RUNX1T1 translocada no cromossomo derivativo 17. C) FISH, com sondas WCP para os cromossomos 8, 17 e 21, revela a origem e o destino de cada material cromossômico envolvido neste rearranjo. der – derivativo, # – número, WCP – Whole Chromosome Painting


4.4.1 inv(16)

A análise por bandeamento G do paciente 2 apresentou o cariótipo:

46,XY,inv(16)(p13q22),+19,-22 em 18 das 22 metáfases analisadas (Fig., 4.9A),

caracterizando-o como cariótipo complexo. Através da técnica de MCB aplicada nos

cromossomos 16, 19 e 22, e utilizando complementarmente sondas WCP para os

cromossomos 19 e 22, além de uma centromérica e, uma sonda subtelomérica para

o cromossomo 22, o cariótipo pôde ser refinado, e definido como:

46,XY,inv(16)(p13q22),dic(22)(qter->p10::p10->qter) (Fig., 4.9B).

38

Figura 4.9 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 2. A) O bandeamento G mostrou o cariótipo 46,XY,inv(16)(p13q22),+19,-22. B) FISH com sondas WCP, CEP e Subtel, mostraram o cromossomo dicêntrico 22. WCP – Whole Chromosome Painting, CEP – Centromeric Probe, ST – Subtelomeric Probe, dic – dicêntrico, q – braço cromossômico longo

4.4.2 del(16)

A análise, por citogenética convencional, da amostra da paciente 6,

apresentou o cariótipo inconclusivo: 46,XX,del(16)(q2?) em 8 das 20 metáfases

analisadas (Fig., 4.10A). O experimento por FISH, utilizando a sonda LSI dual color,

break-apart para o gene CBFβ (Vysis®/Abbott®), foi revelada a perda de um dos

sinais, mostrando uma deleção em uma das cópias do gene CBFβ (Fig., 4.10B). A

técnica de MCB foi aplicada para ambos os cromossomos 16, demonstrando uma

deleção no braço longo de um dos cromossomos 16 e uma inversão em seu

homólogo. O cariótipo final foi definido como: 46,XX,inv(16)(p13;q22),del(16)(q22)

(Fig., 4.10B-C).

39

Figura 4.10 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 6. A) Cariograma. O colchete em vermelho indica um cromossomo 16 nitidamente menor. B) FISH com a sonda LSI dual color, break-apart para o gene CBFβ e, com sondas PCP para o cromossomo 16, ilustra a perda de parte de uma das cópias do gene CBFβ. C) MCB demonstrando a inv(16)(p13;q22). LSI – lócus específico, MCB – Multicolor Chromosome Banding, der – derivativo, p – braço cromossômico curto, q – braço cromossômico longo, inv - inversão

4.4.3 t(16;21)

A paciente 9 apresentou um cariótipo inconclusivo na análise por

bandeamento G:

47,XX,der(2)t(2;?)(q2?;?),t(3;13)(q13;p11),add(5)(q35),t(16;21)(p11;q22), em 14 das

20 metáfases analisadas (Fig., 4.11A). A análise por FISH através da aplicação da

sonda LSI AML1/ETO dual color, dual fusion (Vysis®/Abbott®) revelou que havia

material adicional no cromossomo 21 (Fig., 4.11B). Complementarmente, com a

utilização da sonda LSI dual color, break-apart para o gene CBFβ (Vysis®/Abbott®),

foi possível descartar o envolvimento do gene CBFβ no rearranjo (4.11C). Através

da abordagem por M-FISH, MCB e FISH complementar, utilizando sondas WCP

para os cromossomos 2, 5, 3, 13, 16 e 21, foi então possível caracterizar o cariótipo

final como:

46,XX,der(2)t(2;3)(q2?;?),t(3;13)(q13;p11),der(5)t(3;5)(?;q35),t(16;21)(p11;q22) (Fig.,

4.11D).

40

Figura 4.11 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 9. A) Resultado do bandeamento G, mostrando o cariótipo 47,XX, der(2)t(2;?)(q2?;?), t(3;13)(q13;p11), add(5)(q35), t(16;21)(p11;q22). B) FISH com a sonda AML1/ETO mostrando material adicional no cromossomo 21. C) FISH com a sonda CBFβ mostrando um padrão normal de sinais, revelando que o gene CBFβ não estava rearranjado. D) M-FISH, e seu respectivo contraste revelando cada anormalidade no cariótipo. t - translocação


4.5.1 Envolvimento dos cromossomos 9 e 11

O caso 1, por citogenética clássica, demonstrou em 11 das 20 metáfases

analisadas o cariótipo inconclusivo: 46,XY,del(9)(q31),t(?X;?11)(p22;q22) (Fig.,

4.12A). Os estudos citogenéticos moleculares realizados através da técnica de MCB,

para os cromossomos 9 e 11, possibilitaram o refinamento do cariótipo, sendo

portanto novamente caracterizado como: 46,XY,del(9)(q12q31),del(11)(q13orq14)

(Fig., 4.12B).

41

Figura 4.12 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 1. A) Cariótipo por bandeamento G. As setas demonstram a perda de parte do material dos cromossomos 9 e 11. B) MCB para os cromossomos 9 e 11, revelando os pontos de quebra nas anormalidades del(9)(q12q31) e del(11)(q13 or q14). del – deleção, q – braço cromossômico longo

4.5.2 Envolvimento do cromossomo 11 com rearranjo do gene MLL

O paciente 4 apresentou rearranjo do gene MLL, porém este já foi

propriamente descrito acima (sub item 4.3.1).

4.5.2.1 Rearranjo do gene MLL com envolvimento do cromossomo 10

Por bandeamento G, a amostra do paciente 8 revelou o cariótipo:

46,XY,del(10)(p12) (Fig., 4.13A) em 18 das 20 metáfases analisadas. A aplicação da

técnica de FISH, com a sonda LSI dual color, break-apart para o gene MLL

(Vysis®/Abbott®), demonstrou inserção de um material cromossômico desconhecido

na região do gene MLL (Fig., 4.13B). Em outro ensaio por FISH, desta vez em

metáfases, foi observada a inserção de um material da região 10p, na região 11q23

(Fig., 4.13C); foi possível observar a t(10;11)(p1?;q23) (Fig., 4.13D); e

adicionalmente, com uma abordagem feita pela técnica de MCB, foi demonstrada

uma inversão pericêntrica no cromossomo derivativo 10 (Fig., 4.13E). O cariótipo

42

final foi portanto caracterizado como: 46,XY,der(10)(11qter->11q23.3::10q11.2-

>10p12::10q11.2->10qter),der(11)(11pter->11q23.3::10p12->10p12::11q23.3-

>11q23.3::10p12->10pter).

Figura 4.13 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 8. A) Cariograma mostrando uma deleção no cromossomo 10 (seta). B) FISH, em núcleos interfásicos, com a aplicação da sonda MLL break-apart, mostrando uma pequena inserção entre os sinais (verde e vermelho) do gene MLL. C) FISH, em metáfases, com sondas WCP e PCP, mostrando a inserção de um material cromossômico da região 10p, na região 11q23. D) FISH, com sondas Subtel para os cromossomos 10 e 11 e, sonda WCP para o cromossomo 11, revelando a t(10;11)(p1?;q23). E) MCB mostrando uma inversão pericêntrica no cromossomo derivativo 10. # – número, der – derivativo, p – braço cromossômico curto, q – braço cromossômico longo, ter – região cromossômica terminal, subtel – sonda subtelomérica, PCP – Partial Chromosome Painting, WCP – Whole Chromosome Painting

4.6 Anormalidade variante da t(15;17)

O estudo por banda G, do paciente 7, possibilitou a caracterização do

cariótipo: 46,XY,-6,t(15;17)(q22;q21),+mar, em 21 das 23 metáfases analisadas

(Fig., 4.14A). Portanto, sendo considerado um cariótipo complexo e inconclusivo, foi

referido para os estudos por citogenética molecular. A análise por FISH confirmou a

fusão gênica PML/RARα (Fig., 4.14B). A aplicação das técnicas de MCB e FISH com

sondas confeccionadas a partir de BACs para o cromossomo 6, mostraram que o

43

cromossomo marcador era um cromossomo derivativo 6 e este apresentava duas

aberrações cromossômicas. O cariótipo final foi caracterizado como:

46,XY,t(15;17)(q22;q21),inv(6)(p24;q15) [10]/ 46,XY,t(15;17)(q22;q21),der(6)(6p21.3

>6q16.1)[4] (Figs., 4.14C-E).

Figura 4.14 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 7. A) Cariótipo parcial. A seta verde mostra um cromossomo 6 anormal, e as setas vermelhas indicam a t(15;17)(q22;q21). B) FISH confirmando a fusão PML/RARα. C) MCB mostrando uma inversão no cromossomo 6. D) MCB para o cromossomo 6 homólogo, mostrando uma deleção e uma inversão. E) FISH com BACs demonstrando uma inversão no cromossomo 6. # – número, der – derivativo, inv – inversão, del – deleção, p – braço cromossômico curto, q – braço cromossômico longo, MCB – Multicolor Chromosome Banding

4.7 Envolvimento dos cromossomos 5 e 7 associados a outras

anomalias cromossômicas

A paciente 3 apresentava o cariótipo: 44,XX,?der(4),-5,-7,-10,?dic(13),-15,+2

mars em 18 das 20 metáfases analisadas (Fig., 4.15A). Classificada como

apresentando um cariótipo complexo, foi então referida para estudos moleculares. A

44

técnica de FISH, com a sonda subtelomérica 7q, revelou uma deleção na região 7q

(Fig., 4.15B). Adicionalmente foram realizados estudos por M-FISH, e MCB para os

cromossomos 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 13, 17, 18, 19, 20 e 21. O cariótipo final foi então

caracterizado como:

44,XX,der(5)t(5;19)(q13.3;q12),t(6;18;17)(q24.3;q21;q23.2),der(7)t(7;13)(p11.2;q12),

der(10)(7qter->7q11.23::12q22->12q21.2::10p14->10q21::12q12->12qter),

der(12)(::p13->q12::),-15,del(19)(q12),der(20)t(20;21)(p11.2;q11.2),

+der(21)t(12;21)(q22;q22) (Fig., 4.15C-D).

Figura 4.15 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 3. A) No cariograma podemos notar a ausência de um dos cromossomos 5, 7, 10 e 15. As setas indicam material cromossômico adicional nos cromossomos 4, 5 e 13. B) FISH, com sondas CEP e Subtel para o cromossomo 7, mostra a perda do sinal correspondente à região qter. C) mMCB, revelando a identidade de cada cromossomo no cariótipo. D) MCB para o cromossomo 7, caracterizando o ponto de quebra envolvido na deleção. CEP – sonda centromérica, ST – sonda subtelomérica, del – deleção, q – braço cromossômico longo, mMCB e MCB – Multicolor Chromosome Banding

45

Tabela 4.2 – Pacientes diagnosticados com LMA apresentando cariótipos complexos – Bandeamento G, FISH e MCB

Paciente Subtipo

morfológico Citogenética (GTG) FISH MCB

1 M1 46, XY, del(9)(q31), t(?X;?11)(p22;q22) [11] / 46, XY [9] NF 46,XY,del(9)(q12q31),del(11)(q13orq14)[4]/46,XY,del(9)(q12q31)[2]/46,X

Y[7]

2 M4 46,XY,inv(16)(p13q22),+19,-22 [18] / 46, XY [4] NF 46,XY,inv(16)(p13q22),dic(22)(qter->p10::p10->qter)

3 M5 44,XX,?der(4),-5,-7,-10,?dic(13),-15,+2 mars [18] NF

44,XX,der(5)t(5;19)(q13.3;q12),t(6;18;17)(q24.3;q21;q23.2),der(7)t(7;13)(p11.2;q12),der(10)(7qter->7q11.23::12q22->12q21.2::10p14-

>10q21::12q12->12qter),der(12)(::p13->q12::), -15,del(19)(q12),der(20)t(20;21)(p11.2;q11.2),+der(21)t(12;21)(q22;q22)

4 M4/M5 46, XY, t(1;11;8)(q21;p21;q23) [25] MLL rearranjado 46,XY,der(1)t(1;8)(q21;p21),der(8)t(1;8)(q31;p21),der(11)ins(11;1)(q23;q

21q31)

5 M4/M5 45,X,-Y,del(8)(q22),add(22)(q22),add(22)(q22) [22] RUNX1/RUNX1

T1 45,X,-Y,t(8;22;21)(q21.3;q13.3;q22.12),der(22)t(1;22)(q23;q13.3)

6 M4 46,XX,del(16)(q2?) [8]/ 46, XX [14] NF 46,XX,inv(16)(p13;q22),del(16)(q22) [14]

7 M3 46,XY,-6,t(15;17)(q22;q21),+mar [21] PML/ RARα 46,XY,t(15;17)(q22;q21),inv(6)(p24;q15) [10]/

46,XY,t(15;17)(q22;q21),der(6)(6p21.3 >6q16.1)[4]

8 M5 46, XY, del(10)(p12) [18]/ 46, XY [2] MLL rearranjado 46,XY,der(10)(11qter->11q23.3::10q11.2->10p12::10q11.2->10qter),der(11)(11pter->11q23.3::10p12->10p12::11q23.3-

>11q23.3::10p12->10pter)

9 M1/M2 47,XX,der(2)t(2;?)(q2?;?),t(3;13)(q13;p11),add(5)(q35),t(16;21)(p11;q22) [14]

RUNX1/RUNX1T1/ CBFβ

46,XX,der(2) t(2;3)(q2?;?),t(3;13)(q13;p11),der(5) t(3;5)(?;q35),t(16;21)(p11;q22)

10 M1/M2 46,X, -X, del(8q22), + der(13q3?) [23] RUNX1/RUNX1

T1 46,X, -X, t(8;13;21)(q22;q33;q22)

11 M2 45, X, -Y, del(2)(q33), t(8;21)(q22;q22), del(9)(q22) [13]/ 45, X, -Y, t(8;21)(q22;q22), del(9)(q22) [4] / 46, XY [3]

RUNX1/RUNX1T1

NF

12 M2 46,X-Y,del(8q22),+der(17q?24) [22] RUNX1/RUNX1

T1 46,X-Y,t(8;17;21)(q22;q21;q22)

M1, M2, M3, M4, M5 – Subtipos morfológicos FAB da LMA, NF – não feito, c - constitucional, del - deleção, der - cromossomo derivativo, dic - dicêntrico, ter – região cromossômica terminal, dup - duplicação, inv – inversão cromossômica, mar - cromossomo marcador, p - braço curto do cromossomo, q - braço longo do cromossomo, subtel - região subtelomérica, t - translocação, (-) - sinal negativo: perda de material genético, (+) - sinal positivo: ganho de material genético, ( ) - parênteses: delimita os cromossomos alterados e os pontos de quebra, [Nº] - nº entre [ ]: representa o número de células com determinada alteração, (,) - vírgula: separa nº de cromossomos, cromossomos sexuais e anormalidades cromossômicas, (;) ponto e vírgula: separa cromossomos e as regiões cromossômicas quando os rearranjos estruturais envolvem mais de um cromossomo, (/) - barra inclinada: separa os clones de um cariótipo, (?) - interrogação: identificação questionável de cromossomo ou estrutura cromossômica, X e Y - Cromossomos sexuais, (:) - dois pontos: quebra, (::) - dois pontos duplos: Quebra e união, -> - de – à

46

5. Discussão

A análise citogenética da leucemia mielóide aguda é considerada uma das

mais poderosas ferramentas de estudo, propiciando conhecimentos notáveis quanto

à heterogeneidade de uma população celular e, consequentemente, levando a uma

melhor compreensão das causas dos rearranjos cromossômicos e dos mecanismos

subjacentes à transformação leucêmica. Estas informações vêm sendo importantes

para o diagnóstico e prognóstico dos pacientes pediátricos acometidos por esta

doença (RADHI; MESHINCHI; GAMIS, 2010; KASPERS & REINHARDT, 2011).

Como citado anteriormente, uma (ou mais) anomalia(s) cromossômica(s)

responsável(is) por um prognóstico adverso, pode(m) estar envolvida(s) em

rearranjos complexos e/ou crípticos. Neste contexto, a resolução cromossômica

proporcionada pelo bandeamento G não permite a detecção de determinadas

anomalias, e a origem de cromossomos marcadores (MRÓZEK, 2008). Portanto,

para superar estas limitações, foram desenvolvidas técnicas de citogenética

molecular, tais como FISH, M-FISH e MCB, de modo a contribuir para uma melhor

definição, do perfil cariotípico, da heterogeneidade molecular, bem como revelar

novas fusões gênicas, nas neoplasias hematológicas malignas.

No presente estudo, 12 pacientes pediátricos, diagnosticados com LMA,

apresentaram cariótipo complexo e/ou inconclusivo em estudos citogenéticos por

bandeamento G. Para isto, a combinação das três técnicas, de citogenética

molecular (FISH, M-FISH e MCB), foi fundamental no refinamento da caracterização

dos cariótipos complexos.

Grimwade e colaboradores (2001), assim como Byrd e colaboradores (2002),

utilizando uma amostra de 1.065 e 1.213 pacientes, respectivamente, detectaram a

frequência de 12% de cariótipos complexos na LMA, e observaram um pior

prognóstico nestes pacientes. Vale salientar que estes estudos investigaram os

cariótipos dos pacientes apenas por citogenética convencional. Em nossa amostra

total de casos de LMA pediátrica, com um número menor (98 casos), foi observado o

mesmo percentual (12%). Portanto, é possível que com a investigação dos

cariótipos através da refinação feita pela combinação das técnicas (convencionais e

moleculares), a frequência dos cariótipos complexos na LMA poderá mudar

futuramente, contribuindo para a investigação de seu valor prognóstico.

O cromossomo 21 foi um dos mais envolvidos nas anormalidades

apresentadas neste estudo, presente em 5/12 casos. A trissomia do cromossomo

21, presente em cerca de 5% dos cariótipos complexos, é a segunda mais comum

47

depois da trissomia do cromossomo 8 (RAIMONDI, 1993), estando ambas

relacionadas a um prognóstico intermediário/desfavorável na LMA, de acordo com a

literatura (MANOLA, 2009; MARCHESI et al., 2011). No entanto, em nosso estudo,

estes cromossomos não estiveram envolvidos como alterações numéricas.

A del(9q) é uma anormalidade cromossômica recorrente na LMA e, que de

acordo com a literatura, tem apresentado um desfecho clínico ruim. Além disto,

embora a t(8;21)(q22;q22) esteja relacionada a um bom prognóstico, a presença da

del(9q) associada a esta translocação, é reportada na literatura como um evento não

aleatório, associada a um prognóstico desfavorável (MANOLA, 2009; BRAOUDAKI

& TZORTZATOU-STATHOPOULOU, 2012). Em nosso estudo, foram detectados em

2/12 casos, a deleção no cromossomo 9, em pontos de quebra diferentes. O

cariótipo do paciente 1 apresentou a del(9q) como a anormalidade primária,

enquanto que no caso 11, esta anomalia estava associada à translocação recorrente

t(8;21). Nestes casos, o MCB foi importante para a definição dos respectivos pontos

de quebra. Porém, estudos posteriores, com um maior número de pacientes, serão

necessários para melhor avaliar o impacto prognóstico de cada um destes pontos de

quebra, na doença.

Rearranjos do gene MLL (11q23) são comuns na LMA da infância, se

apresentando em 40-50% dos casos (MARCHESI et al., 2011). Neste estudo, 2/12

pacientes apresentaram esta anormalidade. A análise citogenética convencional, da

amostra do paciente 4, mostrou aparentemente uma translocação complexa,

envolvendo os cromossomos 1, 8 e 11. A técnica de FISH foi fundamental,

permitindo observar material cromossômico adicional no cromossomo derivativo 11,

e portanto elucidando a diferença de uma translocação para uma inserção

cromossômica. Com uma análise ainda mais detalhada, através da técnica de MCB,

foi possível refinar ainda mais o cariótipo em questão demonstrando que ao invés de

uma translocação envolvendo os cromossomos 1, 8 e 11 concomitantemente,

haviam, na verdade, três anormalidades cromossômicas crípticas distintas, sendo

duas translocações envolvendo pontos de quebra distintos entre os cromossomos 1

e 8, e uma translocação do tipo inserção entre os cromossomos 1 e a região q23 do

cromossomo 11. A t(1;11)(q21;q23), que leva à fusão gênica MLLT11/MLL, é uma

importante translocação recorrente na LMA, porém, informações sobre seu impacto

prognóstico ainda são controversas (BALGOBIND et al., 2009). Nosso grupo foi o

primeiro a descrever esta translocação, do tipo inserção entre os cromossomos 1 e

11, na literatura (DE FIGUEIREDO et al., 2010). Em nosso presente estudo,

48

atualizamos o prognóstico do paciente pela citogenética molecular. Este recaiu, da

doença, 2 anos após atingir remissão, apresentando uma nova anormalidade

citogenética. Na recaída, foi possível detectar a t(11;19)(q23;p13). Esta é a

translocação mais comum na LMA secundária, e está relacionada a um prognóstico

desfavorável, envolvendo a região 11q23 do gene MLL. Esta anormalidade também

vem sendo descrita na literatura como uma leucemia relacionada ao tratamento

(HURET, 1998). Após a recaída, o paciente foi a óbito.

Outro caso interessante foi o 8, no qual o bandeamento G apontava apenas

uma deleção no braço longo do cromossomo 10. Este trabalho demonstrou que a

combinação da análise tanto de metáfases como núcleos interfásicos deve ser

considerada para o diagnóstico citogenético final do paciente. Com o emprego do

FISH, foi possível observar uma inserção bastante críptica na região 11q23, vista

somente pela análise em núcleos interfásicos. Adicionalmente, pelo MCB, foi

possível detalhar ainda mais o cariótipo, permitindo a observação de uma inversão

pericêntrica no cromossomo derivativo 10. Estes achados foram publicados na

literatura por nosso grupo (DE FIGUEIREDO et al., 2012). A t(10;11)(p12;q23),

resulta na fusão gênica MLL/MLLT10. Esta fusão é rara na LMA da infância, e é

descrita na literatura como um indicador de mau prognóstico (BALGOBIND et al.,

2009). Portanto, de um ponto de vista clínico, a combinação das técnicas de FISH e

MCB, detectando uma inserção extremamente críptica, foi crucial para revelar

importantes informações prognósticas.

Em relação ao cromossomo 16, foi possível caracterizar o seu envolvimento e

comportamento em três casos. O paciente 2 apresentou duas anormalidades

adicionais à uma inversão do cromossomo 16, observadas através da análise por

bandeamento G. A inv(16) é descrita na literatura como uma anormalidade

citogenética recorrente, presente em 6-12% dos casos pediátricos, conferindo um

bom prognóstico (MANOLA, 2009). A aplicação da técnica de MCB foi importante na

refinação do cariótipo, confirmando a inversão do cromossomo 16, e mostrando que

a anormalidade adicional era, na verdade um cromossomo 22 dicêntrico. Segundo

dados da literatura, o cromossomo 22 tem sido frequentemente envolvido como uma

anormalidade secundária à inv(16), sem implicações prognósticas (MANOLA, 2009).

O paciente 6 demonstrou um cariótipo inconclusivo, com a presença de uma

del(16) por bandeamento G. A combinação das técnicas de FISH e MCB elucidou

que havia uma inversão em um dos cromossomos 16, além da deleção da região

q22 em seu homólogo, onde está localizado o gene CBFβ. Apesar da inv(16) estar

49

relacionada a um prognóstico favorável, sua associação à del(16q), ainda não foi

bem estabelecida na literatura, devido a sua baixa incidência. Além disso, os casos

que apresentam inv(16) e t(16;16) são de difícil detecção pela citogenética clássica,

podendo ser confundidos com a del(16q) (VARDIMAN; HARRIS; BRUNNING, 2002),

ou ainda com alterações mascaradas em cariótipos complexos (SILVA et al., 2008),

daí a necessidade da associação das técnicas de citogenética molecular na

caracterização da fusão CBFβ/MYH11.

O caso 9 apresentou em seu cariótipo, material adicional no cromossomo 5,

um cromossomo derivativo 2, uma t(3;13), um cromossomo marcador, além da rara

translocação t(16;21)(p11;q22). Apesar de seu real impacto prognóstico ainda não

ter sido determinado, devido a sua raridade, a literatura têm demonstrado que

pacientes pediátricos com a t(16;21)(p11;q22) apresentam um prognóstico

desfavorável (MANOLA, 2009). Mais uma vez, a citogenética molecular foi

fundamental não somente para a refinação do cariótipo, mas também para a

estratificação de risco do paciente. A técnica de FISH revelou que havia material

adicional no cromossomo 21 e descartou o envolvimento do gene CBFβ no

rearranjo. Porém, as anormalidades cromossômicas envolvidas neste rearranjo

críptico e citogeneticamente desbalanceado foram reveladas somente através da

abordagem por M-FISH e MCB.

O paciente 3 apresentou uma citogenética convencional bastante complexa,

envolvendo os cromossomos 5, 7, 10, 13 e 15, além de dois cromossomos

marcadores. No entanto, a aplicação da técnica de MCB, revelou um rearranjo

citogeneticamente balanceado, altamente complexo, e envolvendo adicionalmente

os cromossomos 6, 12, 16, 17, 18, 19, 20 e 21. Portanto, a técnica de MCB foi

importante para elucidar e detectar a participação de cromossomos adicionais neste

cariótipo. Neste contexto, vale ressaltar que a literatura tem demonstrado que

quanto maior o número de anormalidades envolvidas em um cariótipo complexo, pior

pode ser a evolução clínica do paciente (OROZCO & APPELBAUM, 2012). Contudo,

se faz necessário um estudo com um maior número de pacientes que apresentam

este tipo de cariótipo utilizando técnicas de citogenética molecular.

Outro achado importante, dentre nossos resultados, foi que o mesmo

cromossomo esteve envolvido em duas anormalidades distintas ao mesmo tempo.

Esta descoberta foi detectada no caso 7. A refinação da caracterização, feita pela

combinação das técnicas de MCB e FISH com a utilização de BACs, revelou duas

anomalias citogenéticas crípticas, em um mesmo cromossomo. Embora as

50

anomalias envolvendo o cromossomo 6 venham sendo associadas a uma evolução

clínica desfavorável, ainda não foi determinado seu impacto prognóstico na

literatura, o que reforça a importância de uma detalhada refinação da caracterização

citogenética nestes casos. Os achados deste caso, fazem parte de um manuscrito

publicado na literatura (MATOS et al., 2013) (Anexo I).

A t(8;21)(q22;q22) está entre as anormalidades recorrentes mais frequentes

da LMA da infância, acometendo cerca de 7-16% dos pacientes nesta faixa etária.

Esta translocação, justapõe os oncogenes RUNX1 e RUNX1T1, resultando na fusão

gênica RUNX1/RUNX1T1, que é relacionada a um bom prognóstico (MANOLA,

2009). Em raras ocasiões, ocorre a presença de um cromossomo a mais nesta

translocação, podendo conferir um prognóstico adverso ao paciente, de modo que o

valor prognóstico da fusão RUNX1/RUNX1T1 vem sendo bastante discutido na

literatura.

Em nosso estudo, a t(8;21) foi encontrada em 4/12 casos (pacientes 5, 10, 11

e 12), dentre os quais, três (pacientes 5, 10 e 12) apresentaram o envolvimento de

um terceiro cromossomo, caracterizando translocações do tipo three-way. Este

estudo pôde detectar e descrever, pela primeira vez na literatura, duas variantes

cromossômicas novas, descritas a seguir.

Através da citogenética clássica, o paciente 10 apresentou monossomia de X,

uma deleção no cromossomo 8 e um cromossomo derivativo 13. A análise por FISH

provou sua eficiência demonstrando, mais uma vez, uma variante molecular da

fusão gênica RUNX1/RUNX1T1. Uma porção do cromossomo 21 estava translocada

no 8, porém a porção do 8 que deveria estar translocada no 21, foi para o

cromossomo 13. Com uma abordagem mais detalhada, feita pelas técnicas de FISH

e MCB para os cromossomos 8, 13 e 21, pôde-se observar que havia parte do

material do cromossomo 13 crípticamente translocado no cromossomo 21. Os

achados clínicos, citogenéticos e moleculares fazem parte de um manuscrito, a ser

submetido (Anexo II). Portanto, a combinação das técnicas de citogenética

molecular (FISH, M-FISH e MCB), utilizadas na caracterização deste tipo de

variante, podem potencialmente revelar alterações genéticas, que podem colaborar

com a caracterização de fusões gênicas novas na leucemogênese, de modo a

determinar suas implicações prognósticas. Deste modo, estas técnicas devem ser

referidas como ferramentas complementares para o monitoramento de pacientes

com LMA.

51

Pela análise por bandeamento G, o paciente 5 mostrou monossomia do

cromossomo Y e perda de material dos cromossomos 8 e 22. A técnica de M-FISH

se destacou neste caso, confirmando a identidade de cada cromossomo anormal,

bem como revelando rearranjos entre os cromossomos 1, 8, 21 e 22. Com a

aplicação das técnicas de MCB e FISH complementar, foi possível revelar uma

translocação desbalanceada entre os cromossomos 1 e 22 e demonstrar o

envolvimento do cromossomo 22, como o terceiro cromossomo na translocação

three-way, t(8;22;21), pela primeira vez. Este caso é mais um exemplo no qual a

combinação das três técnicas foi indispensável, permitindo assim a caracterização

desta nova variante three-way críptica. Estes achados, fazem parte de um

manuscrito publicado por nosso grupo (DE FIGUEIREDO et al., 2011). Neste

presente estudo, atualizamos o prognóstico do paciente que recaiu da doença, 3

anos e 9 meses após a remissão, incluindo terapia com TMO. Na recaída, o

paciente apresentou, adicionalmente à t(8;21;22), uma deleção na região 6(q21).

Anormalidades envolvendo o cromossomo 6 são referidas na literatura como mau

prognóstico, no entanto, não se sabe se esta anormalidade foi adquirida devido à

quimioterapia ou se foi proveniente de um clone que não pôde ser detectado no

primeiro diagnóstico.

O paciente 12 demonstrou pela banda G, monossomia do cromossomo Y,

uma deleção no cromossomo 8 e um cromossomo derivativo 17. A análise por FISH

revelou que um material do cromossomo 21 estava translocado no 8, porém o

material do 8 que deveria estar translocado no 21, foi observado no cromossomo 17.

Portanto, foram aplicadas as técnicas de MCB e FISH complementar com sondas

WCP para os cromossomos 8, 17 e 21. Assim, foi possível observar que havia uma

porção do cromossomo 17 translocada crípticamente no cromossomo derivativo 21,

o que foi fundamental na caracterização deste caso. Esta translocação é a mais

frequente entre as t(8;21) variantes three-way (GALLEGO et al., 1994;

UDAYAKUMAR et al., 2008), entretanto, nosso trabalho pôde definir, através das

técnicas de citogenética molecular, os pontos de quebra precisos nesta

anormalidade, o que será de grande importância para futuros estudos de genes

putativos.

Com relação ao mecanismo deste tipo de translocação, Downing e

colaboradores (1993) e Tanaka e colaboradores (2012), descreveram que existem

pelo menos duas etapas para a formação da variante complexa t(8;21). Uma porção

do braço longo do cromossomo 21(q22) transloca para o braço longo do

52

cromossomo 8, enquanto que a porção final do cromossomo 8 transloca para um

terceiro cromossomo. O material cromossômico restante do terceiro cromossomo

então transloca para o cromossomo 21. Em nosso estudo, as t(8;21) variantes three-

way demonstraram o mesmo comportamento nos três casos apresentados, assim

como em outros casos reportados na literatura (UDAYAKUMAR et al., 2008). Porém

vale salientar que, até aonde sabemos, os demais casos com translocação three-

way, relatados na literatura, apresentavam um cariótipo sugestivo com material

adicional evidente no cromossomo 21. Diferentemente, os casos reportados no

presente estudo foram crípticos, reafirmando a importância de um diagnóstico

acurado da fusão RUNX1/RUNX1T1.

Em suma, este trabalho mostrou a eficácia da combinação de técnicas

citogenéticas moleculares no refinamento de cariótipos complexos, além de

contribuir com novos achados, como, anomalias crípticas que apresentaram impacto

prognóstico para a leucemia mielóide aguda da infância.

53

6. Conclusão

O percentual de casos que apresentam cariótipos complexos encontrado

em nossa amostra total de LMA (98 casos) foi de 12%, o mesmo

demonstrado em trabalhos publicados na literatura que utilizaram um

número muito maior de pacientes.

Com o emprego da técnica de MCB e FISH utilizando BACs, foi possível

descrever, pela primeira vez na literatura, que um único cromossomo pode

participar de duas anormalidades cromossômicas diferentes, como uma

anomalia secundária na Leucemia Promielocítica Aguda.

Novas variantes das translocações recorrentes, tiveram importância no

diagnóstico clínico e no emprego de protocolos terapêuticos dos pacientes

deste estudo.

A combinação das técnicas de citogenética molecular, podem

potencialmente revelar alterações genéticas, que podem colaborar com a

caracterização de fusões gênicas novas na leucemogênese, de modo a

determinar suas implicações prognósticas.

A combinação das quatro técnicas (Bandeamento G, FISH, M-FISH e

MCB) demonstrou eficácia na caracterização de cariótipos inconclusivos,

cariótipos complexos, bem como suas anormalidades crípticas.

A citogenética molecular foi importante no monitoramento de

translocações recorrentes da LMA, pois permitiu identificar possíveis

variações moleculares das fusões gênicas resultantes destas

translocações, as quais podem alterar o prognóstico já conhecido.

54

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66

8. Anexos

8.1 Anexo I

70

8.2 Anexo II

Complex karyotype masked a novel variant three-way t(8;13;21)(q22;q33;q22), in

childhood acute myeloid leukemia

Capela de Matos RRac, De Figueiredo AFac, Liehr Td, Othman MAKd, Binato Rbc, Abdelhay

Ebc, Ribeiro RCe, Silva MLMac

aBone Marrow Unit, Cytogenetics Department, bStem cell Department, and cPost-Graduation

Program in Oncology, National Cancer Institute, Rio de Janeiro, Brazil. dInstitute of Human Genetics, Jena University Hospital, Jena, Germany;

eDepartment of Oncology and International Outreach Program, St. Jude Children’s Research

Hospital, Memphis, Tenn. , USA

Abstract

The translocation t(8;21)(q22;q22) is a frequent non-random cytogenetic anomaly in Acute

Myeloid Leukemia, and is the most common translocation in pediatric AML patients (10-

20%). On the other hand, complex t(8;21) variants that involves one or more chromosomes

occurs in about 0.05-1.1% of childhood AML patients. Although t(8;21) is associated with

good prognosis in general, the clinical relevance and implications of its variants are yet to be

determined, underscoring the relevance of further studies regarding such abnormalities in

AML. The present work presents the case of a child with AML and a novel complex variant

t(8;21) harboring a novel three-way cryptic variant t(8;13;21), studied by molecular

approaches. The GTG-banding showed a complex rearrangement. FISH analysis revealed a

three-way translocation. Multicolor chromosome banding technique clarified the breakpoints

of this complex rearrangement, defining the final karyotype as: 46,X, -X,

t(8;13;21)(q22;q33;q22). Through RT-PCR and sequencing approaches, we were able to

determine that RUNX1 was fused to RUNX1T1 sequence. Thus, in summary, the combination

of molecular techniques (FISH, MCB, RT-PCR and Sequencing), can potentially reveal

genetic changes that might collaborate for the characterization of new gene fusions in

leukemogenesis.

71

Introduction

The history of t(8;21) in patients with Acute Myeloid Leukemia (AML) FAB M2

subtype is dated from 1973, when Rowley JD first described this reciprocal translocation. The

translocation t(8;21)(q22;q22) is a frequent non-random cytogenetic anomaly in AML [1], and

is the most common translocation in pediatric AML patients (10-20%) [2]. Since then, a

variety of additional cases, 3% to 4% of AML [3, 4], in which chromosomes 8 and 21 were

involved in complex rearrangements, have been described, with only a few cases reported in

children [5, 1, 6].

The complex t(8;21) variants that involves one or more chromosomes occurs in about

0.05-1.1% of childhood AML patients [7, 3].

At molecular genetic level, this neoplasm is defined by the involvement of the AML1

(RUNX1) gene on chromosome 21q22 and ETO (RUNX1T1) gene, on chromosome 8q22,

resulting in the AML1/ETO (RUNX1/RUNX1T1) fusion gene product [8]. It is believed that

the fusion protein disrupts the Core Binding Factor (CBF) transcription complex leading to

abnormalities of cell differentiation, proliferation and apoptosis and is a driver of myeloid

leukemogenesis [8].

Although t(8;21) is associated with good prognosis in general, the clinical relevance

and implications of its variants are yet to be determined. Because of its rarity, there is limited

information on the prognostic impact of this translocation, although the few cases reported

suggested that complex karyotypes involving this translocation is associated with unfavorable

prognosis [9, 1].

To contribute to the registry of this rare translocation, we report the clinical and

laboratory features of a child with AML and a complex variant t(8;21) harboring a novel

three-way cryptic variant t(8;13;21), revealed by detailed molecular studies.

Patient, Material and Methods

From May 2007 to September 2013 we received samples from 98 children (0-18 years

old) with AML. Sixteen (16.32%) of these patients had AML-M2, and 12 (12.24%) presented

with the characteristic t(8;21)(q22;q22). Among all of our childhood AML cases, 3 (3.1%)

showed a variant t(8;21) in a masked karyotype.

72

Conventional Cytogenetics

Cytogenetic analysis was performed at presentation on bone marrow cells cultured for 24

hours, without mitogenic stimulation, according to standard protocols. The karyotype was

characterized in accordance with the International System for Human Cytogenetic

Nomenclature (ISCN) [10].

Molecular Cytogenetics

Fluorescence in situ hybridization (FISH) experiments were performed using

commercially available probes LSI AML1/ETO, subtelomeric probe for 13qter and whole

chromosome painting (wcp) probes for chromosomes 8, 13 and 21, according to the

manufacturer’s instructions (Abbott Molecular, Inc., Kreatech biotechnology B.V.,

Wiesbaden-Delkenheim, Germany). Multicolor chromosome banding (MCB) was done for

chromosomes 8 (9 pcp) and 13 (6 pcp). Ten metaphases were evaluated each [11, 12].

RT-PCR / Sequencing

RT-PCR analysis was performed with a combination of 5´RUNX1 and 3´RUNX1T1

primers. All RT-PCR analysis were performed with one microgram of mRNA, treated with

DNAse Amplification Grade I (Invitrogen) and reverse transcribed with Super-script II

Reverse transcriptase® (Invitrogen). Each reaction was carried out with Taq DNA Polymerase

(Invitrogen). The reactions were performed using the following program: 94oC for 2 min and

40 cycles at 94oC for 30s, 58oC for 1min and 72oC for 1 min. β-Actin was used as control and

Kasumi-1 cells was used as a positive control. The following primers were used:

RUNX1/RUNX1T1 - Fw - 5' ATGACCTCAGGTTTGTCGGTCG 3', / Rev- 5'

TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCT 3'; β-Actin - Fw - 5´ ACCTGAGAACTCCACTACCCT

3´ /Rev, 5´GGTCCCACCCATGTTCCAG 3´. PCR products were subjected to direct

sequencing, using the BigDye® Terminator kit (Applied BiosystemsTM) and the 3130xl

Genetic Analyzer (Applied BiosystemsTM).

The Ethical Committee of The National Cancer Institute (INCA), Rio de Janeiro, RJ,

Brazil, approved this study (#088/07).

73

Case Report

A 13-year-old Caucasian girl that was admitted to Itapetinga's hospital with a history

of 5 months anemia, persistent cold associated with fever, otalgia and dysacousia. At

admission, her white blood cell count (WBC) was 22 x 109/l, platelet count was 96 x 109/l and

hemoglobin 6,2 g/dl X-ray examination of the chest was consistent with pneumonia. Physical

examination revealed lymphadenopathy involving the cervical and inguinal regions,

hepatosplenomegaly (4cm palpable liver and 7cm palpable spleen), skin pallor, pale mucosa

and anicteric state. Morphological examination of her bone marrow showed a hypercellular

content with 64% myeloid blast cells classified as AML-M2 by the FAB classification. Flow

cytometry revealed that the blasts were positive for CD45, CD34, CD117, MPO, CD33,

CD13, HLA-DR, CD123, CD15, CD19, thus compatible with the diagnosis of AML. The

patient was stratified into standard risk and treated on AML-BFM-2004 protocol. She

achieved remission, after three courses of chemotherapy. After receiving the intensification

block, she evolved with febrile neutropenia and sepsis. The patient died of cardiac and

respiratory failures.

Results

The GTG-banding analysis defined the karyotype as 46,X, -X, del (8q22), + der

(13q3?) in 23 metaphases analyzed (Fig.A), thus characterizing a complex rearrangement.

FISH analysis confirmed a cryptic fusion RUNX1/RUNX1T1 on derivative chromosome 8

with a RUNXIT1 signal on derivative chromosome 13 (Fig.B1). Complementary FISH

analysis using a subtelomeric probe for the terminal region of chromosome 13 showed a

13qter signal on chromosome 21 (Fig.B2). In order to clarify the breakpoints of this complex

rearrangement, we conducted MCB studies, defining the final karyotype as: 46,X, -X,

t(8;13;21)(q22;q33;q22) (Fig.C). RT-PCR for RUNX1/RUNX1T1 fusion revealed the PCR

product with 260bp (Fig. D). By sequencing the PCR product, it was possible to determine

that RUNX1 was fused to RUNX1T1 sequence (Fig.E).

Discussion

Current treatment of AML with citarabine (Ara-C) and anthracycline, harboring

children and adults, have been showing a good effectiveness with a 5-year overall survival

rate of 69%; However these patients present a relevant risk of relapse, reaching 29% [13].

74

This fact suggests that further biological factors may conceal important prognostic

information. Besides, the literature remains controversial regarding the relevance of variant

t(8;21) to AML outcome, underscoring the importance of detailed cytogenetic characterization

[6].

Recently, studies have demonstrated that the chromosomes more frequently involved

in this variant, as a third chromosome, were 17 (13 cases) 1 (8 cases), 15 (8 cases), 11 (3

cases), 14 (3 cases) and 13 with three cases, including the one reported in this work [5, 1].

The variant t(8;13;21) is exceedingly rare, with only two similar cases previously reported. In

these cases, presented by Gallego et al., 1994 and Achandira et al., 2008, the variant

t(8;13;21) presents itself in a suggestive karyotype, due to evident additional material on

derivative chromosome 21.

In the present work we characterize a rare masked karyotype, harboring a novel three-

way rearrangement t(8;13;21)(q22;q33;q22). In our patient, FISH analyses with the specific

probe LSI AML1/ETO demonstrated the fusion on 8q22. RT-PCR with specific primers

confirmed the presence of RUNX1/RUNX1T1 transcript; furthermore, MCB assay for

chromosomes 8 and 13 accurate the breakpoint at 13q33. In addition, in order to refine the

characterization, we conducted the sequencing of the transcript.

As described by Lindgreen and coworkers in 1977, Downing and coworkers in 1993

and further detailed later by Tanaka and coworkers, 2012, there is at least two steps for the

formation mechanism of the complex t(8;21), following formation of standard t(8;21) and

RUNX1/RUNX1T1 fusion gene [14]. The distal long arm of chromosome 21q22 translocates

to the long arm of chromosome 8, whereas the end of chromosome 8 translocates to a third

chromosome. The remainder of the third chromosome translocates to chromosome 21. This

aberration displayed exactly the same behavior in our patients as well as in the patients

described by Gallego et al., and Achandira et al. In this context, our work reached beyond,

better characterizing the variant t(8;13;21) through molecular studies comprising FISH, MCB,

RT-PCR and Sequencing. The product of the PCR was sequenced, allowing to exactly

ascertain the fusion point. By the application of FISH technique using a subtelomeric probe

(13qter), we could more precisely reveal the exact portion of the chromosome 13 that was

translocated, and where to. In addition, with MCB approaches, we were able to refine the

characterization of this new variant three-way translocation, thus defining the final karyotype

as t(8;13;21)(q22;q33;q22).

As mentioned before, literature data shows that t(8;21), as a complex variant,

involving a third or fourth chromosome is uncommon (0.05-1.1%) in childhood AML [7, 3].

Interestingly, through our data, we demonstrate a percentage of 3.1% (non-published data),

75

among 98 childhood AML patients presenting such aberration.

Literature also have reported variants t(8;21) to be unfavorable [4], although clinical

relevance and implications of such aberrations is yet to be determined. That is because, in this

context, some works have reported that there have been no complications with the patients

related on previous studies, including cases in which there was chemotherapy tolerance and

complete remission was achieved [1, 4, 5]. Regarding this issue, literature remains

controversial, and due to the rarity of this abnormality, this work could contribute to the

literature by adding another novel case, along with clinical and molecular information [14,

15]. Despite the literature points out that deletions in chromosome 13 are associated to

malignant disorders, thus justifying the search for genes related to human disease, no

biomarker was yet identified. Therefore, future studies, using clones from the 13q32-13q34

region, make themselves necessary in order to refine this region and better indicate the

prognostic value of the genes involved [16].

Thus, in summary, the combination of molecular techniques (FISH, MCB, RT-PCR

and Sequencing), used to characterize the novel variant t(8;13;21), can potentially reveal

genetic changes that might collaborate for the characterization of new gene fusions in

leukemogenesis in order to determine prognostic implications. Hence, these techniques should

be important complementary tools for AML patients' screening [6].

Acknowledgements

The authors thank Mariana Tavares de Souza and Daniela Ney-Garcia for their support, and

pathologist Fabia Neves for her contributions. We are grateful to Sharon Naron for editing the

manuscript. This work was supported by CAPES (PROBRAL/DAAD - project no. 419/14);

CNPq (project no. 473878/2011-9), FAPERJ (project no. E-26/110.868/2013); the INCT para

Controle do Câncer, Brazil (Grants CNPq 573806/2008-0) and the American Lebanese Syrian

Associated Charities (ALSAC); and a Center of Excellence Grant from the State of

Tennessee.

76

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78

Figure

Figure Legend – A) Partial karyotype. The red arrow displays a missing portion in

chromosome 8, and the green arrow shows a gain of chromosome material on chromosome

13. B1) FISH with AML1/ETO dual color, dual fusion probe showing the RUNX1/RUNX1T1

fusion on derivative chromosome 8, but also a RUNX1T1 signal on chromosome 13. B2)

Complementary FISH, with a subtelomeric probe for 13qter region, revealing that a portion of

this region was translocated to chromosome 21. C) FISH with wcp probes and MCB, for

chromosomes 8, 13 and 21, confirming the origin and destination of each rearrangement. D)

RT-PCR confirming RUNX1/RUNX1T1 fusion, and revealing the PCR product with 260bp.

E) Sequencing of the PCR product, determining that RUNX1 was fused to RUNX1T1

sequence.

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