Monitoramento da taxa de crescimento de colônias de Saccharomyces Cerevisiae em Placas de Petri usando Plataforma Móvel

Alecsander Pereira Martins¹ Universidade Estadual de

Londrina – UEL apms6592@gmail.com

José Carlos Pizolato Jr.² Universidade Federal de São Carlos – UFSCAR

jcpizolato@yahoo.com.br

Valdinei Luís Belini³ Universidade de São Paulo, São Carlos – EESC–USP valdineibelini@gmail.com

Abstract

The present work proposes an automatic method based on computer vision implemented in mobile platform capable of on-line monitoring of the colonies growth incubated in Petri dishes. The developed optimized image processing algorithm performs this task without human intervention from images of colonies of the microorganism Saccharomyces cerevisiae in different evolution phases. The contribution of this paper is the development of a fast and robust mobile tool to assist bioprocess experts in monitoring the growth of colonies without using the conventional error prone evaluation techniques. The obtained results successfully demonstrated dimensional alterations in colonies in a faster and more precise fashion when compared with the conventional method, with the additional advantage of versatility in producing reliable estimation of the growth rates with higher statistical significance. 1. Introdução

Com o aumento da presença da biotecnologia nas indústrias alimentícia e de bioenergia os processos fermentativos têm ocupado cada vez mais destaque e importância no desenvolvimento de recursos e de pesquisas no segmento de bioprocessos. Para as experiências de laboratório em biotecnologia são utilizados recipientes circulares transparentes conhecidos como placas de Petri. Essas placas acondicionam e permitem acompanhar o desenvolvimento de microrganismos que crescem num meio sólido denominado ágar. Esse meio oferece condições ideais para o desenvolvimento do fungo modelo em estudo, Saccharomyces cerevisiae de maneira consistente e estável em estufa a temperaturas controladas.

Na cultura em placas de Petri as condições favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos possibilitam que amostras de leveduras ou bactérias promovam o

surgimento e o crescimento de unidades formadoras de colônias (UFC) visíveis ao olho humano.

Nesse contexto, o estudo da taxa de crescimento de colônias de microrganismos pode fornecer informações valiosas para avaliar o efeito de antibióticos, inibidores de crescimento, efeito da exposição à radiação, temperatura, pH, composição do meio de cultura, drogas, nutrientes, estresse fisiológico, entre outros fatores ambientais.

Tradicionalmente, a verificação dimensional de colônias utiliza uma análise visual operacional a partir de medições realizadas com uma régua ou paquímetro. Embora esta técnica seja muito conhecida e de baixo custo, o tempo demandado nas medições e as imprecisões nos resultados têm motivado a pesquisa por métodos automáticos. O fato desta observação direta ser uma tarefa muito minuciosa e exaustiva, além de apresentar dependência para com a experiência do especialista, fatores como cansaço, fadiga e distrações podem contribuir para conduzir a registros de tamanhos de colônias diferentes das dimensões verdadeiras. Além da inconsistência de resultados, o tempo consumido na identificação dimensional é um fator limitante quando existe a demanda de diversos acompanhamentos simultâneos de crescimento de colônias em outras placas de Petri.

Com o propósito de reduzir essa carga de trabalho humano e produzir resultados mais consistentes e exatos, muitas propostas automatizaram a contagem e a avaliação da taxa de crescimento de colônias em meio sólido (placas de Petri).

Todavia, a maioria dos trabalhos usou rotinas padrões de processamento de imagem [10], [6], [9], [2], [7], [14] algoritmo de Watershed [1], transformada de Hough [15], técnicas de erosão e dilatação [4] e uma combinação de regiões de interesse com uma rede neural artificial [12].

Mais recentemente, a utilização de um classificador baseado em Support Vector Machine permitiu a contagem e a distinção de diferentes espécies de colônias de bactérias [13]. A autofluorescência também foi explorada em imagens digitais para detectar o surgimento de

colônias em meio sólido, muitas gerações antes de elas tornarem-se visíveis ao olho humano [11].

Apesar da exatidão e da consistência dos resultados demonstrados por essas propostas o desempenho da maioria dos sistemas automáticos é dependente de uma plataforma fixa composta por uma câmera de vídeo para a aquisição de imagens e um computador pessoal (PC) para executar os algoritmos de processamento e de análise das imagens. Essa exigência contribui para restringir o uso de tais métodos a laboratórios de pesquisa ou ambientes restritos.

O aumento da capacidade de processamento e de armazenamento de dados, associados à integração de câmeras de vídeo de alta resolução aos modernos e cada vez mais baratos telefones celulares, têm permitido ampliar substancialmente o elenco de aplicações desses sofisticados equipamentos portáteis. Nesse sentido, esse artigo propõe a automação de comparações dimensionais de colônias em placas de Petri a partir da integração do hardware e do software em uma única plataforma. Para atingir tal objetivo, essa proposta usou um celular Samsung modelo Omnia WSGH-i677 UG, 1,4 GHz e 512 MB (RAM) e sistema operacional Windows Phone 7.5.

Pretende-se contribuir para a redução da subjetividade do especialista no monitoramento do crescimento de colônias e das incertezas estatísticas, quando comparadas com a técnica manual. Embora a capacidade de processamento dessas plataformas móveis tenha aumentado, os algoritmos de processamento de imagem originalmente desenvolvidos para computadores pessoais ainda mostram-se computacionalmente onerosos para serem executados em telefones celulares. Dessa maneira, a otimização de um algoritmo de processamento de imagem, tipicamente utilizado em PC, de tal maneira que ele possa ser executado em dispositivos móveis, representa outra contribuição desse trabalho.

Diferente dos estágios de processamento de imagem tradicionais, os quais demandam elevado custo computacional, esse trabalho baseia-se na aplicação de técnicas de processamento digital somente no domínio espacial da imagem. Como resultado, o algoritmo implementado trabalha diretamente a morfologia matemática dos pixels em imagens previamente convertidas para o domínio binário.

O artigo é organizado como segue: A Seção 2 apresenta os procedimentos de medida e a avaliação do crescimento das colônias. O sistema de monitoramento proposto está na Seção 3. A Seção 4 apresenta e discute os resultados obtidos e a Seção 5 apresenta as conclusões.

2. Procedimentos de identificação do crescimento de colônias em placa de Petri

Em um procedimento convencional, a verificação do crescimento de colônias em placas de Petri é realizada

pela medição manual do diâmetro das colônias ao longo de um período de incubação em estufa sob temperatura controlada. Esse tipo de medição é conduzido por um especialista que utiliza uma escala graduada de algum instrumento de medida, como uma régua ou paquímetro, como ilustrado na Figura 1.

Neste tipo de procedimento convencional de medida há uma incerteza associada ao manuseio do instrumento pelo técnico no momento da leitura [5]. Desta forma, o método tradicional de medição pode gerar diferentes leituras entre técnicos de laboratórios para a mesma região das colônias em uma placa de Petri. Esta inconsistência demanda uma maior quantidade de leituras e repetições para produzir medidas mais exatas.

(a) (b) Figura 1.Figura 1.Figura 1.Figura 1. Medição de tamanho de colônia em placa de Petri com uma régua graduada (a) escala, (b) paquímetro.

O sistema de visão computacional proposto neste

trabalho para a identificação do crescimento de colônias numa placa de Petri é ilustrado na Figura 2.

FiguraFiguraFiguraFigura 2222.... Diagrama em blocos do sistema de identificação de crescimento de colônias proposto.

A entrada do sistema (bloco 1 da Figura 2)

corresponde a uma placa de Petri como mostrado na Figura 1. A aquisição da imagem da placa de Petri é obtida diretamente de uma câmera digital de um dispositivo celular posicionado sobre a mesma. A distância focal do sistema de aquisição da imagem,

Colônia em medição

com escala graduada

Colônia em medição

com paquímetro digital

ilustrado na Figura 3(a)-(b) é ajustada para evitar distorções e, neste caso, foi adotada uma separação igual a 150 mm. O usuário seleciona a imagem da placa de Petri diretamente na tela do celular (bloco 2 da Figura 2). A imagem capturada pelo sistema é processada digitalmente (bloco 3, Figura 2) para a medição do diâmetro das colônias para, subsequentemente, identificar as regiões de proliferação da mesma. O algoritmo otimizado para a plataforma móvel será detalhado na Seção 3. A saída do sistema (bloco 4, Figura 2) informa a porcentagem de ocupação das colônias na placa de Petri.

Este processo de identificação do crescimento de colônias oferece as seguintes vantagens quando comparado ao processo convencional: monitoramento do crescimento de colônias num tempo menor, remoção da subjetividade das medições e minimização dos erros de repetibilidade de leitura. Entretanto, o método proposto é variante ao deslocamento lateral da placa de Petri. Desta forma, foi aproveitada a base suporte ilustrada na Figura 3(a)-(b) para o posicionamento e o alinhamento da câmera fotográfica do aparelho celular para a obtenção de imagens sucessivas. A base suporte é provida de uma lâmpada interna direcionada para região da placa de Petri mantendo a iluminação controlada em todas as coletas de imagem realizadas. A luminosidade artifical do ambiente foi a mesma em todas as coletas realizadas, sem a interferência de luz externa.

(a)

(b)

Figura 3.Figura 3.Figura 3.Figura 3. Sistema de aquisição de imagem do sistema de visão proposto. (a) Dispositivo celular posicionado sobre uma placa de Petri que está fixada numa base suporte. (b) Detalhe da distância focal entre a câmera do telefone celular e a placa de Petri.

3. Sistema de monitoramento proposto

O processamento digital adotado é realizado no plano espacial da imagem da placa de Petri e atua diretamente na morfologia dos pixels da imagem, conforme Figura 4.

FiguraFiguraFiguraFigura 4444.... Diagrama em blocos do processamento digital da imagem no sistema proposto.

O bloco 1 da Figura 4 representa a imagem da placa de

Petri obtida pelo sistema de aquisição descrito na Seção 2. A imagem da placa de Petri (256 x 256 pixels) é digitalmente representada por 256 níveis de cinza, como ilustrado na Figura 5(a).

(a) (b)

FiguraFiguraFiguraFigura 5555.... Imagem de colônias de S. cerevisiae em placa de Petri. (a) Imagem representada em escala de cinza com 256 níveis. (b) Imagem após processo de binarização.

No bloco 2 do diagrama (Figura 4) a imagem da Figura

5(a) é representada na forma matricial pela função f (x, y), sendo que x e y representam, respectivamente, as coordenadas de linha e da coluna de cada posição do pixel. O bloco 3 normaliza os valores de intensidade de pixels (0-255) para o intervalo compreendido entre 0 e 1. Este cálculo é realizado segundo a equação (1) e os novos valores são armazenados em g (x, y).

���, �� � ��,��� ���,�� (1)

sendo: ���, ��:o valor de intensidade original (0 � ���, �� �255);

Distância

focal (150 mm)

Dispositivo celular

posicionado em

suporte

Placa de Petri

com a iluminação

na base suporte

�� �����, ���: o maior valor da matriz ���, ��; ���, ��: a matriz resultante (0 � ���, �� � 1). A função do bloco 4 da Figura 4 é implementar o

processo de binarização da matriz g(x, y). A técnica usada realiza a segmentação da imagem por limiarização descrito [3], pela equação (2) e ilustrada na Figura 5 (b).

���, �� � �1 �� ���, �� � �,0 �� ���, �� � � (2)

A medição da quantidade de pixels é realizada pelo

bloco 5 que implementa a equação (3), conforme especificada por [3].

� ∑ ∑ "#�$%&'()*+&',)* (3)

sendo que p+q refere-se a ordem do momento (p = 0 e q = 0); N e M referem-se aos limites da região da imagem binária em que h(x,y) = 1 e Q é o valor da área em unidades de pixel.

O bloco 6 da Figura 4 calcula a porcentagem de ocupação das colônias na imagem total. A quantidade de pixels das colônias na placa de Petri é comparada com a quantidade de pixels total da imagem. A informação de saída correspondente à porcentagem de ocupação das colônias na placa é exibida na tela do telefone celular.

4. Resultados

Para identificar as alterações dimensionais no sistema

proposto, comparações de leitura foram realizadas contra o método convencional. As leituras convencionais das colônias de S. cerevisiae foram realizadas por dois técnicos de laboratório utilizando inicialmente uma escala graduada com resolução de 0,5 mm. Devido à baixa resolução desta escala, outras medições foram realizadas como leitura referencial, utilizando um paquímetro digital de 0,01 mm de resolução.

No sistema proposto o limiar L da imagem na equação (2) é ajustado pelo usuário no inicio do processo de detecção das colônias, onde o valor é determinado visando melhor detecção das colônias em razão da tonalidade do ágar usado nas placas de Petri. Nos resultados obtidos o valor do limiar L foi igual a 180 em todos os monitoramentos do sistema proposto.

A Figura 6 apresenta os crescimentos de colônias de S. cerevisiae registrados pelo sistema proposto em quatro diferentes diluições pelo método seriado [8], onde 0,1 ml de caldo simples de S. cerevisiae foi diluído em 0,9 ml de água destilada, utilizando as diluições de 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5. No total, foram realizadas 18 medições de ocupação percentual das colônias em desenvolvimento ao longo de 26 horas de incubação. O acompanhamento do crescimento ocorreu durante o período de incubação em estufa a temperatura controlada de 33,2°C.

FiguraFiguraFiguraFigura 6666. Ocupação (%) das colônias em placa de Petri obtido em 18 leituras da plataforma móvel com colônias de S. cerevisiae em diluições: 10

-2, 10

-3, 10

-4 e 10

-5.

As demais análises de resultados desta Seção referem-

se a amostras com diluição do caldo simples a 10-5. Essa baixa concentração de microrganismos foi escolhida para melhorar a percepção visual e facilitar o uso do método convencional.

A figura 7 apresenta uma análise comparativa entre medidas apresentadas pelo uso de uma escala graduada, um paquímetro digital e o método proposto. Devido às grandes diferenças entre as medidas obtidas com o uso de uma escala graduada analógica os valores adotados como referências foram obtidos com um paquímetro digital. As mesmas placas de Petri foram utilizadas em todas as medições, independente do método de medida. A utilização do paquímetro digital demandou maior tempo na obtenção da leitura devido à necessidade de realização de quatro leituras sucessivas para a obtenção das correspondentes médias para cada fase de evolução das colônias.

Figura 7.Figura 7.Figura 7.Figura 7. Comparação entre o método proposto, escala graduada e paquímetro digital em 72 leituras.

No total, 42 colônias de leveduras foram observadas durante um período de 26 horas de incubação. A realização de 18 leituras com repetições, totalizou 72 leituras com paquímetro digital. Ao longo desse intervalo de incubação diferenças percentuais significativas nas dimensões das colônias puderam ser observadas. Diferentemente da técnica convencional, a qual demanda cálculos extras a partir das leituras manuais, o método proposto apresentou a taxa de crescimento das colônias à medida que as imagens eram capturadas. Para os três sistemas de medições as variações de leituras estiveram entre 12% a 31% para a escala graduada, de 4,1% a 5,6% para o paquímetro digital, contra variações de 0,5% a 0,86% para o método proposto (Figura 7).

A resolução de 0,5 mm da escala graduada, associada à dificuldade de visualização, contribuiu para produzir leituras com maiores erros. O paquímetro digital, por sua vez, apresentou leituras diretamente no mostrador do instrumento, com a desvantagem da necessidade de realizar posicionamento manual sobre a placa de Petri.

A consistência das leituras obtidas no paquímetro digital e no sistema proposto, para cada fase de crescimento das colônias, está ilustrada na Figura 8.

Os resultados da Figura 8 indicam que os erros na repetibilidade do paquímetro digital superaram aqueles apresentados pelo método automático, independente da quantidade de leituras realizadas. Em particular, esses erros foram maiores durante a fase exponencial de crescimento das colônias, na qual as dimensões das colônias aproximam-se da resolução do paquímetro. Em contrapartida, o método proposto obteve melhores resultados em razão da sua capacidade em detectar e contar menores quantidades de pixels para a mesma fase de crescimento.

FiguraFiguraFiguraFigura 8888.... Consistência das leituras das colônias de S. cerevisiae. No total, foram realizadas 72 comparações entre o paquímetro digital e leituras do método proposto.

Uma avaliação do desempenho do método automático

(Figura 9) demonstra que são necessários 9 segundos para

capturar e processar uma imagem de 42 colônias incubadas em uma placa de Petri, contra uma média de 249,5 segundos para o método convencional. Essas durações correspondem a 72 leituras coletadas nas mesmas placas de Petri. Observa-se que o tempo demandado pela leitura convencional é diretamente proporcional ao aumento da quantidade de colônias.

FiguraFiguraFiguraFigura 9999.... Tempo de leitura durante 18 estágios de crescimento para um total de 46 colônias, considerando 72 medições.

A sensibilidade das leituras em relação ao tamanho das

colônias incubadas é ilustrada na Figura 10. Nota-se que os erros apresentados pelo paquímetro digital superam aqueles encontrados pelo método automático e são maiores para menores dimensões das colônias.

Figura 10Figura 10Figura 10Figura 10.... Sensibilidade dos métodos de medidas em relação às dimensões físicas das colônias.

Os resultados da Figura 10 indicam que, à medida que

as colônias aumentam em tamanho físico, menores são os erros registrados pelo método convencional. Esse comportamento ocorreu em razão da maior facilidade na

visualização do surgimento das colônias ao longo da sua curva de crescimento exponencial. Para esses casos, o erro do método convencional foi reduzido de 5,6% para 4,1% entre a 1° e a 72° leitura. Em contrapartida, o erro exibido pelo método proposto aumentou ligeiramente ao final das leituras devido à maior quantidade de pixels que as colônias ocuparam. Todavia, essa imprecisão permaneceu abaixo de 1% durante todas as leituras.

5. Conclusões

A partir dos resultados experimentais preliminares,

comparações com o método convencional de medição de colônias em placa de Petri demonstraram que método automático de monitoramento de taxa de crescimento de colônias superou a técnica convencional em diversos aspectos. Entretanto, o método proposto é variante ao deslocamento lateral da placa de Petri e alterações de luminosidade do ambiente, havendo necessidade da base suporte e o sistema de iluminação. O limiar da imagem no sistema proposto deve ser selecionado pelo usuário de acordo com a tonalidade do ágar aplicado na cultura em placa de Petri.

Em comparação em análise de imagens, a proposta automática de identificação do crescimento em colônias de S. cerevisiae utilizando PC e software Matlab [9] demonstrou desempenho operacional 64 vezes mais rápido comparado ao seu método convencional manual. Já no presente trabalho, o sistema proposto em plataforma móvel demonstrou ser 27 vezes mais rápido que o método convencional manual apresentado.

De fato, a plataforma móvel produziu resultados mais exatos e consistentes comparados a método convencional, independentemente da quantidade e do tamanho físico das colônias sob observação. Os menores tempos de leitura, praticamente constantes com o número de colônias, representaram outro resultado atrativo. O uso de uma plataforma móvel oferece a vantagem adicional da mobilidade, especialmente interessante quando diferentes análises devem ser conduzidas em diferentes laboratórios. Além disso, a taxa de ocupação dimensional das colônias pode ser obtida diretamente do equipamento móvel à medida que as imagens eram capturadas e processadas, diferentemente da técnica manual que demanda cálculos externos para a obtenção de resultados com menores significâncias estatísticas. Em melhorias futuras pretende-se desenvolver um banco de dados para o sistema proposto com diferentes limiares definidos, variando de acordo com a tonalidade do ágar utilizado na aplicação.

6. Referências [1] A. Robinson, N. Sadr-kazemi, G. Dickason and S.T.L. Harrison, “Morphological characterization of yeast colony growth on solid media using image processing”, Biotechnology Techniques, Vol. 12, N. 10, 1998, pp. 763-767.

[2] C. Lawless, D.J. Wilkinson, A. Young, S.G. Addinall and D.A. Lydal, “Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar”, BMC Bioinformatics, Vol. 11, 2010, pp. 287- 299.

[3] Gonzalez, R.C., R. Woods, Digital Image Processing. Prentice Hall, 2 ed. New Jersey, 2002.

[4] K. Zalewski, R. Buchholz, “Morphological, analysis of yeast cells using an automated image processing system”, Journal of Biotechnology, Vol. 48, 1996, pp. 43-49.

[5] L. Barazzetti and M. Scaioni, “Crack measurement: Development, testing and applications of an automatic image-based algorithm”, ISPRS Journal of Photogrammetry and Remote Sensing, Lecco, Italy, 2009, pp. 285–296.

[6] M.C. Biston, S. Corde, E. Camus, R. Marti-Battle, F. Esteve and J. Balosso. “An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes”, Physics In Medicine and Biology, UK, Vol. 48, 2003, pp.1551–1563.

[7] M.L. Clarke, R.L. Burton, A.N. Hill, M. Litorja, M.H. Nahm, and J. Hwang, “Low-Cost, High-Throughput, Automatic Counting of Bacterial Colonies”, 77(8), 2010, pp. 790-797.

[8] M. T. Madigan, J. M. Martinko, D. A. Stahl., D. P. Clark, Brock Biology of Microorganisms, Pearson Education, 13 ed. San Francisco, 2010.

[9] N. Memarian, M. Jessulat, J. Alirezaie, N. Mir-Rashed, J. Xu, M. Zareie, M. Smith and A. Golshani. “Colony size measurement of the yeast gene deletion strains for functional genomics”. BMC Bioinformatics, Vol.8. No. 117, 2007.

[10] P.J. Costello and P. R. Monk, “Image Analysis Method for the Rapid Counting of Saccharomyces cerevisiae Cells”, Applied Environmental and Microbiology, Vol, 49 no. 4, 1985, pp. 863-866.

[11] R. London, J. Schwedock, A. Sage, H. Valley, J. Meadows, M. Waddington and D. Straus, “An Automated System for Rapid Non-Destructive Enumeration of Growing Microbes”, Plos One, Vol. 5 no. 1, 2010.

[12] U. Bottigli, M.Carpinelli, P.L. Fiori, B. Golosio, A. Marras, G. L. Masala, and P. Oliva, A "New Automatic System of Cell Colony Counting", World Academy of Science, Engineering and Technology, vol.15, 2006, pp-159-163.

[13] W. Chen; C. Zhang, “An Automated Bacterial Colony Counting and Classification system” Inf Syst Front, 2009, pp. 233-240.

[14] Y. Li and L. Wadso, “Simultaneous measurements of colony size and heat production rate of a mould (Penicilliumbrevicompactum) growing on agar”, J. Therm Anal Calorim, Vol. 104, 2011, pp. 105-111.

[15] Y. Yamashita, M. Kuwashima, T. Nonaka and M. Suzuki, “On-line Measurement of Cell Size Distribution and Concentration of Yeast by Image Processing”, Journal of CHEMICAL Chemical Engineering of Japan, Vol. 26, No. 6 1993, pp. 615-619.