Pesquisa de Mestrado Montagem de curvas para determinao de Biomassa Valdomiro Nery Gonalves

Montagem de curvas para Determinao de Biomassa1. Introduo O objetivo montar uma curva que correlacionem a DO de uma amostra tomada de um meio em fermentao lida no espectrofotmetro com a concentrao de clulas (g/L) contida nessa amostra, e uma curva que correlacione a DO com o nmero de clulas/mL contido nessa amostra, e tambm uma curva que correlacione o nmero de clulas/mL com a concentrao celular em g/L. Para isso temos que fazer os seguintes procedimentos: 1.1.Uma fermentao do micrbio que queremos e deixar a mesma atingir a fase estacionria, quando a concentrao de clulas atinge seu mximo. 1.2.Na sequencia determinar o peso seco de um amostra da fermentao na fase estacionria para determinar a concentrao da biomassa em g/L. 1.3.Depois montar uma curva que correlacione vrias diluies da amostra do meio de clulas que queremos estudar com as respectivas DOs. 1.4.Aps montar uma curva que correlacione a concentrao de clulas em g/L com a DO, utilizando os dados obtidos na determinao do peso seco (item 1.2). 1.5.E depois montar uma curva que correlacione o nmero de clulas lidos em cmara de Neubauer para vrias amostras com a respectiva DO. 1.6.E por ltimo uma curva que correlacione a concentrao de clulas em g/L com o nmero de clulas/mL. 2. Material tubos de ensaio de 10 mL Estante para tubos de ensaio Micropipetas de 0 a 1000 L Pipeta volumtricas de 10 e 5 mL Piscete com gua destilada Piscete com lcool 40 % Microscpio Camar e lamnula de Neubauer 3 Filtros Millipore Bomba de vcuo Kit para filtro Millipore para determinao de peso seco Agitador Vrtex Espectrofotmetro Papel macio para limpeza das cubetas do espectrofotmetro Cultura do microrganismo alvo na fase estacionria

1. Procedimento 1.1.Determinao do Peso Seco 1.1.1.Inicialmente faz-se a cultura da levedura que se quer trabalhar em um meio apropriado e deixa-se a fermentao atingir a fase estacionria onde chega-se ao mximo de clulas produzidas. 1.1.2.Depois temos que saber qual a concentrao de clulas em g/L na fermentao quando esta atinge a fase estacionria. Para isso tomamos uma amostra da fermentao e determinamos o Peso seco para calcular a concentrao. Fazemos o Peso seco em triplicata com um volume de amostra de 5 mL = 0,005 L: Filtros Peso do filtro Peso do filtro c/ clulas secas (g) Matria seca (g) 1

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1 2 3

0,1277 0,1255 0,126 Mdia Peso seco (g/l)= matria seca/ volume = 0,0232/0,005

(g) 0,1029 0,1035 0,1031

0,0248 0,022 0,0229 0,0232 4,647

1.2.Montagem de Curva de Calibrao 1.2.1.Toma-se uma amostra do cultivo e diluem-se vrias vezes (diluies conforme tabela abaixo) e faz-se a leitura no espectrofotmetro a 600 nm para cada diluio. No inicio como est saturado de clulas no vamos obter leituras satisfatrias.

Diluio Densidade tica Estas leituras tem que ser feitas, para cada diluio, no espectrofotme 1 Saturado 1x - 0,500 Nd x - 0,250 Nd x 1/8 0,125 Nd 1/8 x 1/16 0,063 0,633 1/16 x 1/32 0,031 0,361 1/32 x 1/64 0,016 0,163 1/64 x 1/128 0,008 0,093 1/128 x 1/256 0,004 0,049 1.2.2.Com estes dados montamos uma curva relacionando a diluio da amostra de clulas do meio de cultivo com a densidade tica lida no espectrofotmetro (acompanhar pelo excel os grficos feitos).

1.2.3.Pela observao do grfico vemos que h vrios lugares com espaos vazios (pontos espaados, pontos a, b, c e d); e para traar uma reta mais confivel, com um comportamento mais adequado, devemos ter pontos nestes lugares (veja abaixo)

1.2.4.Assim nos definimos os pontos que queremos na reta, definindo os pontos de DO para d eliminar os espaos vazios, por exemplo: podemos definir para o espao a um ponto igual 0,08, para o b 0,12 e 0,16, e assim por diante. Vejamos, para uma DO de 0,08 aplicando a formula da curva acima temos: y = 0,0992x - 0,0014 onde y corresponde a diluio e x a DO, logo y = 0,0992. 0,08 - 0,0014= y = 0,006536 = 0,007 c Sabemos que a diluio escrita, por exemplo, da seguinte 1:10, isto quer dizer 1 volume da amostra para 10 volumes da soluo, ou seja toma-se 1 ml da amostra e dissolve-se em 09 mL b a de gua (logo o volume total da soluo 10 mL, por isso diz-se 1:10). Ento a formula da diluio dada por D = Vamostra / Vtotal (como no nosso caso 1:10); assim tomando a diluio que queremos 0,007 podemos calcular o volume total da soluo para um dado volume de amostra. Tomando 0,1 mL de amostra, para evitar de trabalhar com grandes volumes temos: Vtotal = 0,1 / 0,007 = 14,216902 = 14,22 mL, isto quer dizer que devemos adicionar 14,12 mL de gua nos 0,1 mL da amostra para dar um volume total de 14,22 mL. Desta forma podemos montar uma tabela como abaixo:

2

Pesquisa de Mestrado Montagem de curvas para determinao de Biomassa Valdomiro Nery Gonalves DO 0,08 0,12 0,16 0,22 0,26 0,3 0,34 0,36 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Dil 0,007 0,011 0,014 0,019 0,023 0,026 0,030 0,032 0,035 0,044 0,053 0,062 0,070 V amostra (mL) 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,20 0,20 0,20 0,20 0,3 0,40 0,40 V total (mL) 14,22 9,48 7,11 5,17 4,38 3,79 6,69 6,32 5,69 4,55 5,69 6,50 5,69 V gua (mL) 14,12 9,38 7,01 5,07 4,28 3,69 6,49 6,12 5,49 4,35 5,39 6,10 5,29

Para cada diluio (segunda coluna) devemos ler no espectrofotmetro a Densidade tica real correspondente. E assim reorganizando a tabela acima temos:V amostra (mL) 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,20 0,20 0,20 0,20 0,3 0,40 0,40 V gua (mL) 14,12 9,38 7,01 5,07 4,28 3,69 6,49 6,12 5,49 4,35 5,39 6,10 5,29 V total (mL) 14,22 9,48 7,11 5,17 4,38 3,79 6,69 6,32 5,69 4,55 5,69 6,50 5,69 Dil 0,007 0,011 0,014 0,019 0,023 0,026 0,030 0,032 0,035 0,044 0,053 0,062 0,070 DO 0,064 0,105 0,145 0,194 0,228 0,270

0,335 0,425 0,521

No entendi por que no foram determinadas as DOs para as diluies em vermelho. As duas primeiras talvez porque j tivessem valores na primeira curva? As duas ltimas talvez porque a curva comea a apresentar um comportamento inadequado com DO acima de 0,5????? Com os dados da tabela acima se monta uma nova curva no Excel:

Ou pode-se inverter os eixos e obter a seguinte curva:

1.2.5.Depois temos que saber qual a concentrao de clulas em g/L na fermentao quando esta atinge a fase estacionria. Para isso tomamos uma amostra da fermentao e determinamos o Peso seco para calcular a concentrao. Fazemos o Peso seco em triplicata com um volume de amostra de 5 mL = 0,005 L: Filtros 1 Peso do filtro (g) 0,1029 Peso do filtro c/ clulas secas (g) Matria seca (g) 0,1277 0,0248 3

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0,1255 0,126 Mdia Peso seco (g/l)= matria seca/ volume = 0,0232/0,005

0,1035 0,1031

0,022 0,0229 0,0232 4,647

1.2.6.Depois com o resultado da concentrao em g/L da amostra da fermentao obtido no item 3.1.2 (4,647 g/L), se pode calcular a concentrao de clulas (X) para qualquer diluio da amostra fermentada pela formula: Concentrao da amostra diluda (X) = concentrao inicial x D Assim para a diluio 0,007 temos: X = 4,647 . 0,007 = 0,032529 = 0,033 = 0,03 g/L Desta forma podemos montar uma tabela para as vrias diluies da amostra e correlacionar com a DO j lida anteriormente, a saber:Dilui o 0,007 0,011 0,014 0,019 0,023 0,026 0,030 0,032 0,035 0,04 0,053 0,062 0,070 Concentrao material seca (g/l) 0,03 0,05 0,07 0,09 0,11 0,12 0,14 0,15 0,16 0,19 0,25 0,29 0,33 DO 0,064 0,105 0,145 0,194 0,228 0,270 0,218 0,348 0,335 0,425 0,521 0,585 0,670

1.2.7.Com estes dados se pode montar no Excel uma curva relacionando a Densidade tica a 600 nm com a concentrao de clulas em g/L. Ou pode-se inverter os eixos e obter a seguinte curva:

1.2.8.Depois podemos tomar as diluies da amostra da fermentao feitas anteriormente e determinar na Cmara de Neubauer o nmero de clulas de cada diluio e correlacionar com a DO lida anteriormente para as mesmas diluies. No necessrio fazer a leitura na Cmara de Neubauer para todas as diluies. Assim montamos uma tabela:Dilui o 0,007 0,011 0,014 0,019 0,023 0,026 0,030 0,032 0,035 0,04 Concentrao material seca (g/l) 0,03 0,05 0,07 0,09 0,11 0,12 0,14 0,15 0,16 0,19 DO 0,064 0,105 0,145 0,194 0,228 0,270 0,218 0,348 0,335 0,425 Nmero de clulas/mL (Cmara Neubauer)

1,63E+06 2,64E+06 4,02E+06 4,40E+06 6,30E+06 7,00E+06 5,10E+06 9,90E+06 8,20E+06 1,19E+07

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1.2.9.Com esta tabela podemos fazer uma curva relacionando a DO com o nmero de clulas/mL, a saber: (Como os valores correspondentes as diluies 0,03 e 0,035 no ajudam na elaborao da curva, nos podemos elimin-los.) 1.2.10.E tambm com a mesma tabela podemos fazer uma curva relacionando a concentrao de clulas em g/L com o nmero de clulas/mL, a saber: (Como os valores correspondentes as diluies 0,03 e 0,035 no ajudam na elaborao da curva, nos podemos elimin-los.)

1.2.11.Com estas tabelas fica fcil a partir de um determinado analise feita em uma amostra de uma fermentao utilizando o microrganismo alvo, saber vrios outros parmetros de interesse para essa biomassa.

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