Moraes Et Al. Micologia Cap 4

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Captulo 4MicologiaAurea Maria Lage de Moraes Rodrigo de Almeida Paes Vernica Leite de Holanda 1. Introduo micologia

Os fungos so organismos que convivem conosco todos os dias. Estes organismos so encontrados praticamente em qualquer local do ambiente que nos cerca, inclusive no ar, onde estruturas reprodutivas, na forma de esporos ou condios, esto prontas para, ao cair em um substrato adequado, desenvolver novas estruturas vegetativas e reprodutivas. Estes organismos, muitas vezes, nos so teis, decompondo resduos orgnicos, causando a decomposio ou a degradao de alimentos, ou mesmo atacando seres vivos, parasitando-os e, eventualmente, causando a sua morte. Os fungos so importantes, tanto do ponto de vista ecolgico quanto econmico. Ecologicamente, so considerados os lixeiros do mundo, pois degradam todo tipo de restos orgnicos, independente da origem, transformando-os em elementos assimilveis pelas plantas. J, economicamente, tm implicaes em vrias reas: Medicina humana e veterinria, Farmcia, Nutrio, Fitopatologia, Agricultura, Biotecnologia, entre outras.

400 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Os fungos tiveram seu grupo reconhecido como um reino a partir da descrio de cinco reinos por Whittaker em 1969. Esses organismos foram alocados em reinos com base na morfologia e no modo de nutrio dos seres vivos, sendo criado, ento, o reino Fungi. Em 1990, Carl Woese props o agrupamento dos cinco reinos estabelecidos por Whittaker em trs domnios: Archaea, Eubacteria e Eukaria, onde o reino Fungi faz parte do domnio Eukaria, que rene todos os eucariontes. A Micologia , portanto, a rea da Biologia destinada ao estudo dos fungos.1.1. Elementos fundamentais dos fungos e Citologia

Os fungos so organismos eucariontes, unicelulares (leveduriformes) ou multicelulares (filamentosos), haploides (homo ou heterocariticos), com parede celular contendo quitina e a-glucano. No apresentam plastos ou pigmentos fotossintticos. Todos os fungos conhecidos, com poucas excees, tm origem nos esporos (reproduo sexuada) ou condios (reproduo assexuada), corpsculos que podem ser comparados s sementes das plantas superiores, embora no sejam morfologicamente semelhantes a estas. Os esporos ou condios, para germinarem, necessitam de calor e umidade e o resultado desta germinao a formao de um ou mais filamentos finos, conhecidos como tubos germinativos. Estes tubos se ramificam em todos os sentidos formando uma massa filamentosa, chamada miclio, que constitui o sistema vegetativo, responsvel pelo desenvolvimento fngico e pela absoro dos alimentos. Os filamentos simples ou ramificados que formam o miclio so denominados hifas. Na maioria dos casos, o sistema vegetativo encontra-se no interior dos tecidos parasitados, no solo ou na matria orgnica em decomposio.

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Com a formao dos esporos ou condios necessrio que estes tenham acesso livre ao ar, para assegurar sua disseminao. Realiza-se, ento, uma diferenciao das hifas vegetativas, geralmente levantadas verticalmente sobre o plano do miclio, conhecido como esporforo ou conidiforo, e sobre estes se originam os esporos ou condios. As hifas, por sua vez, podem ser apocticas (com septo) ou cenocticas (sem septo). O ciclo de vida dos fungos compreende duas fases. Uma somtica, caracterizada por atividades alimentares, e outra reprodutiva, onde os fungos podem realizar reproduo sexuada ou assexuada. Em ambos os casos, um grande nmero de estruturas formado, dependendo da espcie. As estruturas assexuadas, como tambm as sexuadas, podem ser formadas isoladamente ou em grupos, neste caso, formando corpos de frutificao. Assim, condios podem ser formados em conidiforos isolados ou agrupados, constituindo ento os conidiomas. Os esporos podem ser formados em ascomas (onde so formados os ascos) ou basidiomas (onde so formados os basdios). De acordo com tipo de reproduo realizada, os fungos podem ser divididos em trs grupos: Holomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza ambas as reprodu-

es, sexuada e assexuada. Anamorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu-

o assexuada. Teleomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu-

o sexuada.


Esquema do ciclo de vida geral do fungo.

1.2. Nutrio, metabolismo e habitat

Os fungos so considerados seres heterotrficos, necessitando de materiais orgnicos j formados, que servem como fonte de energia e como constituintes celulares. Por causa da rigidez da parede celular, sua nutrio por absoro de nutrientes solveis simples. Realizam respirao celular ou fermentao para obteno de energia, e sua reserva energtica sob a forma de glicognio. Devido ausncia de clorofila nos fungos, torna-se necessrio que o substrato fornea as substncias j elaboradas indispensveis alimentao, obrigando os fungos a viverem em estado de saprofitismo, parasitismo, simbiose (liquens, por exemplo) ou mutualismo. Eles podem ser subdivididos em: Saprfitas obrigatrios Fungos que vivem exclusivamente em matria

orgnica morta, no podendo parasitar organismos vivos. Parasitas facultativos ou saprfitas facultativos Fungos capazes de

causar doenas ou de viver em restos orgnicos, de acordo com as circunstncias.

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Parasitas obrigatrios Fungos que vivem exclusivamente atacando

organismos vivos. Os fungos so considerados seres cosmopolitas, pois esto presentes em qualquer parte do planeta. Sendo amplamente distribudos pela natureza, so encontrados na gua, no ar atmosfrico, no solo, sobre os animais e vegetais vivos, na matria orgnica em decomposio, nos produtos alimentcios e industriais. A maioria dos fungos tm como necessidades nutricionais, os elementos C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Mo, Fe e Zn. Muitas espcies no necessitam de luz para seu desenvolvimento, j outras necessitam para formar suas estruturas de reproduo, podendo ser consideradas fototrficas (que buscam a luz). A temperatura ideal para o crescimento dos fungos fica entre 0 a 350C, mas o timo para a maioria fica entre 20 a 300C e a umidade ideal fica em torno da saturao.1.3. Posio sistemtica dos fungos

O reino Fungi dividido em sete filos, (Chytridiomycota, Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microspordia, Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota), e um grupo, os fungos anamrficos. Este grupo no possui valor taxonmico, sendo seus membros relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota. A taxonomia dos fungos tradicionalmente baseada em caracteres citolgicos e morfolgicos. Mas, atualmente, com o desenvolvimento de tcnicas bioqumicas e moleculares, novos caracteres foram adicionados como auxlio na identificao das espcies fngicas. Tais como as tcnicas baseadas em PCR (RAPD, RFLP, AFLP), sequenciamento de DNA, isoenzimas e cromatografia (TLC, HPLC, CG, espectometria de massa).


1.3.1. Filo Chytridiomycota

Os representantes do filo Chytridiomycota so considerados cosmopolitas e saprfitos aquticos. A maioria de gua doce poucos so marinhos. A principal caracterstica do grupo a formao de zosporo flagelado, estruturas de propagao no ambiente aqutico, onde o flagelo ajuda na sua movimentao. Ex: Chytriomyces sp.1.3.2. Filo Neocallimastigomycota

So encontrados no sistema digestivo dos grandes mamferos herbvoros e possivelmente em outros ambientes anaerbios terrestres e aquticos. Tratamse de zosporos no flagelados. Ex: Neocallimastix sp.1.3.3. Filo Blastocladiomycota

Seus representantes apresentam reproduo assexuada com zosporo de um nico flagelo, e reproduo sexuada atravs da fuso de planogametas. So habitantes restritos de gua e solo e parasitos de insetos. Ex: Allomyces sp. e Coelomomyces sp.1.3.4. Filo Microspordia

Organismos eucariontes sem mitocndria e flagelo desconhecido. So parasitas obrigatrios de animais, e comumente atacam peixes e insetos. Estes organismos foram includos no reino Fungi aps estudos filogenticos.1.3.5. Filo Glomeromycota

O filo Glomeromycota representado por fungos de micorrizas arbusculares (FMA). Participam de uma associao mutualstica com as razes

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de algumas plantas, na qual a planta, atravs da fotossntese, fornece energia e carbono para a sobrevivncia e multiplicao do fungo, enquanto este absorve nutrientes, minerais e gua do solo transferindo-os para as razes da planta. Tambm so considerados cosmopolitas. Foi includo neste grupo os representantes do antigo filo Zygomycota, que tem como principais caractersticas, hifas cenocticas e a formao de zigospornangio, por reproduo sexuada; e esporngio, por reproduo assexuada. Os esporngios so estruturas formadoras de propgulos para disperso. Ex: Mucor sp. e Glomus sp.1.3.6. Filo Ascomycota

O filo Ascomycota compreende o maior grupo do reino Fungi, constitudo de aproximadamente 75% de todos os fungos descritos. Seus representantes so considerados cosmopolitas e so encontrados na natureza como saprfitos, parasitas (especialmente de plantas), ou em associao mutualstica (com algas unicelulares) formando os liquens. A principal caracterstica do grupo a presena de asco contendo ascosporos, geralmente oito, que representam a estrutura de propagao do grupo. So produzidos por reproduo sexuada. A reproduo assexuada tambm pode ser encontrada. O asco formado em uma estrutura denominada ascocarpo (corpo de frutificao), que pode ser encontrado nas seguintes formas: apotcio (ascocarpo em forma de taa), cleistotcio (ascocarpo totalmente fechado, que se rompe com a maturidade), e peritcio (ascocarpo em forma de balo, com um poro na sua ponta). A ausncia da formao de ascocarpo tambm observada, sendo este considerado como ascos nus. Ex: Eurotium sp. e Emericella sp.


1.3.7. Filo Basidiomycota

Os representantes do filo Basidiomycota so considerados cosmopolitas e saprfitos. So comumente denominados cogumelos. Tm como principal caracterstica a presena de basdio contendo basidiosporos, geralmente quatro, produzidos por reproduo sexuada. A reproduo assexuada tambm pode ser encontrada. O basdio formado a partir de um basidiocarpo, sendo este constitudo, basicamente, por pleo (o chapu do cogumelo), lamela (estrutura pregueada abaixo do pleo, onde se encontram os basidios) e estirpe (estrutura que sustenta o pleo). Ex: Agaricus sp. e Rhodotorula sp.1.3.8. Fungos Anamrficos

Os Fungos Anamrficos formam um grupo de fungos onde a reproduo assexuada predominante, com a formao de condios como estrutura de propagao. A reproduo sexuada ausente, desconhecida ou teve a capacidade perdida. Esse grupo est relacionado a gneros do filo Ascomycota e Basidiomycota por comparao de sequncias gnicas. So considerados como cosmopolitas, saprfitos, e parasitas de animais e plantas. Os condios so formados por clulas conidiognicas, presentes nos conidiforos, que so prolongamentos de hifas modificadas, com funo reprodutiva. Os condios podem ter diferentes formas, tamanhos e cores, podem possuir ou no a superfcie texturizada, ornamento ou septo. Ex: Aspergillus sp e Penicillium sp.Por 2. Por que estudamos os fungos

Os fungos so conhecidos da humanidade h vrios sculos, tanto por seus benefcios quanto pelos problemas que causam. Muitas doenas huma-

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nas, de animais e plantas (micoses) so causadas por fungos. Em humanos e animais os fungos podem causar alergias respiratrias e cutneas leves ou intensas, dependendo da suscetibilidade e pr-disposio do indivduo. Podem causar infeces em mucosas e outros tecidos subcutneos, assim como infeces crnicas e letais envolvendo rgos inteiros. Cada tecido ou rgo do corpo humano pode ser afetado, com exceo dos dentes. Ns dependemos da agricultura para nos fornecer alimentos, principalmente os gros de cereais (milho, trigo, aveia, amendoim, etc.) que alimentam tanto os humanos quanto os animais. Doenas fngicas em cereais causam perdas significantes na agricultura, tanto para o consumo interno quanto para a exportao de gros atividade to importante em nossa economia. Alm disso, o ataque dos fungos no se restringe ao campo de produo, eles atacam tambm os gros estocados causando sua destruio ou produzindo toxinas carcinognicas potentes (micotoxinas) dentro destes gros. Os fungos tm sido utilizados para os mais diferentes propsitos, desde a antiguidade. O uso mais antigo deles tem sido como alimento, propriamente dito, tendo sido utilizado mais tarde tambm na indstria alimentcia para a produo de pes, queijos, cervejas e vinhos. O sabor e a textura de muitos alimentos, como os queijos e o molho de soja, so dados pelos fungos usados em sua fabricao. Posteriormente, foi descoberto o poder dos fungos na produo de metablitos que poderiam ser teis, como a Penicilina. Estudos em Biotecnologia e Engenharia gentica propiciaram a produo destes metablitos em larga escala. Hoje produtos fngicos usados comercialmente incluem cidos orgnicos, etanol, alguns antibiticos (alm da Penicilina), pigmentos, vitaminas, enzimas e pesticidas biolgicos. Alm de se tornarem valiosos objetos de pesquisa, em particular, como modelos eucariontes, uma vez que so facilmente manipulados em laboratrio, fornecendo informaes importantes sobre a bioqumica, a gentica e a biologia molecular dos eucariontes.


3. Micologia Mdica

A Micologia mdica tem como principal objetivo estabelecer o diagnstico micolgico das infeces por fungos, que por sua vez se baseia em correta coleta e processamento de espcimes clnicos. A observao das normas de preservao, e transporte adequados dos materiais clnicos at os locais de processamento, como laboratrio de Microbiologia/Micologia tambm tem enorme importncia para a obteno de resultados acurados.3.1. Classificao das micoses

Didaticamente, podemos dividir as micoses em grupos, como demonstrado a seguir:3.1.1. Micoses superficiais e cutneas

As MICOSES SUPERFICIAIS so infeces causadas por fungos que invadem as camadas mais superficiais da capa crnea da pele ou a haste livre dos pelos. As leses se manifestam como mancha pigmentar na pele, ndulo ou pelos. A forma invasiva do fungo uma hifa, caracterstica de cada micose. A piedra negra uma micose causada pela Piedraia hortae. Esta micose consiste em ndulos duros, de cor escura, localizados na haste dos pelos e bastante aderentes a eles. Em parasitismo, o fungo se apresenta como um emaranhado de hifas intimamente unidas. Essas hifas so de cor castanha e tm parede e septos espessos. Os ndulos constituem, na verdade, um ascostroma, pois em meio ao enovelado de hifas formam-se lculos ovalados contendo oito ascsporos. J a piedra branca causada por leveduras do gnero Trichosporon. Nesta infeco o fungo cresce sobre a haste dos pelos, formando ndulos de hifas hialinas septadas e ramificadas, facilmente destacveis dos

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pelos, que podem se desarticular, resultando em artrocondios retangulares que se tornam esferides ou polidricos. Leveduras do gnero Malassezia so os agentes da pitirase versicolor. Esses fungos vivem normalmente sobre a pele do homem, na forma de levedura. Usualmente podem filamentar e invadir as clulas queratinizadas das camadas superficiais da pele, determinando a micose. A doena se manifesta como manchas descamativas distribudas pelo trax, abdome e membros superiores. Ao contrrio do que muitos pensam, a micose no adquirida na praia; o que ocorre que quando o doente se bronzeia, os locais da pele onde o fungo est em parasitismo no se queimam, permitindo que as leses possam ser visualizadas com maior facilidade. O diagnstico definitivo se d somente pelo exame direto atravs da observao de hifas curtas e curvas e elementos redondos. A Malassezia no cresce nos meios de cultura habituais usados na rotina porque necessita de suplemento lipdico para seu crescimento. As MICOSES CUTNEAS se caracterizam por serem causadas por fungos que invadem toda a espessura da capa crnea da pele ou a parte queratinizada intrafolicular dos pelos ou a lmina ungueal. Na pele, as leses se manifestam como mancha inflamatria, nos pelos como leso de tonsura e na unha por destruio da lmina ungueal. O contgio feito atravs de animais, homens ou de solo infectado. As dermatofitoses constituem manifestaes clnicas muito variadas causadas por um grupo de fungos, denominados dermatfitos, que produzem leses na pele, pelos ou unhas. Os fungos dermatfitos degradam queratina e pertencem aos gneros Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton. H reconhecidamente 27 espcies patognicas para o homem, dentre as quais 15 ocorrem no Brasil. Destas, as principais so: Trichophyton rubrum,


Epidermophyton floccosum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, M. gypseum e T. tonsurans.As dermatofitoses podem ser classificadas nas seguintes modalidades clnicas: dermatofitose ou tinha do couro cabeludo, da pele glabra, da barba e da face, dos ps, das unhas e inguinal, dependendo da localizao da leso no paciente. J nos cabelos, pela relao com os fungos, podem ser diferenciados dois tipos de parasitismo: endotrix, onde os artrocondios se localizam somente no interior do pelo, esse causado, por exemplo, por T. tonsurans; e ectotrix, onde os artrocondios se dispem no interior e ao redor do fio de cabelo. Podemos citar M. canis e T. mentagrophytes como agentes deste tipo de parasitismo pilar. Em cultivo, os dermatfitos, em sua maioria, produzem dois tipos de condios: macrocondios e microcondios que, juntamente com a caracterstica macroscpica da colnia, vo permitir a identificao das diferentes espcies dos dermatfitos. Os macrocondios so caractersticos dos seguintes gneros: Microsporum So fusiformes, grandes, multisseptados de pare-

des rugosas. Epidermophyton So clavados, robustos bi ou trisseptados com

paredes lisas e espessas. Trichophyton Quando existentes so delicados, clavados,

multisseptados de paredes finas e lisas. O quadro a seguir mostra as caractersticas macro e micromorfolgicas que so observadas nas colnias dos principais fungos responsveis por dermatofitoses.

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Fungo dermatfitoTrichophyton rubrum

MacromorfologiaColnia branca, granular ou cotonosa, com pigmento vermelho no verso

MicromorfologiaMicrocondios em gota de lgrima dispostos ao longo da hifa e macrocondios, que quando existem, so comuns do gnero Macrocondios do gnero, microcondios redondos numerosos Microcondios numerosos e polimrficos, usualmente clavados ou alongados Macrocondios fusiformes, multisseptados de paredes rugosas e mais espessas que a dos septos, poucos microcondios Numerosos macrocondios fusiformes, multissepados, de paredes rugosas e finais poucos microcondios Macrocondios em grupos de trs ou mais na extremidade de conidiforos, microcondios inexistentes

T. mentagrophytes

Colnia branca, granular ou cotonosa, com pigmento que vai do amarelo ao marron no verso Colnia acastanhada com pigmento vermelhoferruginoso no verso Colnia branca, penugenta com pigmento amarelo alaranjado no verso

T. tonsurans

Microsporum canis

M. gypseum

Colnia pulverulenta de cor camura, com pigmento pardo no verso Colnia membranosa de cor verde-limo

Epidermophyton flocosum

A candidase micose causada por leveduras do gnero Candida, em especial pela espcie C. albicans. Elas so hspedes normais do trato gastrintestinal do homem e fazem parte da microbiota de determinadas regies do tegumento cutneo. Porm a Candida pode invadir a camada crnea da pele ou a lmina ungueal de hospedeiros normais. As leses tm localizao


peculiar: nas unhas das mos e nas reas intertriginosas da pele (regio inguinal, espaos interdigitais das mos, regio submamria e axilar). Tambm possvel ocorrerem leses nas unhas dos ps. H ainda outras micoses de pele e de unha que no so causadas nem por fungos dermatfitos nem por fungos do gnero Candida. Dentre esses fungos destacam-se: Fusarium sp., Scytalidium dimidiatum, e S. hyalinum que podem causar leses principalmente em unhas e em espaos interdigitais dos ps. Em cultivo, S. dimidiatum se apresenta como colnia cotonosa, branca no incio tornando-se cinza a negra em dez dias. Microscopicamente, se compe de hifas demceas e hialinas, com artrocondios septados e no septados. S. hyalinum considerado um mutante de S. dimidiatum incapaz de sintetizar melanina e, com isso, as hifas e os condios so sempre hialinos. As culturas de Fusarium sp. podem ser as mais variadas possveis, quanto macroscopia. Esta depender da espcie que causa a leso. Porm, microscopicamente, o que caracteriza Fusarium sp. a presena de macrocondios em forma de lua, bi ou trisseptados.3.1.2 . Micoses subcutneas

As MICOSES SUBCUTNEAS se caracterizam por resultar da inoculao de um fungo patognico por ocasio de um traumatismo, manifestando-se como tumefao ou leso supurada da pele ou do tecido subcutneo, produto da disseminao do fungo por contiguidade ou por via linftica, porm limitada ao territrio aqum do linfonodo regional. A esporotricose tem como agente Sporothrix schenckii. Esse um fungo dimrfico, logo, muda entre as formas miceliana e leveduriforme, de acordo com a temperatura e as condies do ambiente onde se encontra. Assim sendo, S. schenckii, em parasitismo nos tecidos apresenta-se como

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elementos leveduriformes bem pequenos, com brotamento geralmente em forma de charuto. Na natureza, em associao a vegetais e madeira, vive na forma filamentosa. A transmisso clssica da esporotricose se d por traumatismo causado por vegetais onde o fungo se encontra ou pela forma zooflica, ou seja, atravs de leses provocadas por animais infectados por S. schenckii, em especial gatos, como vm ocorrendo no estado do Rio de Janeiro, que uma rea endmica de esporotricose. A leso inicial da esporotricose uma ppula ou ndulo que surge no ponto da inoculao, usualmente localizado nos membros. Desse local o fungo pode propagar-se por contiguidade, determinando uma leso circunscrita ou por via linftica, ocasionando o aparecimento de ndulos em nmero varivel sobre o trajeto de um linftico superficial. O diagnstico definitivo se d com o isolamento em cultivo do fungo em amostras de pus ou bipsia das leses. Testes de deteco de IgG e IgM em amostras de soro podem auxiliar no diagnstico e no acompanhamento teraputico desta infeco. A cromoblastomicose uma infeco que se caracteriza pelo aspecto parasitrio de seus agentes: o corpo muriforme. Esses so elementos globosos, com parede acastanhada espessa e septados em planos distintos. Podem ser visualizados tambm elementos no septados e outros com apenas um septo, porm o que caracteriza o corpo muriforme a presena de septos em planos diferentes. As principais espcies que podem causar cromoblastomicose no ser humano so Fonsecaea pedrosoi, F. compacta, Cladophialophora carrionii, Phialophora verrucosa, e Rhinocladiella aquaspersa. No Brasil, normalmente, os casos dessa micose so causados por F. pedrosoi, aps traumatismo com matria orgnica vegetal. Micetoma o nome coletivo de micoses produzidas por algumas espcies de fungos ou de actinomicetos aerbios, os quais, nos tecidos, se organizam em um agregado de hifas ou filamentos bacterianos, denominados gros. Os agentes de micetoma possuem habitat na natureza associado a vegetais,


nutrindo-se de outros vegetais em decomposio ou como fitopatgenos. O micetoma eumictico se distingue do actinomictico por ser: causado por um fungo, enquanto o actinomictico causado por bactrias filamentosas. Os gros, de tamanho e forma variados, podem ter colorao branco-amarelado, vermelha ou negra. O que caracteriza a cor de um gro somente o fungo ou actinomiceto agente da doena. Por isso, a cor do gro obtido das leses do paciente j fornece um indicativo de qual seja o agente do micetoma. O quadro a seguir o relata alguns desses agentes, com o respectivo tipo e colorao dos gros:Fungos causadores de micetomaGro eumictico negro Madurella mycetomatis Gro eumictico branco Acremonium sp.

M. grisea Pyrenochaeta romeroi Exophiala jeanselmei

Pseudallescheria boydii (Scedosporium apiospermum) Neotestudina rosatii Aspergillus nidulans (Emerciella nidulans)

Actinomicetos causadores de micetomaGro actinomictico vermelho Gro actinomictico branco

Actinomadura pelletieri

Actinomadura madurae Nocardia brasiliensis N. asteroides, N. caviae Streptomyces somaliensis

H outras micoses subcutneas de interesse, como a lobomicose e a entomoftoramicose. No entanto, a esporotricose, cromoblastomicose e micetomas so as mais comuns no Brasil.

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3.1.3. Micoses sistmicas e oportunsticas

As MICOSES SISTMICAS se caracterizam por serem adquiridas por inalao de propgulos fngicos, sendo, consequentemente a leso primria pulmonar, com tendncia regresso espontnea. O fungo pode se disseminar pelo corpo atravs do sangue, originando leses extrapulmonares nos indivduos. Os agentes de micoses sistmicas raramente so implantados traumaticamente; quando isso ocorre, determinam uma leso granulomatosa circunscrita, com ou sem linfangite regional, que regride espontaneamente. Ao invadir os tecidos, os fungos desencadeiam resposta imunolgica no hospedeiro, que pode ser evidenciada por reao intradrmica, na qual se verifica a resposta celular dada pelo hospedeiro, por reaes de hipersensibilidade tardia e por provas de deteco de anticorpos em amostras de soro (imunodifuso dupla e fixao do complemento), onde avaliada a resposta humoral. Uma reao intradrmica positiva evidencia que o indivduo j foi previamente sensibilizado pelo fungo e as provas sorolgicas indicam que h anticorpos contra o fungo. Porm, as provas sorolgicas podem fornecer resultados falso-positivo e falso-negativo, visto que podem ocorrer reaes cruzadas com outros anticorpos na prova aplicada. As provas sorolgicas auxiliam no diagnstico de micoses sistmicas, mas o que realmente diagnostica a doena o isolamento do fungo em cultivo ou sua observao no exame micolgico direto dos materiais adequados para o exame, tendo as provas imunolgicas valor diagnstico presuntivo. As provas imunolgicas so teis para avaliaes epidemiolgicas, para avaliao prognstica e para a triagem de pacientes. As reaes intradrmicas apresentam valor diagnstico baixo, uma vez que no discriminam entre infeces passadas ou recentes. Porm so de grande valor nos estudos epidemiolgicos.


As micoses sistmicas so a coccidioidomicose, a blastomicose, a histoplasmose, e a paracoccidioidomicose. As duas primeiras no so comuns no Brasil, embora sejam relatados casos de coccidioidomicose no semirido do Nordeste, em especial no Piau em caadores de tatus, que revolveram o solo para desentocar a caa. H tambm a esporotricose sistmica, que resultado da inalao de condios de S. schenckii os quais vo causar infeco pulmonar que pode sistematizar-se. Este tipo de apresentao clnica da esporotricose bastante raro. O aspecto macro e micromorfolgico do fungo o mesmo do agente da esporotricose subcutnea. A histoplasmose uma infeco sistmica, causada por Histoplasma capsulatum var. capsulatum ou H. capsulatum var. duboisii. Enquanto o primeiro agente tem distribuio cosmopolita, o outro tem sua distribuio geogrfica restrita ao continente africano. O cultivo de H. capsulatum temperatura ambiente constitudo de colnia branca que, quando muito velha, assume colorao camura. O crescimento do fungo bem lento. Microscopicamente se observam hifas finas e delicadas e condios de dois tipos. Os macrocondios esfricos e tuberculados so estruturas marcantes para a identificao do fungo. Porm, a presena de microcondios esfricos necessria para a correta identificao do agente, pois h alguns fungos saprfitas, pertencentes ao gnero Chrysosporium, que tambm produzem estruturas de propagao semelhantes. Deve-se, para a correta identificao do agente da histoplasmose, realizar a converso desse fungo para a fase leveduriforme em meios enriquecidos com incubao a 37C. Todavia, a converso de H. capsulatum no facilmente obtida e depende tambm das caractersticas fisiolgicas de cada isolado. Quando convertidos fase leveduriforme observam-se colnias glabras, lisas, branco-amarelada, e na microscopia notam-se leveduras ovais e unibrotantes. A paracoccidioidomicose uma micose sistmica causada por Paracoccidioides brasiliensis, caracterizada pela forma parasitria do seu agente: clula leveduriforme mutibrotante com parede celular birrefringente. a micose

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sistmica mais frequente na Amrica Latina. Afeta usualmente agricultores, que mantm contato direto com a natureza, em principal com o solo. A micose endmica no Brasil. As manifestaes clnicas da paracoccidioidomicose resultam da inalao de elementos infectantes do fungo ou de uma reativao de leso primria quiescente, ou seja, de uma leso adquirida h algum tempo, muitas vezes mais de trinta anos, e que no tinha ainda se desenvolvido. O fungo, alm de acometer o pulmo, dissemina-se para outras partes do corpo, atingindo principalmente as mucosas do indivduo, sua pele e linfonodos. O aspecto macroscpico da cultura de leveduras desse fungo tem colorao creme-clara, consistncia cremosa e conseguido em meios especiais, como o meio de Fava-Neto, com incubao a 37C. O cultivo a 25C d origem a colnias de crescimento muito lento, filamentosas, algodoadas ou aveludadas, compostos de uma trama de hifas sem condios. As MICOSES OPORTUNSTICAS so causadas por fungos termotolerantes (que crescem a uma temperatura de 37C), de baixa virulncia e que determinam doenas em hospedeiros com graves deficincias do sistema imunodefensivo. Esses fungos tm porta de entrada varivel, usualmente provocam reao supurativa necrtica. Podem acometer os mais variados rgos, produzindo quadros polimrficos que se apresentam como manifestao cutnea, subcutnea ou sistmica. Os fungos invadem os tecidos como uma hifa. A criptococose causada por leveduras do gnero Cryptococcus, das quais destacam-se duas espcies: C. neoformans, que acomete principalmente indivduos imunodeprimidos e C. gattii, que pode acometer indivduos imunocompetentes. A micose de frequncia elevada nas grandes cidades, onde so diagnosticadas suas formas clnicas mais graves. As formas subclnicas ou as que se manifestam como infeco respiratria inespecfica devem ser


bastante frequentes. A doena endmica no Norte e no Nordeste do pas, acometendo crianas, jovens e adultos, de ambos os sexos e todas as faixas etrias, com ou sem depresso do sistema imunolgico. O fungo apresenta tropismo pelo sistema nervoso central e o lquor do paciente pode simular meningite viral, bacteriana e tambm tuberculose. As leveduras do gnero Cryptococcus possuem uma caracterstica especial, que a presena de uma cpsula polissacardica que envolve todo o fungo. Essa cpsula pode ser evidenciada em exames laboratoriais por contraste com tinta nanquim ou com a colorao pelo Mucicarmin de Mayer. C. neoformans e C. gattii so capazes de produzir a enzima extracelelular fenol oxidase, que extremamente til para a identificao do agente da criptococose, pois esta enzima faz com que a levedura se torne melanizada quando colocada em cultivo com compostos fenlicos. Esta enzima e a cpsula polissacardica esto relacionadas com a virulncia desse fungo ao organismo. A aspergilose causada por membros do gnero Aspergillus que se apresentam nos tecidos como hifas hialinas septadas e ramificadas dicotomicamente, ou seja, num ngulo de 45. A micose se manifesta em trs formas clnicas: a alrgica, de colonizao e a forma invasiva. Poucos grupos de Aspergillus causam infeco no homem. Espcies de Aspergillus dos grupos fumigatus, niger e flavus so os patgenos mais comuns, porm tambm podem causar infeco fungos dos grupos nidulans, terreus, ustus e restrictus. O aspecto microscpico do conidiforo permite a distino entre as diferentes espcies. A candidase oportunista tem incidncia mundial e resulta da invaso por espcies de Candida dos tecidos de hospedeiros com endocrinopatias, nos que recebem teraputicas imunodepressivas, nutrio parenteral e administrao prolongada de antibiticos ou esteroides, e ainda em pacientes com complicaes aps grandes cirurgias. Nos tecidos, as espcies de Candida se apresentam como hifas de aspecto peculiar, com exceo de C. glabrata (nun-

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ca filamenta, sempre se apresenta na forma de levedura). O agente mais comum C. albicans, espcie que faz parte da microbiota do tubo digestivo do homem. Vive tambm em menor nmero na rvore brnquica e na cavidade vaginal. Os microrganismos responsveis pela candidase so classificados em sua forma anamrfica, usando provas fisiolgicas de assimilao e fermentao de acares. medida que vm sendo descobertas as formas teleomrficas das espcies de Candida, as caractersticas dos esporos demonstram que elas pertencem a vrios gneros distintos.3.2. Agentes antifngicos

O nmero de frmacos disponveis para o tratamento de infeces fngicas sistmicas limitado. Nos ltimos anos, a anfotericina B e os azis principalmente cetoconazol, fluconazol e itraconazol tm sido os frmacos de primeira escolha na terapia. Estas duas classes de medicamentos tm como alvo a membrana celular dos fungos. Os polienos ligam-se a uma poro esterol, basicamente ergosterol, presente na membrana de fungos sensveis, formando poros ou canais. O resultado um aumento na permeabilidade da membrana que permite o extravasamento de diversas molculas pequenas, levando morte celular. A anfotericina B um antibitico fungicida de largo espectro e potente, mas seu uso associado a efeitos adversos significantes, como nefrotoxicidade e febre com calafrios, como reao aguda infuso intravenosa, j que a farmacocintica deste frmaco no permite a administrao oral. Os azis so compostos totalmente sintticos. O mecanismo de ao destes frmacos baseia-se na inibio da esterol-14-a-desmetilase, um sistema enzimtico microssomal dependente do citocromo P450, que prejudica a sntese do ergosterol na membrana citoplasmtica e leva ao acmulo de 14- ametilesteris. Esses metil-esteris no possuem a mesma forma e propriedades fsicas que o ergosterol e levam formao da membrana com propriedades alteradas, que no desempenha as funes bsicas necessrias ao desenvolvi-


mento do fungo. Os azis causam menos reaes adversas que a anfotericina B, mas so menos potentes que ela. Podem ter ao fungisttica ou fungicida. O uso excessivo dos azis levou ao aparecimento de resistncia em espcies suscetveis. Um outro agente antifngico sistmico utilizado o pr-frmaco flucitosina. Todos os fungos sensveis so capazes de desaminar a flucitosina em 5fluorouracila, um potente antimetablito; como resultado final, a sntese de cido desoxirribonucleico dos fungos fica prejudicada. Embora as clulas dos mamferos no convertam a flucitosina em fluorouracila, o que crucial para ao seletiva do composto, alguns microrganismos da flora intestinal o fazem, causando certa toxicidade aos humanos. A atividade antimicrobiana de um composto pode ser quantificada com base na determinao da concentrao mnima capaz de inibir o crescimento de um dado microrganismo, um valor chamado CIM (Concentrao Inibitria Mnima), ou MIC (Minimum Inhibitory Concentration) em ingls. Este valor pode ser determinado atravs do mtodo das diluies sucessivas ou do mtodo da difuso em gar, ou ainda atravs do uso de tiras contendo um gradiente de concentrao de antibitico, conhecido como E-teste. Do ponto de vista microbiolgico e clnico, o conceito de sensibilidade e resistncia aplicado para classificar o isolado como sensivel ou resistente. No aspecto microbiolgico, uma cepa considerada resistente a um antifngico quando a concentrao inibitria mnima mais elevada que a habitual do antifngico frente a essa espcie. Podemos observar trs diferentes tipos de resistncia aos agentes antifngicos: Intrnseca: dita quando nenhum membro de uma espcie sensvel

ao antifngico, ou seja, todos so insensveis.

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Primria: ocorre quando dentro de uma espcie, normalmente sensvel

a determinado antifngico, encontra-se uma cepa com resistncia natural a ele, sem necessidade de contato prvio com a droga. Secundria: ocorre quando uma cepa, previamente sensvel, desen-

volve resistncia droga aps ter sido exposta a ela.3.3. Diagnstico imunolgico das micoses pulmonares

As provas imunolgicas prestam valiosos auxlios no diagnstico de uma infeco fngica. Os dados obtidos atravs de tais provas, devem ser criteriosamente interpretados e correlacionados com os achados micolgicos, evidncias clnicas e circunstncias epidemiolgicas. Para segurana e facilidade na interpretao dos resultados, soros controles positivos devem ser includos nas provas sorolgicas para deteco de anticorpos em soro. Essas provas devem ser realizadas com uma bateria de antgenos. No caso especfico das micoses pulmonares, essa bateria deve incluir, no mnimo, antgenos de Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Aspergillus fumigatus e Coccidioides immitis. Para melhor avaliao prognstica, as provas devem ser executadas com amostras seriadas do soro colhido em diferentes perodos, possibilitando assim a elaborao da curva sorolgica. importante salientar que as provas imunolgicas tm valor presuntivo no diagnstico das infeces fngicas, sendo o exame de cultivo o padro-ouro para diagnstico definitivo das micoses.


3.4. Interpretao das provas imunolgicas3.4.1. Paracoccidioidomicose

Pacientes portadores de paracoccidioidomicose ativa sem tratamento apresentam positividade nas provas sorolgicas acima de 90%. Os ttulos da reao de fixao de complemento so mais elevados nas formas graves e agudas da doena, sofrendo quedas medida que ocorre melhora clnica. A reao no tem muito valor diagnstico quando tomada como dado isolado. A correlao com os dados clnicos, epidemiolgicos e resultados fornecidos por outras tcnicas faz com que a importncia diagnstica aumente. Na imunodifuso dupla de Ouchterlony pode ocorrer a formao de vrias bandas de precipitao, sendo mais frequente a demonstrao de apenas uma delas. A reao dotada de alta especificidade. Reaes cruzadas so mnimas e podem ocorrer principalmente com soros de pacientes portadores de histoplasmose. A contraimunoeletroforese mais sensvel que a imunodifuso dupla e permite que os resultados sejam conhecidos em tempo reduzido. Ao lado do alto valor diagnstico, a reao permite tambm acompanhar a evoluo sorolgica do paciente, atravs da titulao seriada de amostras do soro. O sorodiagnstico especfico da paracoccidioidomicose pode ser obtido por intermdio da imunoeletroforese, atravs da demonstrao do arco de precipitao correspondente ao antgeno E2 ou gp43. O arco de precipitao correspondente forma-se na regio catdica da lmina.3.4.2. Histoplasmose

Anticorpos fixadores do complemento podem ser demonstrados na maioria dos pacientes, j a partir da quarta semana aps a infeco. Preconizase a utilizao dos antgenos obtidos da fase leveduriforme do Histoplasma

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capsulatum bem como do antgeno obtido da sua fase filamentosa para aplicao no teste, uma vez que o antgeno leveduriforme apresenta uma maior especificidade e o antgeno filamentoso maior sensibilidade. Os resultados inespecficos esto geralmente relacionados aos ttulos de 1:8 e 1:32. Consequentemente ttulos inferiores a 1:8 so considerados normais, e entre 1:8 e 1:32 so considerados de valor presuntivo. Ttulos de 1:32 ou mais elevados so altamente sugestivos de histoplasmose em atividade. Aps a cura clnica, os ttulos caem rapidamente e normalmente desaparecem aps nove meses. Reaes cruzadas podem ocorrer com soros de portadores de paracoccidioidomicose.Na imunodifuso dupla podem ser verificadas duas faixas de precipitao de importncia diagnstica, denominadas bandas H e M. A faixa M forma-se prxima do orifcio que recebe o antgeno e pode ser demonstrada com soros de pacientes com formas agudas ou crnicas de histoplasmose, ou em indivduos sensveis a histoplasmina e que se submeteram a recente teste intradrmico com o antgeno. A precipitina H demonstrada no soro de pacientes com a doena ativa ou at dois anos aps recuperao clnica, raramente ocorre na ausncia de M. A contraimunoeletroforese tem praticamente o mesmo valor da imunodifuso dupla, permitindo ainda a titulao dos anticorpos anti- H. capsulatum. A deteco de antgeno de H. capsulatum em espcimes de urina, sangue e fluido crebroespinhal oferece um mtodo rpido para o diagnstico, para o monitoramento de terapia, assim como para a identificao de recadas na histoplasmose disseminada. Resultados falso-positivos tm sido observados somente em pacientes com blastomicose, paracoccidioidomicose e infeco por Penicillium marneffei, e menos frequentemente em pacientes com coccidioidomicose.


3.4.3. Aspergilose

Nos aspergilomas, os ttulos de anticorpos especficos demonstrados pela reao de fixao de complemento esto geralmente elevados. As bandas de precipitao reveladas pela imunodifuso dupla e contraimunoeletroforese so geralmente mltiplas, podendo ser acima de dez. Aps a remoo cirrgica do aspergiloma ou tratamento adequado, estes anticorpos deixam de ser detectados em pouco tempo. Na aspergilose brnquica alrgica os ttulos de anticorpos especficos so baixos, e na asma aspergilar raramente so demonstrados. Atravs de provas cutneas com aspergilina, pode-se demonstrar reaes de hipersensibilidade do tipo I e III na aspergilose brnquica alrgica, e do tipo I na asma aspergilar. Nas formas invasivas da doena raramente se demonstram anticorpos atravs das provas usuais, necessitando-se o emprego de provas mais sensveis tais como radioimunoensaios e imunoenzimticas. Na imunodifuso dupla e contraimunoeletroforese, podem ocorrer reaes inespecficas devido protena C-reativa do soro do paciente. A eliminao de tal reao inespecfica se faz atravs da lavagem da lmina, em soluo de citrato de sdio a 5% durante trinta minutos.3.4.4. Criptococose

O imunodiagnstico da criptococose se baseia principalmente na demonstrao de antgeno solvel de C. neoformans , (GLUCORONOXILOMANANA) atravs da reao de soro ou lquor com partculas de ltex sensibilizadas com gamaglobulina de coelho antipolissacride capsular. Interferncias, tais como fator reumatoide e efeito prozona podem ser encontradas neste teste, e so facilmente eliminadas com tratamento das amostras com pronase.

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Os reagentes para demonstrao de antgeno solvel so encontrados no comrcio, de procedncia norte-americana, na forma de KIT. Anticorpos podem ser demonstrados na fase inicial e final da criptococose. As provas mais utilizadas para tal propsito, so as reaes de imunofluorescncia indireta e aglutinao de suspenso de clulas de C. neoformans, porm apresentam baixo rendimento.4. Meios de cultura e corantes 4.1. Meios de cultura

Os meios de cultura so preparaes que contm as fontes nutricionais necessrias para o crescimento e multiplicao dos organismos. O cultivo de microrganismos pode ter diferentes propsitos, mas em todos eles o meio de cultura deve suprir as necessidades mnimas para que in vitro se consiga um ambiente semelhante ao que se encontrava o organismo na natureza. Levando em considerao que os nutrientes so unidades estruturais e fontes de energia para a construo e manuteno da estrutura e organizao dos microrganismos, o meio de cultura deve cont-los para que viabilize o seu crescimento. So esses os principais constituintes do meio de cultura: gua: sempre deve ser usada gua destilada para o preparo de meios

de cultura. A gua da torneira de constituio desconhecida, variando especialmente em ons e em pH. Fonte de carbono: necessria para a sntese de numerosos compos-

tos orgnicos que fazem parte do protoplasma. A glicose a principal fonte de carbono utilizada pelos microrganismos.


Fonte de nitrognio: muitos componentes da clula, principalmente as

protenas, contm nitrognio. Minerais: enxofre e fsforo. Elementos de trao: so os minerais que so exigidos em quantidades

mnimas. Exemplos: potssio, magnsio, etc. Fatores de crescimento: um fator de crescimento um componente

orgnico que a clula deve conter para crescer, mas incapaz de sintetizar. Exemplos: aminocidos, purinas, etc. Observao: Para o preparo do meio de cultura, as drogas usadas devem ser de maior pureza. O pH, a temperatura e a aerao devem ser cuidadosamente controlados. Sempre se deve observar o prazo de validade do produto. Os meios de cultura podem ser classificados da seguinte forma: Quanto ao estado fsico Slido: contm gar (agente solidificante) na concentrao de 1,5g

a 3,0g por litro. Semisslido: 0,1g a 1,1g de gar. Lquidos (caldos): ausncia de gar.

Agentes solidificantes: Gelatina: pode ser hidrolizada. mais utilizada hoje em provas

bioqumicas. gar: uma substncia hidrocarbonada extrada de vrias espcies

de algas vermelhas, e imune ao desdobramento pela maioria dos microrganismos. Slica gel: usada quando se deseja cultivar microrganismos autotrficos.

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Quanto composio qumica Naturais ou Complexos: formados por substncias de composio

qumica no definida. Sintticos: quando a composio qumica conhecida e seus com-

ponentes servem para suprir as fontes necessrias de carbono, nitrognio, vitaminas, etc. Quanto ao emprego Meios de enriquecimento: so meios enriquecidos com determina-

dos nutrientes que favorecero o desenvolvimento de determinado microrganismo, entre vrios outros. Meio de manuteno: garante a viabilidade do microrganismo, por

longos perodos, de modo a torn-los disponveis em qualquer experimentao. Meio diferencial: permite ao microrganismo produzir estruturas ou

reaes que podem ser usadas na sua diferenciao entre gneros ou espcies. Meio seletivo: permite o crescimento de um determinado grupo

ou gnero de microrganismo, em detrimento de outros. Os meios de cultura devem ser preparados e esterilizados cuidadosamente, de acordo com o protocolo a seguir: a) Pesagem dos ingredientes Se o meio preparado a partir de seus ingredientes bsicos,

suas massas corretas para o volume desejado devem ser pesadas isoladamente.


Para meios desidratados, pesar a massa correspondente ao volume

desejado. b) Dissoluo dos ingredientes Nunca usar recipientes de cobre ou zinco para dissoluo dos

ingredientes do meio de cultura, usar preferencialmente o balo de vidro, quimicamente limpo. Adicionar ao recipiente contendo os ingredientes uma quantidade

de gua destilada, aproximadamente a metade do volume desejado, agitando constantemente com basto de vidro, e evitando a formao de bolhas; aquecer brandamente. Usar gua destilada temperatura ambiente, no preparo de meios

lquidos. Completar o volume do meio com a gua aps a formao de

suspenso homognea. Isso essencial, principalmente em meios contendo agentes solidificantes. O aquecimento para uma efetiva dissoluo dos ingredientes e

esterilizao do meio deve ser feito no menor tempo possvel. Os meios que contm gar devem ser aquecidos at o seu ponto de ebulio para uma completa dissoluo. Resfriar os meios contendo gar temperatura aproximada de

50 C, reajustar o volume de gua destilada aquecida de 45 a 50 C, se houver perda significativa de gua durante o aquecimento. c) Determinao e ajuste de pH Determinar o pH de meios formulados antes de adicionar o gar. Quando se tratar de meios formulados, se deve aferir 0,2 unida-

des de pH acima do desejado, haja visto que o pH abaixa aproxima-

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damente este valor aps a autoclavao. Nos meios desidratados, no necessrio o ajuste do pH, pois os meios j vm tamponados. Determinar o pH atravs de um potencimetro ou por papel indi-

cador de pH. Ajustar o pH com soluo de cido clordrico (HCl) 0,1N ou

soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 0,1N. d) Distribuio dos meios Distribuir os meios em recipientes, quimicamente limpos e no caso de

meios que no suportem nova autoclavao, usar recipientes estreis. Ao distribuir em frascos de Erlenmeyers ou bales de fundo chato,

evitar ultrapassar 50% do volume total do frasco. A distribuio em placas deve ser de aproximadamente 15mL; 6ml

em tubos para meio inclinado, 5ml para camada alta e 6ml para caldos em geral. A distribuio nos tubos deve ser feita com pipetas; Codificar os meios conforme padro ou conveno do laboratrio;

e) Esterilizao dos meios Com algumas excees, esterilizar os meios em autoclave a 121 C

durante 15 minutos. f) Preparo de gar inclinado em tubos Ao retirar os tubos contendo meio slido da autoclave, inclin-los

apoiando-os num suporte de madeira, permanecendo os mesmos com aproximadamente 1cm de meio na base. Deixar solidificar temperatura ambiente.


g) Plaqueamento de meio de cultivo Fundir o meio slido em banho-maria, resfri-lo em banho dgua,

de modo a evitar ou diminuir a umidade que se condensa na tampa da placa de Petri, quando o gar se solidifica. Flambar a boca do recipiente que contm o meio, antes de

distribu-lo na placa. Prximo chama do bico de Bunsen, verter o meio, levantando

parte da tampa da placa de Petri estril, o suficiente para permitir a introduo da boca do tubo ou outro recipiente que contm o meio, sem tocar as bordas da placa. Pode-se usar uma pipeta para a distribuio. Fechar a placa, moviment-la levemente sobre a bancada para

permitir uma distribuio uniforme, e deixar solidificar temperatura ambiente. h) Armazenamento e conservao dos meios de cultura: Para perodos de tempo prolongados, recomenda-se guardar os

tubos e frascos de Erlenmeyers contendo meio em temperatura de 12 a 15 C. Os meios contendo gar no devem ser guardados abaixo de 0 C para no alterar seu gel. Geralmente possvel sua conservao durante um ou dois meses

temperatura ambiente em locais secos, limpos e abrigados da luz; Identificar todos os tubos, placas ou frascos que contenham meios

de cultura. Para que no haja perda de gua do meio para o ambiente, os

recipientes devem ser bem vedados. No caso de placas de Petri, seus bordos podero ser lacrados com parafilme.

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Lista de meios de cultura mais utilizados em laboratrio de Micologia gar extrato de arroz (Rice extract agar) Meio desidratado gar gua destilada 15g 30g 1000mL

Suspender o p na gua e deixar embeber o gar durante trinta minutos, fundir, distribuir e esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C. Dextrose Peptona gar gua destilada

gar Sabouraud glicosado (Sabouraud glycose agar) 30g 10g 30g 1000mL Misturar todos os elementos em balo, deixar embeber o gar por trinta minutos, levar autoclave e aquecer lentamente 120 C. Agitar e ajustar o pH para 6,5. Esterilizar por quinze minutos a 121 C.

Batata dextrose gar (Potato dextrose agar BDA) Meio desidratado 39g gar 5g gua destilada 1000mL Suspender em gua e deixar embeber o gar por quinze minutos. Aquecer at a dissoluo completa. Esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C.


Mycosel (Mycobiotic) agar Farinha de soja digerida Dextrose Cicloheximida Cloranfenicol Agar gua destilada

10 g 10 g 0,4 g 0,05 g 15 g 1000 mL

Misturar os reagentes. Esquentar agitando frequentemente at dissolver todos os ingredientes. Autoclavar a 118C por quinze minutos. No aquecer de forma excessiva. Para o meio desidratado seguir o mesmo procedimento sem adio do gar. Czapeck dox gar (CZ) Sacarose Nitrato de sdio Fosfato di-potssico Sulfato de magnsio Cloreto de potssio Sulfato ferroso gar gua destilada 30 g 3g 1g 0,5 g 0,5 g 0,01g 30 g 1000mL

Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embeber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,3 antes de esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C. Para o meio desidratado, seguir o mesmo procedimento sem adio do gar. gar infuso de crebro e corao (Brain Heart Infusion agar BHI) Infuso de 200g de crebro de bezerro 7,7 g Infuso de 250g de corao de vaca 9,8 g Proteose Peptona 10 g

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Dextrose Cloreto de sdio Fosfato dissdico gar

2g 5g 2,5 g 20 g

Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embeber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,4 antes de esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C. Para o meio desidratado seguir o mesmo procedimento sem adio do gar. gar dextrose farinha de milho (Corn meal agar CMA) Farinha de milho 40 g Dextrose 20 g gar 20 g gua destilada 1000 mL Colocar a farinha em Becker com gua e aquecer em banho-maria a 60 C por uma hora. Em seguida, filtrar em gaze dobrada duas vezes. Restabelecer o volume inicial com gua destilada. Transferir para balo que j contenha o gar e a dextrose pesados. Esterilizar em autoclave a 121 C por vinte minutos. Para o meio desidratado usar o mesmo procedimento usado no BDA, porm esterilizar a 121 C por vinte minutos. OBS: Quando este meio utilizado para Mucoracea, trocar a dextrose por glicose. Extrato de malte gar (Malt extract agar MEA) Extrato de malte 30 g gar 30 g gua destilada 1000 mL Usar o mesmo procedimento do meio BDA, e ajustar o pH para 7,0.


Sabouraud Glicose Peptona gar gua destilada

30 g 10 g 20 g 1000 mL

Usar o mesmo procedimento do meio Sabouraud glicosado. Meio seletivo para fungos entomopatognicos Farinha de aveia 10 g gar 10 g Sulfato de estreptomicina 0,50 g Dodine 0,45 g Penicilina G 0,20 g Cristal violeta 2,5 mg gua destilada 500 mL

* Soluo estoque de cristal violeta: 0,1g de cristal violeta em 200 ml de gua destilada. *Soluo estoque de antibiticos: 4g de penicilina G e 10 g de sulfato de estreptomicina em 40 mL de gua destilada.Mistura-se aveia e gar em 490 mL de gua destilada; agitase vigorosamente aquecendo at a fervura, adiciona-se Dodine e 5 mL da soluo estoque de cristal violeta enquanto estiver quente, e autoclava-se por vinte minutos. Quando estiver na temperatura de 50 a 55 C, adicionam-se 2 mL de soluo estoque de antibiticos; agita-se bem e distribui-se imediatamente o meio em placas de Petri.

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Farinha de aveia gar (Oatmeal gar OM) Farinha de aveia 60 g gar 12,5 g gua destilada 1000 mL Bater a farinha no liquidificador com um pouco da gua por um minuto. Depois adicionar o gar e a gua e homogeneizar. Esterilizar em autoclave a 121C por vinte minutos. OBS: No utilizar o frasco de Erlenmeyer na medida exata do meio, pois durante a autoclavao, o meio ferve e pode molhar a rolha ou transbordar. Extrato de levedura-peptona-glicose-gar (Yeast extract-peptoneglucose-agar PYGA) Peptona 5g Extrato de levedura 5g Glicose 20 g gar 13 g gua destilada 1000 mL Seguir os mesmos procedimentos usados para Sabouraud glicosado. MP-5 (meio seletivo para fungos aquticos) Peptona 1g Maltose 4g gar 20 g gua destilada 1000 mL Seguir os mesmos procedimentos usados para o Sabouraud glicosado Observao:Todos os meios utilizados no laboratrio de Micologia podem ser acrescidos com antibiticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc.) para evitar o crescimento de outros microrganismos.


Meio de cultura Fava Netto (para antgeno de P. brasiliensis) Proteose peptona n0 3 (Difco) 3g Peptona 10 g Extrato de carne 5g Cloreto de sdio 5g Extrato de levedura 5g Dextrose 40 g gar 18 g gua destilada qsp 1000 mL Fundir o meio em banho maria fervente. Ajustar o pH entre 7,2 e 7,4. Autoclavar a 1200C durante vinte minutos. Meio de cultura - Smith-Asparagina ( para histoplasmina) L-Asparagina 7g Cloreto de amnio 7g Fosfato monocido de potssio 1,31 g Citrato de sdio 0,9 g Sulfato de magnsio heptahidratado 1,5 g Citrato frrico 0,3 g Glicose 10 g Glicerina 25 g gua destilada qsp 1000 mL Dissolver a asparagina em cerca de 300 mL de gua destilada aquecida a 500C. Dissolver os sais separadamente em 25 mL de gua destilada, sendo que o citrato frrico dever ser dissolvido em gua quente. Misturar as solues dos sais com a soluo de asparagina. Homogeneizar. Acrescentar a glicose e a glicerina. Completar o volume com gua destilada. Homogeneizar. Distribuir o meio, pores de 200 mL, em bales de 500 mL. Autoclavar a 1200C durante vinte minutos

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Meio de Cultura Negroni (Filtrado de cultura de P brasiliensis) . Dissolver 60 g de neopeptona em 120 mL de gua destilada aquecida a 45C. Colocar a soluo de neopeptona em tubos para dilise (membranas de celofane) e dialisar contra gua destilada (cerca de 2 litros) durante cinco horas a 70C, e por uma noite em geladeira a 4C. Retirar o contedo do tubo de dilise e completar o volume com gua destilada para 1.800 mL. Adicionar 36g de glicose, 0,18 g de tiamina e 0,36 g de asparagina. Homogeneizar e acertar o pH, que deve ser entre 6.8 e 7.0; Distribuir o meio, pores de 150 mL em frascos Erlenmeyer ou bales de 300 mL de capacidade. Autoclavar a 120C durante 15 minutos. Observao: Todos os meios utilizados no laboratrio de Micologia podem ser acrescidos com antibiticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc), para evitar o crescimento de outros microrganismos.4.2. Corantes

A colorao um meio utilizado em laboratrios de Micologia com o objetivo de visualizar estruturas vegetativas e reprodutivas dos fungos, as formas de leveduras, e realizar testes de viabilidade. As solues utilizadas so:a) Soluo de hidrxido de potssio KOH (soluo clarificante)

Concentraes:

40% - unhas (fneros). 30% - pelos e pele. 10% - pele tenra de criana. 6% - para exame de escarro. 5% - para estudo de Basiodiomycotina e outros fungos.


Frmula (para soluo 30%):

KOH em lentilhas gua destilada Preparo:

30 g 70 mL

Dissolver os dois ingredientes em movimentos giratrios, at a total dissoluo dos componentes. A soluo deve ficar transparente. Armazenar em vidro escuro.b) Lactofenol de Amann com azul de algodo

Usado para tornar mais distintas as estruturas hialinas dos fungos (corante citoplasmtico) Frmula:

cido fnico cido ltico Glicerina gua destilada Azul de Poirrierblau Preparo:

20 g 20 g 40 g 20 mL 0,05 g

Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor. Depois adicionar 0,05g de azul de Poirrierblau. Esperar 24 horas e filtrar. Observao: Para estudar as estruturas de fungos demceos (negros) pode-se utilizar Lactofenol de Amann sem adio de azul de algodo.

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c) Acridine Orange

Corante vital usado para teste de viabilidade que distingue clulas vivas e mortas, onde as clulas vivas adquirem colorao laranja, e as clulas mortas, colorao verde. Frmula:

Acridine orange PBS pH 7,7 Preparo:

0,02 g 100 mL

Dissolver os dois ingredientes e agitar.d) Verde janus B

Usado na diferenciao de clulas vivas e mortas. As clulas vivas permanecem incolor, enquanto as clulas mortas adquirem colorao azul. Frmula:

Verde-janus B gua destilada Preparo:

0,05 g 100 mL

Dissolver os dois ingredientes e agitar.e) Reagente de Melzer

Usado para deteco de reao amiloide ou dextrinoide de esporos, ascas e tecidos himeniais de Ascomycotina e Basidiomycotina, na qual uma colorao azulada determina uma reao amiloide e uma marrom determina uma reao dextrinoide.


Frmula:

Iodo Potssio iodado Hidrato de cloro gua destilada Preparo:

0,5 g 1,5 g 20 g 20 mL

Dissolver os ingredientes e agitar.f) Floxina B

Usada para o estudo do citoplasma de Basiodiomycotina. Frmula:

Floxina B Glicerina gua destilada Preparo:

10 g 75 mL 175 mL

Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor. g) Glicerina 10% Preserva a colorao original do fungo estudado. Frmula:

Glicerina gua Preparo:

10 mL 90 mL

Misturar os ingredientes com leve agitao.

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5. Tcnicas micolgicas 5.1. Diluio seriada

A diluio seriada uma tcnica simples que pode ser usada para vrios propsitos, como: separao de duas cepas fngicas que estejam misturadas em um tubo ou placa (contaminao no tubo ou na placa), contagem de colnias em amostras, isolamento de fungos de substratos lquidos (anlise de gua, leite, etc) e de solo, alm da determinao da quantidade e qualidade de um inculo para processos fermentativos ou inculos lquidos.a) Preparo da amostra

Separao de duas cepas de fungos Fazer uma raspagem com a ala em L na placa ou no tubo onde se encontram as duas cepas a serem separadas no caso de separao de duas cepas de fungos. Este raspado deve ser colocado em um tubo com 10mL de soluo salina a 0,85% e homogeneizar. Isolamento de fungos de substratos lquidos Colocar 2 mL da amostra lquida (gua, leite, etc) em um tubo com 10 mL de soluo salina a 0,85% e homogeneizar. Isolamento de fungos de solo Colocar 1g do solo a ser analisado em um tubo com 10 mL de soluo salina a 0,85% e homogeneizar.b) Diluio da amostra

Utilizando uma srie de dez tubos com 9 mL de salina, colocar no primeiro tubo 1ml da suspenso homogeinizada do primeiro tubo (devese usar uma pipeta para cada transferncia); homogeneizar e transferir


1mL para o segundo tubo; homogeneizar novamente e transferir 1mL para o terceiro tubo. Repetir este procedimento at o ltimo tuboc) Semeadura nos meios de cultura

Preparar uma placa de Petri com o meio de cultura escolhido para cada tubo de diluio. Todas as placas devem ser marcadas com as respectivas diluies. Retirar 0,1mL ou 1mL ( escolha) de cada uma das diluies e transferir para a placa de Petri com a pipeta (deve-se usar uma pipeta para cada diluio) e espalhar na placa com o auxilio da ala de Drigalski. Incubar as placas por, no mnimo, sete dias na estufa a 250C. Aps o perodo de incubao, observar as placas e fazer a contagem das colnias ou no caso de separao das cepas fngicas, observar as placas e retirar a colnia desejada com a ala em L.d) Observao dos resultados Contagem

A contagem de colnias feita a partir da observao das placas e contagem manual das colnias crescidas e quantificao da diluio original, ou seja, quantos condios ou esporos haviam na sua suspenso original. O nmero de condios presentes na suspenso original ser igual ao nmero de colnias multiplicado pelo fator de diluio. Ex: Se na diluio 10-4 obtivemos cinquenta colnias com inculo de 1mL, a concentrao original ser de 50 x 104 = 5 x 105 condios/mL. Se na diluio 10-6 obtivermos 135 colnias com um inculo de 0,1ml, a concentrao original ser de 135 x 106 x 10 = 135 x 107 = 1,35 x 109 condios/mL. Observao: Para a contagem de condios ou esporos em uma soluo tambm podemos usar a Cmara de Neubauer

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5.2. Tcnicas de semeadura e microscopia5.2.1.Semeadura de fungos

Inoculao em placas As tcnicas usadas para inocular fungos em placas so fundamentalmente efetuadas para obter culturas axnicas (culturas puras) e so bem desenvolvidas, j que a identificao de fungos filamentosos baseia-se principalmente nas caractersticas morfolgicas. Procedimento: Flambar a ala ao rubro e esfriar. No caso de a amostra estar em tubo: remover a tampa de rosca ou tampo de algodo do tubo

que contm a cepa, com o dedo mnimo da mo direita, segurando o tubo com a mo esquerda; flambar a boca do tubo, imediatamente antes e depois da

inoculao; No caso de a amostra tambm estar em placa: tomar a placa com a mo esquerda, de modo que a base da

placa fique segura e a tampa possa ser manipulada num movimento de abrir e fechar, com os dedos polegar e indicador; proceder a uma rpida flambagem na placa toda vez que esta

tenha que ser aberta; manipular a placa na altura da chama do bico de Bunsen;


introduzir a ala ou agulha no tubo ou placa de Petri com amostra,

e retirar uma quantidade suficiente do inculo; tomar uma placa, abrir conforme exposto anteriormente e inocular

no centro da placa ou conforme especificaes em trs pontos eqidistantes. Incubao das placas: incubar as placas, invertidas em estufa ou temperatura

ambiente, para evitar que, durante a incubao, a gua de condensao da superfcie do gar, provoque crescimento confluente do organismo, impedindo a formao de colnias isoladas. obedecer aos requisitos fisiolgicos de crescimento do mi-

crorganismo, tais como temperatura ideal de incubao, iluminao, tempo de incubao, etc.Inoculao em tubos ou frascos de Erlenmeyers

A inoculao em tubos ou frascos de Erlenmeyers pode ser feita em meios slidos e lquidos. Apresentam inmeras finalidades de uso. Em todos os casos, tomam-se medidas asspticas durante a inoculao.a) Meio lquido para meio lquido

Quando a cultura estiver em meio lquido e se pretende repic-la para um tubo contendo meio lquido, deve-se usar uma ala de platina ou nquel-cromo em forma de gota, observando-se as condies de assepsia.

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b) Meio lquido para meio slido

Tomar com uma ala em forma de gota um inculo da amostra em

meio lquido. Introduzir a ala sobre a superfcie do gar inclinado, at a base do

mesmo. Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a

superfcie inclinada at da sua extenso. A superfcie inclinada do gar deve ficar voltada para cima, com a mo do operador por baixo do tubo, de modo que a superfcie inclinada possa ser vista sem obstculo.c) Meio slido para meio lquido

Introduzir a agulha ou ala em forma de L estril no tubo que contm

a cultura em gar inclinado e tomar uma pequena quantidade do inculo. Evite carrear pedaos ou fragmentos do meio com o inculo. Imergir o inculo no meio lquido, agitar a agulha suavemente contra a

parede do tubo para ressuspender o inculo. Homogeneizar o meio sob leve agitao.d) Meio slido para meio slido

Tomar com uma agulha ou ala em forma de L o inculo no meio

slido. Introduzir a agulha sobre a superfcie do gar inclinado, at a sua base. Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a

superfcie inclinada, at aproximadamente da sua extenso. O procedimento o mesmo da inoculao de meio lquido para o meio slido.


Incubao dos tubos: preferencialmente todos os tubos com meio slido

devem ficar em posio vertical em estantes ou outros tipos de suporte.6.2.2. Microscopia Exame direto de um pedao da colnia

Com a ala de platina em forma de L ou agulha esterilizada, cortar um pedao da colnia e coloc-lo sobre uma lmina. No se deve raspar a superfcie da colnia, porque apenas os condios sero retirados. Desta forma, em muitos casos possvel identificar o fungo. Colocar uma gota do corante lactofenol de Amann com azul de algodo ou outro corante desejado sobre o pedao da colnia. Se o fungo for muito escuro, substituir o corante por uma soluo clarificante ou uma gota de gua. Cobrir a preparao com uma lamnula, comprimindo-a com o cabo do bisturi ou do estilete. Examinar ao microscpio, com objetivas de 10X, 40X e 100X.Tcnica de cultivo em lmina

Na maioria das vezes, necessrio obter preparaes onde as estruturas do fungo so observadas por inteiro. Isto porque h muitos gneros cujos esporos ou condios por si s no so caractersticos. Neste caso, as estruturas responsveis pela formao e sustentao dos condios ou esporos necessitam ser observadas por completo. Isto nem sempre possvel com a tcnica de exame direto, havendo necessidade de se fazer o cultivo na prpria lmina. Com isto, obtm-se os fungos com suas estruturas intactas.

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Procedimento: Vazar em placa de Petri uma camada fina do meio de cultura adequado

para cada gnero ou espcie de fungos a ser examinado. Aps a solidificao do meio, com o auxlio de um bisturi, cortar

fragmentos de 0,5 cm2. Montar uma placa de 15 cm de dimetro e cobrir o fundo com papel

de filtro e colocar sobre este um basto em forma de U, duas lminas e duas lamnulas. Aps a esterilizao, colocar o quadrado de meio sobre cada lmina; Inocular nos quatro lados do quadrado do meio de cultura, fragmentos

miceliais e/ou esporos. Colocar sobre o meio de cultura a lamnula. Molhar o papel de filtro com gua destilada estril formando uma

cmara mida. Deixar em temperatura ambiente, por aproximadamente uma semana

ou mais dependendo do fungo estudado. Observar crescimento e esporulao. Fixar pelo formol por 24 horas. Montar lminas e lamnulas com corante e observar em microscpio

tico com objetivas de 10x, 40x e 100x.Tcnica da fita adesiva

Esta tcnica d excelentes resultados quando o fungo est sendo cultivado em placa de Petri. Na maioria das vezes, suas estruturas aparecero inteiras, como no cultivo em lmina.


Procedimento: Cortar um pedao de fita adesiva um pouco menor do que a lmina e

coloc-lo sobre a colnia, com a cola para baixo. Comprimir com a ala de platina em forma de L para que o fungo cole

na fita. Colar a fita sobre o corante na lmina. Observar ao microscpio tico com objetivas de 10X, 40X e 100X.Cultivo sob lamnula

O objetivo desta tcnica a observao das microestruturas vegetativas e reprodutivas do fungo mais intactas. Procedimento: Inocular em uma placa de Petri, contendo 20 mL de meio de cultura

especfico para o gnero a ser identificado, fragmentos do fungo em trs pontos equidistantes entre si, e sobre cada um destes colocar uma lamnula de 24x32mm, previamente flambadas em bico de Bunsen. Aps sete dias de crescimento, as lamnulas sobre os pontos de

inculo devem ser retiradas do interior da placa, com auxlio de uma pina, previamente flambada. As lamnulas devem ser colocadas invertidas sobre lminas contendo uma gota de Lactofenol de Amann com azul de algodo. Observar ao microscpio ptico com objetivas de 10X, 40X e 100X.

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Tcnicas para estudo de Ascomycotina

Procedimento: O uso de um microscpio estereoscpico (lupa) indispensvel para

o exame do material. Seces verticais no corpo frutfero do fungo estudado podero ser

feitas com auxlio de uma gilete ou bisturi. A maioria das lminas para posterior observao ao microscpio ptico

montada normalmente em gua para medio dos ascosporos e observao de sua colorao, o reagente de Melzer s tambm devendo ser usado para o estudo dos anis apicais das ascas. O estudo destes fungos em meio de cultura tambm deve ser feito

para que se conhea o seu anamorfo. Isto poder ser feito atravs da tcnica de isolamento de ascoporos (single ascospore isolation).Tcnica para estudo de Basidiomycotina

O material montado em KOH a 5%. O reagente de Melzers tambm usado para os esporos de fungos

Agaricceos. Impresso de esporos: Uma das mais importantes caractersticas que permite o agrupamento dos gneros em sees a colorao dos basidisporos em massa, ou seja, a impresso de esporos. Procedimento: Selecionar um corpo frutfero fresco e maduro e cortar sua haste junto

ao pleo.


Colocar o pleo sobre uma folha de papel de duas cores (preta e

branca) com as lminas ou poros para baixo. Cobrir o pleo e o papel com papel encerado, cristalizador ou com

uma campnula. Se o corpo frutfero do fungo estiver em boas condies, a impresso de seus esporos poder ser obtida em uma hora.5.3. Coleta e isolamento de fungos ambientais

Observaes quanto ao complexo fungo-substrato so de grande valia por ocasio de qualquer coleta. Deve-se notar que as estruturas mais visveis de um fungo no representam, necessariamente, o seu todo. Alm disso, grande parte de seus ciclos ou remanescentes estruturais podero estar perdidos no interior do substrato. Desta forma, conclui-se que a amostra que se coleta de um fungo, na verdade no passa de um momento do seu ciclo biolgico. As partes mais evidentes, nos fungos, representam em geral, aquelas que mais resistem ao manuseio e ao tratamento para secagem. As condies ideais para o estudo dos fungos residem no isolamento dos organismos a partir de diferentes substratos, e nos diversos ambientes em que os fungos ocorrem: solo, ar, gua ou mesmo na vegetao. Independente do espcime a ser coletado, alguns materiais gerais devem ser providenciados para as coletas: * altmetro * fsforo ou isqueiro * jornal * caderneta de campo * lupa de mo * lpis * mochila ou cesta * mquina fotogrfica * canivete ou esptula * papel indicador de pH * faca afiada * saco plstico * fita crepe * saco de papel * fita mtrica ou trena

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A. Solo

Considera-se o solo um mosaico de micro-habitats devido a sua grande complexidade, longe de ser um simples amontoado de matria inorgnica sem vida. Ao contrrio, o solo costuma ser rico em microbiota e mesofauna, o que fora o pesquisador a usar tcnica ou substncias especiais quando pretende isolar um grupo definido. O mtodo de diluio o mais usado para se estudar a incidncia de fungos em solos. O material, ao ser coletado, deve ser colocado em latas esterilizadas ou em sacos plsticos. As amostras destinadas anlise devem ser manipuladas com o auxlio de uma esptula ou colher, parcialmente esterilizadas com algodo embebidos em lcool ou com auxlio de uma lamparina. De preferncia, o perodo entre a coleta de material e as diluies, no deve ultrapassar quatro horas. Procedimento: Tomam-se 10g de cada amostra de solo e coloca-se em frascos de

Erlenmeyer contendo 90 mL de soluo salina esterilizada. Agitar vigorosamente (soluo 1:10 - mesmo princpio da diluio seriada porm em maiores propores). Desta suspenso, pipeta-se 1mL e adiciona-se a tubo contendo 9 mL

de soluo salina esterilizada, aps agitao (soluo 1:100). Retira-se ento outro 1mL desta ltima soluo e coloca-se em um

novo tubo contendo tambm 9 mL de soluo salina esterilizada, sempre aps agitao (soluo 1:1000). Por fim, se necessrio, a mesma operao anterior pode ser repetida, e

uma alquota de 1 ou 0,1mL plaqueada em um meio de cultura apropriado. Em geral, usa-se gar Sabouraud acrescido de antibitico (cloranfenicol, estreptomicina ou penicilina).


Aps sete dias, faz-se o isolamento dos fungos, repicando-se as

colnias para tubos de ensaio contendo meio slido. Aps o desenvolvimento das colnias, procede-se identificao

genrica-especfica dos fungos. A coleta de substratos orgnicos, como folhas, frutos, razes e troncos em diferentes estdios de decomposio tambm interessante. Estercos de herbvoros devem ser coletados frescos, com uma esptula grande e acondicionados em sacos plsticos. Importante lembrar que as regras de assepsia parcial e etiquetagem (local de coleta, data, condies ambientais e substrato) so idnticas para qualquer coleta, e devem receber ateno especial. O mtodo da placa de solo consiste em se colocar, com uma esptula, quantidades pequenas de solo em uma placa esterilizada, evitando os torres de terra. Verter ento o meio de cultura com antibitico (sugere-se a utilizao do meio de MARTIN, com rosa-bengala e sulfato de streptomicina) e deixar solidificar. Para o isolamento de fungos de substratos orgnicos pode-se utilizar o mtodo de presso de folhas. Este consiste em se pressionar com uma pina uma folha sobre a superfcie do meio de cultura com antibitico, retirando-a em seguida. A placa, ento, deixada temperatura ambiente, observando-se diariamente o crescimento das colnias. Outra opo seria plaquear amostras de substratos (folhas, galhos, insetos, etc), cortadas com bisturi em pequenos pedaos. Deposita-se de uma a trs amostras equidistantes sobre o gar, umedecendo-as levemente com gua esterilizada. Se a amostra for de insetos muito pequenos, coloc-los intactos.

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B. Fungos macroscpicos

Existe uma variao muito grande de fungos macroscpicos, de consistncia diferente. Alguns se decompem logo aps serem coletados, outros so mais resistentes. De qualquer modo, cuidado e bomsenso tornam-se necessrios para o sucesso de uma coleta. Os materiais comumente usados so: Cristalizador. Folha de papel dupla face (branca/preta), para coleta de esporos. Frascos de vidro escuros com fixador lcool a 5%. Papel de filtro ou algodo.

No caso de o substrato ser esterco de herbvoros, preparar um cristalizador contendo papel de filtro embebido em gua e glicerina (para no ressecar rapidamente), antes de introduzi-lo no recipiente. Tampar, ento, deixando o conjunto temperatura ambiente e ao abrigo do sol, porm com iluminao. Impedir o ataque de inseto ou outros artrpodes e observar o crescimento macroscpico dos fungos. Nas coletas, deve-se retirar o material por inteiro com o auxlio de uma faca ou esptula, cuidadosamente, para evitar quebra ou esfarelamento. Se possvel, trazer parte do substrato junto. Aconselha-se no misturar materiais diferentes em um mesmo saco a fim de evitar a mistura de esporos. Ao transport-los para outro lugar, acomod-los na mochila ou cesta, protegendoas com folhas de jornal. Amostras delicadas podem ser coladas no fundo de uma caixa de fsforos. Durante as coletas, anotaes sobre cor, textura e tamanho do material coletado devem ser feitas, pois na maioria dos casos os fungos tm suas caractersticas alteradas depois de secos.


C. Ar atmosfrico

O ar representa um repositrio natural, sob a forma de esporos, dos mais diversos tipos e grupos de fungos. O isolamento depende do local, do tempo de exposio e do substrato empregado. A coleta de ar pode ser realizada de duas formas: 1. Com um amostrador de ar por impactao - Nestes amostradores h um compartimento onde colocada uma placa de Petri com o meio de cultura escolhido e quando o amostrador ligado, a placa recebe todo o ar puxado em um volume determinado por dez minutos. Ao trmino, essas placas so incubadas a 250C por sete dias. As colnias so contadas e repicadas para tubo de ensaio e deve-se ento proceder identificao dos fungos isolados. 2. Expondo as placas de Petri com meio de cultura escolhido, por cinco, dez ou quinze minutos ao ar atmosfrico no ambiente selecionado, incubando em seguida a 250C por sete dias. Repicar as colnias para tubo de ensaio e proceder identificao dos fungos isolados.D. gua

Fungos aquticos Em ambientes aquticos, encontramos tanto fungos zoospricos como tetraradiados (no zoospricos). Os primeiros so realmente adaptados ao ambiente aqutico, pois possuem esporos flagelados mveis. O segundo grupo, sem flagelos, apresenta esporos de forma radiada, com trs ou quatro braos partindo de um mesmo ponto, ou ainda sigmides ou ovalados. Esta morfologia concede maior facilidade de flutuao, disperso e aderncia ao substrato.

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Os fungos aquticos podem tambm ser encontrados no solo, graas formao de estruturas de resistncia que lhe permitem sobreviver at que condies de umidade favorveis se estabeleam. Para observao destes fungos, torna-se necessria a coleta de amostras de gua e solo, s quais adicionam-se iscas especiais. Assim, o material para a iscagem : cido clordrico a 1%. Frasco de 100ml, de boca larga e tampa. Hidrxido de potssio a 2%. Hipoclorito de sdio a 10%. Iscas como: asa de insetos, celofane, ecdise de cobra, exoesqueleto

de camaro, folha de gramnea descorada ou fervida, frutos (ma, jabuticaba, etc), gro de plen do Pinus, gravetos e sementes (cnhamo, Crotalaria sp.). Papel alumnio. Papel encerado. Saco de tela de nilon ou lata.

A iscagem pode ser realizada no campo ou no laboratrio. importante salientar que a transparncia do material ir determinar sua eficincia como isca. De preferncia, os frascos devem ser esterilizados. Para fins taxionmicos, este requisito passa a ser obrigatrio. No momento da coleta da gua, juntar ao pote gravetos ou folhas que estiverem nas proximidades. Uma vez no laboratrio, transferir uma parte do coletado para placas de Petri esterilizadas, adicionar as iscas e deixar temperatura ambiente. Com o desenvolvimento das colnias, entre 48 e 72 horas, procede-se ao isolamento da cultura pura, utilizando o meio MP-5. Aps o crescimento em meio slido, retirar um pequeno quadrado de 1x1cm da parte mais perifrica da colnia, colocando-o em uma placa esterili-


zada com gua destilada estril e duas a trs metades de sementes de cnhamo. Decorridas 48 horas, o material deve estar pronto para ser observado diretamente ou montado em lmina. Todos os substratos que portarem crescimento micelial devem ser separados, lavados em gua destilada e recolocados em placas contendo novas amostras do mesmo substrato com gua destilada esterilizada renovada. Em lmina, pode-se observar os flagelos colocando-se uma a duas gotas de Karo na montagem, a fim de diminuir a mobilidade dos zosporos. Para as espcies que dificilmente ocorrem neste tipo de iscagem, recomenda-se a submerso de frutos, gravetos ou folhas dentro de latas perfuradas ou bolsas de nilon. Estas devem ser amarradas com fio plstico e, de preferncia, protegidas da observao pblica. Aps duas ou trs semanas, este material deve ser retirado e lavado em gua corrente por cerca de trinta minutos, para a remoo de detritos, bactrias, protozorios e pequenos invertebrados. Se os fungos estiverem presentes, pstulas esbranquiadas aparecero na epiderme do fruto, as quais devero ser observadas.

5.4. Preservao de fungos

Culturas microbianas so extremamente vulnerveis e podem se contaminar, mutar ou morrer. Muitas vezes, culturas so insubstituveis, e sua perda pode ser muito grave. Outras vezes ela pode ser reisolada ou adquirida de uma coleo de culturas. Em qualquer um dos casos, tempo, informao e dinheiro so desperdiados, mas isto pode ser evitado ou minimizado com um sistema eficiente de preservao de linhagens. Esta uma das funes mais importantes de uma coleo de culturas. A preocupao central a preservao de linhagens com suas caractersticas originais durante um longo perodo de tempo. Novas espcies, mutantes, organismos portadores de plasmdeos e linhagens produzidas por engenharia gentica devem ser preservadas, de forma

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a manter as suas propriedades. Assim, essencial que colees de culturas executem pesquisas no intuito de definir tcnicas de preservao apropriadas. importante frisar que no existe nenhum mtodo universal para uma preservao adequada a todos os microrganismos. Grupos taxonmicos de microrganismos, e at linhagens dentro da mesma espcie, variam quanto a sua resposta aos diferentes mtodos de preservao.Mtodos de preservao

Estes mtodos tm como objetivo manter as culturas num estado vivel sem mudana morfolgica, fisiolgica ou gentica. Para se obter um bom resultado na aplicao de um mtodo de preservao, a cultura deve estar em timas condies, deve-se respeitar as condies timas de crescimento, temperatura, umidade, aerao, iluminao e meio de cultivo.A. Repique

gar

O mtodo mais tradicional de preservao de culturas atravs da transferncia peridica da cultura (repique) para um novo meio de cultivo slido ou lquido. O intervalo entre cada transferncia varia com o microrganismo, o meio de cultivo empregado e as condies ambientais. A maioria dos fungos pode crescer em BDA ou EM, contudo, alguns tm requerimentos especiais de crescimento. O perodo de tempo entre as transferncias varia de fungo para fungo. Para alguns, a cada duas ou quatro semanas, a maioria a cada dois a quatro meses, enquanto outros podem sobreviver 12 meses sem transferncia. Trs condies devem ser determinadas quando se usa este mtodo para preservao de microrganismos:


Meio adequado para manter as culturas. Temperatura ideal de estocagem. Frequncia entre as transferncias. Preservao sob leo mineral

Muitas espcies de fungos podem ser preservadas por meses ou anos atravs de um mtodo relativamente fcil e simples, que o de imerso em leo mineral. O leo deve ser esterilizado por aquecimento em um forno Pasteur a 170C por uma ou duas horas ou autoclavagem dupla por quinze minutos a 121C. Deixar crescer a cultura em meio apropriado. O repique pode ser feito em gar inclinado ou no. Aps um crescimento adequado, colocar assepticamente o leo mineral estril sobre a superfcie da cultura a uma altura aproximada de 1 a 2cm (quando a cultura estiver em gar inclinado, cobre-se completamente a superfcie). Isto impede a desidratao e reduz a atividade metablica, assim como a velocidade de crescimento do microrganismo, devido reduo da tenso do oxignio. Guardar as culturas com leo mineral na posio vertical. Fazer testes de viabilidade periodicamente para determinar se a cultura est deteriorando. Blocos de gar em gua

O mtodo consiste em cultivar o microrganismo em uma placa de Petri contendo um meio de gar apropriado. Aps o crescimento vigoroso o gar cortado com uma lmina estril em blocos de aproximadamente 4 a 6 mm. No caso de fungos, a partir do final do crescimento das colnias, um nmero apropriado de cubos transferido assepticamente para tubos ou frascos con-

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tendo 10 a 15 mL de gua destilada estril. Para reativao, basta retirar assepticamente um dos cubos e deposit-los sobre um meio adequado, a sua aplicao fica restrita a microrganismos que tenham grande aderncia ao gar, como no caso de fungos filamentosos e algumas leveduras.B. Secagem

Secagem em areia, solo e slica-gel

Tambm considerada como um bom mtodo de conservao de microrganismos. Pode ser uma simples secagem de esporos ou secagem sob vrias condies, como, por exemplo, em secador com ou sem vcuo. Para tanto, emprega-se a seguinte linha de trabalho: Preparar o tubo para estocagem (pode ser de tampa rosquivel ou frascos de penicilina), enchendo-o at com gel (slica-gel purificada, sem indicador, 6-22 mesh), depois esterilizar no mnimo durante trs horas a 180C (calor seco), e colocar em atmosfera seca para seguir em banho de gelo overnight. Fazer uma suspenso de esporos em leite frio desnatado (5%). Derramar a suspenso fria sobre a slica gelada e depois levar para um banho de gelo, pelo menos durante quinze minutos. Deixar os gis temperatura ambiente (25 a 30C) dentro de dessecadores at que, com a agitao, os cristais sejam separados (cerca de uma a duas semanas ou dois a trs dias para fungos de crescimento rpido). Armazenar os tubos em dissecadores em sala fria ou recipientes com slica em geladeira (4C), embora bons resultados possam ser obtidos temperatura ambiente.


Armazenamento em solo estril

A preservao de fungos em solo estril, pode ser feita de duas maneiras: pela inoculao de uma suspenso de esporos; pela inoculao de esporos secos em solo seco ou em substrato

similar, com subseqente estocagem do material seco. O mtodo de estocagem em solo empregado consiste em inocular 5g de solo (20% de umidade e esterilizado pelo menos duas vezes a 121C por quinze minutos) com 1mL de suspenso de esporos em gua, com subsequente crescimento durante cerca de dez dias temperatura ambiente. O armazenamento dever ser feito de preferncia em refrigerador a 5C.C. Liofilizao (freeze-drying)

A liofilizao, ou freeze-drying um dos mtodos mais econmicos e eficientes de preservao a longo prazo. O mtodo permite a produo de grande nmero de liofilizado porque o uso de ampolas pequenas facilitam a estocagem. Enquanto o procedimento da liofilizao relativamente simples, o aspecto terico bastante complexo, pois a liofilizao envolve a remoo de gua de uma suspenso de microrganismos congelados por sublimao sob presso reduzida, isto , a gua evaporada sem passar pela fase lquida (passagem do estado slido para o estado gasoso). As clulas secas podem ser estocadas por longo perodo, se mantidas longe de oxignio, umidade e luz. Elas podem a qualquer hora ser facilmente re-hidratadas e ativadas. A liofilizao pode ser realizada de vrias maneiras, pois vrios tipos de aparelhos foram desenvolvidos

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