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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ Pró – Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias MORFOMETRIA DO TRATO GENITAL MASCULINO: INFLUÊNCIA DO PLASMA SEMINAL OBTIDO EM ÉPOCA SECA OU CHUVOSA SOBRE ESPERMATOZÓIDES CAPRINOS Ana Cláudia Nascimento Campos Fortaleza – CE 2003

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Pró – Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Faculdade de Veterinária

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

MORFOMETRIA DO TRATO GENITAL MASCULINO: INFLUÊNCIA DO

PLASMA SEMINAL OBTIDO EM ÉPOCA SECA OU CHUVOSA SOBRE

ESPERMATOZÓIDES CAPRINOS

Ana Cláudia Nascimento Campos

Fortaleza – CE

2003

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Pró – Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

MORFOMETRIA DO TRATO GENITAL MASCULINO: INFLUÊNCIA DO PLASMA

SEMINAL OBTIDO EM ÉPOCA SECA OU CHUVOSA SOBRE ESPERMATOZÓIDES

CAPRINOS

Ana Cláudia Nascimento Campos

Fortaleza – CE

2003

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Pró – Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Faculdade de Veterinária

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

MORFOMETRIA DO TRATO GENITAL MASCULINO: INFLUÊNCIA DO PLASMA

SEMINAL OBTIDO EM ÉPOCA SECA OU CHUVOSA SOBRE ESPERMATOZÓIDES

CAPRINOS

Ana Cláudia Nascimento Campos

Tese apresentada à Faculdade de Veterinária da

Universidade Estadual do Ceará, como

requisito parcial para a obtenção do grau de

Doutor em Ciências Veterinárias

Área de concentração: Reprodução

Orientador: Dr. José Ferreira Nunes

Fortaleza-CE 2003

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C198m Campos, Ana Cláudia Nascimento Morfometria do trato genital masculino: influência do

plasma seminal obtido em época seca ou chuvosa sobre os espermatozóides caprinos/ Ana Cláudia Nascimento Campos – 2003

85p.; 28 cm Orientador: José Ferreira Nunes Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) –

Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. 1. Reprodução Animal – Ruminante. 2. Caprino I Título

CDD 636.0824

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Pró – Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Faculdade de Veterinária

Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias

Morfometria do trato genital masculino: influência do plasma seminal obtido em época

seca ou chuvosa sobre espermatozóides caprinos

Ana Cláudia Nascimento Campos APROVADA EM 30/04/2003 Banca examinadora:

____________________________ Prof. Dr. José Ferreira Nunes

Orientador __________________________________ _____________________________ Prof. Dr. Abisai de Oliveira Sousa Prof. Dr. Rômulo José Vieira Examinador Examinador _________________________________ _________________________________ Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Moura Co-orientador/ Examinador Examinador

________________________________ Prof. Dr. Arturo Bernardo Selaive Villarroel

Examinador

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Ao meu esposo Daniel Campos de

Barros pelo imenso amor a mim

dedicado e apoio durante a

realização do doutorado e à minha

filha Dâmaris que está para

chegar, meu carinho e amor.

Dedico

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“Procura conhecer o estado das tuas ovelhas, e cuida bem dos teus rebanhos, pois as

riquezas não duram para sempre, nem a coroa de geração em geração. Quando o feno for

removido, e aparecerem os renovos, e se recolherem as ervas dos montes, então os cordeiros

te proverão vestes, e os bodes o preço do campo. Haverá bastante leite de cabras para o teu

sustento e da tua casa e para o sustento das tuas criadas”

Provérbios 26: 23 - 27

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AGRADECIMENTOS

A Deus pelo dom da vida, dando-me assim, a oportunidade de realizar este

trabalho e ânimo para lutar sempre.

Ao Dr. José Ferreira Nunes, professor, orientador e amigo, dedico o meu agradecimento.

Por seu constante incentivo e empenho para que este trabalho fosse realizado, e confiança na minha

capacidade profissional.

À Universidade Estadual Vale do Acaraú, ao Magnífico Reitor Teodoro Soares,

pela liberação para cursar o doutorado, aos colegas do Curso de Zootecnia, meus

agradecimentos também aos colegas de trabalho Fátima Révia Lima, Cláudia Goulart, Ângela

Vasconcelos, Fabianno Cavalcante e João Ambrósio de Araújo Filho pelo incentivo a cursar o

doutorado.

À Universidade Estadual do Ceará pela acolhida, particularmente à Coordenação

do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias.

À Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa, pela bolsa de estudo concedida.

A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias e

funcionários pelos ensinamentos, convivência e colaboração. Em especial às amigas Maria

Audália Carvalho e Emmanuelle Lima de Figueirêdo pela amizade e companheirismo.

Aos meus amigos Jurandir Ferreira da Cruz, Dárcio Ítalo Teixeira, Virgílio

Emanuel Vieira, Marcos Antonio Ferreira e Roberta Costa Ferreira pela imensa amizade que

cultivamos nesses anos de estudo.

Ao meu esposo Daniel Campos, pela compreensão, apoio e dedicação nos momentos

mais difíceis da minha vida, agradeço-lhe com todo o carinho do meu coração.

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RESUMO

Este trabalho teve por objetivos avaliar o efeito da época do ano sobre (1) a morfometria do

trato genital masculino caprino; (2) a adição de plasma seminal (PS) na viabilidade e

morfologia dos espermatozóides epididimários (EE) e (3) a viabilidade do sêmen lavado (L) e

não lavado (NL), resfriado e armazenado a +4oC. (1) Assim, foram coletados 46 e 52 genitais

de machos caprinos na época seca e chuvosa, respectivamente. Os resultados demonstraram

que houve diferença significativa entre os parâmetros mensurados no período seco e chuvoso

(P<0,05), com exceção da vesícula seminal. (2) Espermatozóides foram coletados da cauda do

epidídimo, diluídos, divididos em 7 alíquotas e adicionados de PS. A adição do PS aumentou

significativamente a percentagem de espermatozóides móveis (PEM); algumas morfologias

espermáticas foram influenciadas pelo PS. (3) Foram utilizados 40 ejaculados (20 /seca e 20

/chuvosa). O efeito da presença do PS sobre a motilidade individual progressiva (MIP) e PEM

foi constatado no sêmen L. A época do ano afetou somente à MIP no sêmen L e NL. Uma

degradação significativamente inferior (P<0,02) foi constatada no sêmen L. Concluiu-se que

(1) os parâmetros morfométricos de caprinos SRD da região semi-árida do Nordeste do Brasil

são inferiores aos citados na literatura internacional, provavelmente devido à adaptação; (2)

que o PS exerceu ação sobre a sobrevivência e morfologia espermática, deduzindo-se um

efeito deletério na época seca e benéfico na época chuvosa sobre os EE (3) que o período do

ano e a presença de PS no Nordeste do Brasil não interferem na conservação do sêmen

caprino armazenado a 4oC.

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ABSTRACT

The aims of this study was the effect of time year (1) the biometry from goat male

reproductive; (2) the effect of seminal plasma (SP) on the viability and morphology of goat

epididymal spermatozoa (ES) and (3) cooling and storage at 4oC on the viability of washed

and unwashed semen (1). Thus, 46 and 52 genitals were collected from bucks in dry and rainy

season, respectively. The results showed significant difference between the parameter

measured in dry and rainy season (P<0.05), except from seminal vesicle. (2) The spermatozoa

were collected from the epididymal cauda, diluted, divided into 7 aliquots and added to

seminal plasma. The addition of seminal plasma significantly increased percentage of motile

spermatozoa (PMS); some sperm morphology were affected on SP. (3) We used 40 ejaculates

(20 /dry and 20 / rainy). The effect of the presence of seminal plasma on progressive

individual motility (PIM) was observed for washed semen. The time of semen collection, was

observed only for PIM in both washed an unwashed sperm. A significantly lower degradation

(P <0.02) was observed in washed sperm. We conclude that (1) parameters morphometric

from crioula goat in Northeastern semi-arid Brazil are inferiors to the mentioned in the

international literature, it is probably a process of adaptation; (2) that seminal plasma affected

sperm survival and morphology, being a harmful effect in dry season and beneficial effect in

rainy season on ES and (3) the season of the year and the SP presence in the Northeast of

Brazil does not interfere significantly on conservation of goat sperm stored at 4oC.

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SUMÁRIO

ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS ......................................................................................... 01

INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 02

REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................ 05

1. Anatomia do trato genital masculino de caprinos ......................................................... 05

2. Espermatogênese ......................................................................................................... 06

3. Espermatozóides epididimários .................................................................................... 08

3.1. Alterações adquiridas no espermatozóide durante o trânsito epididimário ........ 09

3.2. Alterações na motilidade espermática ................................................................. 09

3.3. Alterações na composição da membrana plasmática dos espermatozóides ........ 11

3.4. Alterações nas características superficiais da membrana plasmática dos espermatozóides ...................................................................................................................

12

3.5. Alterações da morfologia espermática ................................................................. 13

4. Principais constituintes do plasma seminal e sua ação sobre os espermatozóides durante a ejaculação .............................................................................................................

14

4.1. Principais eletrólitos do plasma seminal e sua importância sobre o metabolismo espermático ....................................................................................................

17

4.2. Proteínas e enzimas do plasma seminal e sua ação sobre os espermatozóides ... 19

4.3. Frutose e ácido cítrico no plasma seminal ........................................................... 20

5. Avaliação da qualidade do sêmen ................................................................................. 22

5.1. Teste de termorresistência ................................................................................... 23

5.2. Atividade de certas enzimas ................................................................................ 24

5.3. Concentração, volume, aparência e movimento em massa ................................. 25

5.4. Morfologia espermática .................... .................................................................. 26

5.5. Teste de habilidade de fertilização dos espermatozóides .................................... 27

5.6. Integridade acrossômica ..................................................................................... 27

6. Conservação do sêmen ................................................................................................. 30

6.1. Conservação do sêmen no estado líquido ............................................................ 32

6.2. Diluidores e constituintes utilizados na conservação do sêmen .......................... 34

6.2.1. Leite ............................................................................................................. 35

6.2.2. Glicerol ........................................................................................................ 35

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6.2.3. Gema de ovo ................................................................................................ 36

6.3. Conservação do sêmen caprino ............................................................................. 37

6.4. Uso da água de coco como diluidor do sêmen dos animais domésticos ............... 38

JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 41

MATERIAL E MÉTODOS

Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso ..........................................................................................................................

42

Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos .......

43

Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de coco e armazenado a 4 oC .........................................................................................

45

RESULTADOS

Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso ..........................................................................................................................

47

Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos .......

49

Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de coco e armazenado a 4 oC .........................................................................................

52

DISCUSSÃO

Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso ..........................................................................................................................

56

Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos .......

58

Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de coco e armazenado a 4 oC .........................................................................................

61

CONCLUSÕES ................................................................................................................... 66

PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 67

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 68

ANEXOS

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ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AAT Aspartato aminotransferase

AF Anormalidade de flagelo

CASA Computer-Assisted Spermatozoa Motility Analysis oC Grau Celsius

Ca++ Íon cálcio

Cl- Íon cloro

cm Centímetros

DC Defeito de cabeça

DPI Defeito de peça intermediária

g Grama

GCD Gota citoplasmática distal

GCP Gota citoplasmática proximal

GPT Piruvato-glutâmico transferase

K+ Íon potássio

LDH Lactato desidrogenase

Mg++ Íon magnésio

mL Mililitros

MIP Motilidade individual progressiva

Na+ Íon sódio

NCD Descondensação da cromatina nuclear

P Probabilidade

PEM Percentagem de Espermatozóides Móveis

PO4-- Íon fosfato

pH Potencial de hidrogênio

sptz Espermatozóides

TDM Taxa de degradação da motilidade

UHT Tratamento ultra térmico

Zn++ Íon zinco

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INTRODUÇÃO

Na região semi-árida do Nordeste do Brasil, os efeitos climatológicos são bem

delimitados, determinando duas épocas: seca e chuvosa, interferindo na disponibilidade de

alimentos, na temperatura e conseqüentemente influenciando a atividade sexual do macho

caprino e ovino deslanado (SILVA & NUNES, 1984). Segundo o COADS – NOA (USA) a

umidade relativa do ar na região metropolitana de Fortaleza na época chuvosa (março – maio)

é de 83% e na época seca (setembro – novembro) é 74%; na região do Inhamuns é de 75% na

época chuvosa e 45% na época seca. A velocidade dos ventos na época chuvosa é 16,9 km/h,

e na seca 30,7 km/h na região metropolitana de Fortaleza. É bem conhecido que temperaturas

elevadas exercem efeitos depressivos na qualidade do sêmen, podendo produzir alterações tais

como: elevação do pH e da percentagem de espermatozóides anormais, diminuição da

motilidade, da concentração espermática, do volume e da percentagem de espermatozóides

móveis (CORTEEL, 1981). Nesse sentido, o sistema termorregulador atua procurando manter

constante a temperatura intratesticular e assim manter a qualidade do sêmen (KASTELIC et

al., 1996). Nas condições semi-áridas, o fator temperatura parece ser o ponto fundamental das

variações quanti-qualitativas do sêmen caprino. A distribuição das chuvas ameniza as

temperaturas e contribuem ainda para uma maior disponibilidade de pastagens que

influenciam diretamente no aspecto nutricional dos animais (NUNES, 1988). A intensidade

pluviométrica no Nordeste brasileiro está diretamente relacionada com a qualidade e

disponibilidade das pastagens para os animais, assim as chuvas interferem indiretamente

sobre o comportamento reprodutivo (NUNES, 1988). O volume do ejaculado, que é uma

conseqüência do aumento de fluidos das glândulas anexas e epidídimo (CORTEEL, 1981)

está sob influência da época do ano, aumentando na época chuvosa (SILVA & NUNES,

1984). A época do ano não afeta de maneira significativa a morfologia espermática na espécie

caprina, entretanto durante o período seco, seus valores estiveram próximos aos índices

limites para um sêmen de boa qualidade (SILVA & NUNES, 1984). Portanto, a má nutrição

traz prejuízos para o processo da espermatogênese e contribui para a má qualidade do plasma

seminal.

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Estudos sugerem que com melhoramento dos níveis de proteína na dieta melhora

as proteínas do plasma seminal, podendo ajudar na regulação das mudanças osmóticas e

capacidade tamponante do plasma seminal, que por sua vez, controla a atividade metabólica

dos espermatozóides (DIETZ & FLIPSE, 1969), sem contudo afetar a capacidade de produção

espermática (EL-AZAB et al., 1998). Estudos realizados no Rio Grande do Sul demonstraram

que a época do ano afetou significativamente a percentagem de espermatozóides anormais e

em menor grau, o volume e concentração espermática, quando os animais são mantidos em

pastagem natural, indicando que esta deficiência deve-se ao manejo alimentar e não ao

fotoperíodo (SELAIVE-VILLARROEL et al., 1985). É bem conhecido que tanto o tamanho

testicular quanto a eficiência da espermatogênese de carneiros estão em níveis elevados

durante a época sexual (fotoperíodo negativo) e que diminuem durante a época não sexual

(fotoperíodo positivo) (COLAS, 1980). Sabe-se também que um dos fatores limitantes na

reprodução caprina é a estacionalidade na produção e qualidade espermática (PÉREZ &

MATEOS, 1996). A amplitude destas variações estacionais varia substancialmente de acordo

com o indivíduo e a raça e representa a sensibilidade de cada animal ou raça aos fatores

ambientais (CORTEEL, 1975). Seria interessante especificar se a intensidade de mudanças

estacionais dentro do processo reprodutivo é mais importante em raças com um curto período

de acasalamento (raças que sofrem muita influência da estacionalidade) do que em animais de

raças que tem uma atividade cíclica anual mais longa (raças que sofrem pouca influência da

estacionalidade) (MANDIKI et al., 1998). A avaliação desta variabilidade é requerida para a

melhor utilização dos animais em um programa de inseminação artificial (MANDIKI et al.,

1998; PÉREZ & MATEOS, 1996).

Esta tese de doutorado teve por objetivos, portanto, comparar a morfometria do

trato genital masculino caprino nas épocas seca e chuvosa e avaliar se a época do ano (seca ou

chuvosa) determina diferenças quanto à qualidade do plasma seminal, com conseqüente

interferência sobre a motilidade, percentagem de espermatozóides móveis e morfologia

espermática.

Com o intuito de uma melhor compreensão dos eventos reprodutivos que ocorrem

no macho caprino nas condições do Nordeste do Brasil, a tese apresentará as seguintes

secções: revisão de literatura, onde serão abordados assuntos relacionados à anatomia do trato

genital masculino do caprino, espermatogênese, espermatozóides epididimários, plasma

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seminal, análise da qualidade do sêmen, conservação do sêmen e diluidores empregados na

conservação das células espermáticas; Material e Métodos; Resultados; Discussão;

Conclusões; Perspectivas e Referências Bibliográficas. Em anexo seguem os artigos

originados dos experimentos de tese.

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REVISÃO DE LITERATURA

1. ANATOMIA DO TRATO GENITAL MASCULINO DE CAPRINOS

O trato genital de caprinos é formado por um par de testículos, epidídimos,

bolsa escrotal, canais deferentes, glândulas anexas, uma uretra, pênis e prepúcio.

Os testículos estão inseridos na bolsa escrotal, apresentam forma ovóide e são

simétricos. Alguns pesquisadores afirmaram que o peso testicular varia segundo a raça, peso

vivo, estação e estado nutricional do animal, pois raças de maior porte tendem a apresentar

testículos mais desenvolvidos (BARIL et al., 1993; VILLAR FILHO et al., 1993). NÚÑEZ

(1993) observou que os pesos testiculares variaram de 150 a 180 g, enquanto NISHIMURA et

al. (2000) estudando caprinos nativos japoneses, com idade entre 12 a 24 meses, encontraram

pesos médios de 126,00 ± 6,3 g. BARIL et al. (1993) citam pesos de 101 g em caprinos

franceses nativos, todavia em raças de maior porte o peso pode variar de 80 – 300 g. O

comprimento testicular de acordo com NÚÑEZ (1993), variou de 7,5 a 11 cm, com largura de

4,7 cm. Nesses aspectos os estudos realizados em caprinos das raças Anglo-Nubiana, Alpina e

Canindé os comprimentos foram 7,75, 7,4 e 7,3 cm, respectivamente (VILLAR FILHO et al.,

1993).

Os epidídimos são compostos de um único túbulo enovelado que se inicia nos

cones eferentes com a função de transportar e armazenar espermatozóides até a ejaculação

(BARIL et al., 1993). Três partes sucessivas podem ser distinguidas: cabeça, corpo e cauda

(HAMAMAH, 1983). No ovino pesam de 20 – 30 g e o túbulo enovelado tem de 50 – 60 m

(THIBAULT & LEVASSEUR, 1991). O canal deferente tem início na cauda do epidídimo e

desemboca na uretra pélvica. Em pequenos ruminantes seu comprimento varia de 45 a 50 cm

(NÚNEZ, 1993).

A bolsa escrotal, na qual são encontrados os testículos, é pendular e conserva os

testículos a 4 à 7oC abaixo da temperatura corpórea. Esta regulação é assegurada por

mecanismos de troca térmica entre o sangue arterial e o venoso no cordão testicular, bem

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como por numerosas glândulas sudoríparas na pele escrotal. A pele também contem alguns

termorreceptores que ativam os mecanismos corporais de termorregulação (MIES FILHO,

1987; BARIL et al., 1993).

As glândulas anexas são constituídas pelas ampolas vesiculares, glândulas

vesiculares, bulbouretrais e próstata. Elas contribuem com a maior parte do volume do

ejaculado (HAFEZ, 1995). As ampolas são dilatações da extremidade uretral do canal

deferente, que também é um lugar de armazenamento dos espermatozóides antes da

ejaculação (BARIL et al., 1993). Nos pequenos ruminantes as vesículas seminais e as

bulbouretrais são bem desenvolvidas em relação à próstata cuja parte externa está ausente e a

interna encontra-se disseminada na uretra pélvica (DELLMAN & BROWN, 1982). Estas

glândulas são de grande importância para a fisiologia do macho caprino, sendo que as

vesículas seminais são androgênicas dependentes, enquanto as bulbouretrais são prolactina

dependentes (NUNES, 1982). As vesículas seminais elaboram a maior parte do plasma

seminal, e estão situadas uma de cada lado da uretra pélvica. As glândulas de Cowper

(bulbouretrais) estão situadas na região caudal da uretra pélvica, dentro do músculo bulbo

esponjoso, sendo muito pequenas e em forma de feijão (DELLMAN & BROWN, 1982; MIES

FILHO, 1987) estas glândulas sintetizam um líquido viscoso e secretam uma enzima

denominada fosfolipase A (NUNES, 1982). A próstata é difusa e não penetra na curvatura

muscular da uretra (DELLMAN & BROWN, 1982).

NUNES (1982) encontrou diferenças significativas entre os pesos das vesículas

seminais nas épocas reprodutiva e não reprodutiva, sendo que os pesos foram maiores na

estação reprodutiva. FERNANDES (1994), em estudos realizados sobre a vesícula seminal

observou que os parâmetros de peso, espessura, largura e comprimento não diferiram entre os

períodos seco e chuvoso. NÚÑEZ (1993) relatou que o comprimento das vesículas seminais

variaram de 2,5 a 4 cm.

2. ESPERMATOGÊNESE

A espermatogênese pode ser definida como um processo altamente coordenado

e cíclico no qual espermatogônias diplóides diferenciam-se em espermatozóides haplóides

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maduros (FRANÇA et al., 1999), ou como um processo cronológico prolongado pelo qual as

células-fonte (espermatogônias) dividem-se por mitose para sua própria manutenção em

número e para a produção cíclica de espermatócitos primários, que por sua vez sofrem meiose

para a produção de células haplóides (espermátides), as quais se diferenciam em

espermatozóides (JOHNSON et al., 2000). De qualquer modo, a espermatogênese efetua-se

nos testículos de modo permanente e contínuo a partir da puberdade (ERICKSON, 1985;

JOHNSON et al., 2000), tendo início quando os níveis hormonais de FSH e LH elevam-se e

ocorre o amadurecimento do eixo hipotâmico-hipofisário-gonádico (THIBAULT &

LEVASSEUR, 1991). No início da puberdade, as células - fonte espermatogoniais começam a

diferenciar-se e a proliferar para formar várias gerações de espermatogônias, marcando o

início da espermatogênese (PARKS et al., 2003).

O processo de espermatogênese consiste de três fases distintas: (1)

espermacitogênese que é a diferenciação e proliferação de células fontes espermatogoniais e

subseqüentemente de espermatogônias geradoras de espermatócitos primários (pré-

leptótenos); (2) meiose que inclui a primeira divisão redutora dos espermatócitos primários

(4N) a espermatócitos secundários (2N) e de espermatócitos secundários em espermátides

(1N) e (3) espermiogênese que é a diferenciação da espermátide em espermatozóide (PARKS

et al., 2003).

A eficiência da espermatogênese é estimada pelo número de espermatozóides

produzidos por grama de parênquima testicular e não é influenciada pela diferença no

tamanho testicular entre os animais (JOHNSON et al., 2000).

O ciclo espermatogênico (ciclo do epitélio seminífero) é uma série de mudanças

em uma dada área (região) do epitélio seminífero entre duas ondas do mesmo estágio (etapa)

de desenvolvimento (THIBAULT & LEVASSEUR, 1991), e a duração de cada ciclo

espermatogênico em caprinos é de 10,6 dias, considerando-se que a duração total da

espermatogênese dura cerca de 4,5 ciclos do epitélio seminífero, a duração da

espermatogênese nessa espécie é de 47,7 dias (FRANÇA et al., 1999).

Após o término da espermatogênese, os espermatozóides testiculares são liberados

das células de Sertoli e em seguida lançados no líquido do túbulo seminífero, onde por meio

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da contração das células mióides dos túbulos seminíferos são transportados para a reti testis e

daí para o epidídimo (THIBAULT & LEVASSEUR, 1991). A degeneração das células

germinativas ocorre ao longo da espermacitogênese, e pode variar com o desenvolvimento

puberal, idade e espécie (JOHNSON et al., 2000). Os espermatozóides provenientes dos

testículos são imóveis e estas células adquirem motilidade potencial durante o trânsito

epididimário (JAISWAL & MAJUMDER, 1998).

3. ESPERMATOZÓIDES EPIDIDIMÁRIOS

Pesquisas realizadas em numerosos mamíferos (do camundongo ao elefante) têm

levado ao paradigma de que o epidídimo desempenha um importante papel na reprodução do

macho pela maturação e armazenamento espermático, bem como transporte a partir dos

testículos (JONES, 1999). Nesse sentido, o epidídimo é essencial para a reprodução normal

dos mamíferos, pois os espermatozóides que deixam os testículos são incapazes de fertilizar o

oócito, adquirindo esta potencialidade durante o trânsito epididimário (AMANN et al., 1993;

MÜLLER et al., 1997; JAISWAL & MAJUMDER, 1998). O mesmo é responsável pelo

transporte, maturação e armazenamento dos espermatozóides possuindo também funções

absortiva e secretora (WHITE, 1973).

Estudos comprovam que se o epidídimo for coletado logo após a morte do animal

e conservado sob condições ótimas de meio e temperatura (4 ºC), os espermatozóides

epididimários podem permanecer viáveis por até dois dias, onde a motilidade e capacidade de

penetração no oócito podem ser mantidas satisfatoriamente (KIKUTI et al., 1998).

Já é conhecido que o trânsito epididimário e a ejaculação são etapas cruciais na

maturação espermática de mamíferos (MÜLLER et al., 1997) e que o gameta masculino está

sob contínuo processo de modificação (THIBAULT & LEVASSEUR, 1991; AMANN et al.,

1993). A maturação dos espermatozóides ocorre no epidídimo; em seguida são misturados

com o fluido seminal durante a ejaculação; expostos ao ambiente do trato reprodutivo

feminino após a ejaculação; envolvidos no microambiente do oócito; e em seguida ocorre a

penetração no oócito e formação do pronúcleo masculino (KVIST, 1980; AMANN et al.,

1993). Ressalta-se ainda que, a célula espermática é altamente polarizada e especializada com

uma estrutura tripartida em cabeça, peça intermediária e cauda (YOSHIDA, 2000). Ela perdeu

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9

sua habilidade de biossíntese, reparo, crescimento e divisão celular na fase final da

espermatogênese (YOSHIDA, 2000).

3.1. Alterações adquiridas no espermatozóide durante o trânsito epididimário

As informações sobre o epidídimo e as mudanças que ocorrem nos

espermatozóides durante sua passagem por este órgão têm sido descritas por diversos autores

(POULOS et al., 1974; DACHEUX et al., 1979; ACOTT & HOSKINS, 1981). Um

espermatozóide é considerado maduro quando ao ser depositado nas vias genitais for capaz de

fecundar um oócito, que por sua vez desenvolver-se-á até o nascimento de um indivíduo

viável (HAMAMAH, 1983). O termo maturação é empregado para descrever o processo

fisiológico pelo qual os espermatozóides adquirem a motilidade e poder fecundante durante

sua passagem pelo epidídimo (HAMAMAH, 1983).

O fluido epididimário que banha as células espermáticas é responsável pela

maturação destas células e o epitélio epididimário deve prover os biocatalíticos ou íons

necessários a este processo (AMANN et al., 1993). As mudanças ocorridas na maturação

durante o trânsito epididimário podem, possivelmente ser devido às alterações bioquímicas e

biofísicas que ocorrem durante este período (AMANN et al., 1993).

Ao longo do epidídimo, os espermatozóides sofrem mudanças quanto à motilidade

(JINDAL & PANDA, 1980; MÜLLER et al., 1997), composição da membrana plasmática,

mitocôndrias, componentes fibrosos e microtubulares da peça intermediária (POULOS et al.,

1974; ATREJA & ANAND, 1985; AMANN et al., 1993), morfologia (JINDAL & PANDA,

1980; MÜLLER et al., 1997), modificação do complexo DNA proteína do núcleo (AMANN

et al., 1993) e modificações das características superficiais (receptores) da membrana

plasmática do espermatozóide (HAMAMAH, 1983; AMANN et al., 1993).

3.2. Alterações na motilidade espermática

Em um estudo sobre a maturação do espermatozóide caprino durante o trânsito

através do epidídimo, JINDAL & PANDA (1980) demonstraram que os espermatozóides da

região da cabeça do epidídimo apresentavam um leve movimento de flagelo; no corpo, o

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movimento era circular e na cauda apresentavam um movimento progressivo. Assim,

mudanças significativas na motilidade progressiva ocorreram entre o corpo e a cauda do

epidídimo.

Cerca de 1% dos espermatozóides da reti testis de carneiros são dotados de

movimento vibratório, esta proporção aumenta no corpo (5%), na cauda do epidídimo (70-

80%) e mantém-se no ejaculado (70-80%) (HAMAMAH,1983). Estes resultados são

similares aos de MÜLLER et al. (1997), que observaram 80% de células móveis no ejaculado

normal de carneiro.

MÜLLER et al. (1997) e JAISWAL & MAJUMDER (1998) demonstraram que na

região da cabeça epididimária os espermatozóides estão praticamente imóveis e na cauda

apresentam um lento movimento progressivo. Do ponto de vista bioquímico, um aspecto

muito intrigante do desenvolvimento da motilidade do espermatozóide é o mecanismo

específico por meio do qual a "proteína de motilidade progressiva" (FMP), sintetizada no

epidídimo, converte a agitação dos espermatozóides imaturos da cabeça do epidídimo em

movimento progressivo coordenado (ACOTT & HOSKINS, 1981). Os mesmos autores

concluíram que a FMP age como um iniciador para ativar os espermatozóides da cabeça a

apresentarem a motilidade progressiva. Estudos posteriores demonstraram que a FMP do

plasma epididimário e o íon bicarbonato têm se mostrado ativos para iniciar a motilidade dos

espermatozóides (JAISWAL & MAJUMDER, 1998).

ACOTT & HOSKINS (1981) sugeriram que o movimento progressivo dos

espermatozóides da cauda do epidídimo independe da FMP, apesar disso, estudos

demonstram que o fluido epididimário é rico em FMP (BAVISTER et al., 1978). Entretanto,

as bases bioquímicas de ação da FMP não são conhecidas (JAISWAL & MAJUMDER,

1998).

Estudos sobre a maturação espermática no epidídimo demonstraram haver

correlação entre a motilidade e a estação do ano, ou seja, a percentagem de células com

movimento progressivo no corpo do epidídimo foi significativamente mais baixa na

primavera do que no outono, demonstrando assim a influência do fotoperíodo (FOURNIER-

DELPECH et al. 1979).

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3.3. Alterações na composição da membrana plasmática dos espermatozóides

POULOS et al. (1974) compararam a composição de fosfolipídeos dos

espermatozóides testiculares e do ejaculado, demonstrando que os espermatozóides

testiculares possuem duas vezes mais fosfolipídeos presentes na membrana plasmática que os

espermatozóides ejaculados.

Alguns estudos demonstraram que a quantidade de fosfolipídeos diminui

significativamente no espermatozóide durante o trânsito epididimário, observando-se assim,

uma menor quantidade de fosfolipídeos nos espermatozóides obtidos na cauda (ATREJA &

ANAND, 1985).

Estudos recentes afirmaram que os fosfolipídeos movem-se entre os folhetos

externo e interno da bicamada da membrana plasmática. Os mesmos autores demonstraram

que a atividade da enzima aminofosfolipídeo translocase e a distribuição assimétrica

fosfolipídica na bicamada são propriedades fundamentais da membrana plasmática dos

espermatozóides do epidídimo e do ejaculado do carneiro (MÜLLER et al., 1997).

POULOS et al. (1974) concluíram em seu trabalho que a maior alteração no

conteúdo e composição dos fosfolipídeos deve-se a três funções: (i) os ácidos graxos ligados

aos fosfolipídeos devem promover a maturação espermática, servindo como uma fonte de

nutrientes em um ambiente relativamente livre de açúcar; (ii) as maiores alterações na

composição de ácidos graxos antes da ejaculação pode conferir propriedades à membrana

espermática que são importantes à sobrevivência no trato reprodutivo feminino; (iii) e

finalmente, a perda de quantidade relativamente importante de ácido araquidônico, um

precursor das prostaglandinas, sugere um possível papel na maturação dos espermatozóides

de ovinos.

O fluido da cauda do epidídimo é capaz de inibir in vitro a reação acrossômica dos

espermatozóides (BAVISTER et al., 1978). A prevenção de mudanças acrossomais dos

espermatozóides no trato reprodutivo masculino são importantes para a preservação da

habilidade fertilizante dos mesmos, pois é necessário que o espermatozóide fertilizante

retenha intacto o acrossoma até que eles estejam em íntima proximidade com a massa celular

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do cumulus oócito (BAVISTER et al., 1978). Assim, os resultados obtidos naquele estudo

indicaram que os componentes bioquímicos distintos do fluido da cauda do epidídimo são

particularmente responsáveis pela inibição da reação acrossômica, para que a mesma ocorra

em momento oportuno (BAVISTER et al., 1978).

Segundo HUNTER et al. (1978), o fluído da cauda do epidídimo contém um

constituinte ainda não identificado que retarda a capacitação espermática.

3.4. Alterações nas características superficiais da membrana plasmática dos

espermatozóides

As propriedades superficiais da membrana plasmática dos espermatozóides

respondem diferentemente ao fluido epididimário, dependendo da espécie animal (DOTT et

al., 1979). As alterações observadas sobre a superfície dos espermatozóides são necessárias

para prolongar a sobrevivência dos mesmos dentro do trato reprodutivo da fêmea, bem como

para expor ou formar sítios de ligação para investimentos do oócito (AMANN et al., 1993).

Ao mesmo tempo ocorrem modificações das membranas acrossômicas e plasmática para

estabilizar as estruturas que isolam o conteúdo acrossômico até o contato com a zona pelúcida

induzir a fusão das membranas (KVIST, 1980; AMANN et al., 1993). Em ovinos, a passagem

dos espermatozóides no epidídimo está associada a modificações na membrana plasmática,

sendo um dos eventos importantes no processo de maturação dos espermatozóides

(HAMAMAH, 1983).

Durante o trânsito epididimário os espermatozóides desenvolvem sítios de ligação

na membrana para a fixação com o oócito, pois o epidídimo assegura a diferenciação de

propriedades da superfície da cabeça do espermatozóide, conferindo-lhe a faculdade de se

fixar in vitro sobre a zona pelúcida do oócito (HAMAMAH, 1983). Esta diferenciação

membranária dos gametas realiza-se sob a influência de uma atividade epididimária regular

do meio (animal não castrado), em parte por via humoral pelos andrógenos de origem

testicular (HAMAMAH, 1983).

A fixação dos espermatozóides à zona pelúcida realiza-se pela membrana

plasmática que cobre a região mais anterior do acrossoma. A capacidade de adesão à zona

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pelúcida é mais fraca nos espermatozóides testiculares; esta capacidade aumenta na cabeça

proximal do epidídimo onde 12% dos oócitos fixam-se e atingem 100% no corpo médio do

órgão (HAMAMAH, 1983).

Durante a maturação epididimária a perda de proteínas carregadas positivamente

ou de seus fragmentos catiônicos pode mudar a conformação e função dessas proteínas

membranárias (SUNDHEY et al., 1995). Os estudos indicam que nos caprinos as proteínas de

membrana tornam-se carregadas negativamente durante a maturação epididimária

(SUNDHEY et al., 1995). Também sugerem que as membranas espermáticas da cauda do

epidídimo diferem daquelas das células testiculares por haver proteínas lipofílicas de 35-170

kDa e proteínas iônicas de 70-130 kDa (SUNDHEY et al., 1995). Estas proteínas podem estar

envolvidas na maturação do espermatozóide e na fusão deste com a membrana do oócito

durante a fertilização (SUNDHEY et al., 1995).

3.5. Alterações da morfologia espermática

Um estudo morfológico dos espermatozóides de duas regiões diferentes do

epidídimo demonstrou que 53% das células da região da cabeça tinham gota citoplasmática

proximal como sinal de imaturidade, enquanto que somente 36% das células da cauda

apresentavam este problema. Em ambos os casos, o número de cabeças isoladas estava abaixo

de 6% (MÜLLER et al., 1997). Segundo JINDAL & PANDA (1980), em caprinos, na região

da cabeça epididimária, cerca de 65,47% dos espermatozóides apresentavam gotas

citoplasmáticas proximais e na cauda 11,20% apresentaram a mesma anomalia. Os mesmos

autores também observaram um aumento gradual na percentagem de espermatozóides com

gotas citoplasmáticas desprendidas, quando os espermatozóides moveram-se da cabeça para a

cauda do epidídimo.

A gota citoplasmática localiza-se próxima ao colo do espermatozóide quando os

mesmos deixam os testículos, e à medida que atravessam o epidídimo, a gota encontra-se,

muitas vezes, na peça intermediária (WHITE, 1973). JINDAL & PANDA (1980) relataram

que as gotas citoplasmáticas movem-se caudalmente ao longo dos espermatozóides à medida

que se deslocam pelo epidídimo, podendo constituir-se um impedimento ao movimento

flagelar normal.

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No sêmen, muitas gotas destacam-se completamente do espermatozóide, entretanto, o

mecanismo envolvido ainda é desconhecido (WHITE, 1973), e normalmente, poucas células

apresentam gota citoplasmática no ejaculado normal (MÜLLER et al., 1997).

Durante o trânsito epididimário foi observado que o comprimento da cabeça dos

espermatozóides caprinos aumentou (JINDAL & PANDA, 1980). Tal fato pode ser atribuído

à formação de pontes de sulfeto que estabilizam a cromatina nuclear durante a passagem pelo

epidídimo (KVIST, 1980).

Em pequenos ruminantes há uma maior proporção de células com anormalidade

morfológica na cauda do epidídimo do que no ejaculado (JINDAL & PANDA, 1980;

HAMAMAH, 1983; MÜLLER et al., 1997). Entretanto, em gatos domésticos há uma alta

proporção de espermatozóides com anormalidade de flagelo no ejaculado, quando

comparados aos espermatozóides obtidos na cauda do epidídimo; tal característica pode ser

atribuída à influência da pressão osmótica quando os espermatozóides são misturados com o

fluido seminal durante a ejaculação (AXNÉR et al., 1998).

4. PRINCIPAIS CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL E SUA AÇÃO SOBRE

OS ESPERMATOZÓIDES DURANTE A EJACULAÇÃO

Por várias razões, a bioquímica do plasma seminal dos mamíferos tem recebido

considerável atenção, seja pela sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial do

espermatozóide ou pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em

órgãos específicos, cujas concentrações são importantes para avaliar a capacidade secretora de

várias glândulas sexuais anexas, as quais dependem da produção de andrógenos pelos

testículos para desempenhar suas funções (MANN, 1974).

Há muito tempo que o sêmen tem sido objeto de intensas investigações

bioquímicas, mas apesar dos consideráveis avanços, os conhecimentos sobre a função do

plasma seminal ainda são obscuros. As modificações que ocorrem após o tratamento in vitro

ocasionam variações do metabolismo e/ou sobrevivência dos espermatozóides. Além disso, a

inexistência de mecanismos de eliminação das células espermáticas mortas submete os

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gametas vivos a uma convivência com os produtos de sua decomposição (CORTEEL, 1980).

SKANDHAN (1981) reconheceu que as alterações de muitos dos componentes do plasma

seminal são responsáveis pela incapacidade de fecundação do gameta.

O plasma seminal contém uma variedade de constituintes bioquímicos, alguns dos

quais são relativamente específicos dentro do mecanismo de regulação da função do

espermatozóide, entretanto as exatas funções destes componentes seminais no controle da

motilidade espermática, ainda não estão bem elucidadas (STREZEZEK et al., 1992). O

contato com o fluido seminal desencadeia eventos preparatórios nos espermatozóides para a

fertilização (MÜLLER et al.,1997), pois os constituintes do plasma seminal são conhecidos

por modular uma variedade de funções espermáticas (CALVETE et al., 1994).

Alguns estudos demonstram haver diferenças na qualidade do ejaculado de

pequenos ruminantes entre as estações do ano em clima temperado (EATON & SIMMONS,

1952; COLAS, 1980; NUNES, 1982; COLAS, 1983; ROCA et al., 1992; TULI & HOLTZ,

1995), e muitos deles atribuíram tais diferenças ao fotoperíodo. Em ovinos, a freqüência de

coleta pode influenciar a composição iônica e a atividade enzimática no plasma seminal, bem

como, os parâmetros espermáticos e produção diária de espermatozóides (KAYA et al.,

2002).

Relatos em várias espécies sugerem que o plasma seminal contenha fatores que

influenciam a fertilidade do macho (AURICH et al.,1996). Estes estudos são geralmente

baseados na comparação do plasma seminal entre machos com fertilidade diferente (AURICH

et al.,1996) ou sobre o isolamento de fatores do plasma seminal que facilitam ou inibem a

capacitação espermática e a fertilização (OLLERO et al., 1997). AURICH et al. (1996)

demonstraram que a adição de plasma seminal de diferentes garanhões afetou a resistência de

espermatozóides em suportar a congelação e descongelação. HENAULT et al. (1995)

demonstraram que a adição de plasma seminal aos espermatozóides da cauda do epidídimo de

touros aumentou a fertilidade, quando comparado à fertilidade dos espermatozóides

epididimários sem a adição do plasma seminal.

Estudos previamente realizados demonstraram haver diferenças entre as

membranas espermáticas dos espermatozóides epididimários e do ejaculado, devido à

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influência do plasma seminal (HENAULT et al., 1995). Estas observações sugerem que

alguns fatores presentes nas secreções das glândulas anexas aumentam a fertilidade de touros

de alta fertilidade ou alguns fatores que inibem a fertilidade estão presentes em animais de

baixa fertilidade (HENAULT et al., 1995). Nesse sentido, as secreções das glândulas anexas

dos touros e eqüinos são fatores determinantes para a fertilidade do macho (HENAULT et

al.,1995; AURICH et al.,1996).

DOTT et al. (1979) demonstraram que a incubação de espermatozóide em altas

taxas de diluição prejudica a motilidade, pois parece possível que haja algum fator essencial

associado à célula para o desempenho da função espermática e que a proximidade das células

é necessária para a provisão de níveis adequados deste fator. Tem sido sugerido que a

presença do plasma seminal de caprinos no meio de conservação interfere no comportamento

dos espermatozóides em suportar a congelação (CORTEEL, 1974).

Talvez a principal razão desse impasse seja devido à grande diversidade do plasma

entre as espécies, ocorrência e concentração de muitos constituintes seminais importantes

(RODGER, 1975). Alguns estudos demonstraram haver ampla variação nos níveis

bioquímicos de muitos constituintes do plasma seminal entre bovinos e bubalinos (DHAMI &

SAHNI, 1993). Esta variação pode ser responsável pelas notáveis diferenças na qualidade,

congelabilidade e fertilidade do sêmen nestas espécies (DHAMI & SAHNI, 1993). Esta

diversidade não é somente encontrada entre as espécies de mamíferos, mas também entre as

raças de uma mesma espécie, como observada em caprinos (EATON & SIMMONS, 1952;

PINHEIRO et al., 1996a). O problema é agravado pela falta de informação e

desconhecimento da fisiologia do espermatozóide in vivo. Estas limitações têm resultado em

contínua identificação de constituintes bioquímicos seminais e especulações sobre o papel de

cada novo constituinte (RODGER, 1975).

4.1. Principais eletrólitos do plasma seminal e sua importância sobre o metabolismo

espermático

Diversos eletrólitos estão presentes no plasma seminal, dentre os mais importantes

foram encontrados Na+, K+, Mg++ (GONZALES et al., 1984; PINHEIRO et al., 1996a); Cl-,

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fosfatos (DHAMI & SAHNI, 1993) e Zn++ (KVIST, 1980). Os níveis de cloreto no sêmen

influenciam o potencial de membrana do espermatozóide e a motilidade em associação com

cátions. Os íons Cl-, Na+ e K+ estão diretamente relacionados com a manutenção da

excitabilidade dos espermatozóides, pH ótimo do sêmen e pressão osmótica constante dentro

e fora das células espermáticas (DHAMI & SAHNI, 1993). Em ovinos, a concentração de

íons Na+, Cl- e PO--4 no plasma seminal excedem àquelas do espermatozóide, enquanto a de

potássio, cálcio e magnésio são maiores no espermatozóide (ABDEL-RAHMAN et al., 2000).

Níveis mais altos de K+ e Ca++ no espermatozóide causam redução na atividade

espermática em ovinos nativos e Merinos. Os dados também sugerem uma relação recíproca

entre o conteúdo intracelular de K+, Ca++ e PO4-- com relação à percentagem de

espermatozóides vivos, onde uma percentagem mais alta de células vivas foram associadas

com altos níveis de K+ e Ca++ e baixa de PO4-- (ABDEL-RAHMAN et al., 2000).

Neste sentido, estudos demonstraram que algumas enzimas têm correlação direta

com o Na+ e K+, como por exemplo, a fosfatase ácida, indicando que a mesma tem importante

papel na atividade eletrolítica do sêmen (DHAMI & KODAGALI, 1987). A elevada

quantidade de íons PO--4 no plasma seminal revela a atividade da fosfatase alcalina em liberar

íons a partir dos processos metabólicos dos espermatozóides (DHAMI & SAHNI, 1993).

PINHEIRO et al. (1996b) constataram que os níveis de Ca++, PO--4 e Mg++ no

plasma seminal do macho caprino podem variar conforme a época do ano (seca ou chuvosa) e

a raça, sugerindo que a disponibilidade e qualidade do alimento entre os períodos chuvoso e

seco, provavelmente influenciam o equilíbrio eletrolítico do sêmen desta espécie. KAYA et

al. (2000) observaram que o aumento na freqüência de coleta de sêmen em ovinos provocou

um aumento significativo na concentração de Na+ e K+ no plasma seminal, todavia os níveis

de Ca++ e Mg++ reduziram marcadamente. No mesmo estudo, observou-se uma redução

progressiva da motilidade das células espermáticas no ejaculado e foi associado com as

concentrações de Na+ e K+.

O zinco é encontrado no próprio espermatozóide e no fluido seminal, onde sua

concentração é consideravelmente maior do que em qualquer outro fluido corporal. No

plasma seminal sua origem principal é a próstata (MANN & LUTWAK-MANN, 1981).

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18

KVIST (1980) demonstrou que a presença do Zn++ no plasma seminal previne a

descondensação prematura da cromatina nuclear, preservando as células espermáticas para o

estágio apropriado da transferência nuclear do genoma do macho, ou seja, o Zn++ espermático

bloqueia a habilidade de descondensação da cromatina nuclear (NCD) do espermatozóide

ejaculado, até este cátion ser removido, em estágios posteriores à transferência do genoma

masculino.

KVIST (1980) sugere que o espermatozóide tem um mecanismo intrínseco para

NCD, o qual é preservado pela inibição temporária do Zn++, podendo ser reativada pela sua

remoção dentro do trato reprodutivo da fêmea. Este estudo também sugere que há uma

correlação direta entre o nível de zinco no fluido seminal e a motilidade do espermatozóide,

ressaltando que pequenas quantidades destes elementos são essenciais para a manutenção da

motilidade espermática. Uma fraca correlação positiva foi encontrada entre a percentagem de

espermatozóides com movimento circular ou movimento progressivo não linear e a

concentração de zinco (HENKEL et al., 1999). Portanto, a motilidade espermática é

significativamente influenciada pelo Zn, pois o Zn flagelar está localizado principalmente nas

fibras densas internas e estes elementos estruturais são quimicamente modificados durante a

maturação espermática epididimária (eliminação do Zn), pois um baixo conteúdo de Zn nas

fibras densas internas após o trânsito epididimário é requerido para realizar o enrijecimento

das mesmas (HENKEL et al., 1999). O enrijecimento das fibras pela formação de pontes

dissulfeto durante a maturação espermática no epidídimo parece ser uma etapa fisiológica

essencial para a geração da motilidade, especialmente a motilidade progressiva (HENKEL et

al., 1999).

A distribuição da maioria dos íons entre a fração espermática e o plasma seminal

poderá promover as bases para a variação da qualidade do sêmen e deverá ser considerada na

interpretação dos resultados obtidos na avaliação da fertilidade de ovinos (ABDEL-

RAHMAN et al., 2000).

4.2. Proteínas e enzimas do plasma seminal e sua ação sobre os espermatozóides

FRAZER & BUCCI (1996) afirmaram que o plasma seminal é composto de

açúcares, lipídios e minerais, bem como de um elevado teor de proteínas especiais, incluindo

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enzimas, hormônios, fatores de crescimento, inibidores, imunossupressores, substâncias

ligadas a andrógenos, inibina e imunoglobulinas, onde a presença ou ausência de muitos

destes componentes pode estar envolvida com a fertilidade.

Estudos demonstraram que alguns componentes do plasma seminal são adsorvidos

sobre a superfície das células espermáticas durante a ejaculação, tais como as proteínas

(CALVETE et al., 1994; OLLERO et al., 1997), pois diversas proteínas estão presentes no

plasma seminal, cuja proporção pode variar entre os indivíduos de uma mesma espécie

(FRAZER & BUCCI, 1996).

Assim também, diferentes variedades de proteínas medeiam a ligação com a

heparina e a superfície espermática em diferentes espécies animais. A possibilidade de que a

maioria das proteínas heparina-ligantes do plasma seminal possa agir como fatores de

capacitação espécie-específico merecem maiores estudos (CALVETE et al., 1994).

Em eqüinos, o aumento da concentração de proteínas no sêmen pouco concentrado

diminui a congelabilidade do mesmo (BITTMAN & KOSINIAK 1992). Em touros, a

estimação dos níveis de lactato desidrogenase (LDH), aspartato aminotransferase (AAT),

fosfatase alcalina, fosfatase ácida e outras enzimas podem ser usadas para avaliar a qualidade,

descongelabilidade e fertilidade do sêmen, podendo assim ajudar na seleção de touros para

uso em inseminação artificial (DHAMI & KODAGALI, 1987). Em ovinos, uma intensa

atividade de coleta de sêmen resulta em um aumento na atividade de AAT e piruvato-

glutâmico transferase (GPT) no plasma seminal. Em contraste com a LDH que teve atividade

reduzida (KAYA et al., 2002).

Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal é indicativo

de dano ou de função alterada na membrana, que ocorre devido, provavelmente, a maturação

inadequada no epidídimo, como conseqüência do aumento da freqüência de coleta (KAYA et

al., 2002). Já a redução da atividade da LDH pode resultar da síntese reduzida no tecido

testicular e pode indicar distúrbios da função do parênquima testicular, bem como mudanças

no metabolismo espermático (KAYA et al., 2002).

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As proteínas do plasma seminal exercem múltiplos efeitos sobre a função

espermática e desempenham um importante papel na capacitação dos espermatozóides,

traduzido por um complexo processo que habilita a célula espermática a penetrar, através da

zona pelúcida, por meio da reação acrossômica (CALVETE et al., 1994).

BITTMAN & KOSINIAK (1992) descreveram que a habilidade fertilizante do

espermatozóide seria, em grande parte, determinada pelas proteínas espermáticas localizadas

no acrossoma e peça intermediária, conhecidas como fonte de enzimas metabólicas

especialmente ativas, cujas liberações em grandes quantidades podem indicar danos na

membrana plasmática do espermatozóide.

Alguns aminoácidos presentes no plasma seminal de ovinos, tais como a taurina e

hipotaurina, parecem ter efeito positivo sobre a fertilidade. É possível que o melhoramento

observado nas características de motilidade de espermatozóides ovinos congelados na

presença da taurina possa ser devido a outros fatores que não sejam suas propriedades

antioxidantes (SÁNCHEZ-PARTIDA et al., 1997).

4.3. Frutose e ácido cítrico no plasma seminal

IBARRA & NAVARIDAS (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como

um marcador das funções das vesículas seminais, sendo necessária à sobrevivência e à

motilidade inicial da célula espermática e que o ácido cítrico reflete a atividade secretora da

próstata, mesmo que sua função ainda não esteja bem conhecida. Todavia, acredita-se que o

ácido cítrico se comporte como um ativador da fosfatase ácida, sendo importante para a

manutenção do equilíbrio osmótico, juntamente com o potássio e o sódio, favorecendo desse

modo a atividade espermática.

O ácido cítrico é um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta

relação com os níveis de testosterona plasmática, ocorrendo em altas concentrações na

maioria das espécies de mamíferos, por constituir-se em um agente regulador necessário em

muitos sistemas bioquímicos, tendo portanto, elevada importância para o metabolismo e

motilidade espermática (POLAKOSKI & KOPTA, 1982).

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21

A formação de frutose na vesícula seminal depende essencialmente de duas vias

metabólicas: uma que deriva da glicose sangüínea e outra que é conseqüência do metabolismo

do sorbitol (MANN, 1974). Esta se constitui num componente seminal importante para o

metabolismo do espermatozóide e seu nível reflete na qualidade espermática, na atividade

metabólica e na função normal secretora da glândula vesicular (DHAMI & SAHNI, 1993).

SINGH & PENBEY (1995), avaliando a correlação existente entre os níveis de

testosterona plasmática com a quantidade de alguns constituintes bioquímicos do plasma

seminal, observaram que altas concentrações do andrógeno, não somente conduziam a uma

melhor demonstração da libido, como também, eram responsáveis pela elevação dos níveis de

frutose e ácido cítrico no sêmen de caprinos. HIROE et al. (1960) afirmaram que a condição

de armazenamento do plasma seminal, a freqüência de ejaculações, o nível de glicose no

sangue e a condição nutricional podem interferir fortemente na produção e metabolismo da

frutose.

ROCA et al. (1993), observando o efeito da variação estacional sobre os níveis de

frutose e ácido cítrico no plasma seminal de caprinos da raça Murciana-Granadina, na

Espanha, constataram uma variação sazonal em ambos componentes do plasma seminal. Os

níveis de frutose e ácido cítrico foram mais altos no verão e outono (dias curtos) e mais baixo

na primavera (dias longos). O inverno foi considerado um período transicional.

PINHEIRO et al. (1996a), com o objetivo de determinar os parâmetros

bioquímicos normais no plasma seminal de caprinos criados no Nordeste do Brasil, em

machos das raças Alpina, Moxotó e mestiços Alpina-Moxotó, observaram que os valores

encontrados para frutose, ácido cítrico e proteína total foram inferiores na época seca.

Entretanto, em ambas as épocas, o tipo racial Moxotó mostrou valores sempre mais elevados,

correlacionando os níveis de frutose e ácido cítrico com a maior disponibilidade de alimento

ocorrida durante a época chuvosa.

5. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO SÊMEN

O método ideal para avaliar a fertilidade do reprodutor, além de sua habilidade de

produzir a gestação, é pelo exame do sêmen (HAFEZ, 1995). A avaliação da qualidade

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espermática geralmente está ligada ao desejo de predizer a fertilidade dos reprodutores para

servirem nos rebanhos ou para serem utilizados em programas de reprodução programada

(MANUAL PARA EXAME ANDROLÓGICO E AVALIAÇÃO DE SÊMEN ANIMAL,

1998).

Por quase um século ou mais, clínicos e pesquisadores têm lutado para desenvolver

técnicas para predizer acuradamente a fertilidade das amostras seminais de um indivíduo

(AMANN & HAMMERSTEDT, 1993). DEN DAAS (1992) e HAFEZ (1995) citam que as

características do sêmen relacionadas à qualidade da população espermática presente na dose

inseminante são motilidade (teste de termorresistência), integridade da membrana, integridade

acrossômica, atividade de certas enzimas, concentração, volume e aspecto do sêmen,

movimento em massa (turbilhonamento), morfologia espermática, habilidade de ligar-se à

zona pelúcida do oócito e capacidade para fecundação in vitro. Nenhum teste único foi

desenvolvido para predizer acuradamente a fertilidade de um ejaculado individualmente, mas

quando vários testes são combinados cuidadosamente, os ejaculados podem ser selecionados

para utilização com potencial de apresentar a mais alta fertilidade (HAFEZ, 1995).

As características do sêmen são avaliadas não somente para predição da fertilidade

do touro ou do suíno, mas também para avaliar o modo de processamento do ejaculado no

laboratório (DEN DAAS, 1992). Um método confiante de mensuração do volume e

concentração do ejaculado é tão importante quanto às características da qualidade do sêmen,

especialmente para a preparação das doses inseminantes (DEN DAAS, 1992). Em ovinos,

uma redução no volume de sêmen, após submissão a um regime de coleta freqüente, indica

uma redução da função secretora das glândulas anexas (KAYA et al., 2002).

5.1. Teste de Termorresistência: Motilidade

A motilidade é rotineiramente avaliada pela estimação visual da percentagem de

células móveis, porém é um julgamento subjetivo (EATON & SIMMONS, 1952; DEN

DAAS, 1992).

Segundo CORTEEL (1981), a percentagem de espermatozóides móveis (PEM) e a

motilidade individual progressiva (MIP) são os parâmetros mais comumente utilizados para

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mensurar a qualidade do sêmen. A MIP refere-se ao vigor ou intensidade de movimentação

linear dos espermatozóides, que é avaliada num escore de 0 – 5, onde zero corresponde à

ausência de espermatozóides móveis e cinco à máxima movimentação progressiva

(CORTEEL, 1974; 1981).

Os espermatozóides precisam de várias horas após a ejaculação ou inseminação

artificial para atingirem o local de fecundação na fêmea (HAFEZ, 1995). Seu poder

fecundante está conseqüentemente, em parte ligado à sua sobrevivência no trato genital da

fêmea (MIES FILHO, 1987). Esta observação tem levado a utilização de testes de

termorresistência à mesma temperatura corpórea da fêmea, in vitro para apreciar a

sobrevivência espermática. As condições de incubação variam com a espécie e com o tipo de

sêmen a testar (fresco ou congelado), mas em caprinos e ovinos, o sêmen é geralmente diluído

em concentração compreendida entre 80 e 300 x 106 sptz/ml, e colocado em banho-maria à 37

– 38oC (MANUAL PARA EXAME ANDROLÓGICO E AVALIAÇÃO DE SÊMEN

ANIMAL, 1998). A percentagem de células móveis e motilidade podem ser calculadas ao

início do teste e 2 – 3 horas após a incubação (BARIL et al., 1993).

Ao sêmen pós-descongelado, têm sido adicionadas algumas metilxantinas, como a

cafeína e a teofilina, que tendem a aumentar a motilidade dos espermatozóides de modo

significativo, mas não aumentam a percentagem de espermatozóides móveis e nem a

anormalidade acrossômica (SINHA et al., 1995). Neste experimento, foi encontrada uma

correlação significativa entre a motilidade após a adição das metilxantinas e a fertilidade

(SINHA et al., 1995).

À medida que a duração de incubação a 37oC prossegue, há o acúmulo de ácido

láctico e o valor de pH tende a diminuir, acidificando o meio. Levando assim, a um declínio

gradual na atividade metabólica. Neste estudo, o tipo de diluidor não pareceu afetar

significativamente o acúmulo de ácido láctico, e sim o tempo de conservação. Estas mudanças

no acúmulo de ácido láctico podem ser atribuídas à presença de flora microbiana no meio

diluidor (SINGH et al., 1982). O problema de contaminação e crescimento bacteriano do

material espermático durante o armazenamento do sêmen resfriado, e particularmente, quando

conservado a 10 –15oC foi amenizado após a descoberta e aplicação de antibióticos

(MAXWELL & SALAMON, 1993).

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5.2. Atividade de certas enzimas

Alguns pesquisadores têm procurado métodos alternativos que apresentem

melhores correlações com a fertilidade que a motilidade. Dentre esses métodos tem surgido o

estudo do extravazamento enzimático de algumas enzimas metabólicas para o meio diluente

do sêmen congelado. Destas enzimas, encontram-se a lactato desidrogenase, a aspartato

aminotransferase, a fosfatase alcalina entre outras. Entretanto, na espécie ovina, até o

momento, os estudos não demonstraram resultados satisfatórios, não possibilitando assim o

uso desta técnica como único indicador da qualidade do sêmen, pois faltam respaldos

científicos que confirmem sua utilização como método alternativo mais eficaz que a análise

da motilidade espermática (PANGAWKAR et al., 1988; BORQUE & AYLLÓN, 1996;

UPRETI et al., 1996). Em algumas espécies como a suína, o nível de acrosina no meio

diluidor, após a descongelação do sêmen tem sido apontada como indicador da qualidade

espermática (GLOGOWSKI et al., 1998).

Há também um método recentemente desenvolvido denominado Computer-

Assisted Spermatozoa Motility Analysis (CASA) que analisa alguns parâmetros de

motilidade: velocidade curvilinear, velocidade média, velocidade linear, linearidade,

amplitude do movimento lateral da cabeça e número de espermatozóides móveis (BAILEY et

al., 1994). Todavia, os mesmos pesquisadores encontraram uma baixa correlação entre a

fertilidade e o CASA. Em caprinos a motilidade parece ser uma característica amplamente

individual, podendo ser afetada pela saúde ou condição do indivíduo no momento da coleta,

bem como pela técnica utilizada na coleta do sêmen (EATON & SIMMONS, 1952).

5.3. Concentração, volume, aparência e movimento em massa

O sêmen deve possuir uma aparência cremosa ou leitosa, com cor amarelada

(marfim), ou esbranquiçada nas espécies caprina e ovina (MANUAL PARA EXAME

ANDROLÓGICO E AVALIAÇÃO DE SÊMEN ANIMAL, 1998), que são indicativos de alta

concentração espermática. Geralmente, animais jovens e aqueles de menor tamanho dentro de

uma espécie produzem menores valores de sêmen (HAFEZ, 1995). Normalmente, o volume

do ejaculado varia de acordo com a espécie animal considerada e, dentro de uma mesma

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espécie, a variação é muito ampla, correndo por conta do indivíduo, da raça, do número de

ejaculações sucessivas, a alimentação etc (MIES FILHO, 1987). Freqüentes ejaculações

resultam em menor volume, e quando dois ejaculados são obtidos consecutivamente, o

segundo usualmente apresenta menor volume (HAFEZ, 1995; KAYA et al., 2002). Volumes

pequenos não são prejudiciais, porém são acompanhados por baixa concentração espermática,

e o número de espermatozóides disponíveis é limitado (HAFEZ, 1995). Em caprinos, o

volume do ejaculado varia de 0,2 a 2,0 mL (MIES FILHO, 1987).

Uma determinação acurada do número de espermatozóides por mililitro de sêmen

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5.4. Morfologia espermática

O sêmen da maioria dos machos apresenta alguns espermatozóides anormalmente

formados (HAFEZ, 1995). Nesse aspecto, a morfologia espermática tem sido identificada

como uma das características que podem ser usadas na predição da fertilidade espermática,

(BUENDÍA et al., 2002), assim a avaliação da qualidade do sêmen tem que considerar que a

competência funcional é determinada por vários fatores. A avaliação do estado morfológico e

motilidade do espermatozóide é indicação crucial de sua capacidade fertilizante (BLOTTNER

et al., 2001). A morfologia espermática, especialmente da cabeça, tem recebido considerável

atenção em relação à habilidade do espermatozóide em alcançar uma fertilidade normal

(AZIZ et al., 1998). Em caprinos o índice de anormalidade máxima permitida que não

interfira na fertilidade é 15% (MANUAL PARA EXAME ANDROLÓGICO E

AVALIAÇÃO DE SÊMEN ANIMAL, 1998).

As alterações morfológicas do espermatozóide podem atingir as diversas partes

constituintes como por exemplo, o acrossomo, núcleo, colo, peça intermediária, flagelo, e em

alguns casos, tomar duas ou mais partes da célula simultaneamente (MIES FILHO, 1987).

Estas alterações morfológica dos espermatozóides podem ser primárias, secundárias ou

terciárias (HAFEZ, 1995). As anormalidades primárias são devido à falha da

espermatogênese, enquanto que as secundárias ocorrem durante a passagem pelos epidídimos,

àquelas que ocorrem durante ou após a ejaculação são designadas anormalidades terciárias

(HAFEZ, 1995). COLAS (1980) classifica as anormalidades em: cabeças anormais

(microcefalia, cabeça piriforme, acrossoma danificado), cabeça sem flagelo, gota

citoplasmática proximal, gota citoplasmática distal, e anormalidade de flagelo (flagelo curvo,

quebrado, peça principal enrolada até antes da peça intermediária ou enrolada sobre a

intermediária). E quando um mesmo espermatozóide apresenta duas anormalidades, somente

a anormalidade mais grave é reconhecida (COLAS, 1980).

5.5. Teste de habilidade de fertilização dos espermatozóides

Os procedimentos-padrão para a análise de sêmen (concentração, morfologia e

motilidade espermática) são indicadores relativamente pobres da capacidade fertilizante dos

espermatozóides (HAFEZ, 1995). O método mais comumente utilizado é o teste do Hamster,

onde a avaliação da fertilidade espermática é baseada na penetrabilidade do espermatozóide

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dentro da zona pelúcida do óvulo de hamster (HAFEZ, 1995). Outro teste descrito é a

inchação hipo-osmótica (HOS), baseado na avaliação da integridade funcional das membranas

espermáticas (CURRY & WATSON, 1994; HAFEZ, 1995). A manutenção da integridade da

membrana é importante devido à incapacidade dos espermatozóides em assegurar ou restaurar

a membrana celular quando ocorre dano na mesma. CURRY & WATSON (1994) sugerem

que diferenças na sensibilidade da membrana plasmática para o transporte de água entre as

espécies, e a existência de subpopulações sensíveis de espermatozóides de uma mesma

espécie, podem ser fator importante na determinação da crio-sobrevivência ótima do

espermatozóide. Rotineiramente, o uso do corante eosina ou um teste hipo-osmótico são

usados para avaliar a membrana espermática (DEN DAAS, 1992).

5.6. Integridade acrossômica:

O acrossoma é um lisossoma essencial para a função da célula espermática. A

reação acrossômica tem ocorrido no local de fertilização e é desencadeado pela condição local

ou ligação específica do espermatozóide à zona pelúcida (DEN DAAS, 1992). A reação

acrossômica está associada com múltiplos locais de fusão entre a membrana externa

acrossômica e a superfície da membrana plasmática, seguida por fenestrações da membrana e

formação de vesículas ligada à membrana sobre toda a superfície acrossômica (VARNER et

al., 1993). Após a reação acrossômica o conteúdo enzimático dos lisossomas é liberado (DEN

DAAS, 1992). A fertilização requer um número suficiente de espermatozóides

morfologicamente normais, motilidade espermática com a habilidade de reação acrossômica à

zona pelúcida e a cromatina intacta para o desenvolvimento do pro-núcleo após a penetração

do oócito (BLOTTNER et al., 2001).

A relação entre as características laboratoriais do sêmen e a fertilidade tem

freqüentemente demonstrado inconsistência. Uma das razões é que muitos estudos têm sido

desenvolvidos com um número definido de espermatozóides por inseminação (taxa de

diluição), pois a fertilidade é afetada pelo número de espermatozóides (DEN DAAS, 1992).

Tais alterações na taxa de diluição devem revelar uma diferente relação entre a característica

em questão e a fertilidade (DEN DAAS, 1992).

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O sucesso em predizer a fertilidade é dificultado pelos aspectos (1) do

espermatozóide, (2) do processo de fertilização e (3) do acesso para avaliação in vitro da

qualidade espermática. A compreensão dos elementos “causa - problema” de cada aspecto é

necessária para a avaliação dos melhores procedimentos da análise espermática (AMANN &

HAMMERSTEDT, 1993).

(1) Para ter sucesso um espermatozóide necessita expressar ou suprimir

adequadamente, um número de atributos na seqüência temporal correta para alcançar a

fertilização. Alguns atributos são conhecidos como, por exemplo, morfologia aceitável,

metabolismo para a produção de energia, motilidade progressiva, capacidade para motilidade

hiperativada, membrana lipídica, proteínas de membrana e integridade das enzimas

acrossômicas, e outras que ainda permanecem desconhecidas (AMANN &

HAMMERSTEDT, 1993). Um ou mais atributos podem limitar a fertilidade de uma dada

célula, tais como o fator limitante dependente no espermatozóide, como os espermatozóides

são coletados e avaliados, e como os espermatozóides são utilizados (AMANN &

HAMMERSTEDT, 1993).

(2) Fertilização é um evento probabilístico relacionado com a presença de um

espermatozóide suficientemente fértil perto de um ovócito. Há duas probabilidades para a

capacidade fertilizante: i. que em cada espermatozóide, todos os atributos essenciais sejam

expressos no momento e local corretos; ii. que em cada população espermática total, deva

existir uma dada percentagem de células com potencial fertilizante completo (AMANN &

HAMMERSTEDT, 1993).

Um espermatozóide com atributos fertilizantes únicos que fecundem um ovócito e

seus aspectos probabilísticos, não refletem a população média de atributos. Os atributos

necessários para a fertilização dependem da metodologia adotada na fecundação in vitro, da

natureza do armazenamento e do local de deposição do sêmen na inseminação artificial, a

técnica de acasalamento empregada, como a monta natural, e de fatores próprios da fêmea. A

correta expressão de poucos atributos espermáticos é requerida na fecundação in vitro e a

inseminação artificial pode reduzir ou eliminar certas interações restritivas entre o ambiente

espermático e feminino (AMANN & HAMMERSTEDT, 1993). O uso preferencial de

espermatozóides da cauda do epidídimo que aqueles do ejaculado, espermatozóides

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criopreservados que aqueles frescos, ou inseminação artificial intrauterina no lugar da

intracervical geralmente afetam o resultado de fertilidade (AMANN & HAMMERSTEDT,

1993).

(3) Toda amostra seminal contém uma população heterogênea de espermatozóides.

Nem todas as células espermáticas em uma população possuem o mesmo potencial

fertilizante, algumas são precoces ou tardias, considerando-se que outras nunca adquirem o

potencial fertilizante ou morrem antes do oócito está viável (AMANN & HAMMERSTEDT,

1993). Esta probabilidade facilita o sucesso na fertilização em mamíferos onde a passagem

através do trato reprodutivo da fêmea e possivelmente uma espera de vários dias são

requeridas antes da expressão do atributo final da função espermática incluindo ligação ao

oócito, penetração e provisão de um pro-núcleo masculino (AMMAN et al, 1993).

As provas tradicionais para a avaliação da qualidade espermática ignoram esta

heterogeneidade sendo, portanto, seriamente prejudicadas (AMANN & HAMMERSTEDT,

1993).

A avaliação in vitro ideal da qualidade espermática deveria qualificar

simultaneamente várias centenas ou preferencialmente, milhares espermatozóides em uma

dada amostra de uma série de atributos representando diferentes aspectos requeridos para a

fertilidade (AMANN & HAMMERSTEDT, 1993).

As mais importantes motivações biológicas e econômicas para a avaliação da

qualidade espermática são identificar machos com uma alta probabilidade de fertilidade

reduzida ou determinar se a fertilidade de um macho é aumentada ou diminuída (AMANN &

HAMMERSTEDT, 1993). Estas propostas para avaliação da qualidade espermática in vitro

têm sido e continuarão sendo importantes para a andrologia (AMANN & HAMMERSTEDT,

1993).

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6. CONSERVAÇÃO DO SÊMEN

A inseminação artificial tem permanecido como o principal veículo para uma

rápida dispersão de genes e tem sido o método de escolha por criadores de todo o mundo para

melhorar a qualidade genética de seus rebanhos (VISHWANATH, 2003). Em bovinos

leiteiros, este constante nível de progresso genético é primariamente devido a avanços na

tecnologia do sêmen e à rápida aceitação da inseminação artificial para a difusão de genes

favoráveis na população bovina (VISHWANATH, 2003). Assim também, o constante

aumento da população mundial tem levado a uma contínua demanda para melhorar o nível

dos rebanhos (VISHWANATH, 2003).

O sêmen fresco diluído permanece viável por um período limitado de tempo (DE

PAUW et al., 2003a). Ao contrário de sua limitada vida in vitro os espermatozóides podem

permanecer viáveis por várias semanas quando armazenados na cauda do epidídimo

(SETCHELL et al., 1993). Em bovinos, o sêmen no estado líquido pode ser usado como um

método alternativo para a inseminação artificial em relação ao sêmen congelado-

descongelado, na condição que seu potencial fertilizante possa ser mantido por um mínimo de

dois dias e preferencialmente por quatro dias, podendo também ser facilmente transportado e

utilizado em local distante da coleta (VISHWANATH & SHANNON, 2000).

Nos últimos anos, a tecnologia de conservação do sêmen tem sido desenvolvida e

muitas pesquisas têm sido realizadas para prolongar a viabilidade in vitro e a fertilidade

potencial do sêmen líquido armazenado, pela alteração ou redução do metabolismo catabólico

espermático ou pelo aumento da estabilidade da membrana às injúrias térmicas ou outras

injúrias ambientais (FOOTE & PARKS, 1993; BATELLIER et al., 2001). Todavia, até o

momento nenhum melhoramento importante tem sido feito para aumentar a fertilidade

potencial do espermatozóide mais do que 3 – 5 dias, quando eles são armazenados em

ambiente líquido à altas taxas de diluição e à temperatura ambiente (SHANNON, 1997).

A conservação do sêmen geralmente requer uma redução ou parada do

metabolismo dos espermatozóides, prolongando assim a vida dos mesmos (SALAMON &

MAXWELL, 2000; YOSHIDA, 2000).

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A importância da preservação de fontes genéticas para este milênio é amplamente

reconhecida, considerando-se que a conservação de sêmen terá maior contribuição com

aplicação potencial na pecuária, biotecnologia, conservação das espécies e medicina clínica,

os seguintes itens deverão ser destacados:

1. Troca (importação/ exportação) internacional de linhagens genéticas;

2. Conservação de sêmen manipulado (seleção sexual);

3. Conservação de linhagens genéticas superiores ou raça em via de extinção ou

linhagens transgênica (estabelecimento de um banco genético);

4. Suprir reserva em resposta à doenças-calamidades ou na coleta de sêmen

humano antes de quimioterapia ou radioterapia, coletando espermatozóides de forma não

fisiológica (epididimário ou testicular) e

5. Preservação de espécies ameaçadas de extinção (YOSHIDA, 2000).

A necessidade do uso de reprodutores por longos períodos ou em diferentes épocas

do ano estimula a pesquisa sobre armazenamento de sêmen sob condições artificiais

(SALAMON & MAXWELL, 2000). A combinação da temperatura de armazenamento,

composição química do diluidor e o controle higiênico são fatores-chave que afetam a

sobrevivência espermática (YOSHIDA, 2000). BATELLIER et al., (2001) afirmaram que o

sucesso no resfriamento e armazenamento do sêmen depende de múltiplos fatores, tais como:

a temperatura de armazenamento, composição do diluidor, taxa de diluição, número de

inseminações etc.

6.1. Conservação do sêmen no estado líquido

A tecnologia de resfriamento do sêmen é de grande interesse por ser capaz de

manter o sêmen fértil por 1 – 3 dias e por permitir o transporte (BATELLIER et al., 2001).

Entretanto, quando o sêmen é armazenado a baixas temperaturas, deve se ter

cuidado para não submeter os espermatozóides ao choque térmico (SALAMON &

MAXWELL, 2000), pois a preservação eficiente das células espermáticas com boa habilidade

fertilizante é de grande importância para a conservação do sêmen (YOSHIDA, 2000).

CHANTLER et al. (2000) mostraram que a separação dos espermatozóides do plasma

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o estresse oxidativo (BATELLIER et al., 2001). De fato, as células espermáticas são

caracterizadas por sua capacidade incomum de gerar metabólitos oxigênio- reativos, que

causam peroxidação lipídica, especialmente durante a sobrevivência espermática

(SALAMON & MAXWELL, 2000; BATELLIER et al., 2001). Altos níveis de peroxidação

lipídica da membrana plasmática podem modificar grandemente a fluidez da membrana,

levando a modificações dramáticas na permeabilidade da membrana e morte celular

(BATELLIER et al., 2001). Os eventos acima são acompanhados pelo declínio no transporte

e sobrevivência dos espermatozóides no trato reprodutivo e redução da fertilidade

(SALAMON & MAXWELL, 2000; BATELLIER et al., 2001).

É possível que o processo de armazenamento líquido antecipe a maturação das

membranas espermáticas, aumentando então a proporção de células espermáticas capacitadas

e com acrossomas reagidos (SALAMON & MAXWELL, 2000). Espermatozóides

capacitados têm viabilidade reduzida e vida fértil limitada (SALAMON & MAXWELL,

2000) ou podem conferir incapacidade de fertilização se eles envelhecerem no trato

reprodutivo das fêmeas após inseminação cervical (MAXWELL & WATSON, 1996). É

portanto, provável que cuidados com resfriamento e reaquecimento do sêmen possam evitar

os problemas associados com o choque térmico sem comprometer os resultados de análise do

sêmen (CHANTLER et al., 2000).

Um aumento na pressão osmótica tem influência sobre a integridade da membrana

espermática, pois leva a uma desidratação celular, com conseqüente dano na membrana (DE

PAUW et al., 2003a). Os estudos também têm demonstrado que a idade do espermatozóide in

vitro leva a uma grande incidência de injúrias na mitocôndria do que no DNA nuclear (DE

PAUW et al., 2003a).

A concentração espermática também influencia grandemente a sobrevivência dos

espermatozóides, pois concentrações muito elevadas diminuem a sobrevivência espermática

(DE PAUW et al., 2003a). Além disso, a inexistência de mecanismos de eliminação das

células espermáticas mortas, submete os gametas vivos a uma convivência com os produtos

de sua decomposição (CORTEEL, 1980). Espermatozóides bovinos ejaculados e armazenados

preservam a integridade da membrana mesmo em concentrações mais baixas (DE PAUW et

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al., 2003a). Sugerindo que houve uma redução na quantidade produtos metabólicos tóxicos ou

por uma exaustão mais lenta dos substratos a altas diluições (DE PAUW et al., 2003a).

6.2. Diluidores e constituintes utilizados na conservação do sêmen

Embora a frutose seja o único carboidrato simples presente no plasma seminal de

pequenos ruminantes, o espermatozóide também metaboliza glicose e manose quando estes

açúcares são incluídos no diluidor de armazenamento (SALAMON & MAXWELL, 2000).

Nenhum outro açúcar age como fonte de energia, mas vários tipos de açúcar tem sido

examinada por sua habilidade em preservar a motilidade espermática (SALAMON &

MAXWELL, 1993). Muitos investigadores usam glicose e frutose como componentes dos

diluentes. Alguns açúcares (sacarose e lactose) podem agir somente extracelularmente para

manter a pressão osmótica do diluente e integridade da membrana das células espermática

durante o armazenamento (SALAMON & MAXWELL, 2000).

Quase todos os trabalhos concentram o uso de tampões orgânicos, baseando-se que

estes têm melhor capacidade tampão, e que fosfato ou citrato não são tóxicos para as células

vivas, podendo penetrar na célula espermática agindo, desse modo, como tampão intracelular

contra mudança no pH, ou aumentando a tolerância da célula a um incremento intracelular de

cátions monovalentes (SALAMON & MAXWELL, 2000). Tampões orgânicos oferecem

aumento na tonicidade total do diluente, que é importante quando o sêmen é armazenado

(SALAMON & MAXWELL, 2000).

6.2.1. Leite

O leite integral, desnatado ou líquido tem também sido utilizado por muitos anos

como diluidor do sêmen caprino e ovino (SALAMON & MAXWELL, 2000; CORTEEL,

1974). O sucesso deste diluidor tem sido atribuído a sua fração protéica, que pode agir como

um tampão contra mudanças no pH e como um agente quelante contra a presença de metais

pesados (SALAMON & MAXWELL, 2000). Ele pode proteger parcialmente os

espermatozóides durante a redução da temperatura de armazenamento. O leite bovino tem

sido preferível ao leite de outras espécies (SALAMON & MAXWELL, 2000). Todavia, o

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leite é um fluido biológico com uma composição complexa (mais de 100.000 moléculas) e

contém componentes que podem ser benéficos ou deletérios para a sobrevivência espermática

(BATELLIER et al., 2001). Além do mais, a concentração do componente protetor do leite

pode ser otimizada para melhorar o armazenamento do sêmen por longo período a

temperaturas positivas (BATELLIER et al., 2001).

Nos últimos anos, o leite conhecido comercialmente como longa vida (tratamento

ultra térmico – UHT) tem sido aprovado satisfatoriamente como diluidor do sêmen fresco e

também pela manutenção da viabilidade do espermatozóide durante o estado líquido

(SALAMON & MAXWELL, 2000).

6.2.2. Glicerol

O glicerol é a substância protetora mais comumente usada nos diluidores para a

congelação do sêmen. Assim, para a congelação do sêmen pelo método convencional lento, o

uso principalmente de diluidores hipertônicos (adição de glicerol), fez com que muitos

pesquisadores observassem que a concentração ótima de glicerol seria entre 6 – 8%

(SALAMON & MAXWELL, 2000).

O glicerol pode ser adicionado ao sêmen em uma fração diluente separada (2a

etapa – diluição) ou pela simples adição do diluidor contendo glicerol (uma etapa)

(SALAMON & MAXWELL, 2000).

6.2.3. Gema de ovo

A gema de ovo é um constituinte comum dos diluentes de sêmen, protege os

espermatozóides contra o choque térmico e confere proteção durante a congelação e

descongelação (SALAMON & MAXWELL, 2000).

Já foi demonstrado que a adição de gema de ovo ao diluidor teve efeito benéfico

sobre a percentagem de espermatozóides móveis no sêmen ovino, principalmente após rápido

resfriamento do sêmen de 10 e 5oC (FISER & FAIRFULL, 1986). Todavia, alguns estudos

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indicam que a fração lipoprotéica de baixa densidade da gema de ovo é a fonte comum de

proteção do espermatozóide ovino contra os efeitos do armazenamento a +5oC (WATSON &

MARTIN, 1975). Os fosfolipídios da fração lipoprotéica da gema de ovo favorecem a

proteção da membrana da célula espermática (WATSON, 1981). Já a proteína da fração

lipoprotéica da gema de ovo serve para solubilizar o lipídio e ligá-lo à membrana da célula

(WATSON, 1981). Mais recentemente, MOUSSA et al. (2002) demonstraram que a fração

lipoprotéica da gema de ovo possui efetiva propriedade crioprotetora sobre os

espermatozóides congelados-descongelados de touros, pois melhor motilidade espermática foi

obtida com a adição da gema de ovo.

A ação de revestimento espermático em menos de 5 minutos com a gema de ovo

durante a diluição tem um importante efeito sobre várias características após quatro dias de

armazenamento em uma solução salina simples com pH 6 e 300 mOsm/ Kg (DE PAUW et

al., 2003a), já que melhoramentos foram realizados pela proteção adicional do

espermatozóide durante o armazenamento em meio contendo gema de ovo (DE PAUW et al.,

2003b).

Uma grande taxa de concentração de gema de ovo tem sido examinada em

diluentes para a congelação do sêmen ovino (SALAMON & MAXWELL, 2000). Os

trabalhos iniciais utilizaram 30-50%, mas subseqüentemente, os investigadores incluíram uma

taxa mais baixa de concentração no diluente (SALAMON & MAXWELL, 2000).

Avanços na tecnologia reprodutiva e melhor compreensão da fisiologia

reprodutiva dessas populações animais são necessárias para permitir a aplicação de técnicas

reprodutivas assistidas (YOSHIDA, 2000).

6.3. Conservação do sêmen caprino

Um dos principais problemas que tem interferido na expansão e aplicação da

inseminação artificial em caprinos é a qualidade do sêmen congelado, pois o processo de

congelação diminui a viabilidade das células espermáticas. Além disso, a presença de

fosfolipase A (IRITANI & NISHIKAWA, 1964) e possivelmente, lisofosfolipase (ATREJA

& ANAND, 1985) no sêmen caprino, catalisa a hidrólise de lecitinas em lisolecitinas

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produzindo ácidos graxos livres (SNOW, 1985). As lisolecitinas, devido a sua ação detergente

sobre os lipídios da membrana plasmática, e os ácidos graxos são considerados tóxicos aos

espermatozóides (NUNES, 1982). Em adição, a lecitina é o fosfolipídio majoritário nas

membranas plasmáticas dos espermatozóides e está contida na gema de ovo, sendo portanto,

substratos perfeitos para a ação hidrolítica da fosfolipase (ROY, 1957).

ROY (1957) relatou a ação do plasma seminal sobre os elementos dos diluidores,

no caso, a gema de ovo, mesmo estando a baixas concentrações como 2,5%. No entanto, um

estudo sobre os fosfolipídios, antes e depois da congelação, revelou que os lipídios da gema

de ovo adicionados ao sêmen diluído não foram hidrolisados a lisofosfolipídeos e ácidos

graxos livres (CHAUAN & ANAND, 1990). Dentro deste contexto, desenvolveram-se linhas

de trabalho que preconizam a remoção do plasma seminal mediante centrifugação em solução

tampão (CORTEEL, 1974), em associação ao uso da gema de ovo no diluidor (TREJO et al.,

1987) ou em ausência de gema de ovo (CORTEEL, 1977).

RITAR & SALAMON (1982) demonstraram que a gema de ovo a uma

concentração de 9% no diluidor de sêmen caprino não lavado causou coagulação do meio

com morte dos espermatozóides após 24 h de incubação a 37oC. Os mesmos autores

demonstraram que concentrações maiores que 1,5% deprimiram a sobrevivência espermática

no sêmen não lavado após a descongelação.

A conservação do sêmen por períodos curtos é dependente da redução reversível

da motilidade e da atividade metabólica dos espermatozóides a baixas temperaturas

(MAXWELL & SALAMON, 1993; MACHADO & SIMPLÍCIO, 1995). No entanto, a

estocagem do sêmen refrigerado em diluidores à base de citrato – gema ou leite desnatado não

deve exceder oito horas, pois a partir deste momento mais de 50% da motilidade é perdida

(SAHNI, 1987) e a capacidade fecundante do sêmen resfriado decresce enormemente.

6.4. Uso da água de coco como diluidor do sêmen dos animais domésticos

A água de coco proveniente de um fruto com seis meses de idade apresenta

osmolaridade em torno de 500 milliosmoles e pH em torno de 4,5 a 5, que devem ser

corrigidos para a sua utilização como diluidor do sêmen (NUNES, 1987).

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A água de coco também tem sido muito utilizada em biotecnologias relacionadas à

reprodução animal. Excelentes resultados têm sido obtidos com a utilização da água de coco

em estudos de preservação de sêmen de animais domésticos como caprinos (SALLES, 1989;

NUNES, 1998), ovinos (CRUZ, 1994), suínos (TONIOLLI & MESQUITA, 1990) e caninos

(SILVA et al., 1998). Entretanto, até o momento, não se tem o domínio dos protocolos de

conservação do sêmen, os quais utilizam a água de coco como diluidor do sêmen.

Muitas dificuldades têm sido encontradas, particularmente com a congelação de

sêmen de caprinos. É conhecido que durante a estação não sexual, em clima temperado, o

plasma seminal deprime fortemente a motilidade individual e a percentagem de

espermatozóides móveis, colhidos, congelados na estação sexual e descongelado na estação

não sexual (NUNES, 1982).

NUNES et al. (1982) demonstraram que esse efeito deletério do plasma seminal da

estação não sexual provém das glândulas bulbouretrais que durante essa estação tornam-se

hipertrofiadas e secretam grandes quantidades de fosfolipases do tipo A. Esta enzima age

sobre os fosfolipídios dos diluidores levando à formação de lisolecitinas e ácidos graxos, que

exercem ação tóxica sobre os espermatozóides. Esse efeito é exacerbado quando há interação

entre as enzimas fosfolipases e fosfolipídeos presentes no meio diluidor como o leite, e

plasma seminal, respectivamente. Foi demonstrado que a congelação do sêmen caprino

diluído em leite, contendo acima de 10 mg de fosfolipídios, causou a morte total dos

espermatozóides (NUNES et al. 1982). Portanto, diluidores pobres em fosfolipídeos poderiam

ser a solução evitando ou reduzindo os efeitos negativos causados pela fosfolipase A sobre o

sêmen de animais desta espécie (NUNES, 1987).

De acordo com NUNES (1987) a fertilidade de cabras inseminadas com sêmen

diluído em água de coco é superior àquela do leite.

Visando isolar a fração que atua sobre os espermatozóides, NUNES et al. (1994)

promoveram o fracionamento da água de coco, utilizando uma coluna de Sephadex G-25, a

um comprimento de onda de 210 nm, verificando quatro piques de saída, e recuperados em 60

tubos, sendo que o pique observado entre os tubos 20 e 30 corresponde à fração B, da qual

isolaram uma molécula pertencente ao grupo das auxinas, o ácido 3-Indol-Acético, substância

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com atividade hormonal estimuladora de crescimento de vegetais, a qual demonstrou

atividade sobre o metabolismo do espermatozóide. A adição do ácido 3-Indol-Acético (IAA)

na composição dos diluentes convencionais de sêmen de diferentes espécies confere aos

espermatozóides um incremento na motilidade, aumentando a taxa de fertilidade, além de

permitir sua conservação durante períodos mais longos (TONIOLLI et al., 1995).

Tem sido observado que o IAA tem efeito benéfico sobre a integridade

morfológica do acrossoma do espermatozóide suíno, mas parece que outras moléculas

presentes na água de coco também participam desta atividade (TONIOLLI et al., 1996).

CRUZ (1994) obteve uma fertilidade significativamente superior com o uso de

sêmen preservado por 48 horas a +4oC em meio contendo o JYP - molécula ativa da água de

coco (40,74%) quando comparado com sêmen em meio à base de leite (14,81%). A

estabilização da água de coco tanto em forma líquida, como na forma de gel, facilitaria seu

emprego, assim como a sua difusão em trabalhos de inseminação artificial, tornando-se

fundamental no processamento do sêmen caprino (NUNES, 1988).

A água de coco poderá sofrer alterações em sua composição de acordo com o

estágio de maturação do fruto, ou ainda referente à variedade da planta (LAGUNA, 1996),

sendo de fundamental importância o seu estudo A utilização da água de coco proveniente de

frutos de diferentes idades, sobre a qualidade in vitro e a fertilidade do sêmen caprino poderá

contribuir de forma significativa para o entendimento de protocolos experimentais que

utilizarem a água de coco, recomendando-se assim, a sua estabilização ou padronização.

Atualmente, alguns estudos têm sido realizados com o desenvolvimento da água de coco em

pó, que é um produto mais estável, por apresentar pH e osmolaridade bem regulados

(SALGUEIRO et al., 2002).

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JUSTIFICATIVA

Alguns estudos realizados na região semi-árida do Nordeste do Brasil

demonstraram não haver diferenças significativas na qualidade espermática entre a época seca

e chuvosa (SILVA & NUNES, 1984). Entretanto, a pouca diferença encontrada tem sido

atribuída quase que exclusivamente ao fator alimentação, ou seja, a carência alimentar no

período seco diminui a qualidade dos ejaculados, todavia os estudos não têm levado em

consideração se alguns componentes do plasma seminal podem aumentar ou diminuir seus

níveis, exercendo ou não ação benéfica sobre os espermatozóides.

Questiona-se se em clima tropical semi-árido em latitude sul, o plasma seminal

possa exercer o mesmo efeito deletério sobre os espermatozóides, como observado em clima

temperado e em latitude norte (NUNES et al., 1982).

Os procedimentos de lavagem prévia do sêmen antes da congelação são baseados

em estudos realizados em clima temperado que demonstram que há grande variação na

composição do plasma seminal entre a estação reprodutiva (sexual) e não reprodutiva (não-

sexual) (NUNES et al., 1982).

Entretanto, não há estudos demonstrando que no semi-árido do Nordeste

brasileiro, o plasma seminal comporta-se de modo semelhante ao observado em clima

temperado. A comprovação de que o plasma não exerce o mesmo efeito deletério sobre os

espermatozóides, eliminará a necessidade da lavagem prévia do sêmen caprino antes da

conservação, facilitando o manejo do material espermático, incrementando, provavelmente, a

fertilidade dos rebanhos.

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MATERIAL E MÉTODOS

Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem

raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso.

Foram coletados em abatedouros locais da região metropolitana de Fortaleza 46

genitais de machos caprinos sem raça definida (SRD), com idade média de 18 meses no

período seco (setembro – novembro) e 52 genitais no período chuvoso (março – maio), para

análise morfométrica do trato reprodutivo. Depois foram identificados, pesados e mensurados,

conforme a categoria da peça anatômica analisada. Ressalta-se que os genitais foram

dessecados e cortados para a separação dos diferentes componentes: testículos, epidídimos,

ductos deferentes, pênis e glândulas vesiculares.

Testículos

Foram identificados conforme sua topografia em direito e esquerdo, em seguida

pesados (sem epidídimos) individualmente em balança de precisão. Após, foram mensurados

com auxílio de paquímetro e fita métrica, quanto ao comprimento, espessura e diâmetro.

Epidídimos

Foram dessecados dos testículos, identificados com direito ou esquerdo e em

seguida pesados

Ductos deferentes

Foram destacados da cauda do epidídimo e mensurado quanto ao comprimento.

Pênis

Foi mensurado quanto ao comprimento.

Glândulas Vesiculares

Foram identificadas em direita ou esquerda, pesadas individualmente, e

mensuradas quanto a comprimento, largura e espessura.

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Análise estatística

Os parâmetros de peso, largura, espessura e comprimento das diferentes estruturas

foram expressos em média e erro padrão (SEM) e submetidos ao teste t de Student não

pareado a 5% de probabilidade (Stat View, 5.0). Os dados foram comparados entre períodos e

entre os lados direito e esquerdo

Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a

viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos

Local do experimento

O experimento foi realizado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen da Faculdade

de Veterinária do Ceará, Fortaleza, com latitude norte de 3o 43´ e longitude oeste de 38º30',

com temperatura média anual de 27o C, apresentando segundo a classificação de Koppen,

clima tropical.

Coleta dos espermatozóides epididimários

Os epidídimos foram obtidos em abatedouros locais de Fortaleza (de caprinos sem

raça definida, com 16.0 ± 6.0 meses de idade e circunferência escrotal de 34 ± 2,5 cm) e os

espermatozóides coletados diretamente da cauda do epidídimo através de uma incisão na parte

distal e recuperados em tubos de ensaio. Foram realizadas um total de 14 coletas e cada coleta

considerada uma repetição.

Plasma seminal

O plasma seminal foi obtido de vários pools de ejaculados de dois animais

vasectomizados sem raça definida coletado por meio de vagina artificial durante as épocas

seca e chuvosa, e armazenado a –196oC em nitrogênio líquido até ser adicionado aos

espermatozóides epididimários.

Teste de termorresistência

Os espermatozóides foram diluídos em uma solução composta de 50% de água de

coco e 50% de citrato de sódio a 2,5%, tendo osmolaridade e pH ajustados para 300

mOsmols, pH 6,8, respectivamente. Os espermatozóides epididimários foram diluídos a uma

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concentração final de 400 x 106 sptz/ ml (espectrofotometria). Após a diluição foram

divididos em 7 alíquotas iguais de 100 µl (40 x 106 sptz). O plasma seminal de época seca ou

chuvosa foi adicionado em seis (6) delas nas seguintes proporções de 10, 20 ou 30 µl,

respectivamente, perfazendo os tratamentos 10C e 10S (10 µL de plasma seminal de época

chuvosa e seca, respectivamente / 100 µl de espermatozóides diluídos), 20C e 20S (20 µL de

plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente / 100 µl de espermatozóides

diluídos), 30C e 30S (30 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente/

100 µl de espermatozóides diluídos). Uma alíquota não foi adicionada de plasma seminal e

constituiu o tratamento controle (C). As amostras foram incubadas a 37oC em banho-maria e

avaliadas quanto à motilidade individual progressiva (MIP) e percentagem de

espermatozóides móveis (PEM) aos 5, 60 e 120 minutos de incubação pelo teste de

termoresistência (BARIL et al., 1993). A taxa de degradação da motilidade (TDM) foi

calculada ao final da incubação, utilizando a seguinte fórmula:

MIP 5 min – MIP 120 min

MIP 5 min

Morfologia espermática

Esfregaços de espermatozóides epididimários das diferentes amostras foram

realizadas aos 5 e 120 minutos de incubação a 37oC para mensuração das possíveis alterações

morfológicas provocadas pela ação do plasma seminal. Os esfregaços foram corados com

solução formada por eosina a 1%, nigrosina a 3% e citrato de sódio a 3%. Um total de 200

células foi avaliado em um microscópio de contraste de fase (aumento: X1000). As

morfologias foram classificadas segundo COLAS (1980) em normais (NO), defeito de cabeça

(DC), defeito de peça intermediária (DPI), gota citoplasmática proximal (GCP), gota

citoplasmática distal (GCD) e anormalidade de flagelo (AF) e patologia total (PT).

Análise estatística

Os resultados foram expressos em média e erro padrão (SEM), os parâmetros de

PEM, MIP, TDM e morfologia espermática, foram analisados após transformação arcoseno e

submetidos a ANOVA (P<0,05) pelo programa estatístico STAT VIEW (5,0).

TDM = x 100

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Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de

coco e armazenado a 4 oC

Local do experimento

O experimento foi realizado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen da Faculdade

de Veterinária do Ceará, Fortaleza, com latitude de 3o43´ e longitude oeste de 38º30', com

temperatura anual média de 27o C.

Elaboração do diluidor

O diluidor foi elaborado a partir da água de coco in natura, obedecendo ao

seguinte protocolo: 50% de água de coco e 50% de citrato de sódio a 2,5%, contendo ainda

2,5% de gema de ovo com osmolaridade ajustada para 300 milliosmoles e pH corrigido para

6,2 a 6,8.

Coleta e processamento do sêmen

O sêmen de quatro caprinos Saanen com idade média de dois anos foi coletado em

vagina artificial. Os animais permaneceram em manejo intensivo, recebendo volumoso

(capim elefante picado) ad libitum e 400g de um concentrado (18% PB) por. Após a coleta, o

sêmen foi imediatamente avaliado quanto ao volume (mL) e concentração espermática (109

sptz/ mL). Logo após a primeira avaliação, o sêmen foi diluído em água de coco a uma

concentração final de 200 x 106 sptz /mL, metade deste sêmen foi resfriado a +4oC

(tratamento: sêmen não-lavado) e a outra metade foi centrifugada (lavagem) para retirada do

plasma seminal sendo também resfriada a +4 oC (tratamento: sêmen lavado). A lavagem foi

realizada duas vezes utilizando-se a mesma solução diluidora (centrifugado a 550g / 15 min),

tendo-se o cuidado de manter o volume líquido do diluidor após cada lavagem, e assim

manter a mesma concentração espermática. Ambas amostras de sêmen foram avaliadas a 0,

24, 48 e 72 horas de resfriamento, onde pequenas amostras de 300 µl (60 x 106 sptz) foram

retiradas e submetidas ao TTR em banho-maria a 37 oC, avaliado-se quanto a motilidade

progressiva individual (MIP) e porcentagem de espermatozóides móveis (PEM), por meio do

TTR aos 5, 60, e 120 minutos de incubação.

Estas observações foram realizadas em microscopia ótica (microscópio de contraste de

fase) no aumento de 100X. Após cada incubação foram calculadas as médias de MIP e PEM

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[(5 min + 60 min + 120 min)/3] e a taxa de degradação da motilidade (TDM) pela seguinte

fórmula:

TDM = MIP 5 min – MIP 120 min

MIP 5 min

Morfologia espermática

Esfregaços de sêmen das amostras de cada animal e dos diferentes tempos de

conservação (0, 24, 48 e 72 h) foram realizados aos 120 minutos de incubação a 37oC para

mensuração das possíveis alterações morfológicas provocadas pela ação do plasma seminal.

Os esfregaços foram corados com solução formada por eosina a 1%, nigrosina a 3% e citrato

de sódio a 3%. Um total de 200 células foi avaliado em um microscópio de contraste de fase

(aumento: X1000). A morfologia espermática foi classificada segundo COLAS (1980) em

normais (NO), defeito de cabeça (DC), defeito de peça intermediária (DPI), gota

citoplasmática proximal (GCP), gota citoplasmática distal (GCD) e anormalidade de flagelo

(AF) e patologia total (PT).

Para efeito de confiabilidade estatística, foram realizadas cinco repetições no

período chuvoso (abril e maio) e cinco no período seco (setembro e outubro), perfazendo um

total de 20 ejaculados no período chuvoso e 20 no período seco.

Análise estatística

Os parâmetros de MIP, PEM, TDM e morfologia espermática foram expressos em

média e erro padrão (SEM) e submetidos a ANOVA (P<0,05). Quando foi identificada

diferença entre os tratamentos os parâmetros foram submetidos ao teste Fisher´s PLSD a

P<0,05 (Stat View, 5.0). Ressalta-se que o delineamento experimental foi inteiramente

casualizado, onde cada ejaculado foi considerado uma repetição para comparações dentro de

cada tratamento. Os diferentes parâmetros foram comparados entre tratamentos (lavado x não

lavado), entre épocas (seca x chuvosa) e entre tempo de conservação (0, 24, 48 e 72 h) e todos

os parâmetros percentuais sofreram transformação em arcoseno e em seguida foram

submetidos aos testes citados anteriormente.

x 100

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46

RESULTADOS

Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem

raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso.

Os parâmetros testiculares demonstrados na tabela 1 foram diferentes

significativamente (P<0,05) entre os períodos seco e chuvoso, destacando-se resultados

superiores no período seco. Todavia, não houve diferença significativa (P>0,05) entre os

testículos direito e esquerdo.

Tabela 1: Média ± erro padrão (SEM) das dimensões dos testículos de caprinos tipo sem raça

definida (SRD) no Nordeste do Brasil no período seco (setembro – novembro) e chuvoso

(março – maio) de 2001.

Parâmetros testiculares (cm)

Espessura Comprimento Largura

Período do

ano direito esquerdo direito esquerdo direito esquerdo

seco 3.34 ±

0.081a

3.40 ±

0.074a

5.95 ±

0.11a

6.08 ±

0.10a

4.06 ±

0.08a

4.07 ±

0.069a

chuvoso 3.05 ±

0.074b

3.07 ±

0.69b

5.67 ±

0.11b

5.64 ±

0.10b

3.74 ±

0.08b

3.79 ±

0.071b

a,bletras diferentes com diferença significativa (P<0,05) – diferença entre linhas (entre

períodos do ano)

(P>0,05) – entre colunas

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47

No tocante ao peso testicular (tabela 2) também foi constatada diferença

significativa (P<0,05) entre os dois períodos estudados.

Tabela 2: Média ± SEM dos pesos médios e totais dos testículos (T) e epidídimos (E) em

grama (g) de caprinos tipo sem raça definida (SRD) no Nordeste do Brasil no período seco

(setembro – novembro) e chuvoso (março – maio) de 2001.

Testículos Epidídimos Período do

ano direito esquerdo total (T) direito esquerdo total (E)

Seco 56.32 ±

2.56a

56.22 ±

2.43a

112,55±

4,96a

9.25 ±

2.43a

9.24 ±

0.46a

18,48±

0,93a

Chuvoso 48.87 ±

2.21b

48.90 ±

2.22b

96,90 ±

4,88b

6.71 ±

0.34b

6.69 ±

0.34b

13,41±

0,68b

a,bletras diferentes com diferença significativa (P<0,05) – diferença entre linhas (entre

períodos do ano)

Referente às glândulas vesiculares (tabela 3), não foram observadas diferenças

significativas (P>0,05) entre os parâmetros de peso, espessura, largura e comprimento entre

os períodos seco e chuvoso.

Tabela 3: Média ± SEM das glândulas vesiculares de caprinos tipo sem raça definida (SRD)

no Nordeste do Brasil no período seco e chuvoso

Glândulas Vesiculares

Peso (g) Espessura (cm) Largura (cm) Comprimento (cm)

Período

do ano direita esquerda direita esquerda direita esquerda direita esquerda

Seco 3.08 ±

0.38

2.80 ±

0.41

0.79 ±

0.049

0.77±

0.046

1.40±

0.068

1.36±

0.074

2.50 ±

0.123

2.54 ±

0.13

Chuvoso 2.66 ±

0.16

2.80 ±

0.15

0.76 ±

0.030

0.77 ±

0.02

1.39±

0.03

1.37±

0.036

2.31 ±

0.05

2.33 ±

0.06

P>0,05 – entre linhas e colunas

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48

O comprimento do pênis e ductos deferentes (tabela 4) diferiram

significativamente (P<0,05) entre os períodos do ano.

Tabela 4: Média ± SEM do comprimento do pênis e do ducto deferente de caprinos tipo sem

raça definida (SRD) no Nordeste do Brasil no período seco e chuvoso

Comprimento do ducto deferente (cm) Período do ano Comprimento do pênis

(cm) direito esquerdo

Seco 25.62 ± 0.52a 34.81 ± 0.86 a 35.16 ± 0.94a

Chuvoso 23.46 ± 0.24 b 39.66 ± 0.95 b 39.8 ± 0.95 b

a,bletras diferentes com diferença significativa (P<0,05) – diferença entre linhas (entre

períodos do ano).

P>0,05 – entre colunas

Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a

viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos

O efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa sobre a PEM

epididimários foi observado aos 5 e 60 min de incubação (tabela 1). No tocante a MIP,

nenhum efeito foi observado a nenhum momento da incubação ou qualquer dose do plasma

seminal.

A adição do plasma seminal aumentou significativamente a PEM no

tratamento10S (5 min) comparado ao controle, (P<0,05) no qual PEM foi maior após a adição

de plasma seminal (10S). Uma diferença significativa também foi observada entre os

tratamentos adicionado de plasma seminal de época chuvosa - 10C, 20C e 30C (P<0,05),

embora os tratamentos 20C e 30C não tenham diferido um do outro apresentaram uma maior

PEM. Diferença significativa também foi observado entre os tratamentos adicionados de

plasma seminal de época seca - 30S e 10S a 60 min (P<0,05), onde uma menor PEM foi

encontrada no tratamento que recebeu maior dose de plasma seminal (30S), sugerindo que

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49

doses maiores de plasma seminal de época seca reduzem a viabilidade espermática à medida

que a incubação continua.

Tabela 1: (Média ± SEM). Efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa

sobre a percentagem de espermatozóides móveis epididimários (PEM) após incubação a 37oC.

Tempo de incubação (min)

Tratamento 5 60 120

(controle) C 89,64 ± 0,82* 83,46 ± 2,49 76,25 ± 4,08

10C 90,71 ± 0,88a 86,78 ± 2,65 81,78 ± 3,80

20C 91,42 ± 0,81bc 86,78 ± 2,07 76,78 ± 3,69

Chu

vosa

30C 91,42 ± 1,32c 86,07 ± 1,97 78,57 ± 3,75

10S 92,14 ± 0,86** 87,14 ± 2,32a 78,57 ± 4,20

20S 88,92 ± 1,07 83,21 ± 1,86 78,21 ± 2,75

Seca

30S 87,64 ±1,79 80,00 ± 2,68b 75,41 ± 2,78

a,b letras diferentes, representa diferença significativa (P<0,05) entre tratamentos (linhas).

*,** representa diferença significativa (P<0,05) entre tratamentos (linhas).

O efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa sobre os

espermatozóides epididimários não teve ação sobre a TDM (tabela 2), não se verificando

diferença significativa entre os tratamentos (P>0,05).

Tabela 2: (Média ± SEM). Efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa

sobre a taxa de degradação da motilidade (TDM) de espermatozóides epididimários incubados

a 37oC.

Tratamentos

C 10C 10S 20C 20S 30C 30S

TDM (%) 8.88 ±

2.22

4,62 ±

2,54

5.55 ±

2.16

4.62 ±

2.14

5.55 ±

2.25

4.62 ±

5.71

7.77 ±

2.89

(P>0,05)

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50

C: controle; 10C e 10S (10 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 20C

e 20S (20 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 30C e 30S (30 µL de plasma

seminal de época chuvosa e seca, respectivamente).

Com relação à morfologia espermática, alguns tratamentos diferiram entre si

(P<0,05). Aos 5 min de incubação, nenhum tratamento apresentou diferença na morfologia

espermática (NO, DC, DPI, GCP, GCD e AF). Exceto os tratamentos 20S (12,00 ± 1,74%) e

C (34,50 ± 10,56%) diferiram significativamente na PT (P<0,05), com um índice patológico

maior ocorrendo no tratamento C (Figura 1).

Figura 1: Efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa sobre a patologia total

(PT) da morfologia espermática epididimária com 5 e 120 min de incubação a 37oC.

0

10

20

30

40

C 10S 10C 20S 20C 30S 30C

Tratamentos

% d

e e

sp

erm

ato

ide

s

PT c/ 5 min

PT c/ 120 min

a,b letras diferentes representam diferença significativa (P<0,05) entre tratamentos

C: controle; 10C e 10S (10 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 20C

e 20S (20 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 30C e 30S (30 µL de plasma

seminal de época chuvosa e seca, respectivamente).

PT: patologia total

Aos 120 min de incubação, o número de células normais no tratamento 30S foi

menor que o observado nos demais tratamentos (tabela 3) (P<0,05). No que se refere ao DC,

somente o tratamento 30S diferiu do controle (C), onde a adição de plasma seminal aumentou

esta patologia (P<0,05). Concernente a GCD, os tratamentos 30S e 30C diferiram

significativamente do controle (P<0,05), com um grande número de espermatozóides com

GCD sendo observada no tratamento C. Nenhum efeito do plasma seminal foi observado

sobre a incidência de DPI, GCP, AF ou PT com 120 min de incubação.

b

a

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51

Tabela 3: (Média ± SEM). Efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa

sobre a morfologia espermática epididimária após 120 min de incubação a 37oC.

Tratamentos

Morfologia C 10C 10S 20C 20S 30C 30S

NO 184.28 ±

2.06b

190.92 ±

1.03b

184.57 ±

3.42b

181.42 ±

5.35b

178.28 ±

3.86b

182.57 ±

3.33b

147.14 ±

18.30a

DC 3.07 ±

0.91ª

3.85 ±

0.65

4.40 ±

1.45

11.85 ±

5.09

11.07 ±

3.39

7.85 ±

2.22

18.50 ±

8.03b

GCD 7.78 ±

2.03ª

2.00 ±

0.74

5.50 ±

2.29

3.57 ±

1.34

7.50 ±

2.87

5.78 ±

1.92b

2.57 ±

1.05b

a,b letras diferentes, representam diferença significativa (P<0,05) entre tratamentos (colunas)

(NO: Normais; DC: Defeito de cabeça; GCD: Gota citoplasmática distal).

C: controle; 10C e 10S (10 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 20C e 20S (20 µL

de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 30C e 30S (30 µL de plasma seminal de época

chuvosa e seca, respectivamente).

Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de

coco e armazenado a 4 oC

Os resultados do experimento estão expressos nas tabelas 1 e 2.

Foi observada diferença na conservação entre o sêmen lavado e o não lavado nos

parâmetros de MIP e PEM no período chuvoso quando conservados a 0, 24 e 48 h (P< 0,001),

com resultados superiores no sêmen lavado (tabela 1). No período seco a MIP diferiu apenas

no sêmen conservado a 0h (P< 0,001), onde o melhor resultado foi observado no sêmen

lavado. No tocante a PEM, no período seco foram constatadas diferenças entre o sêmen

lavado e não lavado conservado por 0, 24 e 72 h (P< 0,001), resultados superiores

encontrados no sêmen lavado.

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52

Tabela 1: Motilidade Individual Progressiva (MIP) e Percentagem de Espermatozóides

Móveis (PEM) do sêmen caprino lavado e não lavado conservado por 72 h a +4oC durante o

período chuvoso e seco e avaliado pelo Teste de Termorresistência (TTR).

TTR

MIP PEM

Época Época

Tempo de

resfriamento

Tratamento

chuvosa seca chuvosa seca

Não Lavado 3,67 ± 0,10aA* 3,17 ± 0,13aA** 68,61 ± 2,46aA 61,52 ± 3,62aA 0h

Lavado 4,07 ± 0,85b1* 3,78 ± 0,07b1** 79,90 ± 2,01b1 75,91 ± 2,09b1

Não Lavado 3,32 ± 0,10aB 3,21 ± 0,10AB 53,14 ± 3,10aB 51,11 ± 3,49aB 24h

Lavado 3,77 ± 0,07b2* 3,42 ± 0,092** 65,88 ± 2,63b2 60,26 ± 2,76b2

Não Lavado 3,05 ± 0,08aCBD 2,73 ± 0,15C 38,97 ± 3,28aCD 40,00 ± 3,89CD 48h

Lavado 3,62 ± 0,06b3,4 3,02 ± 0,093,4 65,43 ± 1,79b3,4 46,37 ± 2,693,4

Não Lavado 2,81 ± 0,13D 3,00 ± 0,07AD 40,51 ± 3,31D 34,79 ± 3,42aD 72h

Lavado 2,73 ± 0,114 2,84 ± 0,104 44,44 ± 2,814 46,66 ± 3,14b4

ab letras diferentes, comparação entre sêmen Não Lavado e Lavado P<0,001 A, B, C e D letras diferentes, comparação entre o sêmen Não Lavado (0, 24, 48 e 72 h) P<0,001 1, 2, 3 e 4 números diferentes, comparação entre o sêmen Lavado (0, 24, 48 e 72 h) P<0,001 *, ** no de asteriscos diferentes, comparação entre colunas: seca e chuvosa (P<0,01).

Também foi observado que o tempo de conservação diminuiu a viabilidade

espermática do sêmen lavado e não lavado. No sêmen não lavado a MIP, no período chuvoso,

foi superior a 0h quando comparada com os demais tempos de conservação (P< 0,001). No

período seco não houve diferença entre o sêmen conservado por 0 e 24 h (P< 0,001), todavia

deferiram significativamente daquele conservado por 48 h (P< 0,001). No que se refere a

PEM, também no sêmen não lavado, foi observado que tanto no período chuvoso como no

seco não houve diferença entre o sêmen conservado por 0 e 24 h, contudo ambos foram

superiores àquele conservado por 48 e 72 h (P< 0,001).

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53

No sêmen lavado A MIP e a PEM tanto no período chuvoso como no seco foram

significativamente superiores no sêmen conservado a 0 h (P< 0,001), não havendo diferença

entre o sêmen conservado por 48 e 72 h (P> 0,001).

A época do ano mostrou efeito somente sobre a MIP do sêmen lavado e não lavado

conservado a 0 h e no sêmen lavado conservado a 24 h, com resultados superiores observados

no período chuvoso (P< 0,001).

A época do ano afetou a TDM do sêmen lavado, onde uma menor degradação foi

observada no período seco, com 72h / 4oC. No tocante ao tratamento dado ao sêmen antes do

resfriamento (lavagem ou não) uma degradação significativamente inferior (P<0,02) foi

constatada no sêmen lavado e conservado por 0 h (tabela 2).

Tabela 2: Taxa de Degradação da Motilidade (TDM) do sêmen caprino não lavado e lavado,

resfriado a 4oC e conservado por até 72 h.

Tempo de Conservação Período do ano Tratamento

0 h 24 h 48 h 72 h

Não lavado 35,11 ± 4,47a 20,91 ± 6,48 33,42 ± 9,84 16,66 ± 5,67 Seca

Lavado 15,43 ± 7,47b 21,45 ± 4,47 23,93 ± 5,06 11,20 ± 3,08a

Não lavado 31,10 ± 6,87 33,66 ± 9,22 16,04 ± 8,11 25,51 ± 10,71 Chuvosa

Lavado 27,37 ± 7,10 24,60 ± 7,19 25,50 ± 6,53 33,12 ± 7,60b

a,b Letras diferentes, comparação entre linhas (P< 0,02)

A época de coleta do sêmen (seca ou chuvosa) teve efeito sobre a morfologia

espermática, como células normais (NO) no sêmen lavado e conservado por 72 h, defeito de

cabeça (DC) no sêmen não lavado e conservado por 48 e 72 h, e patologia total (PT) no sêmen

lavado e conservado por 48 e 72 horas a +4oC, onde um maior número de NO e DC foi

observado na época seca, e PT na chuvosa (tabela 4).

No que se refere, ainda ao DC, às 72 h de conservação, uma diferença significativa

foi observada no tratamento dado ao sêmen (lavado ou não lavado), pois uma maior taxa de

anormalidade foi observada no sêmen lavado (P<0,02). No tocante ao tempo de conservação

(0, 24, 48 e 72h), não foi constatadas diferença significativa no período seco (P>0,05).

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54

Todavia, no período chuvoso foi constatada diferença significativa (P<0,05) entre os

diferentes tempos de conservação apenas no sêmen submetido à lavagem, para as morfologias

NO, que diminuiu com a conservação, DC e PT, que aumentaram com a conservação (tabela

4).

Tabela 3: (Média ± SEM). Efeito da remoção ou não plasma seminal do sêmen caprino

conservado por 72 h a +4oC durante o período chuvoso e seco sobre a morfologia

espermática.

Normais (NO)

(no de células)

Defeito de cabeça (DC)

(no de células)

Patologia Total (PT)

(no de células)

Período

do ano

Tempo de

conservação

Lavado

Não

lavado

Lavado

Não

lavado

Lavado

Não

lavado

0 h 185,26 ±

1,56

178,94 ±

3,77

11,00 ±

1,71

16,68 ±

3,86

15,05 ±

1,66

21,05 ±

3,77

24 h 184,89 ±

1,27

184,81 ±

1,24

11,47 ±

0,90

12,81 ±

1,24

15,05 ±

1,29

15,18 ±

1,24

48 h 184,12 ±

2,05

177,63 ±

4,31

12,54 ±

2,22

20,45 ±

4,12A

15,37 ±

2,12

22,36 ±

4,30

Seca

72 h 184,46 ±

1,00 A

185,33 ±

1,78

11,86 ±

0,86

12,66 ±

1,58A

15,53 ±

1,00A

14,66 ±

1,78

0 h 183,68 ±

1,91a

183,83 ±

1,83

8,36 ±

1,35a

9,55 ±

1,18

15,84 ±

1,77a

16,77 ±

1,72

24 h 184,68 ±

1,83ab

180,06 ±

3,00

8,62 ±

1,71ab

12,31 ±

2,02

15,31 ±

1,83ab

20,00 ±

3,01

48 h 180,66 ±

2,25abc

178,93 ±

1,90

10,00 ±

1,67ab

10,60 ±

1,70B

19,33 ±

2,25abc

21,06 ±

1,90

Chu

vosa

72 h 176,88 ±

2,91cB

185,71 ±

3,20

13,66 ±

2,29*b

7,17 ±

1,40**B

23,11 ±

2,91cB

14,258 ±

3,20

*,** - comparação entre colunas (sêmen Lavado x Não lavado) a,b,c - comparação entre linhas (época chuvosa)

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55

A,B - comparação entre linhas dentro do mesmo tempo de conservação (época seca x chuvosa)

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56

DISCUSSÃO

Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem

raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante os períodos seco e

chuvoso.

Os parâmetros testiculares demonstrados na tabela 1 foram diferentes

significativamente (P<0,05) entre os períodos seco e chuvoso, destacando-se resultados

superiores no período seco. Todavia, não houve diferença significativa (P>0,05) entre os

testículos direito e esquerdo. Estes dados estão de acordo com os achados por VILLAR

FILHO et al. (1993), onde demonstraram que o comprimento dos testículos direito e esquerdo

foram bastante homogêneos. Contudo, no presente estudo, esse parâmetro foi bem inferior ao

encontrado pelos citados autores, pois observaram 7,3 cm de comprimento testicular em

caprinos nativos da raça Canindé também criados no Nordeste do Brasil. Os resultados do

presente trabalho também foram inferiores aos citados por NÚÑEZ (1993), que relata um

comprimento testicular variando de 7,5 a 11 cm em caprinos nativos da Venezuela.

Entretanto, a largura testicular (4,5 cm) citado por NÚÑEZ (1993) foi similar àquela

encontrada neste trabalho durante o período seco no Nordeste do Brasil.

No tocante ao peso testicular (tabela 2) também foi constatada diferença

significativa (P<0,05) entre os dois períodos estudados, com resultados superiores no período

seco, apresentando-se todavia, inferiores aos citados por NÚÑEZ (1993) que foram de 150 a

180 g (ambos testículos). BARIL et al. (1993) demonstraram que o peso testicular em bodes

nativos adultos na França foi de 101 g (ambos testículos), dados semelhantes foram obtidos

no atual trabalho durante o período seco no Nordeste do Brasil. Não foi constatada diferença

significativa (P>0,05) entre o peso testicular e epididimário direito e esquerdo. Resultados

semelhantes foram encontrados por NISHIMURA et al. (2000) que também não constataram

diferença entre os referidos parâmetros, sendo semelhantes ainda aos achados por BARIL et

al. (1993) em caprinos da raça Alpina fora da estação não sexual. VILAR FILHO et al. (1993)

ressalta que raças de maior porte tendem a apresentar maiores pesos testiculares.

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NISHIMURA et al. (2000) estudando o desenvolvimento testicular de caprinos

nativos japoneses (Tokara), animais que não apresentam estacionalidade, demonstraram que o

peso dos testículos não variou dos 12 aos 24 meses de idade, pesando em média 127 g (ambos

testículos). Estes resultados foram semelhantes aos encontrados no presente estudo durante o

período seco, que por sua vez foram superiores aos encontrados durante o período chuvoso.

Estudos conduzidos em três raças de ovinos em clima temperado demonstraram que o

desenvolvimento testicular ocorreu até 17 – 19 meses de idade, e que esse crescimento sofreu

influencia da estação do ano em clima temperado, ou seja tiveram melhor desenvolvimento na

primavera e verão (MANDIKI et al., 1998). Os mesmos autores encontraram diferença de

desenvolvimento entre raças, sugerindo haver diferentes sensibilidades aos fatores ambientais.

No tocante às vesículas seminais (tabela 3), não foram observadas diferenças

significativas (P>0,05) entre os parâmetros de peso, espessura, largura e comprimento entre

os períodos seco e chuvoso. Estes resultados foram similares àqueles encontrados por

FERNANDES (1994), onde não foi observada diferença significativa entre o peso e o

comprimento das glândulas coletadas nos períodos seco e chuvoso no Nordeste do Brasil,

contudo, os lobos direito e esquerdo foram mais pesados (3,1 e 3,6 g respectivamente) que o

encontrado no presente trabalho. Concernente ao comprimento das glândulas vesiculares,

também apresentou dimensão inferior ao encontrado por FERNANDES (1994), em caprinos

SRD. Estes resultados demonstram que a biometria das glândulas vesiculares se mantém

constante durante os períodos do ano no semi-árido nordestino do Brasil em caprinos SRD. O

comprimento das vesículas seminais foram também similares aos citados por NÚÑEZ (1993)

que relatou uma variação de 2,5 a 4 cm, entretanto, os parâmetros de espessura (1 a 1,5 cm) e

largura (2 a 2,5 cm) foram inferiores.

O comprimento do pênis e ductos deferentes (tabela 4) diferiram

significativamente (P<0,05) entre os períodos do ano. O pênis apresentou maior comprimento

no período seco, todavia foi inferior ao citado por NÚÑEZ (1993). Já no que se refere aos

ductos deferentes maiores dimensões foram observadas no período chuvoso, porém foi

inferior ao relatado por NÚÑEZ (1993), onde o referido autor observou uma variação de 45 a

50 cm de comprimento em caprinos na Venezuela.

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58

Os resultados deste experimento sugerem que as diferenças encontradas entre os

períodos seco e chuvoso, com melhores dimensões no período seco para a maioria dos

parâmetros analisados, devam-se em parte, a uma necessidade de melhor sobrevivência

durante o período de escassez de alimentos, demonstrando talvez uma maior adaptabilidade

dos caprinos nativos às condições de aridez do Nordeste do Brasil. Todavia, sugere-se que

durante o período seco os animais sejam levados para o abate apresentando três ou quatro

meses de idade a mais que aqueles do período chuvoso, podendo assim ter sido responsável

pelos melhores resultados para a maioria dos parâmetros serem encontrados no período seco.

Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a

viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos

O presente estudo demonstrou que maiores doses de plasma seminal de época seca

tiveram efeitos desfavoráveis sobre a sobrevivência espermática (PEM – tabela 1), sugerindo

que a presença ou ausência de alguns componentes bioquímicos no plasma seminal parecem

interferir na sobrevivência espermática. Variação na presença, ausência ou concentração

crítica de certos componentes, provavelmente proteínas, no plasma seminal podem ser

responsáveis pela variabilidade destes efeitos sobre a sobrevivência espermática (MAXWELL

& JOHNSON, 1999). CORTEEL (1980) detectou a ocorrência de modificações após

tratamento in vitro, causando possíveis variações no metabolismo e/ ou sobrevivência

espermática.

Alguns experimentos têm demonstrado que o plasma seminal melhora a

motilidade e a sobrevivência espermática (DOTT et al., 1979; AZIZ et al., 1998; TONIOLLI

& COMBARNOUS, 1998; CASTELLINI et al., 2000). Todavia, no presente estudo não foi

observado efeito do plasma seminal sobre a MIP. Resultados similares foram encontrados por

NUNES (1982), demonstrando que a adição do plasma seminal de estação sexual (época

reprodutiva) não modificou a motilidade dos espermatozóides epididimários durante as duas

horas de incubação a 37oC, em animais estudados em latitude norte.

NUNES (1982) sugeriu que o plasma seminal é capaz de eliminar espermatozóides

e que parte das secreções das glândulas acessórias provoca extensiva morte celular. Por outro

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59

lado, o plasma seminal pode prevenir a descondensação da cromatina nuclear, intervindo

assim na transferência do genoma masculino (KVIST, 1980).

Os resultados relatados por NUNES (1982) demonstraram que o plasma seminal

de estação não sexual (época não reprodutiva) teve efeito deletério sobre as células

espermáticas. O autor concluiu que o plasma seminal de estação não sexual, por ser rico em

fosfolipase A2 secretada pelas glândulas bulbo-uretrais, apresentou uma ação prejudicial sobre

sobrevivência espermática. Todavia, o plasma seminal de época seca apresentou uma

tendência negativa sobre a sobrevivência espermática (PEM – tabela 1). Estudos mais

profundos, especialmente sobre os componentes bioquímicos do plasma seminal, são

necessários para elucidar o modo de ação do plasma seminal de época seca ou chuvosa de

caprinos criados no Nordeste do Brasil.

Sugere-se que os efeitos sobre as PEM podem ser similares aos efeitos do plasma

seminal sobre os espermatozóides provenientes do epidídimo durante a ejaculação. Alguns

estudos têm demonstrado que durante a passagem dos espermatozóides pela uretra, os

mesmos recebem secreção das ampolas vesiculares, vesículas seminais, próstata e bulbo-

uretrais, ou seja, durante a ejaculação os espermatozóides adquirem alterações significativas

na membrana espermática (HENAULT et al., 1995), na motilidade (DHAMI & SANHI,

1993; HENKEL et al., 1999), na estabilidade da cromatina nuclear (KVIST, 1980), na

capacidade de ligar-se à zona pelúcida (CALVETE et al., 1994) dentre outras alterações que

são importantes para a aquisição de sua capacidade fecundante (CAMPOS et al., 2000).

CASTELLINI et al. (2000) observaram que a baixa concentração de plasma

seminal no meio diluidor afetou positivamente a sobrevivência de espermatozóides de coelhos

e os parâmetros de motilidade, com o efeito aparecendo imediatamente após a coleta e

aumentando durante a incubação a 37oC. Os autores demonstraram que os espermatozóides de

coelhos quando lavados e ressuspensos no TRIS ou com um conteúdo extremamente baixo de

plasma seminal perderam a motilidade e a viabilidade dentro de 1 – 3 horas.

Neste experimento observou-se que a PEM e MIP permaneceram acima de 75% e

4,0 (dado não mostrado) respectivamente, demonstrando que a presença ou ausência do

plasma seminal aos 60 e 120 min de incubação a 37oC não interferiram na qualidade dos

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espermatozóides epididimários de caprinos. Entretanto, CASTELLINI et al. (2000),

demonstraram que a presença do plasma seminal é necessária para uma melhor conservação

in vitro em coelhos.

No tocante à taxa de degradação da motilidade (TDM) expressos na tabela 2, não

foi observada diferença significativa entre os diferentes tratamentos (P>0,05). Entretanto, foi

constatada uma tendência para uma menor TDM após a adição de plasma seminal de época

chuvosa. CASTELLINI et al. (2000) observaram que a presença de uma grande quantidade de

plasma seminal no meio de diluição aumentou a resistência dos espermatozóides de coelhos

durante a estocagem in vitro, bem como, suas características de motilidade. Resultados

similares foram observados neste experimento, sugerindo-se que o plasma seminal aumentou

a resistência dos espermatozóides epididimários de caprinos.

A tabela 3 e figura 1 mostram que algumas morfologias espermáticas foram

provocadas pelo plasma seminal (NO, DC, GCD e PT). Pesquisas têm relatado que a

motilidade pode permanecer viável mesmo que a membrana plasmática e o acrossoma não

estejam íntegros (HAFEZ, 1995), necessitando-se, portanto da avaliação morfológica

espermática. AURICH et al. (1996) demonstraram que a adição de plasma seminal aos

espermatozóides congelados – descongelados de eqüinos aumentou a percentagem de células

com membrana espermática intacta quando comparado a não adição de plasma seminal.

Alguns estudos têm demonstrado que o plasma seminal inibe a reação acrossômica

(KATSKA et al., 1996), ou seja, preserva a integridade das membranas plasmática e

acrossômica (MAXWEEL et al., 1996; MAXWEEL et al., 1998; MAXWEEL & JOHNSON,

1999), bem como, preserva a estabilidade da cromatina nuclear do espermatozóide (KVIST &

ELIASSON, 1980).

Foi demonstrado que o plasma seminal continha substâncias antioxidantes que

preservaram a função espermática (VAN OVERVELD et al., 2000). Entretanto, no presente

experimento a adição de plasma seminal (30 µL) de época seca aumentou significativamente

os DC (tabela 3), sugerindo que alguns componentes “protetores” das membranas

espermáticas presentes no plasma seminal estejam em níveis mais baixos que o necessário

para prover uma proteção adequada. HAIDL et al. (1993) afirmaram que a adição de plasma

seminal aos espermatozóides epididimários humanos aumentou o número de células com

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flagelos normais. Este experimento também demonstrou que a adição do plasma seminal

aumentou significativamente a PEM no tratamento10S (5 min) comparado ao controle (C),

(P<0,05) no qual a PEM foi maior após a adição de plasma seminal (10S) (tabela 1). Este

resultado sugere que apesar das características motoras não terem sido danificadas

significativamente, outras funções espermáticas, todavia poderiam ter sido afetadas, sugerindo

que a motilidade somente não é confiável para predizer a condição fisiológica do

espermatozóide (CHANTLER et al., 2000). A importância da análise morfológica dos

espermatozóides, constatada nos diversos experimentos, sugere interferência na fertilidade,

sendo esta mais diretamente relacionada com o aspecto morfológico celular que com a

motilidade (AZIZ et al., 1998).

Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de

coco e armazenado a 4 oC

Estudos têm demonstrado o efeito positivo da lavagem sobre a motilidade do

sêmen caprino, mostrando que a remoção do plasma seminal foi benéfica na preservação da

integridade dos espermatozóides após a congelação (MEMON et al., 1985). Pois as secreções

das glândulas bulbo-uretrais promoveram diminuição na PEM, deterioração na qualidade do

movimento, danos ao acrossoma e morte celular dos espermatozóides caprinos diluídos no

leite desnatado (PELLICER- RUBIO et al. 1997). No presente estudo, o efeito da presença do

plasma seminal sobre a MIP foi observada até as 48 h de conservação a 4oC, no período

chuvoso e 0h do período seco, apresentando resultados superiores no sêmen lavado (tabela 1).

No tocante a PEM, o efeito da presença do plasma seminal foi observado até 48 h do período

chuvoso e a 0, 24 e 72h no período seco (P< 0,001), onde resultados superiores foram

constatados no sêmen lavado (tabela 1). PELLICER-RUBIO & COMBARNOUS (1998)

sugerem que a deterioração do espermatozóide na presença das secreções das glândulas

bulbo-uretrais em caprinos é devido à catálise de triglicerídeos hidrolisáveis e que as proteínas

aumentam esta atividade.

RIGBY et al. (2001) demonstraram que no sêmen eqüino a centrifugação para

remoção do plasma seminal não teve efeito aparente sobre as características de motilidade

após 48 h de resfriamento a +5oC, ou seja, o sêmen não centrifugado (não lavado) foi

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semelhante ao sêmen centrifugado (lavado) e adicionado de 20% de plasma seminal.

Resultado semelhante foi encontrado no presente trabalho, onde não se constatou diferença

entre o sêmen lavado e o não lavado após 48h de resfriamento (tabela 1) no período chuvoso e

seco (exceto sobre a PEM – 72h), demonstrando que após este período a presença ou ausência

de plasma seminal não interferiu na qualidade espermática, ou já interferiu ao máximo. Estes

resultados sugerem que o plasma seminal foi um fator negativo na conservação do sêmen,

sugerindo-se que alguns componentes presentes no plasma seminal poderiam ter interagido

com os constituintes do diluidor, possivelmente a gema de ovo, exercendo ação tóxica sobre

os espermatozóides, interferindo assim na sobrevivência espermática. Já foi demonstrado que

a adição de gema de ovo ao diluidor teve efeito benéfico sobre a PEM no sêmen ovino,

principalmente após rápido resfriamento do sêmen para 10 e 5oC (FISER & FAIRFULL,

1986). Também foi demonstrado que concentrações superiores a 1,5% de gema de ovo no

diluidor deprimiram a sobrevivência espermática na pós-descongelação do sêmen caprino não

lavado (RITAR & SALAMON, 1982). Todavia, alguns estudos indicam que a fração

lipoprotéica de baixa densidade da gema de ovo é a fonte de proteção do espermatozóide

ovino contra os efeitos do armazenamento a 5oC (WATSON & MARTIN, 1975). WATSON

(1981) observou que os fosfolipídios da fração lipoprotéica da gema de ovo favoreceram a

proteção da membrana da célula espermática e que o componente proteíco da fração

lipoprotéica da gema de ovo serviu para solubilizar o lipídio e ligá-lo à membrana da célula

(WATSON, 1981). Mais recentemente, MOUSSA et al. (2002) demonstraram que a fração

lipoprotéica da gema de ovo possui efetiva propriedade crioprotetora sobre os

espermatozóides congelados-descongelados de touros, pois melhor motilidade espermática foi

obtida com a adição da gema de ovo. No presente estudo foi evidente a eficiência da gema de

ovo na conservação do sêmen caprino, pois no sêmen lavado foram observados os melhores

índices de qualidade espermática.

AHMAD et al. (1996) demonstraram que a remoção do plasma seminal do sêmen

de búfalo favoreceu a viabilidade do mesmo quando diluído no leite desnatado-gema de ovo-

glicerol após incubação a 37oC. BEDFORD et al. (1995) constataram que durante a

conservação do sêmen eqüino a +5oC e diluído em diferentes diluidores foi observada

interação deletéria entre o plasma seminal e a gema de ovo. Esta diminuição na motilidade

causada pela gema de ovo foi particularmente prevalente após longo período de

armazenamento (BEDFORD et al., 1995). Também constataram que a centrifugação do

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sêmen é essencial se a gema de ovo é adicionada ao diluidor. Assim, a remoção do plasma

seminal e adição de gema de ovo ao sêmen diluído no leite desnatado provê altas

percentagens de células móveis após 48 horas de incubação a +5oC (BEDFORD et al., 1995).

Resultado semelhante foi observado no presente estudo, pois uma maior PEM e MIP foi

obtida no sêmen lavado. BRINSKO et al. (2000) afirmaram que a centrifugação e remoção

parcial do plasma seminal antes do resfriamento e armazenamento foi benéfico para os

espermatozóides eqüinos que sofreram uma excessiva redução na motilidade espermática

progressiva, especialmente quando o sêmen é resfriado e armazenado por mais de 24 h.

Resultado semelhante foi observado no presente trabalho, pois dois animais só apresentaram

boa conservação por mais de 24 horas quando o plasma seminal foi removido, sendo também

observado que o sêmen do animal que não se conservava bem durante o período chuvoso (não

lavado), apresentava excelentes resultados no período seco. O mesmo efeito aconteceu com

outro animal que apresentou excelentes resultados no período chuvoso sendo que no período

seco não foi possível conservar o sêmen (não lavado) por 24h, podendo-se atribuir estes

resultados a uma possível variação individual entre os reprodutores. Há uma considerável

evidência que o resfriamento, entre outros processos, altera a função espermática e que alguns

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No tocante a época de coleta do sêmen (seca ou chuvosa) foi verificada diferença

significativa (P<0,05), somente quanto à MIP tanto no sêmen lavado e não lavado a 0 e 24 h

de conservação (tabela 1). Estes resultados demonstraram que o período de coleta do sêmen

não interferiu significativamente sobre a conservação do mesmo, sugerindo que os

componentes do plasma seminal de caprinos no semi-árido nordestino do Brasil não variam

entre os períodos seco e chuvoso.

A época do ano afetou a TDM do sêmen lavado, onde uma menor degradação foi

observada no período seco, com 72h / 4oC (tabela 2). Referente ao tratamento dado ao sêmen

antes do resfriamento (lavagem ou não) uma degradação significativamente inferior (P<0,02)

foi constatada no sêmen lavado (tabela 2). Estes resultados também contribuem para

demonstrar o efeito deletério do plasma seminal sobre a MIP.

O efeito da época de coleta do sêmen (seca ou chuvosa) sobre a morfologia (NO,

DC e PT) do sêmen lavado e não lavado, sugerem que há ligeira diferença na composição do

plasma seminal entre as épocas citadas, pois LA FALCI et al, (2002) sugerem que o plasma

seminal contem diferentes fatores que interferem na manutenção da viabilidade espermática e

que modula sua função, que por sua vez pode ser controlada por mudanças estacionais.

ROCA et al. (1997) observaram que a presença do plasma seminal preservou o número de

células com integridade acrossômica, ou seja, um maior número de alterações foi observado

no sêmen lavado.

Estudos conduzidos por AZERÊDO et al. (2001) demonstraram que a maior

incidência de defeitos menores (que parecem não interferir na fecundação – GCD, flagelo

pouco encurvado) foram significativamente influenciados pela presença do plasma seminal e

da congelação. Todavia, segundo os mesmos autores, no sêmen fresco não foi observado

efeito da presença ou ausência do plasma seminal. Resultado semelhante foi encontrado neste

trabalho onde o efeito da presença ou ausência do plasma seminal só foi observado após 72 h

de conservação, na anormalidade DC (tabela 4) e somente na época chuvosa (P< 0,04).

NUNES (1982) encontrou aspectos positivos da presença do plasma seminal nos

espermatozóides submetidos à congelação. Assim, os resultados encontrados trabalho

sugerem que para o resfriamento do sêmen caprino a presença ou ausência do plasma seminal

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parecem não interferir negativamente sobre a morfologia espermática. Isto pode levar o sêmen

a ser conservado sem a lavagem prévia do plasma seminal. Sendo provável que a lavagem

espermática remova tanto os componentes que favoreçam, quanto os que desfavoreçam a

sobrevivência espermática. Além disso, na prática não se utiliza o sêmen após longo período

de conservação (72 h), pois os valores de motilidade espermática se encontram abaixo dos

indicados para uso em inseminação artificial.

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CONCLUSÕES

1. Os parâmetros morfométricos de caprinos tipo SRD criados na região semi-

árida do Nordeste do Brasil são inferiores aqueles citados na literatura internacional. Estes

resultados demonstraram que o processo de adaptação de raças exóticas trazidas pelos

colonizadores portugueses ao longo destes 500 anos provocou uma diminuição do porte dos

caprinos, tornando-os mais rústicos, mostrando, todavia, características reprodutivas

satisfatórias, mesmo durante as épocas de escassez de alimentos.

2. O plasma seminal de época seca ou chuvosa afeta a sobrevivência e a

morfologia espermática, sugerindo-se que o plasma seminal é importante para que os

espermatozóides epididimários adquiram modificações funcionais e estruturais essenciais para

sua capacidade fertilizante. Nesse mesmo sentido, demonstrou-se que o plasma seminal de

época seca apresentou efeito deletério sofre os espermatozóide epididimários e o de época

chuvosa efeito benéfico. Estudos complementares sobre a composição do plasma seminal,

principalmente a presença da fosfolipase A2, darão uma melhor compreensão destes efeitos

deletérios observados in vitro.

3. O período do ano no Nordeste do Brasil não interfere significativamente na

conservação do sêmen caprino de animais da raça Saanen, quando estes são submetidos ao

manejo intensivo de criação, todavia recomenda-se a lavagem do sêmen quando se deseja

uma melhor qualidade espermática, pois o melhor período do ano para o beneficiamento do

sêmen caprino foi a época chuvosa.

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PERSPECTIVAS

1. A morfometria do trato genital poderá ser realizada em outras espécies, como

nos ovinos, e assim, verificar se a época do ano afeta a morfometria do trato genital dessa

espécie.

2. Apesar da diferença encontrada entre os tratamentos, a qualidade do sêmen não

lavado não o inviabiliza para uso em programas de inseminação artificial, sendo

recomendado, todavia, testes de fertilidade para comprovação da eficiência do sêmen

submetido ao processo de conservação.

3. Recomendamos que este estudo também seja realizado com sêmen congelado,

pois a comprovação de que o plasma seminal poderá não interferir significativamente na

fertilidade, facilitará o processo de conservação do sêmen caprino.

4. Estudos bioquímicos mais aprofundados necessitam ser realizados para verificar

se há diferença significativa entre a composição do plasma seminal de época seca ou chuvosa,

e caso haja, que época seria mais adequada para a realização da congelação do sêmen.

5. Estes estudos com sêmen deveriam ser realizados com caprinos tipo SRD e

assim verificar se a época do ano tem interferência sobre a conservação do sêmen.

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