PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM

DEAE -CELULOSE

• Os assuntos abordados nessa aula são:

- Dosagem de proteínas

- Métodos cromatográficos para separação de

proteinas e para a separação de imunoglobulinas

Métodos de Isolamento de Biomoléculas

O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede

os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D

e a compreensão de suas propriedades biológicas.

Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou

seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína

individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais

eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

Métodos de

purificação

1 proteína

isolada

Proteínas de uma célula

Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:

1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)

2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)

3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)

Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas

moléculas:

4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que

interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)

Métodos de Isolamento de Biomoléculas

Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas.

Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo

de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas

tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.

Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:

ORGANELAS

Lisossomos Lisossomos

Mitocôndria Mitocôndria

Golgi Golgi

Núcleo Núcleo

SOBRENADANTE

F 1 F

2 F

3 F

4

F 2 .1

F 2 .2 F

2 .3

F 2 .3.1

F 2 .3.2 . . . . . . F

2. 3.N

Precipitação com Sal/Solvente

Precipitação com Sal/Solvente

Cromatografia Troca Iônica

Cromatografia Troca Iônica

(pH ou resina diferente)

F 2 .3.N.X

1 Proteína apenas

(0.001g) - 0.1 a 0.5% total

Gel Filtração

MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)

O fluxograma ao lado representa a

“marcha” de purificação de uma proteína,

mostrando as etapas sucessivas, cada

uma consistindo de método, que levam ao

isolamento de uma proteína presente

numa mistura complexa.

Observe a quantidade de proteínas

(100g) presente no material inicial e

quanto da proteína purificada se obtém no

final (0,001g). Esses números são típicos

para a purificação da maioria das

proteínas, em especial enzimas.

Em cada etapa, a proteína de interesse é

separada das demais com base em uma

propriedade diferente. Consequente-

mente, as proteínas ainda misturadas com

aquela que está sendo isolada são cada

vez mais semelhantes em suas

características físico-químicas, exigindo

métodos cada mais sensíveis, capazes

de explorar pequenas diferenças, para se

chegar à proteína pura.

BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou

4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline

Reagente Bradford

= Coomassie

Brilliant Blue G-250

Método baseado em uma mudança espectral do

reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor

azul), quando interage com proteínas.

Interação com proteínas se dá através de

forças de Van der Waals e ligações iônicas,

especialmente com arginina, mas também com

resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e

fenlialanina.

Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de

proteínas reagem fortemente com o BCA

formando um composto azul,

Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato

Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um

complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm

1. Cu2+ é quelado pela proteína

[Cu2+-proteina]

2. Reação redox

Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína]

Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de

proteínas e cadeias laterais de aminoácidos

aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o

reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo-

mobidênio-tungstênio), dando um composto

de cor azul.

Método de Lowry

Métodos para medida do conteúdo de proteína:

2.- Materiais e Método para preparação da coluna deDEAE–celulose

para a separação de Ig G bovina

2.1.- Materiais

2.1.1- DEAE – celulose previamente embebido e carregado por tratamento

com soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH).

2.1.2- Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de

amônio e dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna

de DEAE – celulose. A concentração protéica dessa coluna deve ser

previamente determinada.

2.1.3.- Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e

preparada para ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de

cânulas de pequenas pinças para regulagem do fluxo da coluna.

2.1.4.- Tampão fosfato 0,01M pH 8,0.

2.1.5.- Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados

com a numeração de 1 a 15.

2.2.- Método:-

2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar

abrindo cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna

para 12 gotas por minuto. Quando não houver mais tampão acima da resina e

com a coluna fechada, deve ser adicionada a solução de gama globulina, com

muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida, abrir vagarosamente

a coluna para deixar a solução de gama globulina entrar na resina, fechando a

coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume

de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado

de modo a permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir

o fluxo da coluna, começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o

fluxo novamente para 12 gotas por minuto.

2.2.2.- Testar de cada fração colhida, por coloração rápida e com reativo

apropriado em uma microplaca, a presença de proteína, misturando-se l da

fração com l do reativo.

2.2.3.- Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no

comprimento de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M

pH 8,0.

2.2.4.- Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene

a -20ºC para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.

Gama-Globulina

3ml

12 gotas/min

Assunto 04- figura 01

Solventes miscíveis com a água diminuem a constante

dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação

das proteínas.

Os mais utilizados são etanol e acetona.

Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou

quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico.

Água

Dimetilformamida

Metanol

Etanol

Acetona

Clorofórmio

Benzeno

78.5 1.85

48.9 3.96

32.6 1.66

24.3 1.68

20.7 2.72

4.8 1.15

2.3 0.00

Solvente Constante

Dielétrica

Momento

Dipolar

Proteína P.I.

Pepsina <1,0

Ovalbumina galinha 4,6

Albumina sérica humana 4,9

Tropomiosina 5,1

Insulina bovina 5,4

Fibrinogênio humano 5,8

Gama-globulina 6,6

Colágeno 6,6

Mioglobina equina 7,0

Hemoglobina humana 7,1

Ribonuclease A bovina 7,8

Citocromo C equino 10,6

Histona bovina 10,8

Lisozima, galinha 11,0

Salmina, salmão 12,1

Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI

tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam

a camada de solvatação menos organizada.

Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.

-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros

tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.

- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja

- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente

- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.

Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é

necessário reverter as condições que levaram à precipitação.

Membrana

de celofane

solvente

solução a

ser dialisada

Aos precipitados obtidos com sal ou

solvente, adiciona-se água.

Ao precipitado obtido com variação

de pH, retornar ao pH original.

início final Dt

Co

nce

ntr

açã

o

Tempo ou volume

Coletor de

frações

Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica

Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou

matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),

banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.

Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:

Tempo 1

Mais tampão é

colocado na

coluna,

forçando os

componentes

da amostra a

interagirem

com a resina

Componentes da

amostra se

separam e saem

da coluna com

diferentes

volumes de

tampão

Tempo 2 Tempo n

Líquido

que sae

da coluna

é

recolhido

em tubos

de um

coletor de

frações

Os componentes da mistura são

separados por interação diferenciada

com a resina, com base em

propriedades moleculares como:

• massa molecular

• carga elétrica

• solubilidade

• afinidade

Amostra com

diferentes

componentes

Resina

embebida

em

tampão

Tempo zero

Um cromatograma, como o

gráfico ao lado, é a maneira

usual de se representar o

resultado de uma

cromatografia.

Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar

separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?

Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:

separação de moléculas pela massa molecular

géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros

Cromatografia de troca iônica:

separação de moléculas pela carga elétrica

géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente

Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):

separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso

géis possuem carácter hidrofóbico

Cromatografia de afinidade:

separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante

géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular

grãos (beads) da

resina com poros grão da resina poroso

proteína grande

proteína pequena

Tampão

“empurra”

moléculas

através da

resina

tubos

Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes

volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os

canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o

percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.

Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com

pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de

volume morto (Vo).

Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um

volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).

Moléculas com massas diferentes

Fluxo do tampão

Ab

sorb

ân

cia

a 2

80

nm

volume

Med

ida

da a

tiv.

bio

lóg

ica

Moléculas

maiores

Moléculas

menores

Kav

Massa m

ole

cula

r (k

D)

20 40 60 80 100 120 mL

25 50 75 100 125 mL

volume de eluição

A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de

uma proteína em seu estado nativo

Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica

e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a

gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.

Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa

molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.

O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-

filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.

Curva de calibração

traçado da medida de atividade

biológica nas frações

Medir o volume de eluição

da fração mais ativa.

Transportar para a curva de

calibraçao.

Ler a massa

correspondente

Observa

r a

escala

log

Cromatografia de troca iônica

A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou

negativa, em uma ampla faixa de pH.

Trocadora de ânions Trocadora de cátions

DEAE CM

Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),

como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem

carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

Adsorção

Eluição

+ +

+

+

+ +

+

+

Moléculas com a mesma carga,

ou sem carga, não interagem com a resina,

sendo as primeiras a sair da coluna

Adição de sal ao tampão resulta em

competição entre os íons em solução

e as moléculas adsorvidas na resina.

Na+Cl- +

A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas:

1) adsorção das proteínas com carga contrária à

resina, e saída da coluna das proteínas com a

mesma carga;

2) eluição das proteínas adsorvidas.

+ +

+

+

+ +

+

+

+

+ +

No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou

trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):

Para a eluição, as condições de adsorção da coluna

(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a

interação entre as proteínas e a resina.

Mais frequentemente utiliza-se um aumento da

concentração do sal no tampão, pois alterações

de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a

precipitar dentro da coluna.

PI ácido

+

básico

- neutro

-COOH -COO

-NH3

H +

+

-

H +

-NH2

Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico

das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.

Proteína P.I.

Pepsina <1,0

Ovalbumina galinha 4,6

Albumina sérica humana 4,9

Tropomiosina 5,1

Insulina bovina 5,4

Fibrinogênio humano 5,8

Gama-globulina 6,6

Colágeno 6,6

Mioglobina equina 7,0

Hemoglobina humana 7,1

Ribonuclease A bovina 7,8

Citocromo C equino 10,6

Histona bovina 10,8

Lisozima, galinha 11,0

Salmina, salmão 12,1

Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

Proteínas apresentam carga positiva quando em meio

ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em

meio alcalino em relação ao seu pI.

Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido

ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio.

A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o

pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos

aminoácidos ácidos e básicos.

Carboximetil~celulose

(trocadora de cátions) Dietilaminoetil~celulose

(trocadora de ânions)

Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica

Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo

com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do

tampão de eluição.

As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas,

sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).

_

=

= _

+

+ + + +

(+)

(+)

(+)

(+)

0. 10 M

0. 15 M

0. 20 M

Eluição NaCl

Não retidas

DEAE + +

0. 10 M

0. 15 M

0. 20 M

Eluição NaCl

+

(-)

(-)

(-)

+ + +

_ =

= _ (-)

Não retidas

CM

Tipos de Resina de troca Iônica

Tipos de Resina de troca Iônica

Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES

Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH 2 N+(CH 3 ) 3 Troca aniônica

resina de polistireno

Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO 3 -H Troca Catiônica

resina de polistireno

DEAE - celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas

- CH 2 CH 2 N+(C 2 H 5 ) 2 ácidas e neutras

CM - celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas

- CH 2 COOH básicas e neutras

DEAE - Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração

básico - CH 2 CH 2 N+(C 2 H 5 ) 2 e troca iônica de proteínas

ácidas e neutras

CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração

ácido - CH 2 COOH e troca iônica de proteínas

básicas e neutras

* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio Rad Laboratories

Cromatografia de afinidade:

Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao

ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou

por competição com o ligante livre

Desprezar

proteínas não

retidas

Lavagem

Eluição

pH 2,0 ou sal

Antígeno A

puro

Anti-A

interage

apenas

com a

proteína A

-

Mistura de proteínas

Coluna

empacotada

com esse gel

Partículas de

gel recobertas

de anticorpos

anti-A

Adsorção

Complexo

Ag-AC é

desfeito

Um dos métodos mais

eficientes para a

purificação de proteínas,

possibilitando um alto

rendimento com número

reduzido de etapas.

A separação de

moléculas tem como

base a interação

específica do analito

(molécula-alvo) com um

ligante imobilizado na

matriz. Forças

envolvidas nessa

interação podem ser não

covalentes

(eletrostáticas,

hidrofóbica, pontes de H)

ou covalentes (p.e.,

ponte dissulfeto).

Ex: cromatografia de imunoafinidade

Ligante

grupo-específico

Especificidade

Proteína A Região Fc de IgG

Proteína G Região Fc de IgG

Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-

Cibacron Blue Várias enzimas, albumina

lisina Plasminogênio, RNA ribossomal

arginina proteinases tipo tripsina

benzamidina proteinases tipo tripsina

calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina

heparina Fatores de coagulação, lipases,

hormônios, receptores estoróides, etc

Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos

de His expostos

1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo

- análogos de substratos ou inibidores de enzimas

- agonistas ou antagonistas de receptores

- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos

- ligantes com “tag” ou “marcação”

- glutationa-S-transferase

- poli-Histidina

2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:

Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade

8-AEA-cAMP

8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic

monophosphate

(ligante para proteínas com afinidade por cAMP

ou cGMP)

Sítios de ligação das proteínas

A, G e L à imunoglobulina, que

permitem a purificação de

anticorpos por cromatografia

de afinidade

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento

estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade

ou impede sua ligação à resina.

A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco.

Estratégias para acoplamento de ligantes à resina

Reagente Alvo no ligante

Braço espaçador covalente entre

a resina e o ligante

Ligação reversível não covalente

ligante

Molécula-alvo (analito)

Preparo da resina de afinidade:

Passo 1. Ativação da resina

Passo 2. Acoplar

o ligante