Mutacoes Em Bacterias

Modificação da informação genética (II)

Principais mecanismos que geram variabilidade genét ica nas bactérias e contribuem para o processo de evolução:

. Mutação

. Transposição

. Transferência de genes ( veiculada por plasmídeos ou bacteriófagos)

. Recombinações entre regiões das moléculas do DNA

Como surgemas mutações ?

• Espontâneas– na ausência de qualquer agente mutagénico– aleatórias; podem resultar de erros durante a replicação do

DNA– Baixa frequência: ~ 10-8 por par de nucleótidos e por

geração

• Induzidas– Desenvolvem-se após exposição a um agente mutagénico,

que aumenta a frequência de mutação.

Mutação - qualquer alteração permanente de uma sequência debases do DNA, mesmo que não tenha efeito detectável no fenótipo.

Pode levar ao estabelecimento de uma subpopulação.

Teste de Ames– usado para despistar a potencial acção mutagénica de compostos químicos (por exemplo, compostos aditivos de alimentos ou cosméticos, pesticidas, etc.); recorre a mutantes auxotóficos de bactérias (ex. Mutante His- de Salmolella sp.). Neste teste, é analisada a frequência de reversão das células de mutante auxotrófico a prototróficas por acção do composto a testar.

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Teste de Ames-detecção de compostos mutagénicos

Placa controlo(colónias de revertentes espontâneos)

Placa onde foi introduzido o possível agente mutagénico–maior nº de colónias prototróficas em relação à histidina do que na placa controlo

Estirpe ou clone - uma população de células geneticamente idênticas

Gene- um fragmento de DNA em que a sequência de bases, após transcrição e tradução, origina uma proteína com uma sequência de aminoácidos bem definida

Genoma - conjunto de todos os genes de um organismo.

Genótipo - conjunto de genes específico que um organismo possui.(Ex. his, his-)

- gene hisC (codifica para proteína HisC); hisC-

Fenótipo - propriedade observável. A expressão fenotípica é profundamente influenciada por factores ambientais.Ex. Estirpe His+ versus estirpe His-

→→→→

Mutação espontânea

Tautomerismo de bases-resulta de erros na replicação do DNA devido à incorporação de nucleótidos contendo for-mas tautoméricas raras das bases.

Os níveis de mutação espontâneasão controlados pela actividade de polimerases 5´-3´ e exonucleases 3´-5´(reconhecimento e reparaçãode erros durante a replicaçãodo DNA)


Mutação espontânea por transição


Neste tipo de mutação uma purina é substituída por outra purina diferente (ou uma pirimidina por outra pirimidina d iferente)ex: G A

C T

Neste tipo de mutação uma purina é substituída por outra purina diferente (ou uma pirimidina por outra pirimidina d iferente)ex: G A

C T

Outras causas de mutações espontâneas:- radicais de oxigénio (p.ex. Guanina →→→→ 8-Hidroxiguanina)

Mutação pontual

Adição e eliminação de bases


Seta azul –indica a direcção da replicação

Hipotéticamente, pode ocorrerum escorregamento numa dascadeias (cadeia em formação ou parental) que leva àformação de um “laço”estabilizado por ligações de –H-

A continuação da replicaçãode DNA leva à adição ou remoçãode nucleotídeo(s), respectivamente.

Adição de 1 T Eliminação de 2 Ts

Transposição

- requer a enzima transposase e extremidades contendo sequências de repetição invertida (IR); recombinação não-homóloga

- em células do tipo procariótico e do tipo procariótico

- sequências de inserção são transposões simples

Transposões complexos – podem transportar genes diversos (p.ex. Genes que conferem resistência a antibióticos ou a metais pesados, genes que codificam para toxinas, etc)

(~750 – 1600 bp)

Tn-5Tn-10

Canamicina (resistência)Tetraciclina (resistência)

Tn-1681 →→→→ Heat-stable enterotoxin formation (virulência)

A mutação pode ocorrer por inserção de uma sequênci a de inserção ou de um transposão complexo dentro da sequência codificante de um gene ou na sua região reguladora.

Consequências possíveis:

- paragem prematura da tradução por introdução de um codão „stop“;- interrupção da sequência codificadora de um gene;- activação da transcrição de um gene (o transposão pode transportar uma região reguladora);- transferência de genes para plasmídeos, ou de plasmídeos para o cromossoma;

(P.ex. Os transposões complexos que transportam genes de resistência a antibióticos podem contribui para a criação de plasmídeos R e para a disseminação deste fenómeno entre bactérias)

Efeito das mutações ao nível das proteínas

Mutação "missense"

Molécula de DNAnormal

⇒⇒⇒⇒ Proteína normal

Mutação pontualnum codão pode levar à substituição de um aminoácido por outro, resultando numa proteínadiferente (p.ex. inactiva)

Mutação "nonsense“(sem sentido)

Origina o aparecimentode um codão STOP, tendocomo consequência a produçãode uma proteína truncada, sem actividade

Mutação "frameshift„(mutação desfasada)

A adição ou eliminação depares de bases não múltiplosde 3, leva à alteração da gre-lha de leitura aberta do segmento de DNA que codifica para uma proteína

Expressão das mutações

A detecção de mutantes numa população microbiana só é posível se as alteraçõesocorridas no património genético do microrganismo c ausar uma alteração de fenótipo

�� "Forward mutation„ (mutação directa)

�� "Reverse mutation" (mutação inversa)

AAA ( K, Lys) GAA (E, Glu) AAA (K, Lys)selvagem mutante selvagem

Forward Reverse

UCC (S, Ser) UGC (C, Cys) AGC (S, Ser)selvagem mutante selvagem

Forward Reverse

Gene →→→→ gene mutado →→→→ proteína modificadaselvagem „ Forward “

Estirpe selvagem →→→→ Mutante

Contudo, a seguir a uma primeira mutação directa, p odem seguir-se mutações (mutação inversa ou mutação supressão) que restabel ecem o genótipo selvagem ou um genótipo equivalente ao que existia antes d a 1ª mutação ⇒⇒⇒⇒ restabelecimento do fenótipo original

�� "Suppressor mutation" (mutação supressão)

As mutações de supressão (alteração compensatória) podem restabelecero fenótipo original. Podem ser intragénicas ou extragénicas

K S P S L R AAAG AGU CCA UCA CUU AAU GCC

(-A) (+G)

AAG GUC CAU CAC UUA AUG GCCK V H H L M A

Selvagem

Mutanteduplo

Ex. mutação supressão intragénica

Mutação silenciosa

Devido à degenerescência do código genético, nem todas asmutações são expressas fenotipicamente. Em muitos codões,a modificação na 3a base é uma mutação silenciosa.

GCU GCC, GCA, GCGA A A A

Mutação neutra

Resulta na codificação de um aminoácido diferente, masfuncionalmente equivalente

AAA AGAK R

Lisina Arginina (aminoácidos com cadeias laterais iónicas)

�� Agentes mutagénicos

��Químicos ��Físicos

Exemplo:Radiação UV

Mutações induzidas

�� Preparação e selecção de mutantes

Agentes mutagénicos - são agentes que aumentam a taxa de mutação (~ 1000 x)

Taxa de mutação - é a probabilidade de haver uma mutaçãonum gene quando a célula divide. A taxa de mutação espontânea num determinado gene é de 10 - 8 (1 mutação em cada 10 8 genes que replicam)

• Os agentes mutagénicos são frequentemente usados em laboratório para aprodução de mutantes para investigação ou melhoramento de estirpes para fins biotecnológicos

⇒⇒⇒⇒ Selecção de mutantes

• Para fins biotecnológicos, os mutantes obtidos por ma nipulação genética são mais difíceis de aceitar

�Bioquímicos- levam a alterações metabólicas

- Auxotróficos- Têm mutações em vias metabólicas- Necessitam de um produto de uma

via metabólica no meio de cultura, porque não são capazes de o sintetizar

- Prototróficos• Crescem em meio mínimo

(sem suplementos adicionais)

Exemplos• Auxotróficos para a síntese de

aminoácidos, vitaminas, etc.- Placas réplica com meio de cultura completo e meio mínimo

Tipo de mutantes Selecção

Detecção e selecção de mutantes

Mutantes nutricionais (auxotróficos Lys-)obtidos por réplica plating

"Master plate "Meio de crescimento completo (contendo lisina)(os mutantes Lys- estão assinaladoscom um x)

" Replica plate "Meio mínimo (sem lisina)

Selecção indirecta (negativa)- „replica plating“


1) Tratamento com agente mutagénico

2) Selecção de mutantes auxotróficos para a Lisina (Lys-)

A selecção indirectapermite detectar Mutantes bioquímicose mutantes condicionais

Por exemplo, a técnica de replica platingé usada para identificar mutantes que perderam a capacidade de sintetizar um nutrienteessencial (são auxotróficosem relação a esse nutriente)


Mutantes nutricionais (auxotróficos Lys-)obtidos por réplica plating

"Master plate "Meio de crescimento completo (contendo lisina)(os mutantes Lys- estão assinaladoscom um x)

" Replica plate "Meio mínimo (sem lisina)

�Bioquímicos- levam a alterações metabólicas

- Auxotróficos- Têm mutações em vias metabólicas- Necessitam de um produto de uma

via metabólica no meio de cultura, porque não são capazes de o sintetizar

- Prototróficos• Crescem em meio mínimo

(sem suplementos adicionais)

Exemplos• Auxotróficos para a síntese de

aminoácidos, vitaminas, etc.

• Deficientes na capacidade de fermentar açúcares

- Placas réplica com meio de cultura completo e meio mínimo

- Meio contendo um indicador de pH


Detecção e selecção de mutantes


�� MorfológicosAnálise da morfologia colonial(cor, mucosidade)

Ex: mutantes pigmentados e despigmentados de Aspergillus nidulans

�� de Resistência (resistentes)

Crescimento em meio de cultura que contém concentrações seleccionadas do agente de resistência (ex. toxina, antibiótico, etc.)

Ex: Desenvolvimento de colónias resistentesa um antibiótico

Selecção directa

A selecção directapermitedetectar mutantes morfológicos,mutantes de resistênciae mutantes prototróficos(a partir de população de mutante auxotrófico)


Teste de Ames– usado para despistar a potencial acção mutagénica de compostos químicos (por exemplo, compostos aditivos de alimentos ou cosméticos, pesticidas, etc.); recorre a mutantes auxotóficos de bactérias (ex. Mutante His- de Salmolella sp.). Neste teste, é analisada a frequência de reversão das células do mutante auxotrófico a prototróficas por acção do composto a testar.


�� Exemplos de agentes mutagénicos

��Químicos ��Físicos

Exemplo:Radiação UV

Incorporação de análogos de bases

Nos análogos de bases existe maior frequência da forma enol rara

Ex: 5-bromouracilo


A molécula de 5-bromouracilo é incorporada no DNA em lugar detimina, mas muitas vezes emparelha com guanina. O c rescimento de uma população de células na presença deste análo go origina uma descendência de células onde ocorreu substituiç ão de bases(par A-T →→→→ par G-C).

Agentes alquilantes

Agentes:HidroxilaminaMetanossulfonato de etilo (EMS)Metanossulfonato de metilo (MMS)N-metil-N´-nitro-N-nitrosoguanidina

Posições de alquilação:N7 e O6 da guaninaN3 da adeninaO4 da timina

A alquilação de purinas (A, G)também torna mais lábil a sua ligação à desoxirribose ⇒⇒⇒⇒ depurinação do DNA


⇒⇒⇒⇒ Emparelhamento errado de bases

Desaminação oxidativa das bases por acção de HNO2

A adenina é desaminada a hipoxantina a qual forma ligação com citosina emvez de timina

A citosina é desaminada a uracilo, o qual liga a adenina em vez de guanina

A guanina é desaminada a xantina, a qual continua a emparelhar com citosina, mas só por duas ligações de hidrogénio⇒⇒⇒⇒ Ligação mais lábil


Ácido nitroso como agente mutagénico

A adenina desaminada emparelha com a citosina


O ácido nitroso pode ser gerado na água a partir de NO2- (nitrito; poluente da água)

Agentes que se intercalam entre as bases da cadeia dupla de DNA

Estes agentes químicos intercalam-se entre as bases do DNAformando um "laço" numa das cadeias. Quando ocorre replicação,uma ou mais bases podem ser inseridas ou eliminadas. Estes agentes causam mutações do tipo "frameshift" .

Exemplos:

-Brometo de etídeo-Acridina laranja-Proflavina

Agentes mutagénicos físicos – Radiação UV

Mutantes de interesse são seleccionados entre as células sobreviventes.

Vantagem: é eficiente e evita o recurso a compostos químicos (que são tóxicos)

Realizar selecção de mutantes naausência de luz visível(mutação pode ser eficientementereparada por acção fotoquímica)

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