Mutações MECANISMOS DE REPARO DO DNA SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA Profa. Dra. Ana...
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Mutações
MECANISMOS DE REPARO DO DNA SÍNDROMES DE INSTABILIDADE
CROMOSSÔMICA
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
Departamento de Biologia
TERMINOLOGIA
Mutagênicos: causam mutações de ponto Clastogênicos: causam alterações na
estrutura cromossômica Carcinogênicos: aumentam o risco de
aparecimento de tumores Turbagênicos (aneugênicos): atuam nos
processos envolvidos no fuso celular (aneuploidias)
Citotóxicos: morte celular
Peróxido de hidrogênio: causa danos ao tecidos e ao DNA.
Corantes: geralmente são carcinogênicos; principalmente os corantes fluorescentes são intercalantes do DNA (mutagênicos e carcinogênicos).
Brometo de etídeo, Diaminobenzidina e 5-Bromo-2`-Deoxyuridine-(BrDu) são carcinogênicos e mutagênicos.
Éter: pode provocar lesões no fígado e afetar o sistema nervoso central
Clorofórmio: causa irritação à pele, olhos e trato respiratório, afeta Sistema Nervoso Central, rins, Sistema Cardiovascular e fígado. Pode causar câncer dependendo do nível e duração de exposição.
Fenol: Corrosivo, irritante das membranas mucosas, causa severas queimaduras, afeta o sistema nervoso central, fígado e rim.
Xilol: Afeta o sistema nervoso central. Causa severas irritações na pele, olhos e trato respiratório. Pode ser danoso se absorvido pela pele.
Metanol: Causa irritação na pele, olhos e trato respiratório. Afeta o sistema nervoso e o fígado.
Acrilamida e Bis-acrilamida: são mutagênicas, causa irritação da pele, olhos e trato respiratório. Pode afetar o sistema nervoso central.
PRODUTOS QUÍMICOS USADOS EM LABORATÓRIO
Rev. Nutr. vol.13 no.2 Campinas May/Aug. 2000
-compostos fenólicos, fibras, clorofila, -caroteno, vitaminas (C e E).
(Vit E)
TIPOS DE LESÕES NO DNA
Estimativa: 100.000 lesões célula/dia (quebras SSB, perdas de bases espontâneas, outras lesões)
Exposição ao sol (UV): induz 100.000 fotoprodutos/queraticócito
Preservação da Integridade do Genoma
Mecanismos para manutenção do genoma:
Sistemas de checkpoint e tolerância
Diversos mecanismos de reparo do DNA
Ativação do câncer e senescência, ou morte celular
LESÕES RETARDAM PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR
Danos DNA
Bloqueio do
ciclo celular
(Checkpoint)
Reparo do DNA
Apoptose
Doenças genéticas
Câncer
Síndromes de instabilidade cromossômicaEnvelhecimento
ATM
P53
MECANISMOS DE REPARO DO MECANISMOS DE REPARO DO DNADNAReparar danos no DNA surgidos Reparar danos no DNA surgidos
espontaneamente ou induzidos por espontaneamente ou induzidos por mutágenosmutágenos•Reparo diretoReparo direto
•Reparo de pareamento errôneo Reparo de pareamento errôneo (mismatch repair)(mismatch repair)
• Reparo de excisão de basesReparo de excisão de bases
•Reparo de excisão de nucleotídeosReparo de excisão de nucleotídeos
• Reparo de quebras de fita dupla no Reparo de quebras de fita dupla no DNA:DNA:
- Reparo Homólogo ou - Reparo Homólogo ou RecombinaçãoRecombinação
- Reparo da junção das - Reparo da junção das extremidadesextremidades
• reversão ativa da lesão → sem reversão ativa da lesão → sem retirar a base danificada → muito retirar a base danificada → muito eficienteeficiente
• OO66-metilguanina -metilguanina → transição G:C para → transição G:C para A:TA:T (produzida endogenamente ou (produzida endogenamente ou mutagênicos químicosmutagênicos químicos alquilantes) alquilantes)
•Enzima MGMT (metil guanina Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase)metiltransferase) → → remove o grupo remove o grupo metilmetil
• alto custo energético → uma alto custo energético → uma molécula da enzima é inativada para molécula da enzima é inativada para cada lesão corrigidacada lesão corrigida
REPARO DIRETOREPARO DIRETO
O6-metil guaninaO6-etil guaninaE.coli e mamíferos
Reparadas pela O6-metilguanina
DNA metiltransferases
(MGMT)
Transfere grupo alquil (metila) para uma cisteína da DNA metiltransferaseA proteína é inativada
REPARO DIRETOREPARO DIRETO
GG
CC
Agente Agente alquilaalquilantente
GG
CC
CHCH33
O6-Metilguanina
GG
CC
MGMMGMTT
CHCH33
DNA DNA restaurado e restaurado e
enzima enzima inativainativa
GG
CC
CHCH33Reconhecimento Reconhecimento
da base alterada e da base alterada e transferência do transferência do grupo metil para grupo metil para
resíduo de resíduo de cisteína da MGMTcisteína da MGMT
Reparo Reparo DiretoDireto
MGMMGMTT
• reparo pós-replicação: bases incorporadas erroneamente no DNA durante a replicação (DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb)REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: DNA pol com atividade exonuclease 3’ 5’: corrige 99,9% dos erros de replicação
• eliminação de bases mau pareadas e alças de deleção/inserção• atua na cadeia recém-
sintetizada → →
logo após a replicação do DNAlogo após a replicação do DNA
•Genes em humanos: MSH, MLH e PMS → → as proteínas formam complexos as proteínas formam complexos (heterodímeros)(heterodímeros)
•Genes em procariotos: MutS, MutL e MutH
REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO
MISMATCH REPAIR - MMRMISMATCH REPAIR - MMR
Deslizamentos da DNA Deslizamentos da DNA
Polimerase em regiões de Polimerase em regiões de microssatélite microssatélite sofre sofre deslocamento e produz deslocamento e produz filamento de DNA com bases filamento de DNA com bases extras extras formam alças formam alças
REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO
MISMATCH REPAIR - MMRMISMATCH REPAIR - MMR
Câncer de cólon não-poliposo Câncer de cólon não-poliposo familial: instabilidade de familial: instabilidade de microssatélitesmicrossatélites-70 a 85% de risco70 a 85% de risco- mutações em mutações em MLH1 e MLH2MLH1 e MLH2 são mais comunssão mais comuns
Mutações em genes MMR segregam com a síndrome de predisposição ao câncer colorretal não polipose (HNPCC) maioria dos pacientes são heterozigotos para mutações recessivas na linhagem germinativa em genes MMR (MLH, MSH, PMS)
células tumorais sofrem perda do alelo normal e exibem instabilidade de microssatélites números variáveis de repetições de microssatélites nas células tumorais
REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEOREPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO
GG
AA
5’ 3’
Cadeia filhaCadeia filha
Cadeia Cadeia parentalparental
Base errada
MSH3
Reconhecimento Reconhecimento do dano e corte do dano e corte na cadeia filhana cadeia filha
GG
AAMSH2MSH2
MSH6
AA
GG Excisão de Excisão de fragmento de 100 fragmento de 100
a 1000pb a 1000pb contendo a base contendo a base
incorretaincorreta
Fita reparadaFita reparadaTT
AA
MLH2 PMS2
Síntese de DNA e Síntese de DNA e ligação da fita ligação da fita reparadareparada
AA
DNA pol DNA pol //
DNA ligase
ETAPAS COMUNS
etapa 1 = incisão (endonuclease) e excisão (exonuclease)
etapa 2 = ressíntese do DNA (DNA polimerases β, δ, ε)
etapa 3 = ligação das extremidades (DNA ligases)
REPAROS DE EXCISÃO:
Reparo de excisão de bases
Reparo de excisão de nucleotídeos
REPARO POR EXCISÃO DE BASES - REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBER
• reparo de danos causados por agentes endógenos (danos oxidativos (ROS) oxigênio reativo,radicais livres H2O2, hidrólises) que modificam a estrutura das bases
• reparo de danos induzidos por radiação ionizante e agentes alquilantes
• rrealizado pelas DNA glicosilases: cada DNA glicosilase (~ 8 genes diferentes) reconhece uma base alterada no DNA e catalisa sua remoção por hidrólise
•Ex.: uracila-DNA-glicosilase remove a uracila do DNA remove a uracila do DNA (desaminação da C (desaminação da C U) U) transição GC transição GC AT AT
- quebram ligações base-açúcar
- liberam as bases gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos (sítios AP)
- sítio reparado por endonucleases específica
REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBASES - BER
•Etapas:
• remoção da base danificada (DNA glicosilase) sítio AP
• incisão do sítio AP na porção 5’ (endonuclease)
• excisão do terminal 5’ e remoção (exonuclease) gerando lacuna de 1 nucleotídeo (via curta) ou 2-12 nucleotídeos (via longa)
• síntese DNA (DNA polimerase)
• ligação da cadeia (DNA ligase)
REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBASES - BER
*
Base danificada
DNA DNA glicosilasglicosilas
ee
ReconhecimenReconhecimento e formação to e formação
do sítio APdo sítio AP
APE1
ReconhecimenReconhecimento e incisão 5’ to e incisão 5’
do sítio APdo sítio AP
XRCCXRCC11
DNA DNA polpol
Excisão da Excisão da porção açúcar-porção açúcar-P e síntese de P e síntese de
DNADNA
XRCCXRCC11
DNA DNA ligase ligase
IIIIII
Ligação da Ligação da cadeiacadeia
Short-patch Short-patch
Quebra de cadeia simples
XRCCXRCC11
PARPPARPReconhecimReconhecim
ento da ento da quebraquebra
PNKPNK Incisão 5’Incisão 5’
PCNPCNAA
DNA polDNA pol
FENFEN11 Síntese Síntese
DNA e DNA e excisãoexcisão
DNA DNA ligase Iligase I
Long-patchLong-patch
Ligação Ligação da da
cadeiacadeia1 nucleotídeo
2-13 nucleotídeos
REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NERNER• remoção de adutos no DNA remoção de adutos no DNA distorção da distorção da
dupla hélicedupla hélice
• dímeros de pirimidina (radiação UV) , HAP, dímeros de pirimidina (radiação UV) , HAP, cisplatinacisplatina
• fatores ambientaisfatores ambientais
• principal mecanismo de reparoprincipal mecanismo de reparo
• deficiência: doenças genéticasdeficiência: doenças genéticas
•realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG (humanos)
•Bactérias: complexo UVrA, UVrB, UVrC e UVrD
• remove 22-30 nucleotídeos
Xeroderma Pigmentoso Xeroderma Pigmentoso
-Mutações em XPA-XPGMutações em XPA-XPG
- 1000 a 4000X o risco de câncer de pele 1000 a 4000X o risco de câncer de pele exposição solar ou irradiação UV exposição solar ou irradiação UV
Etapas: Reconhecimento da lesão no DNA (complexo XPA-XPC)
ligam-se ao DNA danificado abertura da dupla hélice atividade de helicase
XPB e XPD Dupla incisão na cadeia danificada: 3’ (XPG) e 5’ (XPF) Excisão remoção do segmento de DNA Síntese de DNA DNA polimerase Ligação da cadeia DNA ligase
REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NUCLEOTÍDEOS - NERNER
Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)
Reconhecimento dano (XPA-XPC)→ interação com TFIIH →atividade de helicase
ERCC1-XPF: endonuclease que corta a fita em 5’
XPG: endonuclease que corta a fita em 3’
DNA pol, PCNA, RPA e RFC: síntese da fita nova
Ligase
Fragmento 26-27 nucleotídeos
SÍNDROMES ASSOCIADAS A DEFEITOS NO NER
Reconhecimento da lesão
Incisão
Excisão: remoção dano
Síntese reparo
http://www.uenf.br/Uenf/Downloads/LBT_4516_1187792657.pdf
COMPARAÇÃO ENTRE OS REPAROS BER E NER
REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA DUPLA
• DSB (quebra fita dupla):DSB (quebra fita dupla): lesão espontânea lesão espontânea induzida por radicais de Oinduzida por radicais de O22 livres, replicação do livres, replicação do DNA e agentes genotóxicos como a radiação DNA e agentes genotóxicos como a radiação ionizanteionizante
• causa de aberrações cromossômicascausa de aberrações cromossômicas
• Duas vias principais em mamíferos:Duas vias principais em mamíferos:
•Reparo recombinação homóloga (RH)Reparo recombinação homóloga (RH)
pareamento com o cromossomo homólogo intacto
• Reparo de ligação das extremidades não- Reparo de ligação das extremidades não- homóloga (NHEJ)homóloga (NHEJ) religação direta das extremidades quebradas
REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA DUPLA •Reparo homólogo (RH) Reparo homólogo (RH) Etapas
•Reconhecimento da quebra e pareamento do cromossomo homólogo intacto com o cromossomo que apresenta a quebra dupla
•Degradação das extremidades danificadas
•Deslocamento da cromátide-irmã intacta para o sítio a ser reparado
•A cromátide-irmã serve como molde para síntese de DNA restaura a sequência original
•Ligação das extremidades
REPARO HOMÓLOGOREPARO HOMÓLOGO
Radiação ionizante
CromátidCromátides irmãses irmãs
Quebra de Quebra de cadeia cadeia dupladupla
Degradação Degradação 5’-3’5’-3’Rad5Rad522
Rad
50 MRE1
1NBS1
BRCA1BRCA1 Rad54Rad54
Invasão Invasão da cadeiada cadeia
BRCABRCA22 Rad51Rad51
DNA DNA polpol
DNA DNA ligaseligase
Síntese de Síntese de DNA e ligação DNA e ligação das cadeiasdas cadeias
Reparo Reparo DNA com DNA com fidelidadefidelidade
ProcessamenProcessamento das to das
extremidadeextremidadess
LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGASHOMÓLOGAS
DNA fita duplaDNA fita dupla
Agente Agente danificantedanificante
Quebra de cadeia Quebra de cadeia dupladupla
DNA DNA PKc1PKc1
KU80KU70
KU80KU70
XRCC4XRCC4
DNA ligase DNA ligase IVIV Ligação das Ligação das
extremidadextremidadeses
DNA reparado DNA reparado com baixa com baixa fidelidadefidelidade
Ligação c/ RPA (proteína de replicação) e RAD51 (recombinase)
Facilita o encontro da cromátide-irmã e invasão
Células em proliferação
Células em proliferação ou não
Ligação das extremidades pela LIG4+XRCC4
Modificação das extremidades: KU70 e KU80 recruta DNA-PK (proteína quinase) complexo
Ligação das extremidades pela LIG1
http://www.sbbq.org.br/revista/mtdidaticos/Env.pdf
CLASSES DE DISTÚRBIOS AFETANDO A
MANUTENÇÃO DO GENOMA
1. Envelhecimento acelerado: síndromes progeróides
2. Tipos de câncer:
3. Envelhecimento acelerado e câncer
SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA: ENVELHECIMENTO (PROGÉRIA)
Síndrome Genes mutados Processo Afetado Sintomas
Cockayne CSA, CSB, XPB, NER
XPD, XPG
Tricotiodistrofia XPB, XPD, TTDA NER
Rothmund-Thomson RECQL4 Deficiência helicase
(reparo de danos oxidativos)
Hutchison-Gilford LMNA função da lâmina nuclear
(Progéria)
SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA: CÂNCER
Síndrome Genes mutados Processo Afetado
Câncer mama BRCA1, BRCA2 Reparo Homólogo
familial (quebras duplas)
Li-Fraumeni TP53 Checkpoint G1-S
Câncer colorretal não- MSH2, MLH1 Mismatch repair
polipose hereditário (MMR)
(HNPCC)
SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA: PROGÉRIA + CÂNCER
Síndrome Genes mutados Processo Afetado
Xeroderma pigmentoso XPA-XPG NER
S. Bloom BLM Deficiência helicase
(recombinação mitótica)
Anemia de Fanconi FANC Reparo DNA crosslink
Ataxia telangiectasia ATM Reparo DSB
S. Werner WRN Deficiência helicase
(recombinação/reparo DNA
manutenção dos telômeros)
Adolescência - 40 anos
Xeroderma Pigmentoso
Síndrome de Cockaine
Tricotiodistrofia
Anemia de Fanconi
Ataxia telangiectasia
Síndrome de Bloom
SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA
defeitos nos mecanismos de reparo e replicação do DNA
freqüência aberrações cromossômicas
incidência câncer
AR
Clínica
manifestações cutâneas (1,5 anos)
anomalias oculares (4 anos)
anomalias neurológicas progressiva (6 meses)
primeiro câncer de pele (8 anos)
Xeroderma (pele seca)
Incidência:
1/250.000 (USA) e 1/40.000 (Japão)
Células XP: sensíveis a radiação UV indivíduos incapazes reparar dímeros TT: risco ↑ câncer de pele (2000x)
XP: defeito no reparo de excisão de nucleotídeos (NER)
XERODERMA PIGMENTOSO (XP)
grupos de complementação: XPA-XPG diferenças clínicas defeitos enzimáticos incapacidade de excisar danos induzidos pela luz UV e mutagênicos químicos
diagnóstico exposição a luz solar
tratamento proteção da pele da luz solar
chapéus
óculos que absorvem luz UV
bloqueadores solares
roupas protetoras
acompanhamento periódico por dermatologista
Síndrome de Cockayne
Características:- Anormalidades esqueléticas: face
parecida com a de um passarinho
- Cáries, cifose e osteoporose em pacientes de idade avançada.
- Degeneração neurológica progressiva: início precoce, desenvolvimento psicomotor atrasado, defeitos no modo de andar e retardo mental.
- Microcefalia- Perda da audição, retinopatia
pigmentar, cabelos finos e cataratas
Morte: 12,5 anos
principais causas: pneumonia e infecções respiratórias
Alterações genéticas: Dois genes com mutações foram
identificados nesta síndrome: CSA e CSB.
O gene CSA, responsável pela síndrome de Cockayne do tipo 1→ cromossomo 5.
O gene CSB, responsável pela síndrome de Cockayne do tipo 2 → cromossomo 10q11.
Reparo defeituoso: NER
TRICOTIODISTROFIA (TTD)
AR
Clínica
cabelos quebradiços (deficientes S)
iquitiose (escamas de peixe)
retardo mental e físico
fácies distintivas orelhas protuberantes queixo retraído
descrita 1968 Pollitt e colaboradores
1/2 pacientes fotossensibilidade NER defeituoso
TTD não desenvolvem câncer de pele
TTD
XPB XPD
Helicases do fator de reparo/transcrição TFIIH
30 grupo de complementação: TTD-A (fator de transcrição basal)
AR
Clínica
anemia
alterações da pigmentação da pele (64%)
baixa estatura (62%)
malformações do rádio (50%)
anomalias oculares (41%), renais (34%),
microcefalia (37%), deficiência mental (25%)
90% anemia aplástica
ANEMIA DE FANCONI (FA)
descrita 1927 Guido Fanconi
incidência: 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos
8 grupos de complementação: FA-A, FA-B, FA-C, FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F e FA-G heterogeneidade genética
células FA: sensíveis à agentes químicos que causam ligações cruzadas entre as fitas de DNA: mitomicina C (MMC), diepoxibutano (DEB), mostarda nitrogenada (NM), cisplatina , ...
freqüência de neoplasias: leucemias e tumores hepáticos
quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri, quadri e multirradiais.
AR
Clínica
peso ao nascimento
retardo de crescimento pré e pós-natal
(145 cm H; 130 cm M)
telangiectasias e fotossensibilidade (borboleta)
cabeça alongada, microcefalia, inteligência normal
imunodeficiência: infecções (respiratórias e gastrointestinais)
SÍNDROME DE BLOOM (SB)
Incidência: 1/58.000 judeus
asquenazim
figuras quadrirradiais
mutações no gene BLM 15q26.1 DNA helicase ( RecQ) papel na replicação e reparo do DNA
Risco maior de câncer: carcinomas, leucemias e linfomas
AR
Clínica
-ataxia cerebelar (12-14 meses) disfunção neuromotora
-telangiectasia olhos e pele (3 e 5 anos) retardo de crescimento (70%)
incidência neoplasias (linfoma e leucemia linfóide) e imunodeficiências
incidência: 1/40.000
risco câncer de mama heterozigotos AT
ATAXIA TELANGIECTASIA (AT) SÍNDROME DE LOUIS-BAR
células AT sensíveis a radiação ionizante e agentes radiomiméticos (N-acetoxi-N-2-acetil-2-aminofluoreno - 4-NQO)
linfócitos AT rearranjos espontâneos dos cromossomos 7 e 14
4 grupos de complementação: A, C, D e E mutações gene ATM
gene ATM (11q22-23) diversas vias
controle transdução de sinal
checkpoint ciclo celular
resposta celular ao dano no DNA induzido por radiação
gene ATM interage p53 na checagem G1-S e mutações no gene ATM abolem mecanismo de reparo pré-síntese de DNA
defeito mecanismo de reparo do DNA ou defeito na replicação DNA
Doença Características Tipo de reparo do defeito Xeroderma Pigmentoso
Tumores de pele, fotossensibilidade,
cataratas, anomalias neurológicas
Defeitos de reparo de excisão de nucleotídeo, incluindo mutações nos
genes de endonuclease e helicase (XPA-XPG)
Anemia de Fanconi Anemia, suscetibilidade a
leucemia, malformações nos membros, rins e coração,
instabilidade cromossômica
Até oito genes diferentes (FANCA-FANCH) podem estar envolvidos, mas
sua função exata no reparo do DNA ainda não é conhecida
Síndrome de Bloom Deficiência de crescimento, imunodeficiência,
instabilidade cromossômica, aumento de incidência de
câncer
Mutações na família reqQ helicase Gene BLM
Síndrome de Werner Cataratas, osteoporose, aterosclerose, perda de
elasticidade da pele, baixa estatura, diabetes, aumento
de incidência de câncer
Mutações na família reqQ helicase Gene WRN
Ataxia telangiectasia Ataxia cerebelar, telangiectasias*, deficiência
imune, aumento de incidência de câncer,
instabilidade cromossômica
Produto do gene normal (ATM) provavelmente está envolvido no
bloqueio do ciclo celular após ocorrer dano ao DNA