nesseria gonorreia

Ministrio da Sade Secretaria de Polticas de Sade Programa Nacional de DST e Aids

Cultura, Isolamento e Identificao da Neisseria Gonorrhoeae

Braslia 2001

MINISTRIO DA SADE Jos Serra Ministro de Estado da Sade Cludio Duarte Secretrio de Polticas de Sade Paulo Roberto Teixeira Coordenador Nacional de DST/AIDS-MS Miriam Franchini Coordenadora de Produo do Projeto Telelab Autores: Cludia Renata Fernandes Martins Jos Antnio Pinto de S Ferreira Luis Fernando de Ges Siqueira Lus Alberto Peregrino Ferreira Maria Luza Bazzo Miriam Franchini Oscar Jorge Berro Slvio Valle Assessoria Pedaggica: Maria Lcia Ricciotti Ribinik Martistela Arantes Marteleto

Cultura, isolamento e identificao da Neisseria gonorrhoeae.Braslia: Ministrio da Sade, Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS, 1997. 72 p.: iI. (srie TELELAB) 1.Neisseria gonorrhoeae I. Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS (Brasil). II. Srie TELELAB

Os responsveis pela implantao do TELELAB empenharam toda sua capacidade profissional para tornar este projeto digno da qualidade tcnica e cientfica e da eficincia que nossa coordenadora-geral sempre imprimiu s realizaes do Programa Nacional de DST/ AIDS do Ministrio da Sade. Dra. Lair Guerra de Macedo Rodrigues, exemplo de coragem e liderana, dedicamos este trabalho.

Pedro Chequer

APRESENTAO............................................................................................................................07 INTRODUO E CARACTERSTICAS DA NEISSERIA GONORRHOEAE......................11introduo.........................................................................................................................................11 caractersticas da Neisseria gonorrhoeae...............................................................................12 amostras indicadas.................................................................................................................13 cultura.......................................................................................................................................14 condies para o crescimento da Neisseria gonorrhoeae........................................................15

IDENTIFICAO, CULTURA E ISOLAMENTO.........................................................................17meios de transporte..................................................................................................................19 meios de cultura.......................................................................................................................20 meios de identificao..............................................................................................................21 fluxograma................................................................................................................................22 obteno da atmosfera de CO2............................................................................................23 reconhecimento da Neisseria gonorrhoeae no meio de Thayer Martin...................................24 caractersticas morfotintoriais da Neisseria gonorrhoeae..........................................................25 prova de catalase.....................................................................................................................25 prova de oxidase.......................................................................................................................26 prova de degradao de carboidratos....................................................................................27 outros mtodos de identificao de Neisseria gonorrhoeae......................................................29 -lactamase ou penicilinase......................................................................................................29 prova da cefalosporina cromognica......................................................................................33 manuteno de cepas de Neisseria gonorrhoeae.................................................................33

CONTROLE DE QUALIDADE.....................................................................................................35 PREPARO DOS MEIOS..................................................................................................................39meio de Amies.........................................................................................................................41 meio de Trayer Martin modificado.............................................................................................42 suplemento definido de Kelloggs.............................................................................................43 meio para degradao de acares.......................................................................................44 meio de fitas para prova de oxidase.........................................................................................46 meio de BHI + glicerol.............................................................................................................46

BIOSSEGURANA..................................................................................................................47-69 CONSIDERAES FINAIS............................................................................................................63 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade


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Ao final deste curso voc ser capaz de: identificar os procedimentos, os testes e as tcnicas recomendados pelo Programa Nacional de DST/AIDS-MS para a cultura, o isolamento e a identificao de Neisseria gonorrhoeae; executar a cultura, o isolamento, a identificao de Neisseria gonorrhoeae e as provas especiais, obedecendo aos critrios tcnicos, critrios de controle de qualidade e cuidados de biossegurana recomendados.PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Cultura, Isolamento e Identificao da Neisseria Gonorrhoeae

INTRODUO E CARACTERSTICAS DA NEISSERIA GONORRHOEAE

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A gonorria uma Doena Sexualmente Transmissvel (DST), definida como um processo infeccioso causado pela Neisseria gonorrhoeae. A descrio do agente etiolgico da gonorria foi feita por Albert Neisser em 1879 e sua transmisso d-se por meio do contato sexual. A transmisso vertical causa a oftalmia gonoccia do recm-nascido. O risco de contgio para o sexo masculino, aps contato sexual com parceira infectada, de 20% e, no caso de reexposio, este ndice poder elevar-se a 90%. Nos homens, e em cerca de 20% das mulheres, os sintomas surgem cerca de 2 a 8 dias aps o contgio. Para o sexo feminino, o risco de infeco em torno de 80%. Quando as mulheres so reexpostas, esse nmero aumenta para mais de 90%. Dentre as mulheres infectadas, cerca de 60% a 80% no apresentam sintomas. Epidemiologicamente, o fato de 60% a 80% das mulheres no apresentarem sintomas ressalta a importncia do controle da populao infectada para interrupo da cadeia de transmisso. A gonorria, no homem, quando no tratada, evolui para complicaes do tipo epididimite, prostatite e outras, cuminando com o quadro de esterilidade. J na mulher, as complicaes so mais severas, evoluindo para Doena Inflamatria Plvica (DIP) e esterilidade, chegando, em alguns casos, a bito. Os principais mtodos de diagnstico da gonorria so a bacterioscopia e a cultura. A Organizao Mundial da Sade (OMS) indica a bacterioscopia como mtodo de escolha para o diagnstico da gonorria no homem, em funo de sua sensibilidade e especialidade. J para as mulheres, em funo do nmero de casos assintomticos e da presena de um ecossistema vaginal, indicada a cultura de amostras do canal endocervical. Neste manual, esto apresentadas as recomendaes do Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids do Ministrio da Sade PN-DST/AIDS, para transporte, cultivo, isolamento e identificao da Neisseria gonorrhoeae, alm das provas especiais para deteco de cepas de Neisseria gonorrhoeae resistentes penicilina.PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Cultura, Isolamento e Identificao da Neisseria Gonorrhoeae

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Quais as caractersticas da Neisseria gonorrheae? A Neisseria gonorrhoeae uma bactria Gram-negativa, aerbia, na forma de diplococos riniformes ou gros de caf, caractersticas do gnero de Neisser. Esses diplococos medem 0,6nm por 1,0nm e apresentam-se aos pares, com faces cncavas adjacentes, ou seja, voltadas entre si. Esta espcie adere nas superfcies de clulas epiteliais do hospedeiro, por meio de uma estrutura chamada pili (ou plo) que um apndice filamentoso de origem protica, da super fcie bacteriana.

Figura 1. diplococos Gram-negativos intracelulares sugestivos de Neisseria gonorrhoeae



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Quais as amostras clnicas indicadas para cultivar, isolar e identificar o agente etiolgico da gonorria?

A cultura da Neisseria gonorrhoeae pode ser realizada nas seguintes amostras: secrees colhidas nos seguintes stios: canal endocervical; uretra masculina e feminina; orofaringe; canal anal; conjuntiva; articulaes; leses; e sangue.



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O que uma cultura e quando deve ser utilizada? Cultura o mtodo de crescimento e isolamento do agente etiolgico em meios especficos. Deve ser realizada nos seguintes casos:

a) em pacientes do sexo masculino, recomendado cultivo da secreo uretral sempre que, aps exame bacterioscpico negativo, persistir a suspeita clnica, ou em casos de suspeita de resistncia ao tratamento. Pode ainda ser realizada em amostras da orofaringe e do canal anal, quando houver indicao; b) em pacientes do sexo feminino, recomendado cultivo da secreo endocervical como rotina diagnstica. Aps a correta anamnese ou ainda quando houver sinais clnicos, recomenda-se o cultivo de amostra da orofaringe e do canal anal; c) na oftalmia gonoccica, em recm-nascidos ou em adultos; d) na infeco disseminada, por meio da cultura de sangue; e e) no seguimento de tratamento.



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Quais so as condies indispensveis para o crescimento da Neisseria gonorrhoeae em meio de cultura? O sucesso da cultura do gonococo depende de cinco requisitos ambientais bsicos:

Semeadura imediata no meio de transporte ou meio de TMm; Atmosfera de CO2 em torno de 3% a 7%; Teor de umidade em cerca de 90%; Incubao temperatura de 35,5 a 36,5C; e Meio de cultura adequado.



IDENTIFICAO, CULTURA E ISOLAMENTO

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Quais os meios de transporte recomendados e suas caractersticas? O PN-DST/AIDS recomenda o meio de Amies para o transporte de amostras de secrees suspeitas. Este meio preserva o gonococo em boas condies para o cultivo por at 8 horas. O meio de Amies contm um tampo de sal inorgnico balanceado e carvo mineral para absorver as toxinas inibidoras presentes no material. Na evoluo dos meios de transporte de espcimes biolgicos, vrios outros sistemas foram desenvolvidos para Neisseria gonorrhoeae e colocados disposio nos mercados nacional e internacional. Estes sistemas baseiam-se na utilizao do meio indicado para o cultivo de diplococos Gram-negativos patognicos, que o meio de Thayer-Martin modificado (TMm). Alguns so apresentados na forma de garrafas ou tubos de ensaio, contendo aproximadamente 30 ml de meio disposto em gar inclinado bico de flauta, proporcionando uma superfcie maior para a semeadura. Contm, ainda, atmosfera de 3 a 10% de CO2, requisito obrigatrio para o crescimento das Neisserias. Para a semeadura neste meio, deve-se tomar o cuidado de manter o frasco em posio vertical, garantindo a permanncia de CO2 que, por ser mais pesado que o ar, tende a ocupar o fundo do frasco. Aps a semeadura, deve ser incubado em estufa a 35,5 a - 36,5C, por um perodo de 24 horas. Este sistema permite o primo-isolamento no prprio meio de transporte e tambm se presta identificao presuntiva. Um outro tipo de sistema de transporte para a Neisseria gonorrhoeae foi desenvolvido em uma placa plstica, retangular, contendo o meio de TMm. Esta placa apresenta um orifcio lateral onde colocado um comprimido gerador de CO2, sendo depois hermeticamente lacrado em um saco plstico. Este sistema apresenta grandes vantagens quando comparado aos demais, por apresentar uma superfcie maior, facilitando a semeadura e a observao das colnias isoladas, alm de gerar o prprio CO2. Este sistema o mais apropriado ao trnsito postal, entretanto muito caro.



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Quais os meios que podem ser utilizados para a cultura da Neisseria gonorrhoeae e qual o recomendado pelo PN-DST/AIDS-MS? Para a cultura da Neisseria gonorrhoeae so necessrios meios enriquecidos e seletivos. A seletividade assegura o crescimento e desenvolvimento da Neisseria gonorrhoeae. Em meios no seletivos, ocorre o fenmeno da competitividade com outras bactrias, constituintes de floras normais ou no, presentes nos materiais coletados. A Neisseria gonorrhoeae uma bactria fastidiosa que exige suplementos especiais para o seu crescimento, por isso os meios so enriquecidos com o suplemento VX. Dentre os meios de cultura seletivos para o cultivo da Neisseria gonorrhoeae, os mais tradicionais so o Thayer Martin modificado, Martin Lewis e o NY (New York City), que diferem entre si pelas substncias inibidoras utilizadas. O meio recomendado pelo PN-DST/AIDS, por sua comprovada eficincia e simplicidade de produo, o Thayer Martin modificado (TMm). O PN-DST/AIDS recomenda rigoroso controle da qualidade em todos os lotes dos meios utilizados.



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Quais os meios utilizados para identificao da Neisseria gonorrhoeae? A identificao da Neisseria gonorrhoeae feita em meios que revelam a utilizao de carboidratos (acares), alm de outras provas. Para a realizao da prova da degradao dos carboidratos entre as espcies do gnero Neisseria, necessrio um meio com base enriquecida onde foram adicionados diferentes carboidratos. Alm disso, realizam-se provas especficas como colorao de Gram, prova de catalase, prova da oxidase. Veja, no fluxograma na pgina seguinte, a seqncia em que essas provas devem ser realizadas.



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FLUXOGRAMA PARA CULTURA, ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DA

Neisseria gonorrhoeae



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Como obter a atmosfera de CO2? Se voc possuir uma estufa de CO2, em seu laboratrio, s calibrar a injeo de CO2 e garantir que este equipamento esteja proporcionando uma atmosfera entre 3% e 7% de CO2. No processo de calibragem, aconselhamos a regulagem para 5% de CO 2. Se voc no possuir este equipamento em seu laboratrio, utilize o mtodo da vela ou do comprimido efervescente. Para executar o primeiro mtodo, voc deve fixar uma vela na parede da lata sobre a tampa de uma placa de petri. Acenda a vela, tampe bem a lata e vede com fita adesiva ou esparadrapo. Certifiquese de que a vela usada no txica, usando cepas-controle. O mecanismo de funcionamento deste sistema consiste no queima do oxignio (O2) pela chama, transformando em dixido de carbono (CO2). Lembre-se de que a vela dever ser colocada na parte mais superior da lata, pois o CO2 mais pesado do que o O 2, que subir e entrar em combusto. Este sistema proporciona uma atmosfera em torno de 3% de CO2. O outro mtodo consiste na colocao de um comprimido efervescente sobre um chumao de algodo embebido em gua na tampa de uma placa de Petri. Tampe bem a lata como no mtodo da vela. O mecanismo de funcionamento desse mtodo semelhante ao da vela. A diferena que o CO2 gerado a partir do comprimido efervescente. A atmosfera de CO2 obtida com este mtodo fica em torno de 7%.



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Como reconhecer uma colnia de Neisseria gonorrhoeae no meio de cultura de Thayer Martin? (Etapa A do fluxograma) As colnias de Neisseria gonorrhoae so normalmente pequenas, brilhantes, viscosas e extremamente aderidas ao meio, difceis de serem retiradas do meio da cultura com o auxlio da ala bacteriolgica. Essa aderncia deve-se presena dos pili (plos). Quanto mais pili possui uma cepa, mais aderida fica ao meio. s vezes, na cultura, aparecem colnias grandes, com aspecto e tonalidade acastanhada. Essas cepas no possuem pili e so facilmente removidas do meio com ala bacteriolgica.

Figura 1. colnias caracterstica de Neisseria gonorrhoeae.



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Como fazer a confirmao das caractersticas morfotintoriais da Neisseria gonorrhoeae pelo mtodo de Gram? (Etapa B do fluxograma) Aps 24 a 48 horas de incubao, verifique o crescimento nas placas de Thayer Martin modificado. Selecione uma colnia suspeita. Pegue esse colnia com ala bacteriolgica e transfira-a para a superfcie de uma lmina de vidro, contendo uma gota de soluo salina estril. Deixe secar e faa a colorao de Gram conforme demostrado no curso TELELAB Tcnica de colorao Gram. Observe, sob microscpio, em objetiva de imerso (100X). O achado de estruturas morfolgicas compatveis com o gnero de Neisser (diplococos Gram-negativos reniformes) confirma que a bactria crescida uma Neisseria. Como fazer a prova de catalase? (Etapa C do fluxograma) Com o auxlio de uma ala bacteriolgica, pegue uma colnia suspeita do meio de TMm e homogeneize sobre uma lmina limpa, seca e desengordurada. Em seguida, adicione uma gota de perxido de hidrognio (gua oxigenada) a 10 volumes, que corresponde a uma soluo a 3%. A reao de catalase detecta uma enzima hemoprotica que cataliza a quebra do perxido de hidrognio em oxignio e gua. Na reao positiva, ocorrer desprendimento de pequenas bolhas e, na reao negativa, o lquido permanecer inalterado. A Neisseria gonorrhoeae caracteriza-se por apresentar reao de catalase positiva, indicando a produo dessa enzima. O perxido de hidrognio a 30% tambm pode ser utilizado para essa prova. Pingue uma gota da soluo sobre uma colnia suspeita e observe a reao. Quando ocorre bolhas, a reao positiva.



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Como fazer a prova de oxidase? (Etapa D do fluxograma) Existem dois reagentes que podem ser utilizados para essa reao. O primeiro pode ser preparado segundo Kovacs e consiste na formulao de uma soluo aquosa a 1% de tetrametil-p-fenilenodiamina. O segundo, de acordo com Gordon e Mcleod, consiste no preparo de uma soluo aquosa a 1,5% de dimetil-p-fenilenodiamina. Voc poder fazer a reao de oxidase colocando o reativo diretamente sobre a colnia, na placa de cultivo, ou preparado previamente uma fita de oxidase. Se voc utilizar o reativo em soluo sobre a colnia, este dever ser preparado no momento do uso, no podendo ser estocado. Se voc preferir usar as fitas reativas de oxidase, veja como prepar-las em preparo dos meios. Para realizar a reao da oxidase, pegue uma colnia suspeita e esfregue-a sobre a fita. Uma cor rosa, chegando at prpura, aparecer rapidamente, entre 10 a 20 segundos, nas reaes de oxidase positiva, quando o reagente utilizado for o dimetil-p-fenilenodiamina. Uma cor violeta surgir quando for utilizado o tetrametil-p-fenilenodiamina. Se a reao for negativa, a colorao do reagente no papel de filtro permanecer inalterada. Para maior praticidade, existem fitas de oxidase, prontas para uso, disponveis no mercado. A Neisseria gonorrhoeae caracteriza-se por apresentar reao de oxidade positiva.



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Quais os fatores que interferem no resultado da prova da oxidase? A utilizao de alas ou fios metlicos, tais como nquel-cromo e platina, podem provocar reaes falso-positivas. importante reforar que a prova de oxidase deve ser feita sempre aps a colorao de Gram, pois alguns bacilos Gram-negativos so positivos na reao de oxidase e podem produzir colnias semelhantes s da Neisseria gonorrhoeae, principalmente quando o meio de Thayer Martin modificado tem mais de 10 dias de preparo. Nesta fase do procedimento de identificao, se as provas forem positivas, voc ter terminado a identificao presuntiva. Como realizar a identificao confirmatria? Se a reao de oxidase for positiva, voc dever repicar a cepa em meio no seletivo (gar chocolate enriquecido) etapa E do fluxograma. A partir do subcultivo, voc vai fazer a reao de degradao dos carboidratos (acares). Como fazer a prova de degradao dos carboidratos (acares)? Prepare uma suspenso densa da bactria em soluo salina 0,85%, utilizando o crescimento de uma subcultura pura, obtida a partir do meio de isolamento no seletivo (gar chocolate enriquecido) com crescimento de 18 horas. Pingue de duas a trs gotas em cada um dos tubos de CTA, contendo 1% de cada um dos acares (glicose, maltose e sacarose, respectivamente). Misture a soluo no tero superior do meio com ala bacteriolgica. Incube entre 35,5 e 36,5C por 24, 48 e 72 horas, sem atmosfera de CO2. Examine os tubos de fermentao de acares a cada 24 horas de incubao. Caso haja acidificao do meio, o indicador (vermelho de fenol) mudar a cor do meio de vermelho alaranjado para amarelo. A prova ser positiva para Neisseria gonorrhoeae, apenas quando a glicose for o nico carboidrato metabolizado, como pode ser visto na tabela.PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Cultura, Isolamento e Identificao da Neisseria Gonorrhoeae

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Resultados da prova de degradao dos carboidratos

Espcime N. gonorrhoeae N.meningitidis N. lactamica N. cinerea N. polysaccharea N. subflava N. sicca N. mucosa N. flavescens N. elongata

Glicose + + + + + + + -

Maltose + + + + + + -

Lactose Sacarose + V + + -

ONPG + -



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Que outros mtodos existem para a identificao confirmatria da Neisseria gonorrhoeae? Existem vrios mtodos disponveis no mercado. Dentre eles, os mais utilizados so o sistema Quad Ferm + TM, Minitek e Bactek. Mtodos imunolgicos baseados na reao com a protena I do Gonococo tambm esto disponveis no mercado internacional e so apresentados em vrios formatos. Os mais conhecidos so o Gonogen, Gonogen II, PHADEBACT MONOCLONAL GC e o MINITEK-TM. Embora prticos, os testes acima mencionados so, via de regra, importados e custam caro. Como saber se uma cepa de gonococo sensvel penicilina? Voc deve fazer a pesquisa de -lactamase. O que -lactamase ou penicilinase?

-lactamase ou penicilinase uma enzima inativadora da penicilina. A penicilina ainda o antibitico de primeira escolha para o tratamento da gonorria no Brasil. Esta enzima, na Neisseria gonorrhoeae, sintetizada no espao periplasmtico da parede celular. Sua produo mediada por um plasmdio (material gentico extracromossmico) figura 2. A -lactamase destri a ligao amida dentro do anel -lactmico da penicilina, produzindo cido penicilinico. Como o anel -lactmico da penicilina responsvel pela atividade deste antibitico, a hidrlise deste anel causa a perda de sua atividade figura 3. No espao periplasmtico, entre a protena-alvo, na membrana interna, e a membrana externa da parede celular, a -lactamase, por mecanismo de competio, liga-se penicilina, inativando-a figura 4.



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parede celular bacterianamembrana externa camada tripla: protena fosolipdeo lipoprotena espao perisplasmtico camada peptidoglican

espao extracelular

b - lactamase

PROTENA RECEPTORA DE PENICILINA

citoplasma celular

Figura 2. representao esquemtica do envelope celular de bactrias Gam-negativas



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PENICILINA

CIDO PENICILINICO

Figura 3: ao bioqumica da penicilinase sobre a penicilina.

PAREDE CELULAR BACTERIANAPENICILINA

MEMBRANA EXTERNA

-LACTAMASEESPAO PERIPLASMTICO

MEMBRANA INTERNA PROTENA RECEPTORA DE PENICILINA

Figura 4: mecanismo de ao da -lactamase, hidrlise e ligao da -lactamase ao anel -lactmico de antibitico.PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Cultura, Isolamento e Identificao da Neisseria Gonorrhoeae

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Quais os mtodos disponveis para a deteco da enzima -lactamase ou penicilinase? Existem trs mtodos disponveis: 1. mtodo acidomtrico: composto por uma penicilina como substrato e um corante indicador de pH. Quando a penicilinase est presente, ela hidroliza o anel -lactmico da penicilina, formado cido penicilinico, que acidifica o meio, mudando a cor do corante indicador de cor. 2. mtodo iodomtrico: composto por uma mistura de amido e penicilina e revelado por uma soluo de iodo. O iodo, quando em contato com o amido, forma uma colorao negro-azulada. Quando a penicilinase est presente, ela hidroliza o anel -lactmico da penicilina, formando cido penicilinico, que acidifica o meio, desnaturando o amido e evidenciando um halo esbranquiado em volta do material testado (colnia suspeita); e 3. mtodo da cefalosporina cromognica: a cefalosporina cromognica um antibitico -lactmico, assim como a penicilina. Quando a penicilinase est presente, ela hidroliza o anel -lactmico da cefalospina cromognica, formando tambm um cido, que vai induzir o aparecimento de uma colorao avermelhada. Esta prova pode ser realizada em soluo lquida, em fita ou disco previamente preparado. Este teste o mtodo indicado como padro de trabalho pelo Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids do Ministrio da Sade.



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Como fazer a prova da cefalosporina cromognica? A cefalosporina cromognica pode ser adquirida comercialmente sob vrias apresentaes: solues lquidas, discos e fitas. Independente da apresentao, a realizao do teste consiste basicamente na mistura da cepa bacteriana com a cefalosporina. A reao positiva, indicada pelo desenvolvimento de colorao rosa no material, ocorre geralmente dentro de 5 minutos, porm, s vezes, pode levar at 1 hora para se desenvolver.

Como estocar cepas de Neisseria gonorrhoeae para futuros estudos de sensibilidade aos antibiticos? Existem vrios mtodos para a manuteno de cepas por longos perodos. A liofilizao, o congelamento a -70C em papel de filtro, ou tubos e outros. O PN-DST/AIDS recomenda a estocagem em tubos, por congelamento a -70C. Para assegurar a viabilidade de sua cepa, proceda como descrito a seguir: 1. Pegue um tubo para congelamento (criotubo) estril de 1,8 ml; 2. Prepare uma soluo densa de suspenso bacteriana, pela adio de vrias colnias em 1,0 ml de BHI com glicerol (vide preparo dos meios). Utilize um subcultivo recente, com 18 horas de incubao e tome cerca de 1/3 das colnias crescidas; e 3. Congele imediatamente a -70C. Essa suspenso pode ser descongelada para a remoo de uma pequena alquota e recongelada a seguir, desde que a suspenso inicial seja bastante densa.



CONTROLE DE QUALIDADE

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Como fazer o controle de qualidade dos meios de transporte, cultura e identificao da Neisseria gonorrhoeae? Voc vai fazer o controle de qualidade, lote a lote, de todos os meios reagentes usando cepas-padro. O controle de qualidade deve ser feito a cada novo lote de meio preparado ou adquirido e sempre antes de iniciar a testagem das amostras da rotina diria. Veja na tabela quais as cepas-padro que voc dever utilizar e que os resultados voc dever obter.Meios/reagentes Cepas-padro Resultado esperado

Meios de Transporte de Amies

Recuperao da bactria Neisseria gonorrhoeae W HO A, B, C, D quando semeado em meio de e E ATCC 49.226 e 29.213 TMm

Neisseria gonorrhoeae W HO A, B, C, D Crescimento POSITIVO e E ATCC 49.226 e 29.213 Meio de Thayer Martin modificado Escherichia coli ATCC 25.922 Crescimento NEGATIVO

Neisseria gonorrhoeae W HO A, B, C, D Acidifica apenas a glicose e E ATCC 49.226 e 29.213 Cystina Tryptyicase gar - CTA

Neisseria meningitidis ATCC 13.102 Acidifica a glicose e a maltose

Reao de catalase

Staphylococcus aureus ATCC 25.923 Streptococcus pyogenes ATCC 19.615 Escherichia coli ATCC 25.922

POSITIVA NEGATIVA NEGATIVA

Pesquisa de lactamase ou penicilinase

Neisseria gonorrhoeae W HO A e E

Cepa W HO A - NEGATIVA Cepa W HO E - POSITIVA



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Como fazer o controle da qualidade dos meios e reagentes? Com o auxlio de um swab, pegue uma ou duas colnias de uma das cepas descritas no quadro e inocule no meio de transporte de Amies. Aps 4 horas, semeie em meio de Thayer Martin modificado (veja tcnicas de semeadura no curso TELELAB Tcnicas para coleta de secrees). Aps 48 horas de incubao em condies apropriadas, confira o crescimento da Neisseria gonorrhoeae. Caso esse seja positivo, significa que o lote do meio de Amies possui a qualidade desejada. Para o meio de Thayer Martin modificado utilize as cepas descritas o quadro e, aps 48 horas de incubao em condies apropriadas, confira a condio de crescimento, tambm descrita no quadro. Para o teste de degradao de acares utilize as cepas descritas no quadro e, aps 24, 48 e 72 horas de incubao em condies apropriadas, confira a condio de acidificao dos acares. Para os demais testes utilize as cepas indicadas no quadro, realizando os testes conforme as tcnicas descritas nesse manual.

Sempre que os resultados forem os descritos no quadro, seus meios e reagentes estaro adequados para uso.



PREPARO DOS MEIOS

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Meio de Amies Esse meio pode ser adquirido comercialmente na forma desidratada ou preparado em seu laboratrio. Caso voc adquira o produto comercialmente, siga as instrues do fabricante. Caso voc opte pelo preparo, pese separadamente os seguintes componentes.

tioglicolato de sdio........................................................................................1,00g carvo farmacutico neutro.........................................................................10,0g cloreto de sdio (NaCl)..................................................................................3,00g fosfato de sdio dibsico (Na2 HPO4)............................................................1,15g fosfato de potssio monobsico (KH2 PO4)......................................................0,20g cloreto de potssio (KCI).................................................................................0,20g cloreto de clcio (CaCI2 2H2O).......................................................................0,10g cloreto de magnsio (MgCI2 6H2O).................................................................0,10g gar.................................................................................................................3,60g gua destilada...........................................................................................1000 ml

Dissolva os componentes na gua destilada. Esse meio pode ser aquecido at o ponto de fervura. O importante que todos os componentes estejam completamente dissolvidos. Ajuste o pH em 7,4 0,2. Autoclave por 15 minutos a 121C. Distribua 2 ml em tubos de vidro estreis com tampa rosquevel. Estes tubos podem ser guardados em geladeira, no mximo, por um ms. Lembre-se de que o meio de Amies proporciona um percentual alto de culturas positivas de Neisseria gonorrhoeae em relao a outros sistemas de transporte. Entretanto, recomendado para trnsito de curto perodo, at 8 horas.PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Cultura, Isolamento e Identificao da Neisseria Gonorrhoeae

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Meio de Thayer Martin modificado Esse meio preparado em quatros etapas. Para o seu preparo, confira se voc dispe dos seguintes componentes:meio base GC..............................................................................................36,00g hemoglobina bovina...................................................................................10,00g suplemento VX (ou de Kelloggs)..............................................................10,00 ml VCNT (vancomicina 3,00 ml, colistina 7,5 ml, nistatina 12,5 ml e trimetroprima 5,0 ml) gua destilada.................................................................................................1 litro

Etapa 1 Em um balo de fundo chato, coloque 500 ml de gua destilada. Adicione 36 gramas de meio base GC. Aquea sob agitao constante em chama de bico de Busen ou de fogo a gs, at a completa dissoluo do meio. Evite que a mistura atinja o ponto de fervura. Autoclave por 15 minutos a 121C. Etapa 2 Em outro balo de fundo chato, dissolva 10,00g de hemoglobina em 500 ml de gua destilada. Aquea sob agitao constante em chama de bico de Busen ou de fogo a gs, at a completa dissoluo. Autoclave por 15 minutos a 121C. Etapa 3 Em banho-Maria ajustado em 45 5C, aquea as misturas produzidas nas etapas 1 e 2 at que o gar esteja completamente fundido. Assepticamente, misture o contedo dos dois bales e homogeneize.



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Etapa 4 Em capela de fluxo laminar, pegue a mistura da etapa 3. Assegure-se de que esta esteja em temperatura de 45 5C. Adicione os 10 ml de suplemento VX e os antibiticos que compem o VCNT, nas concentraes definidas. Homogeneize bem. Distribua, assepticamente, cerca de 25 ml do meio em placas de petri. Deixe solidificar (15 a 20 minutos). Acondicione em sacos plsticos. Estoque em geladeira a 4C por 10 dias. Aps esse perodo, os meios comeam a sofrer desidratao e os antibiticos apresentam declnio de sua ao inibidora, diminuindo a seletividade do meio.

Suplemento definido de KelloggsGlicose......................................................................................................40,00 g Glutamina....................................................................................................1,00 g Soluo de nitrato de ferro a 0,5%..........................................................10,00 ml gua destilada...............................................................................................90 ml

1. Misture os ingredientes; 2. Autoclave por 15 minutos a 120C; 3. Esfrie em banho-maria a 45 5C; 4. Adicione 1 ml de soluo estril de cocarboxilase a 20%; e 5. Guarde em frasco estril de 100 ml com tampa rosquevel a 4C (estvel por vrios meses).



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Meio para degradao de acares Esse meio preparado em trs etapas. Etapa 1gar cistina tripticase, CTA..........................................................................2,90 g gar.............................................................................................................0,75 g gua destilada............................................................................................95,0 ml

Em um balo de fundo chato de 200 ml, coloque 95,0 ml de gua destilada. Adicione 2,9 g do meio CTA e 0,75 g de gar. Aquea sob agitao constante em chama de bico de Busen ou de fogo a gs at a completa dissoluo. Evite que a mistura atinja o ponto de ebulio. Autoclave por 15 minutos a 121C. Se voc no possuir o meio CTA pronto, ou se preferir, voc poder formular da seguinte maneira:triptose.........................................................................................................2,00 g I-cistina.......................................................................................................0,05g cloreto de sdio............................................................................................0,5 ml sulfito de sdio............................................................................................0,05g vermelho de fenol....................................................................................0,0017g gar.............................................................................................................1,00 g gua destilada...............................................................................................95 ml



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Etapa 2 Nesta etapa, voc preparar as solues estreis dos acares. Para o seu preparo, confira se voc dispe dos seguintes componentes:gua destilada............................................................................................100 ml glicose.........................................................................................................20,0 g lactose........................................................................................................20,0 g sacarose......................................................................................................20,0 g maltose.......................................................................................................20,0 g

Coloque 100 ml de gua em um balo de fundo chato de 250 ml e adicione 20,0 gramas do acar a ser preparado. Agite at a completa dissoluo. Esterilize por filtrao em membrana de 0,22 de dimetro. Repita o procedimento para todos os acares. As solues estreis dos acares podero ser guardadas em frascos-ampola lacrados, estreis, em geladeira (4C) e podero ser utilizados por 6 meses. Se voc tiver dificuldades para acondicionar e estocar em condies ideais, diminua o volume para 10 ml (adicionando 2,0 g de cada acar para 10 ml de gua destilada). Esterilize por filtrao, como descrito acima. Utilize o volume necessrio e despreze o restante. Etapa final Em banho-Maria ajustado para 45 5C, aquea o meio de CTA preparado na etapa 1, at que o gar esteja completamente fundido. Assepticamente, acrescente 5 ml da soluo do acar a 20%, preparado na etapa 2. Misture bem e distribua 4 ml em tubos estreis de 12 X 120 mm, com tampa rosquevel. Rotule adequadamente e estoque a 4C, em geladeira por at 30 dias. Descarte antes, se voc observar a ocorrncia de desidratao. Lembrese de que esta preparao dever ser repetida para cada acar.



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Preparo de fitas para prova de oxidase reativo de kovacs tetrametil-p-fenilodiamina......................................................................0,1 g gua destilada.......................................................................................10 ml reativo de Gordon e Mcleod dimetil-p-fenilodiamina.........................................................................0,15 g gua destilada........................................................................................10 ml Modo de preparo 1. 2. 3. 4. Corte papel de filtro em tiras de 2X1 cm; Coloque as tiras em uma placa de Petri; Pingue 3 gotas do reagente sobre cada tira; Deixe-as secar em estufa a 37C, mantendo a placa de Petri destampada; 5. Guarde as tiras em frasco de vidro escuro, limpo, seco e identificado com o nome do reagente e a data do preparo; 6. Guarde em geladeira; e 7. Teste a fita diariamente com uma cepa-controle. Meio de BHI + glicerol para congelamento de cepas BHI (Brain Heart Infusion Broth)................................................................3,7 g glicerol................................................................................................20,00 ml gua destilada..................................................................................80,00 ml Modo de preparo: 1. Em um balo, misture todos os componentes; 2. Autoclave por 15 minutos a 121C; 3. Dispense, assepticamente, 1 ml em tubos para congelamento (criotubos) com tampas rosqueveis; e 4. Estoque a 4C.PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Cultura, Isolamento e Identificao da Neisseria Gonorrhoeae

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Para cuidar de sua segurana, da segurana de seus colegas de trabalho e do meio ambiente, obedea aos procedimentos bsicos de biossegurana em laboratrios:

Figura 1. Smbolo de risco biolgico


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Todo cuidado pouco na manipulao de materiais biolgicos, tais como soro, sangue ou secrees, fluidos orgnicos, tecidos etc. Redobre suas precaues, pois esses materiais so potencialmente infectantes e muitas vezes esto contaminados com agentes etiolgicos diferentes do que se est pesquisando, ou ainda desconhecidos. Nunca pipete com a boca e jamais cheire placas de cultura. A inativao do soro em banho-maria a 56C por 30 minutos no elimina o potencial infectante da amostra. Lembre-se de que, com a automao, aumentou muito o nmero de amostras processadas em laboratrio e, conseqentemente, aumentou tambm o risco de contaminao. Como voc sabe, difcil afirmar que um profissional se contaminou, de fato, em servio. Isso faz com que as doenas infecto-contagiosas causadas por acidentes de trabalho no sejam devidamente notificadas; em conseqncia, as medidas de segurana envolvendo o biorrisco acabam no sendo implementadas.


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Use sempre Equipamento de Proteo Individual (EPI): avental ou jaleco longo de mangas compridas e punho retrtil, luvas descartveis, culos de proteo, pipetadores manuais ou automticos e, quando for o caso, protetor facial.

Os EPI so regulamentados pelo Ministrio do Trabalho e seu uso visa a minimizar a exposio do tcnico aos riscos e evitar possveis acidentes nos laboratrios. Note que, s vezes, os profissionais de laboratrio precisam de um tempo para se adaptar ao uso dos equipamentos na sua rotina. O importante que voc se adapte e incorpore a utilizao dos EPI sua prtica profissional. O uso indevido dos EPI, ao invs de proteger, poder ocasionar acidentes.

Figura 2. Ilustrao dos principais Equipamentos de Proteo Individual (EPI)PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Biossegurana

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Evite a formao e disperso de aerossis. Aerossis so micropartculas slidas e lquidas com dimenses aproximadas entre 0,1 e 50 micra que podem, caso contenham microorganismos, permanecer em suspenso e plenamente viveis por vrias hora. A pipetagem, flambagem de alas, abertura de frascos e ampolas, manipulao de seringas, agulhas, lancetas, lminas e outros assemelhados podem gerar e propagar aerossis.

Abertura de frascos, ampolas, tubos e garrafas de cultura requer cuidados especiais. Envolva a parte a ser aberta com um pedao de gaze. Utilize um pedao de gaze para cada material, prevenindo assim a contaminao cruzada. Descarte-a imediatamente em hipoclorito de sdio a 2 %. Centrfugas, agitadores e maceradores, quando manipulados sem as precaues e abertos antes da total parada ou trmino da operao, igualmente podem contaminar o ambiente laboratorial.


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Jamais reencape agulhas. Esse procedimento uma das principais causas da contaminao de profissionais de sade por microorganismos, existentes no sangue e em outros fluidos orgnicos, como por exemplo, o vrus da hepatite B e o HIV. Aps a coleta, voc deve descartar esse material diretamente em recipiente de paredes rgidas com tampa, contendo hipoclorito de sdio a 2 % em volume superior a metade do recipiente. Lembre-se: Cada mililitro de sangue contaminado com o vrus da hepatite B contm 100.000.000 de partculas virais, que podem permanecer viveis por at uma semana. Basta uma dessas partculas para contaminar a pessoa.

Figura 3. Ilustrao do descarte de agulha em recipiente apropriado.PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Biossegurana

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Reduza ao mximo o manuseio de resduos, em especial os perfurocortantes. Descarte o rejeito perfurocortante diretamente em recipiente de paredes rgidas, contendo hipoclorito de sdio a 2 %. Deixe em imerso total no mnimo por 24 horas e, em seguida, faa a autoclavao desse material.

Esta uma regra bsica para diminuir os riscos de acidente nos laboratrios. fundamental que os materiais perfurocortantes sejam autoclavados depois da imerso em hipoclorito de sdio a 2%. S ento esses materiais devem ser encaminhados ao lixo hospitalar. O acondicionamento dos resduos de laboratrio deve seguir a Norma Brasileira (NBR) 9190 da Associao Brasileira de Normas Tcnicas- ABNT, que recomenda sacos brancos leitosos para os resduos potencialmente infectantes e hospitalares e escuros para o lixo comum. Os profissionais responsveis pela limpeza e conservao devem ser bem orientados e usar equipamentos de proteo. Todos os recipientes para descarte devem estar identificados. Lembre-se de que, pela legislao brasileira, quem gera o resduo o responsvel pela sua eliminao e controle. No caso dos materiais reutilizveis, como vidraria e utenslios, deposite-os em recipiente contendo o desinfetante prprio, pelo tempo de contato recomendado e, em seguida, faa a autoclavao. Depois, lave normalmente esses materiais e guarde-os para uso posterior.


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Identifique e sinalize os principais riscos presentes em seu laboratrio. Produtos e reas que oferecem risco devem ser marcados com os devidos smbolos internacionais em etiquetas auto-adesivas padro. Veja, a seguir, os principais smbolos associados aos riscos em

PERIGO BIOLGICOEntrada permitida somente para pessoas autorizadasNatureza do risco: Funcionrio responsvel: Em caso de emergncia, chame por: Telefone diurno: Telefone residencial:

Figura 4. Smbolo de risco biolgico para entrada de laboratrio.


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Figura 5. Principais smbolos internacionais associados aos riscos em laboratrios.PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Biossegurana

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Verifique sempre as condies de funcionamento dos equipamentos de Proteo Coletiva (EPC): extintores de incndio, chuveiros de segurana, lava-olhos, pia para lavagem de mos, caixa de areia e cabine de segurana biolgica. Existem trs tipos de cabines de segurana biolgica disponveis no mercado: as de classe I, classe II e classe III. So recomendadas para o uso em laboratrios clnicos as de classe II. Veja a figura , na pgina seguinte. Procedimentos que devem ser obser vados na cabine de segurana biolgica: Descontamine a superfcie interior, antes e depois do uso, com gaze estril embebida em desinfetante adequado; Ligue a cabine e a luz ultravioleta 20 minutos antes e deixe tudo ligado pelo mesmo tempo ao final de sua utilizao; Use avental de mangas longas, luvas descartveis e mscara; No efetue movimentos rpidos ou bruscos dentro da cabine e evite operaes que causem turbulncia; No use bico de Bunsen, pois pode acarretar danos ao filtro HEPA e causar desequilbrio do fluxo de ar. Se necessrio, use incinerador eltrico ou microqueimador automtico ; e Mantenha as grelhas anteriores e posteriores da cabine desobstrudas. A cabine no um depsito. Evite guardar equipamentos ou quaisquer outros objetos no seu interior.


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CLASSE I

CLASSE II

CLASSE III

Figura 6. Ilustrao das cabines de segurana biolgica - classes I, II e III.

As cabines de classe I e II so consideradas como barreira de proteo parcial e a de classe III uma barreira de proteo total.


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Para descontaminao pessoal, de equipamentos e superfcies fixas, utilize desinfetantes eficientes e adequados. Use sempre produtos registrados no Ministrio da Sade.

No existe um desinfetante nico que atenda a todas as necessidades. fundamental conhecer os diversos agentes qumicos e sua compatibilidade de uso para evitar custos excessivos e utilizao inadequada. Para a descontaminao de amostras biolgicas na rotina dos laboratrios clnicos, recomendamos os compostos liberadores de cloro. O mais comumente utilizado o hipoclorito de sdio a 2%. Sua forma mais ativa o cido hipocloroso (HOCI), que formado em solues com pH entre 5 e 8. A eficcia do cloro decresce com o aumento do pH e vice-versa. Cabe lembrar que a atividade desse cido diminuda na presena de matria orgnica, fato que deve ser considerado quando aplicado em superfcies contendo sangue e outros lquidos corpreos. Os hipocloritos tm sua estabilidade dependente de fatores como concentrao, temperatura, pH, luz, metais e prazo de validade. Os hipocloritos so corrosivos para metais. Objetos de prata, alumnio e at mesmo de ao inoxidvel so atingidos, quando imersos em solues rotineiramente utilizadas em laboratrio. O hipoclorito de sdio txico e causa irritao na pele e olhos. Se ingerido, provoca corroso das membranas e mucosas e sua inalao causa irritao severa no trato respiratrio. Jamais misture os hipocloritos com outras substncias qumicas, tais como desinfetante, lcool, solues germicidas etc. Aps o tratamento por 24 horas com hipoclorito de sdio a 2%, os materiais devem ser autoclavados. A autoclavao recomendada tendo em vista a possibilidade de o hipoclorito no atingir as partes do material a ser esterilizado. Caso isso no seja possvel, a alternativa o mtodo de fervura por perodo no inferior a 30 minutos.


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Observe, na tabela abaixo, a indicao de alguns agentes qumicos e seu espectro de ao antimicrobiana.

Eficincia antimicrobiana de alguns agentes qumicos desinfetantes frente a agentes microbianos.Bactrias Etanol Formaldedo Glutaraldedo Comp. Cloro Fenis Quaternrios de amnia Iodforos + + + + + + + Vrus lipoflicos + + + + + + + Vrus hidroflos _ + + + _ + + Microbatrias + + + + + _ _ Fungos + + + + + + Esporos bacterianos _ + + + _ _ _

(+) Atividade ( - ) Ausncia de atividade ( V ) Varivel de acordo com o microorganismo


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Tenha muito cuidado com a manipulao e estocagem de substncias qumicas. Leia com ateno as informaes contidas nos rtulos.

A estocagem de matria-prima deve ser feita em armrios apropriados, bem ventilados, ao abrigo da luz solar e calor. importante observar a incompatibilidade entre as diferentes substncias. Sempre que recomendado pelo fabricante, os agentes qumicos devem ser manipulados em capelas de exausto qumica devidamente instaladas. Ateno: No confunda capela de exausto qumica com cabine de segurana biolgica. Veja a seguir os riscos relacionados a cada categoria qumica:

Categoria qumica e riscos relacionados

GRUPO QUMICOcidos Bases Cianetos e Sulfetos Lquidos inflamveis Slido Inflamvel

RISCOCorroso Corroso Envenenamento Incndio Incndio


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Seja sempre consciente da importncia de suas aes na preservao da biossegurana em seu local de trabalho: Lave as mos antes e depois de qualquer procedimento laboratorial; Nunca pipete com a boca; Jamais cheire placas de cultura; Dentro do laboratrio, no fume, no coma, no beba, no prepare refeies; Quando estiver usando luvas, no manuseie objetos de uso comum, como telefones, maanetas de portas e janelas, jornais, revistas etc; No guarde alimentos ou bebidas em geladeiras e congeladores para armazenagem de material biolgico; e Vacine-se rotineiramente contra a hepatite B.

Seguindo essas recomendaes, voc vai estar contribuindo para a diminuio de acidentes.

Se acontecer um acidente de trabalho em seu laboratrio, notifique imediatamente a sua chefia.


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CONSIDERAES FINAIS

Muitas das atividades aqui descritas j fazem parte do seu cotidiano. Faa uma reflexo sobre o que acabou de ler e verifique o que pode ser mantido, modificado e incorporado a seu trabalho e ao seu laboratrio para que a sua prtica profissional se desenvolva de acordo com os procedimentos tcnicos e cuidados de biossegurana recomendados pelo Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids, do Ministrio da Sade. As questes colocadas a seguir facilitaro essa reflexo.



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Condies gerais do laboratrio As reas de circulao esto desobstrudas? Qual a situao geral quanto ao aspecto de limpeza? Qual o estado de conservao e manuteno de pisos, escadas, paredes e tetos? O local de trabalho est adequado para atividades envolvendo o risco biolgico? As bancadas e demais mobilirios do laboratrio esto em condies de uso? Existem bancadas apropriadas para trabalhos com solventes e demais substncias qumicas corrosivas? Existe pia diferenciada para lavagem das mos no laboratrio? Existem mecanismos de conteno que previnam a entrada de insetos e roedores? Existem programas de manuteno preventiva de equipamentos? Estocagem Os produtos armazenados e a rea de estocagem esto organizados com os devidos cuidados de segurana? Existe o cuidado de se estocar materiais e/ou substncia incompatveis separadamente?


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Local de higiene pessoal e de alimentao O local mantido limpo e em condies de higiene? Existe gua potvel disponvel? Existem sabo e toalha em condies de uso? Existe local para troca de roupa e guarda de objetos pessoais? Existe rea para alimentao separada da rea de laboratrio? Existe adequada organizao para coleta de lixo e demais rejeitos (no-infecciosos)? Refrigerao e Ventilao A temperatura de trabalho est entre 20 e 260C? As janelas esto protegidas contra o excesso de luz solar? Existe ventilao adequada, especialmente nas salas com cabines de fluxo laminar? Iluminao A iluminao geral adequada? Existe iluminao dirigida nas bancadas de trabalho? Servios O laboratrio tem suficiente abastecimento de gua, energia eltrica e gs? Existe adequada manuteno de fusveis, lmpadas e cabos eltricos? A limpeza e higienizao das caixas d`gua so realizadas com periodicidade recomendada?


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Segurana geral O laboratrio devidamente fechado e seguro quando no est ocupado? As portas e janelas so mantidas devidamente fechadas? Os materiais txicos e equipamentos de risco so estocados em rea segura? Preveno de incndio Existe sistema de alarme? As passagens pelas portas de emergncia esto desobstrudas? O sistema de deteco de incndio est em bom funcionamento e regularmente testado? Existe sinalizao de emergncia? Existem extintores de incndio para os diversos tipos de materiais e em quantidade suficiente? Os extintores esto dentro do prazo de validade? Existe sinal de no fumar na rea de laboratrio? A equipe est treinada em combate a incndio? Estocagem de lquidos inflamveis O local est separado do prdio principal? Existe ventilao suficiente para retirar vapores? O local est devidamente sinalizado? Existem lmpadas seladas para proteo contra ignio nos vapores? Existe advertncia de no fumar?PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Biossegurana

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Risco com eletricidade As instalaes esto de acordo com os padres estabelecidos pela ABNT? Existe fio de terra? Os equipamentos esto devidamente aterrados? Os equipamentos com potencial de risco de desligamento esto devidamente ligados a um circuito de emergncia para os casos de queda ou interrupo de energia? Os cabos de conexo aos diversos equipamentos esto em perfeito estado de manuteno? Cada equipamento est ligado em uma tomada; evita-se o uso de benjamim? Todas as tomadas tm sua voltagem identificada? Voc sabe onde fica o quadro-geral de fora da sua unidade? Gases e lquidos comprimidos Os diversos tipos de gases esto devidamente identificados? Os cilindros possuem vlvulas de segurana? Existe advertncia de no-utilizao de leo nas vlvulas? Os cilindros esto devidamente seguros contra quedas? Existe ventilao suficiente para evitar a formao de bolses de gases e exploses? Proteo pessoal Existem em quantidade suficiente: Lava-olhos? Chuveiros de emergncia? Protees contra radiaes, incluindo os dozmetros? Mscara contra partculas? Luvas descartveis? Pipetadores manuais e/ou automticos? culos de proteo e outros?PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Biossegurana

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Segurana e sade ocupacional Existe servio de sade ocupacional? Existe caixa com materiais para primeiros-socorros? Existem profissionais treinados em primeiros-socorros? Existem informaes sobre como agir em caso de emergncia, tais como: telefone de hospitais, pronto-socorros e bombeiros? Existe um programa de vacinao atualizado? Existe sinalizao educativa para prevenir o risco? Equipamento de laboratrio Os equipamentos esto validados e certificados quanto a seu uso? Existe procedimento de desinfeco de equipamentos antes de envi-los manuteno? As cabines de segurana biolgica e qumica so regularmente testadas? As autoclaves esto validadas? As centrfugas, rotores e frascos tm seus tempos de utilizao devidamente anotados? Vidrarias quebradas e trincadas so descartadas? Existem recipientes adequados para descartar frascos quebrados e material perfurocortante? As capelas de exausto para manipulao esto devidamente sinalizadas? Suas balanas esto certificadas pelo Inmetro? Seus congeladores, geladeira, fornos, estufas ou equipamentos termo-regulavis possuem sinais de controle e registro de temperatura?


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Material infeccioso, qumico e radioativo Os materiais biolgicos so recebidos em condies de segurana? Utilizam-se luvas descartveis, quando se est manipulando material biolgico? As bancadas so desinfetadas com a devida freqncia? Existe protocolo de descarte de material contaminado? Os desinfetantes so apropriados e devidamente validados? As substncias esto devidamente etiquetadas? Existe cartaz com os riscos e categorias toxicolgicas das diversas substncias? O estoque de radioistopos devidamente controlado? Existe procedimento de descarte de substncias qumicas e radioistopos? Existem procedimentos que visam a evitar contato entre substncias qumicas incompatveis? Utilize este manual, junto com o vdeo, como fonte permanente de consulta. Mantenha este manual sempre ao seu alcance e faa dele um instrumento a mais de trabalho. Voc tem comunicao direta e gratuita com o:

TELELAB - PN- DST/AIDS - MS Telefax gratuito: 0800 - 61- 2436


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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Agradecimentos: equipe do: Instituto de Sade Pblica do Distrito Federal-ISDF Ao Laboratrio ControlBio, So Paulo; e ao Hospital Universitrio - Universidade Federal de Santa Catarina-UFSC.

Arte-final, diagramao: Coordenao Nacional de DST e Aids

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