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NOVA Lite® ANCA Kits/Substrate Slides Para Diagnóstico In Vitro Código do Produto: 708295, 708297 508295, 508297, 508295.10, 508297.20 Complexidade CLIA: Elevada

Aplicação Diagnóstica Este produto (kit ou lâminas com substrato) é indicado para o despiste e quantificação dos auto-anticorpos anti-neutrófilos citoplasmáticos (ANCA). Estes anticorpos são marcadores para o diagnóstico e tratamento de granulomatose de Wegener’s e outras vasculites sistémicas.1

Resumo e Explicação do teste As vasculites necrosantes, incluindo granulomatose de Wegener’s, poliarterite nodosa, síndroma de Churg Strauss, glomerulonefrite idiopática crescente e ‘overlap’ vasculite sistémica são um grupo de doenças relacionadas que podem variar consideravelmente nas manifestações clínicas, o que causa consequentemente, problemas no diagnóstico. Granulomatose de Wegener’s é uma doença vascular grave caracterizada por granulomas necrosantes do tracto respiratório e glomerulonefrite focal. Um diagnóstico precoce é importante como terapia imunossupresiva rápida tendo um maior efeito no resultado renal, mas sintomas iniciais na apresentação e exames histológicos por biópsias são frequentemente não específicos.2

Em 1982 Davies et al descreveu a presença de anticorpos anti-neutrófilos citoplasmáticos (ANCA) no soro de doentes com glomerulonefrite necrotising.3 Também foi descrito, em 1985 numa publicação de Van de Woude et al 25 de 27 doentes com granulomatose de Wegener’s activa que exibiam o padrão citoplasmático clássico (c-ANCA) por imunofluorescência indirecta.1 O padrão clássico c-ANCA com os neutrófilos fixados em etanol revelam uma coloração característica granular citoplasmática com uma coloração mínima dos lobos nucleares. O antigénio c-ANCA alvo é, na sua maioria, a proteinase 3, uma protease serina. Um segundo padrão de coloração ANCA (perinuclear, p-ANCA) foi descrito em 1988 por Falk et al em doentes renais com vasculite sistémica.4 Pensa-se que o antigénio p-ANCA alvo seja a mieloperoxidase, porém outros antigénios (Ex. lactoferina, elastase, catepsina G) encontram-se associados mas a um grau mais baixo. O padrão p-ANCA com os neutrófilos fixados em etanol revelam uma coloração perinuclear nitidamente delineada. Muitas amostras que foram submetidas a testes para detecção dos ANCA, podem ser positivas para anti-dsDNA, anti-histonas e outros autoanticorpos antinucleares (ANA), podendo acompanhar o padrão p-ANCA. Amostras de doentes positivas para ANA podem também ser positivas para p-ANCA. É obviamente crítico distinguir um verdadeiro padrão c-ANCA e p-ANCA de outros artefactos não-ANCA. Isto é conseguido utilizando uma combinação de lâminas com neutrófilos fixados com etanol e formol. Nos neutrófilos fixados com etanol ocorre uma migração dos grânulos citoplasmáticos positivamente carregados para o DNA do núcleo carregado negativamente, resultando no padrão perinuclear (p-ANCA).5 Se os neutrófilos são tratados com um fixador como o formol, então esta migração não ocorre e as proteínas granulares citoplasmáticas permanecem no citoplasma onde amostras p-ANCA verdadeiras mostram um padrão granular citoplasmático c-ANCA em lâminas fixadas com formol. Amostras ANA positivas, quando testadas com neutrófilos fixados com formol, tornam-se negativas ou revelam uma grande redução na intensidade da coloração. Amostras ANA específico de granulócitos (GS–ANA) mostram uma reacção nuclear ou perinuclear em neutrófilos fixados com etanol, sendo negativos quando testados com neutrófilos fixados com formol. A imunofluorescência indirecta de lâminas com neutrófilos é o método de referência para o despiste dos ANCA. As lâminas da INOVA utilizam neutrófilos humanos purificados, sendo preparados e fixados de modo a atingir padrões óptimos de coloração. Amostras cujo resultado é ANCA positivo, ANA e padrões atípicos devem ser titulados à parte.

Princípio do Procedimento É utilizada uma técnica de imunofluorescência indirecta, com este kit6, em que quer as amostras dos doentes, quer os controlos apropriados são incubados com o substrato neutrófilos. Os anticorpos que não reagem são eliminados por lavagem, sendo depois aplicado um conjugado marcado com fluoresceína. O conjugado excedente é depois removido também por lavagem. As lâminas são observadas ao microscópio de fluorescência, onde se observa uma fluorescência “verde-maçã” no caso das amostras positivas, que correspondem a áreas dos neutrófilos onde o anticorpo se ligou.

Composição do dispositivo 1. Substrato de neutrófilos fixados com formol em lâminas de 6 e 12 poços.

Apenas em kit 2. Dois ou mais soros controlo positivo contendo azida de sódio a 0,09% (ex. p-ANCA, c-ANCA, ANA). Pré-diluído

e pronto a utilizar. 3. Soro controlo negativo contendo azida de sódio a 0,09%. Pré-diluído e pronto a utilizar. 4. Anti-IgG humana de cabra, purificada por afinidade e conjugada com fluoresceína com Azul de Evans contendo

azida de sódio a 0,09%. Pré-diluído e pronto a utilizar. 5. Azul de Evans a 1%, como contrastante opcional 6. Tampão fosfato (PBS II), 40x concentrado na forma líquida 7. Meio de montagem, contendo um agente que evita a perda de fluorescência 8. Lamelas

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Advertências/Precauções Este produto é para Uso de Diagnóstico In Vitro. Este produto deve ser apenas manipulado por pessoal treinado e para o objectivo indicado. Recomenda-se que seja seguido o procedimento. Todos os dadores de soro fornecido nos kits foram examinados e determinados negativos para o antigénio da superfície do vírus Hepatite B, anticorpos contra o vírus da Hepatite C e para o Vírus de Imunodeficiência Humana (HIV 1 & 2). No entanto estes testes não garantem a ausência de agentes infecciosos. Deverão ser estabelecidas medidas adequadas para o manuseamento e eliminação de material potencialmente infectado e o procedimento deverá ser efectuado apenas por pessoal treinado nestes métodos. Alguns componentes do kit contêm azida de sódio a 0,09% como conservante e devem ser manuseados com cuidado – não ingerir nem permitir o contacto com a pele ou membranas mucosas. Em caso de contacto lavar abundantemente com água e procurar um médico. Podem formar-se azidas metálicas explosivas nas canalizações de cobre e alumínio; quando eliminar o reagente lavar abundantemente com água para impedir a formação das azidas.

Condições de Armazenamento Os kits fechados devem ser guardados a 2-8ºC e podem ser utilizados até à data de validade inscrita. NÃO CONGELAR. Quando se retirar as lâminas do invólucro, estas deverão ser utilizadas imediatamente. O PBS II diluído pode ser armazenado até um mês a 2-8ºC. O conjugado com fluoresceína do kit deve ser mantido afastado da luz solar, fluorescente e U.V., sempre que possível e armazenado a 2-8°C. Todos os reagentes devem ser guardados a 2-8ºC.

Colheita de Amostras As amostras de sangue devem ser colhidas por punção venosa, deixar coagular naturalmente e separar o soro o mais rápido possível para prevenir a hemólise. O soro pode ser conservado de 2-8°C até 7 dias antes do teste10, ou em aliquotas a -20°C ou menos, para períodos mais prolongados. Não congelar e descongelar o soro mais do que uma vez. Evitar a utilização de soros lipémicos, hemolisados e contaminados com microorganismos dado que poderá ocorrer uma diminuição do título ou um padrão de marcação pouco claro. Procedimento Material fornecido (kits) 708295 10 ANCA Neutrophil Substrate Slides – 6-well (lâminas x 6 poços com neutrófilos, fixados com formol). 1 1mL p-ANCA Positive Control (Controlo positivo p-ANCA) 1 1mL ANA Positive Control (Controlo positivo ANA, somente) 1 1mL IFA System Negative Control for ANCA (Controlo negativo) 1 7mL anti Human IgG AFF Fluorescein with Evans Blue (Conjugado anti-IgG humano purificado e marcado com

fluoresceína com Azul de Evans) 2 25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrado, x40) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Contrastante Azul de Evans 1%) 1 3mL Mounting Medium (Meio de montagem) 1 10 Coverslips (Lamelas) 1 folheto de instrucções

708297 20 ANCA Neutrophil Substrate Slides – 12-well (lâminas x 12 poços com neutrófilos, fixados com formol). 1 1mL p-ANCA Positive Control (Controlo positivo p-ANCA) 1 1mL c-ANCA Positive Control (Controlo positivo c-ANCA) 1 1mL ANA Positive Control (Controlo positivo ANA, somente) 1 1mL IFA System Negative Control for ANCA (Controlo negativo) 1 15mL anti Human IgG AFF Fluorescein with Evans Blue (Conjugado anti-IgG humano purificado e

marcado com fluoresceína com Azul de Evans) 2 25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrado, x40) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Contrastante Azul de Evans 1%) 1 10mL Mounting Medium (Meio de montagem) 1 20 Coverslips (Lamelas) 1 folheto de instrucções

Material fornecido (lâminas) 508295.10 10 x ANCA Neutrophil Substrate Slide – 6-well (lâminas x 6 poços com neutrofílos, fixados com formol) 508295.20 20 x ANCA Neutrophil Substrate Slide – 12-well (lâminas x 12 poços com neutrofílos, fixados com

formol)

Material Necessário Não Fornecido 1. Água destilada para diluir o PBS II concentrado 2. Recipiente para o tampão PBS II 3. Micropipetas e pontas descartáveis para aplicação das amostras dos doentes. 4. Câmara húmida para os passos de incubação 5. Microscópio de fuorescência com filtro excitador de 495nm e um filtro barreira de 515nm 6. Esguicho de plástico para a lavagem inicial com o PBS II

No caso de utilização apenas das lâminas, deverá necessitar do seguinte material (números de peça de INOVA): controlo positivo; ex. c-ANCA (508191), p-ANCA (508291), controlo negativo (508007), conjugado IgG marcado com FITC (508113) ou conjugado anti-IgGAM humana marcado com FITC (504031), PBS II (508998), Azul de Evans (504049, opcional), meio de montagem de neutrófilos (508001, 508005, 508006), lamelas.

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Procedimento Controlo de Qualidade Os controlos positivos e negativos devem ser utilizados sempre que são testadas as amostras. 1. Diluir o PBS II concentrado. Diluir o PBS II concentrado em água destilada (1 parte de PBS II concentrado + 39

partes de água destilada) e misturar bem. Nota: o PBS II é utilizado para diluir as amostras dos doentes e como tampão de lavagem. Diluir todo o PBS II apenas se todo o kit for utilizado dentro de um mês.

2. Diluição das amostras Despiste: Diluir as amostras 1/20 adicionando 10µL de soro a 190µL de tampão PBS II. Quantificação: Efectuar diluições sucessivas das amostras positivas com o tampão PBS II (ex: 1/40, 1/80,

1/160, 1/320 e 1/640 etc). Por exemplo: Uma amostras de 100µL com uma diluição de 1/20 misturar com 100µL de PBS II para obter uma diluição de 1/40. Repetir este procedimento para as diluições seguintes.

3. Lâminas com substrato: Deixar as lâminas com substrato durante 30 minutos à temperatura ambiente (18-28ºC) antes de se retirarem do invólucro. Rotular as amostras correctamente, colocar na câmara húmida e adicionar uma gota de controlo positivo e outra de controlo negativo nos respectivos poços. Adicionar 25µL de amostra nos restantes poços.

2. Incubação das lâminas. Incubar as lâminas durante 30 minutos na câmara húmida à temperatura ambiente (18-28ºC).

3. Lavagem com PBS II. Remover as lâminas da câmara húmida e lavar abundantemente com o esguicho de PBS II, mas com cuidado. Não deitar directamente nos poços. Colocar as lâminas num suporte e imergi-las em PBS II e agitar durante 10 minutos.

4. Adição do conjugado fluorescente. Colocar novamente as lâminas na câmara húmida e colocar imediatamente uma gota de conjugado fluorescente em cada poço. NÃO DEIXAR OS POÇOS SECOS POR MAIS DE 15 SEGUNDOS. Se o substrato secar os resultados serão seriamente afectados.

5. Incubação da lâmina. Incubar as lâminas durante 30 minutos na câmara húmida à temperatura ambiente (18-28ºC) no escuro.

6. Lavagem com PBS II. Lavar novamente como descrito no passo 5. Contraste opcional: Adicionar 2-3 gotas de Azul de Evans a 1% por 100mL de PBS II antes de imergir a lâmina.

7. Montagem com a lamela. Remover uma lâmina de cada vez da solução de PBS II. Adicionar uma gota de meio de montagem a cada poço. Colocar cuidadosamente a lamela na lâmina, evitando a formação de bolhas de ar; no entanto se existirem não tentar removê-las. Cuidadosamente, limpar algum excesso de meio de montagem.

8. Observação das lâminas num microscópio de fluorescência. As lâminas devem ser conservadas entre os 2-8ºC. Devem ser observadas com a maior brevidade possível.

Controlo de Qualidade Em neutrófilos fixados com formol, amostras c-ANCA e p-ANCA revelam uma coloração granular do citoplasma. Em mas em neutrófilos fixados com formol essa ANA positividade não se observa. O controlo negativo não deverá apresentar alguma fluorescência. Se os controlos não se apresentam como o descrito, o teste deve ser considerado inválido, pelo que deve ser repetido.

Interpretação dos Resultados Negativo Uma amostra é considerada negativa se a coloração específica do neutrófilo é equivalente ao do poço correspondente ao controlo negativo. Positivo Uma amostra é considerada positivo se se observar uma coloração citoplasmática. Nota: Cada laboratório deve estabelecer qual o ponto pelo qual um resultado positivo é considerado como tendo significado clínico. Interpretação dos padrões c-ANCA (coloração citoplasmática) Quer em lâminas fixadas com formol, amostras c-ANCA positivas revelam uma coloração granular generalizada do citoplasma. p-ANCA (padrão perinuclear) Em lâminas fixadas com formol, as p-ANCA amostras revelam uma coloração granular generalizada do citoplasma, similar à obtida para amostras c-ANCA positivas. Padrão ANA Em lâminas fixadas com formol, a maioria dos antigénios nucleares foram destruídos, pelo que revelam uma fluorescência negativa ou muito reduzida, quando comparada com o controlo positivo p-ANCA.

Limitações do Procedimento 1. Amostras inactivadas pelo calor, hemolisadas ou imcompletamente desfibrinadas podem causar interferências

na coloração, tornando assim a interpretação mais difícil. Assim, devem ser obtidas novas amostras para se proceder a um novo teste. Amostras problemáticas devem ser diluídas com tampão PBS II contendo albumina a 2% ou soro bovino, de modo a reduzir eventuais interferências na coloração.

2. A fonte de luz, os filtros e as oculares de microscópios de fluorescência diferentes irão influenciar a sensibilidade do teste. A qualidade do microscópio é significativamente influenciado pela manutenção correcta, especialmente o címbre da lâmpada de vapor de mercúrio e substituição da lâmpada após o período de tempo recomendado.

3. Os resultados positivos por IFA devem ser confirmados através dos kits por EIA mieloperoxidase (MPO) e proteinase 3 (PR3).11,12 As lâminas de ANCA fixadas com formol podem também contribuir para a determinação da especificidade do anticorpo, especialmente para amostras com títulos baixos ou altos.

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4. Amostras ANCA positivas nem sempre revelam resultados positivos para mieloperoxidase (MPO) ou proteinase serina 3 (PR3) utilizando EIA, isto porque a positividade para ANCA se pode dever a outros antigénios granulares primários, que poderão ser responsáveis por padrões positivos de coloração p- ou c-ANCA. Nestes incluem-se elastase, lactoferrina, catepsina G, proteína catiónica 57 e outros antigénios de neutrófilos ainda não identificados.

5. Anticorpos anti-músculo liso (actina) podem reagir com neutrófilos humanos fixados com etanol, bem como aloanticorpos tais como, mart ou NB17 Anticorpos anti-músculo liso ou actina podem reagir com o citoplasma dos neutrófilos dando um padrão homogéneo, em lugar de um padrão de coloração típico de c-ANCA, fortemente mosqueado. Aloanticorpos também reagem com o citoplasma dos neutrófilos revelando um padrão finamente mosqueado. Geralmente, somente 40% das células ou menos evidencia fluorescência.

6. As amostras podem conter mais do que um autoanticorpo, ex. c-ANCA e p-ANCA ou c-ANCA e ANA. 7. Anticorpos reactivos aos neutrófilos podem também ser encontrados em soros de doentes com a doença

inflamatória de Bowel ou Colite ulcerativa.8 Em lâminas de neutrófilos fixados com etanol, estas amostras surgem com um padrão p-ANCA, isto é, com uma coloração perinuclear muito acentuada. Em lâminas de neutrófilos fixados com formol estas amostras são negativas ou evidenciam uma fluorescência muito reduzida.

8. Este teste por si só não deve ser considerado como diagnóstico. Outros factores deverão ser tomados em conta tais como, a história clínica do doente e outros resultados serológicos e biópsias.

As lâminas vendidas em separado têm a classificação de “Reagentes específicos de analitos”. Excepto como componente do kit NOVA Lite® ANCA IFA, as características analíticas e de desempenho não foram estabelecidas.

Características especiais Valores Esperados % Positivo Grupo de doentes No. p-ANCA c-ANCA Pessoas saudáveis 30 0 0 Doença de Crohn 80 25 0 Colite ulcerativa 46 46 0 Esclerose colangite primária com doença inflamatória de bowel 17 58 0

Cirrose biliar primária 25 28 0 Hepatite autoimune 15 33 0 Granulomatose de Wegener 30 0 100 Poliarterite nodosum * 5 0 100

Toda a informação acima descrita, deriva de Seibold et al9, com excepção da marcada *, que foi obtida por estudos “in-house” na The Binding Site Ltd.

Precisão 10 soros de doentes (três p-ANCA positivo, três c-ANCA positivo, dois ANA positivo e dois negativos) foram testados nove vezes (em triplicado com três lotes de kits diferentes). O padrão de coloração obtido para cada amostra não diferiu mais do que uma unidade de coloração (baseado numa escala de 1+ (coloração fraca) a 3+ (coloração forte).

Estudo comparativo 100 amostras de soro clínicas e 40 de dadores de soro adultos (20 homens, 20 mulheres) foram testados com o kit da Binding Site ANCA Combi e com um kit da concorrência. Os resultados foram os seguintes:

The Binding Site

Com

petit

or c-ANCA p-ANCA ANA Neg. p-/c-ANCA

c-ANCA 60 3 0 0 0 p-ANCA 3 27 0 0 0 p-/c-ANCA 0 0 0 0 1 ANA 0 0 6 0 0 Neg. 0 0 0 40 0

134 das 140 amostras testadas deram resultados idênticos pelos dois métodos. Para o padrão c-ANCA, a sensibilidade relativa foi de 95%, a especificidade relativa foi de 96%, e a concordância foi de 96%. Para o padrão p-ANCA, a sensibilidade relativa foi de 90%; a especificidade relativa foi de 97% e a concordância relativa foi de 96%. Para as seis amostras que deram padrões diferentes, todos demonstraram uma forte ou fraca coloração em um ou em ambos os kits, o que torna a interpretação difícil. RESUMO DA TÉCNICA 1. Diluir o PBS II com água destilada. 2. Diluir as amostras 1/20 com PBS II. 3. Retirar as lâminas do frio e equilibrar à temperatura ambiente (18-28°C). 4. Retirar a lâmina do invólucro e colocar na câmara húmida. Adicionar 25µL dos controlos e amostras. 5. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. 6. Enxaguar as lâminas com o esguicho de PBS II. 7. Lavar durante 10 minutos no suporte. 8. Adicionar imediatamente uma gota de conjugado fluorescente. 9. Incubar as lâminas durante 30 minutos. 10. Lavar novamente como descrito no paço 7. 11. Adicionar o meio de montagem a cada poço e a lamela. 12. Observar as lâminas num microscópio de fluorescência. NOVA Lite é uma marca registada da INOVA Diagnostics, Inc.Copyright 2012 Todos os Direitos Reservados©

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Referências

1. Van der Woude F.J. et al (1985) Autoantibodies against neutrophils and monocytes: Tool for diagnosis and marker of disease activity in Wegener’s granulomatosis. Lancet I, 425-9.

2. Goeken J. A. (1991) Antineutrophil cytoplasmic antibody – a useful serological marker for vasculitis, J. Clin. Immunol. 11, 161-174.

3. Davies D. J. et al (1982) Segmental necrotizing glomerulonephritis with antineutrophil antibody: possible arbovirus aetiology? Br. Med. J. 285, 606.

4. Falk R. J. and Jenette J. C. (1988) Antineutrophil cytoplasmic auto antibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic neutotizing and crescentic glomerlonephritis N. Engl. J. Med. 318, 1651-7.

5. Charles L. A., Falk R. J. and Jenette J. C. (1989) Reactivity of antineutrophil cytoplasmic autoantibodies with HL-60 cells. Clin. Immunol. Immunpathol. 53, 243-253.

6. Weller T. H. and Coons A. H. (1954) Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med 86, 789-794.

7. Stroncek D. F. et al (1993) Neutrophil alloantibodies react with cytoplasmic antigens: a possible cause of false – positive indirect immunofluorescence assays for antibodies to neutrophil cytoplasmic antigens. Am. J. Kidney Dis. 21, 368-373.

8. Hardarson S. et al (1992) Antineutrophil cytoplasmic antibody in inflammatory bowel and hepatobiliary diseases. Clinical Microbiology and Immunology 99, No. 3.

9. Seibold, F. et al (1992) Clinical significance of antibodies against neutrophils in patients with inflammatory bowel disease and primary sclerosing cholangitis. Gut 33, 657-662.

10. Protein Refence Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed A Milford Ward. J Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.

11. Savige J, Gillis D, Benson E, Davies D, Esnault V, Falk RJ, Hagen EC, Jayne D, Jennette JC, Paspaliaris B, Pollock W, Pusey C, Savage CO, Silvestrini R, van der Woude F, Wieslander J, Wiik A. International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA) Am J Clin Pathol. 1999 Apr;111(4):507-13. Review.

12. Savige J, Dimech W, Fritzler M, Goeken J, Hagen EC, Jennette JC, McEvoy R, Pusey C, Pollock W, Trevisin M, Wiik A, Wong R; International Group for Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA). Addendum to the International Consensus Statement on testing and reporting of antineutrophil cytoplasmic antibodies. Quality control guidelines, comments, and recommendations for testing in other autoimmune diseases. Am J Clin Pathol. 2003 Sep;120(3):312-8. Review.

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