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- 1 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
Maria Patrícia Albuquerque de Farias
Recife, 2006
LABSINFA-UFPEFA-UFPE
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FARIAS, M. P. A.
NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO
DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES
ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA Aluna: Maria Patrícia Albuquerque de Farias Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Farmacêuticas do Departamento
de Ciências Farmacêuticas da Universidade
Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos
à obtenção do título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e Medicamentos.
Departamento de Ciências Farmacêuticas (UFPE)
Orientador: Prof. Dr. Dalci José Brondani Co-Orientador: Prfa. Dra. Ana Cristina Lima Leite
Recife, 2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
PRÓ-REITORIA PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Dr. Celso Pinto de Melo
VICE DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Dra. Jane Sheila Higino
VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Samuel Daniel Sousa filho
COORDENADOR DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Dra. Miracy Muniz de Albuquerque
VICE-COORDENADOR DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Dr. Pedro José Rolim Neto
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O caráter e o destino de uma pessoa não é criado somente com base no
serviço que ela faz, mas com base em um coração verdadeiro e honesto.
Aqueles que fazem algo apenas intelectualmente ganham um nome.
Aqueles que fazem algo com seus corações ganham bênçãos.
Brahma Kumaris
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Dedico este trabalho
A Deus por sempre se fazer presente em mim, nas mais diversas formas de
força, perseverança e otimismo, Colocando sempre pessoas especiais e
importantes em minha vida, e como não poderia ser diferente, em um
momento
decisivo e final deste trabalho fez-se força em forma de criança: esta linda
criança que concebida em meu ventre, hoje soma alegria comigo: meu
primeiro filho (a).
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AGRADECIMENTOS
A Deus, que permite o somar de tantas vitórias ao longo de minha vida, sendo Ele força principal em cada nova conquista. Ao Prof. Dr. Dalci José Brondani, pela oportunidade de desenvolver este trabalho, por sua orientação, compreensão, confiança e amizade. A Profa. Dra. Ana Cristina Lima Leite, pelo apoio, amizade, companheirismo e incentivo em todos os momentos. A Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza, pela realização dos testes de toxicidade aguda, além do carinho, grande incentivo, apoio e amizade. Aos companheiros de mestrado Elisangela e Aldo pela disposição na realização dos testes de toxicidade aguda, além do apoio e amizade. A Profa. Dra Milena B. P. Soares da Fiocruz Salvador-Ba, pela realização dos testes antichagásicos. Ao Prof Dr. Frederico C. L. Maia do Departamento de Medicina Veterinária da da UFRPE, pelas análises histopatológicas de diversos órgãos. A Profa. Dra. Maria Nely Caetano pela realização dos ensaios de atividade antimicrobiana frente às cepas de Staphylococcus aureus muti droga resistentes. A Rogério Ribeiro Soares pela execução dos ensaios de atividade antimicrobiana frente às cepas de Staphylococcus aureus muti droga resistentes. A Profa. Dra. Janete Magali, pela realização dos ensaios de atividade antimicrobiana. As mestrandas Vânia T. Lima e Rosa E. de A. da Silva, do departamento de antibióticos, pela execução dos ensaios de atividade antimicrobiana.
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Aos colegas do LabSinfa Diogo Moreira, Ana Célia, Cristiane Souza, Victor Hugo, Marcos Veríssimo, Fábio Fernandes, Flávio Ricardo, Lucas oliveira, Marcos Moraes pela convivência e incentivo. Ao mestrando Diogo Moreira, do Labsinfa, por toda dedicação, disposição, companheirismo e pelo grande incentivo profissional e emocional, no decorrer deste trabalho. Aos colegas do curso de mestrado e em especial a Cinthia Meireles, Sandra Guimarães, Ana Flávia, Kristiana Mousinho, companheiras de estudo, pela amizade e incentivo. Aos professores e funcionários do departamento de farmácia pela dedicação, amizade, convívio. A Ricardo Oliveira e Eliete Barros da central de química analítica pela realização dos espectros de infravermelho e ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono. Aos meus pais, Seu céu e Dona Carminha, por serem sempre os primeiros incentivadores e torcedores de meus sonhos e conquistas. Aos meus amigos Ricardo O. de Moura e Diana J. N. Malta, pela fiel amizade cultivada desde o início de nossa graduação, que de tantos risos e choro partilhado juntos, nos tornou irmãos. Aos queridos amigos de graduação Diana, Ricardo, Andréa, Rebeka, Sandra, Victor, Bonifácio e George pelo convívio e amizade. A Dra Ádila Freitas pelo apoio incondicional, por ser instrumento da palavra e vontade de Deus em minha vida. A Profa. Dra Maria do Carmo Alves de Lima, a querida Nena, pela disposição num momento determinante da realização deste trabalho, pela dedicação, carinho e amizade.
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Ao meu irmão Pedro Farias, e toda minha família por todo apoio, carinho e incentivo em todos os momentos. A Marcos Rogério, meu fiel companheiro por tantos momentos difíceis, de puro descontrole emocional, que com muita sabedoria e amor soube contornar e transformar em força e apoio, cruciais para realização deste trabalho. A equipe da Pharma Face, farmácia de manipulação, dos bairros de Boa Viagem e Tacaruna, pelo respeito, apoio e carinho. A todos que diretamente ou indiretamente muito contribuíram para mais esta conquista em minha vida. A coordenação de aperfeiçoamento ao ensino superior-CAPES DF, pelo apoio financeiro, de grande contribuição no desenvolvimento deste trabalho.
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SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE SIMBOLOGIA E ABREVIAÇÕES
RESUMO
ABSTRACT
CAPÍTULO 1 – Introdução, Revisão da Literatura e Objetivos
1. INTRODUÇÃO 16
1.1. Das Crenças a Ciência na Descoberta de Novas Drogas 17
1.2. Doenças Tropicais: Tripanossomíase Americana 22
1.2.1. Doenças Tropicais 22
1.2.2. Distribuição Geográfica e Epidemiológica da Doença de Chagas 23
1.2.3 Doença de Chagas no Brasil 23
1.2.4. Aspectos Morfológicos / Ciclo Biológico do Parasito 24
1.2.5. Fisiopatologia da Doença de Chagas / Sintomas 25
1.2.6. Patogenia da Doença de Chagas 28
1.2.7. Mecanismo de Transmissão / Diagnóstico 28
2. REVISAO DA LITERATURA 30
2.1. Nitrofurazona: Origem Sintética e Terapêutica 30
2.2. Otimização do Método de Síntese da Nitrofurazona 31
2.3. Síntese de Análogos da Nitrofurazona 32
2.4. Nitrofurazona e Derivados: Potentes Agentes Antimicrobianos 35
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2.5. Síntese e Avaliação de Agentes Tripanomicidas 38
2.5.1. Obtenção de Novos Fármacos através da Síntese Orgânica 38
2.6. O Grupo Nitro e sua Importância na Química Medicinal 41
3. OBJETIVOS 45
3.1. Objetivo Geral 45
3.2. Objetivos Específicos 45
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 46
CAPÍTULO 2 - Artigo 1
Synthesis and biological activities of N-alkyl nitrofurazone analogues 50
CAPÍTULO 3 - Artigo 2
Evaluation of Nitrofurazone and N 2 - alkyl- derivatives against
methicillin resistant Staphylococcus areus (MRSA) multi-drug resistance
70
CAPÍTULO 4
Conclusões e Perspectivas 78
CAPÍTULO 5
(anexos) 81
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LISTA DE SIMBOLOGIA E ABREVIAÇÕES
T. cruzi - Tripanossoma cruzi
IVTF – Espectrometria de Infravermelho com Transformada de Fourier
1 H-RMN – Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
13 C-RMN - Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
Rf – Referência de Fase
TR – Tripanotiona Redutase
PQ – Primaquina
LLC-MK2 – célula epitelial renal de macaco Rhesus (Macaca mulata)
EOR – Espécies Oxigenadas Reativas
DL50 – Dose letal para 50%
IC50 – Concentração que inibe 50%
MRSA – Cepas de Staphylococcus aureus meticilina resistentes
VISA – Cepas de Staphylococcus aureus vancomicina intermediário
resistentes
DMF – Dimetilformamida
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NF – Nitrofurazona
SAR – Relação Estrutura Atividade
KBr – Brometo de Potássio
UV – Ultravioleta
NF01 – Derivado N 2 butil nitrofurânico
NF02 – Derivado N 2 pentil nitrofurânico
K2CO3 – Carbonato de potássio
Na2SO4 – Sulfato de sódio
p.f. – (ponto de fusão)
DMSO – Dimetilsufoxido
MIC – concentração mínima inibitória
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RESUMO
As infecções parasitárias causadas por protozoários patogênicos afetam mais de 3 bilhões
de pessoas em todo o mundo e representam um importante fardo de saúde e econômico.
Apesar do empenho no desenvolvimento de vacinas, a quimioterapia permanece o meio
isolado mais efetivo e barato de controlar a maioria das infecções microbianas e
parasitarias. Um derivado nitrofurano, a Nitrofurazona (5-nitro-2-
furfurilidenosemicarbazona) estudado inicialmente na década de 40, tem merecido destaque
por se tratar de um composto que possui atividade antimicrobiana de largo espectro de ação
contra microorganismos Gram-positivos e Gram-negativos, como também potente ação
para a forma aguda da doença de Chagas. Entretanto, este composto apresenta efeitos
tóxicos, além de baixa lipossolubilidade, o que requer maiores concentrações para obter
efeitos terapêuticos desejáveis. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi sintetizar,
mediante emprego da modificação molecular, fundamentada na homologação do protótipo
(Nitrofurazona), a obtenção e caracterização de novos derivados mais potentes e menos
tóxicos. Os novos derivados da Nitrofurazona foram sintetizados mediante a inédita
alquilação em meio aprótico, na posição N2 e N2,N4 da porção semicarbazona, com bons
rendimentos e grau de pureza. Os derivados N2-monoalquilados foram os mais ativos da
série, quanto à atividade antimicrobiana em ensaio in vitro frente a microorganismos
patogénos, revelando-se mais potente que o protótipo, principalmente para bactérias Gram-
positivos, incluindo cepas de S. aureus multi-resistentes (MRSA). A atividade
antichagásica foi determinada in vitro frente a forma epimastigota do T. cruzi, cepas Y, nos
quais os derivados N2,N4-dialquilados foram mais potentes que o protótipo. A toxicidade
aguda preliminar in vivo foi realizada para o derivado N2-monobutil (mais potente derivado
antimicrobiano), com DL50 = 186mg/kg, se revelando ligeiramente mais tóxico que o
protótipo; no entanto por ser este derivado mais lipossolúvel, seu transporte é facilitado
com maior poder de penetração celular. Os resultados obtidos foram bons, tanto no método
desenvolvido e rendimentos obtidos aos novos derivados, como também o aumento da
lipofília e a potencialização destes, frente a microrganismos e ao parasita T. cruzi.
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ABSTRACT
The parasitic infections caused by protozoary affect more than 3 billion people in the
worldwide and represent an important pack for economic and health. Despite the
persistence in the vaccine development, the chemotherapy it remains the more effective
isolated way and cheap to control the majority of the microbial and parasitic infections. The
nitrofuran derivative, Nitrofurazone (5-nitro-2-furfurilidenosemicarbazone) studied initially
in the decade of 40, has deserved prominence for dealing with a compound that possess
biological activity such as antimicrobials wide-specter of action against Gram-positives and
Gram-negative microorganisms, as also powerful action for the acute form of the Chagas’
disease. However, this compound presents severe collateral effect and weak liposolubility,
requiring great concentrations to get therapeutically effect. In this view, the objective of
this work was obtain, by principles of the molecular modification, based on the
homologation of the prototype (Nitrofurazone), the attainment and characterization of
compound more liposoluble, and consequently, more active and less toxic. The new
derivatives of the Nitrofurazone had been prepared by means of the new alkylation way in
aprotic solvents, in the position N2 and N2, N4 of the semicarbazone, with good yields and
degree of purity. The derivatives N2-monoalkylated had been most active of serie for
antimicrobial activity in assay in vitro against several microorganisms, showing more
potent than prototype, mainly for Gram-positives strains, including multi-drug resistant S.
aureus (MRSA). The antichagasic activity was determined in vitro against epimastigote
form of the T. cruzi, Y strain, in which the derivatives N2, N4-dialkylated had been more
active than the prototype. The preliminary toxic activity in vivo was carried through for the
N2-monobutyl derivative (more potent antimicrobial derivative), with LD50 = 186 mg/kg,
showing slightly more toxic than the prototype, however, more liposoluble, facilitating the
transport of this drug with larger power of crossing-cell. The gotten results had been good,
as much in the developed method and incomes gotten to the new derivatives, as well as the
increase of the lipofilia and the potencialization of this, against the microorganisms and to
parasite T. cruzi
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Capítulo 1
Introdução e Revisão da Literatura
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Das Crenças a Ciência na Descoberta de Novas Drogas
As atividades terapêuticas têm, provavelmente a idade do sofrimento do homem
numa estreita relação com sua própria biologia. A capacidade do curador de prover alívio
das dores e dos desconfortos, assim como a cura das doenças era motivo de fascinação e
respeito entre os membros do seu grupo social. A ele atribuíam-se poderes místicos e
mágicos, a capacidade de confidenciar com os deuses, procurando através de sucessivas
experimentações empíricas, o sopro das inspirações divinas que pudessem aumentar a sua
capacidade de curar e obviamente de influenciar profundamente todos os membros do
grupo1 .
A evolução das buscas terapêuticas vem dos primórdios onde a observação casual e
as reflexões analógicas foram certamente as bases dos primitivos ensaios clínicos,
necessariamente simples e criativos 1 .
No século passado, com o desenvolvimento da química e ciências afins seu interesse
se voltou para o isolamento dos princípios ativos de plantas ou animais, responsáveis pela
atividade biológica neles observada. Os avanços sobretudo da química orgânica sintética e
da química analítica tornaram possível a síntese de moléculas antes provenientes de fontes
naturais e especialmente vegetais. Estima-se que tenham sido identificados até o presente,
mais de cinco milhões de substâncias químicas das quais cerca de 63.000 são de uso
corrente e dessas, aproximadamente 6.000 são fármacos 1 . O emprego crescente da
computação no planejamento de novos fármacos se constitui em perspectiva promissora na
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busca de alternativas terapêuticas especialmente para doenças cujos fármacos disponíveis
são ainda inadequados 1 .
No último século os dois grandes avanços da medicina e da farmacologia, que
inclusive mudaram de modo significativo o padrão de distribuição das doenças e da
mortalidade, são representados pelo desenvolvimento dos antibióticos e das vacinas. No
início do século XX, existiam poucos tratamentos eficazes ou medidas preventivas para as
doenças infecciosas 1 .
No final do século XIX, a busca para encontrar medicamentos menos tóxicos do que
aqueles baseados em fontes naturais resultaram na introdução de substâncias sintéticas que
atuam como fármacos e seu uso foi ampliado no século XX. O trabalho inclui o
desenvolvimento de análogos mais eficazes, menos tóxicos e mais seguros que os
compostos protótipos existentes, como os anestésicos locais benzocaína e procaína a partir
da cocaína (figura 1) 2 .
NCH3
COO CH3
O
CO
H2N
OO
CH3
H2N
OCH2CH2N(CH2CH3)2
O
Figura 1: Estrutura dos anestésicos locais: cocaína (A), e derivados sintéticos: benzocaína (B) e procaína (C)
Estima-se atualmente que para cada 10.000 compostos sintetizados, somente um é
comercializado 2 . O primeiro desenvolvimento racional de fármacos sintéticos foi
A B C
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realizado por Paul Ehrlich e Sacachiro Hata, que produziram a arsfenamina em 1910,
combinando a síntese com uma triagem biológica e processos de avaliação confiáveis. No
início do século XIX, Ehrlich reconhecera que tanto as propriedades benéficas como as
tóxicas de um fármaco eram de grande importância para a sua avaliação 2 .
Na década de 30 a descoberta do primeiro antibiótico representou um marco na
busca de novos fármacos e estimulou a pesquisa intensiva de substâncias com atividade
antibiótica. Mais de 6.000 antibióticos já foram isolados e identificados e a cada ano 100
novas alternativas são introduzidas no mercado 1 .
De maneira geral, os fármacos disponíveis na terapêutica moderna são em sua
ampla maioria de origem sintética (85%), considerando também aqueles oriundos de
processos de heme-sínteses como muitos antibióticos provenientes de intermediários
homoquirais preparados em processos fermentativos. Em 1999 o mercado mundial
totalizava 354 bilhões de dólares, sendo apenas 13 bilhões a fatia nacional 3 .
O Ácido Acetil Salicílico (Aspiririna), representou o primeiro fármaco sintético
desenvolvido em 1889; a partir de então muitos outros compostos foram desenvolvidos até
o presente momento 3 .
A química medicinal, área interdisciplinar do conhecimento, baseada na química,
mas também envolvendo princípios de biologia, medicina e ciências farmacêuticas,
preocupa-se no planejamento, identificação e preparação de compostos biologicamente
ativos, bem como o estudo de seu metabolismo. Assim, a química medicinal figura-se com
grande desafio para os pesquisadores que almejam contribuir para o avanço dessa área
multidisciplinar 2 .
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Apesar de todo arsenal terapêutico existente, pesquisadores do mundo inteiro se
unem na perspectiva constante de novas descobertas no que tange a cura ou melhoria das
enfermidades que atingem o Homem e sua existência.
Neste arsenal, destaca-se o estudo de fármacos relacionados a doenças causadas por
microorganismos e parasitas, devido a alta incidência de doenças microbianas como
também a crescente resistência destas aos fármacos existentes.
Mediante estes relatos, a incessante busca de novos e melhores medicamentos
antimicrobianos e antiparasitários são pesquisas incansáveis de renomados grupos de
estudo da microbiologia e parasitologia agregados a química medicinal, em grandes
laboratórios públicos e privados em todo o mundo.
A obtenção de novos fármacos se utilizando de técnicas de modificação molecular a
partir de protótipos é exemplificada segundo o fluxograma a seguinte (figura 2) 4
.
Figura 2: Fluxograma para obtenção de novos fármacos a partir de protótipos já estudados.
PROTÓTIPOS DE ATIVIDADE TERAPÊUTICA COMPROVADA
MODIFICAÇÃO ESTRUTURAL
SÍNTESE DE ANÁLOGOS
TESTES BIOLÓGICOS
RELAÇÃO ESTRUTURA - ATIVIDADE
TESTES BIOLÓGICOS
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Neste universo de candidatos a fármacos, os compostos heterocíclicos têm se
destacado por apresentarem propriedades biológicas diversas tais como: antimicrobiana 5 ,
tuberculostática in vivo 6, 7, antimicótica 8, virostática in vitro 9, analgésica 10, antipirética 10,
imunossupressora 11 dentre outras.
Dentro deste grupo merecem destaque os compostos sintéticos derivados dos
nitrofuranos (figura 3); heterocíclicos de cinco membros contendo o átomo de oxigênio em
seu anel; apresentam um largo espectro de ação antimicrobiana (contra bactérias Gram
positivas, Gram negativas, além de fungos leviduriformes e filamentosos) 12. Também muito
estudados como agentes antiparasitários de grande importância na erradicação da
tripanossomíase americana ou doença de Chagas no inicio do século XX 13 .
ONO2
Figura 3: Nitrofurano, núcleo protótipo para vários fármacos.
Tem sido evidenciado o efeito tóxico de alguns nitrofuranos, como a Nitrofurazona
(figura 4), porém sua estrutura química tem despertado interesse de pesquisadores em
química medicinal, por sua notável atividade antimicrobiana e antiparasitária 14 .
Devido as importantes ações biológicas e a ocorrência da toxicidade elevada, a
utilização de técnicas racionais de modificação moleculares se mostra como alternativa
para a otimização deste fármaco.
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CO NH2NHNO CHO2N
Figura 4: Estrutura da Nitrofurazona.
1.2. Doenças Tropicais: Tripanossomíase Americana
1.2.1. Doenças Tropicais
As doenças tropicais estão geralmente associadas a condições de temperatura e
umidade, responsáveis pela proliferação de insetos vetores onde aspectos socioeconômicos
decorrentes das condições de subdesenvolvimento também fazem parte deste conceito 15 .
As doenças tropicais acometem milhões de pessoas que vivem em determinadas
áreas dos trópicos. Países em desenvolvimento são afetados por doenças tropicais como a
malária, esquistossomose, filariose, tripanossomíases, hanseníase, entre outras 15 .
Dentre as doenças tropicais conhecidas, merece destaque à doença de Chagas,
descoberta em 1909 por Carlos Chagas, doença causada pelo Tripanossoma cruzi 16 .
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1.2.2. Distribuição Geográfica e Epidemiológica da Doença de Chagas
A infecção por T.cruzi em humanos se estende do México até o sul da Argentina.
Atualmente, a doença afeta entre 16 a 18 milhões de pessoas e aproximadamente 25% da
população da América Latina (cerca de 100 milhões) correm o risco de adquirir a doença de
Chagas (Figura 5) 17 .
Figura 5: Países afetados pela doença de Chagas 17 .
1.2.3. Doença de Chagas no Brasil
No Brasil, a doença de Chagas está associada, historicamente, aos movimentos de
interiorização de populações colonizadoras que se iniciou no século XVII, onde o pico de
incidência está entre os anos de 1850 a 1950, através da consolidação de colônias
agropastoris no Sul, Sudeste e Nordeste do Brasil. Atualmente atinge uma área endêmica
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de cerca de 3.600.000 Km 2 , representando 44,5% da área do País, incluindo 2.400
municípios dos Estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Espírito Santo, Goiás, Maranhão, Mato
Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraíba, Paraná, Pernambuco, Piauí, Rio de Janeiro, Rio
Grande do Norte, Rio Grande do Sul, São Paulo, Sergipe e o Destrito Federal 18 .
1.2.4. Aspectos Morfológicos / Ciclo Biológico do Parasito
O ciclo de vida do T. cruzi é complexo e compreende três formas principais, dotadas
de características morfológicas e biológicas distintas (no vetor e no hospedeiro). Estas
formas são: amastigota (Leishimania), epimastigota e tripomastigota 19 . A característica
morfológica utilizada como base para a diferenciação é a posição do flagelo em relação ao
cinetoplasto e seu ponto de emergência do corpo do parasito 20. Nos hospedeiros
vertebrados ocorrem os tripomastigotas do tipo sanguícola e os amastigotas intracelulares,
enquanto nos hospedeiros invertebrados e em meios de cultura predominam as formas
epimastigotas, que passam depois à tripomastigotas metacílicas 21.
As formas tripomastigotas metaciclicas lembram as formas delgadas dos
tripomastigotas (que não podem evoluir se não penetrarem em hospedeiro vertebrado), e
que exibem capacidade invasiva para atravessar mucosas e conjuntivas e não são
suscetíveis ao soro humano, podendo sobreviver a temperaturas mais elevadas 22.
A forma tripomastigota se encontra no lúmem do reto do inseto, sendo depositados
juntamente com as fezes próximo ao local da picada (Figura 6) 21.
Os epimastigotas apresentam dimensões e formas variáveis, com citoplasma
abundante e cinetoplasto justaposto ao núcleo; a base do flagelo é próxima ao cinetoplasto,
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sendo que o flagelo emerge de um lado do corpo do parasito. Os epimastigotas são
originários da diferenciação de tripomastigotas sanguícolas ingeridos pelo vetor durante a
picada e multiplicam-se por divisão binária longitudinal no lúmem do tubo intestinal do
inseto (figura 6) 22.
A forma amastigota intracelular, mede aproximadamente 4 mm e é desprovida de
flagelo externo, sendo o aparelho locomotor reduzido ao segmento contido no bolso
flagelar. É encontrada no interior da célula do homem e a característica mais importante
dos amastigotas é a recuperação da capacidade de multiplicação, que se manifesta cerca de
35 horas após a invasão celular (figura 6) 21, 22.
Figura 6: Formas tripomastigota (A), epimastigota (B) e amastigota (C) do T. cruzi 23.
1.2.5. Fisiopatologia da Doença de Chagas / Sintomas
A doença causada pelo Tripanosoma cruzi, popularmente conhecida como doença
de Chagas, é uma importante doença endêmica, há muito reconhecida como um problema
de saúde pública 24.
A B C
- 26 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
A doença começa com uma febre simples e invade cada órgão do corpo em um
período dos anos, causando finalmente danos ao coração, cérebro e destruição do sistema
digestivo. Este fato é uma realidade para milhares dos povos americanos, africanos e
latinos 25.
O vetor principal que causa a doença de Chagas é o inseto Triatomideo, conhecido
por barbeiro e encontrado principalmente em casas de barro (figura 7). O excremento
deste, contém o parasita, que penetra no corpo através das membranas da mucosa, olhos, e
em ferimentos abertos 26.
Figura 7: Inseto triatomídeo (A) e uma típica casa de barro (B). 26
A doença de Chagas tem uma fase aguda, indeterminada e uma crônica. A fase
aguda aparece imediatamente depois da infecção inicial, no geral com sinais inespecíficos:
somente uma proporção muito pequena é reconhecida pelo olho fechado por causa do
inchamento das eyelids (sinal de Romaña) que se expressa em aproximadamente 5% dos
casos 26. (figura 8) .
A B
- 27 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
Figura 8: Triatomídeo, vetor causador da doença de Chagas (A) 27. Chagoma da inoculação
(B) 27 . Inchamento dos eyelids (sinal de Romaña) (C) 26 .
Após a infecção aguda, ocorre um período intermediário longo sem manifestações
clínicas. Na maioria destes casos, os pacientes apresentam a fase indeterminada com uma
expectativa de vida normal. Finalmente, em um terço da população infectada os ferimentos
do período crônico são desenvolvidos: miocardiopatía (figura 9) ou patologias do sistema
digestivo de diferentes graus de severidade. A manifestação pode estar na incapacidade
física parcial ou total, que reduz a sobrevida destes pacientes em 10% pelos 10 anos
seguintes, com medidas alternativas terapêuticas não satisfatórias 26 .
Figura 9: Coração de paciente chagásico crônico global ampliado (vista externa anterior) 27
A B C
- 28 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
1.2.6. Patogenia da Doença de Chagas
Na doença de Chagas são inúmeros os fatores que atuam direta ou indiretamente no
aparecimento das lesões produzidas pelo Tripanossoma cruzi. Alguns são devido ao
parasito (eventos iniciais na relação parasito-hospedeiro, polimorfismo, tropismo celular,
virulência do clone, cepa ou raça do parasito, reinfecção, infecções mistas, seleção clonal,
etc.,) e outros fatores são inerentes ao hospedeiro (constituição genética, sexo, idade, raça,
resposta imunitária, nutrição, tipos de células que interagem com o parasito, tais como
macrófagos e células musculares). Isto demonstra, a exemplo de outras doenças
parasitárias, que também na doença de Chagas os mecanismos pelos quais o T. cruzi
determina as lesões devem ser multifatoriais e deles depende o aparecimento ou não das
formas anatomoclínicas da doença, ou seja, a forma indeterminada, a cardíaca sintomática
ou não, a digestiva (megaesôfago e megacólon) ou a nervosa, além, é claro, das formas
mistas 16 .
1.2.7. Mecanismo de Transmissão/ Diagnóstico
Segundo Neves e colaboradores, existem vários tipos de transmissão, sendo cinco as
de maior importância epidemiológica: transmissão pelo vetor, transfusão sanguínea,
transmissão congênita, transmissão oral, transplante, além de acidentes de laboratório e
coito. Todas estas formas citadas representam meios importantes de disseminação da
doença e, portanto o controle destas se torna crucial para a diminuição da infecção
parasitária 16.
O diagnóstico por sua vez, pode ser realizado através de métodos clínicos e
laboratoriais de acordo com a fase em que se encontre a doença. O método clínico se detém
a pesquisar a origem do paciente e a presença dos primeiros sinais visíveis da doença que
são o sinal de Romaña e o chagoma, decorrentes da fase primária ou aguda da patologia, já
- 29 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
na fase crônica o ensaio clínico investiga as alterações cardíacas acompanhadas de sinais
de insuficiência cardíaca confirmados pelo eletrocardiograma e as alterações digestivas, do
esôfago e do cólon, revelados em raio X 16.
Os métodos investigativos laboratoriais por sua vez passam pelo diagnóstico de
pesquisa do parasito, através do exame de sangue em gota espessa, xenodiagnósticos,
dentre outros. Além disso, o diagnóstico sorológico é um outro método muito usado para o
diagnóstico da doença de Chagas 16.
- 30 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Nitrofurazona: Origem Sintética e Terapêutica
Partindo-se do conhecimento de que o ácido furóico, derivados alquilícos e 2-furano
mercuriais deste ácido apresentavam atividade bacteriostática, Dood e Stilman sintetizaram
o nitrofural, conhecido como Nitrofurazona. Este composto se mostrou eficaz tanto contra
bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas, sendo menos ativo contra Pseudomonas
pyocynea 28.
A Nitrofurazona, quimicamente corresponde a semicarbazona do 5-nitro-furfural,
preparada originalmente segundo o esquema abaixo (figura 10).
O C
(I )
O CH (O AC )2O
H
O C H =N -N HO 2N N H 2
O
(I I )
H (OAC )2O CO 2N
(I I I ) N it rof urazona (IV)
Figura 10: Esquema da primeira síntese da Nitrofurazona.
O furfural (I), protegido sob a forma de diacetato (II), é nitrado (na posição 5 do
anel), obtendo-se o 5-nitro derivado (III) e posterior condensação com semicarbazida em
ácido sulfúrico diluído, resulta na Nitrofurazona (IV) 28.
A Nitrofurazona foi primeiramente empregada no tratamento de queimaduras e
outras infecções durante a II Guerra Mundial. A essa época, foi observada atividade
antimicrobiana de amplo espectro e baixa incidência de sensibilização. Entretanto, o
- 31 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
espectro antibacteriano foi se modificando ao longo dos 20 anos da primeira utilização.
Atualmente algumas cepas de bactérias Gram-negativas são resistentes a este fármaco 29.
Em 1969, Andrade e Brener estudando os efeitos deste fármaco contra T. cruzi,
observaram que o nitrofurano em questão provocava extensa destruição parasitária. Por
outro lado, em 1988, Henderson e colaboradores, estudando a tripanotiona redutase (TR),
observaram que derivados de naftoquinonas e nitrofuranos, incluindo a Nitrofurazona,
apresentavam capacidade de inibir esta enzima 30.
Gonçalves e colaboradores observaram que a Nitrofurazona potencia os efeitos
tripanomicidas provocados pela Primaquina (PQ), em cultura de células LLC-MK2
infectadas com formas tripomastigotas de T. cruzi 31.
A Nitrofurazona é tóxica quando administrada por via oral, causando hemólise e
neuropatia periférica grave 29. Por isso, foi retirado do mercado de alguns países e, em
outros como no Brasil, seu uso é permitido apenas por via tópica (em baixas doses, de 2 à
5%). É quimioterápico de escolha para o tratamento de infecções estafiloccócicas da pele
resistentes a outros fármacos, sendo utilizado no tratamento, por aplicação local, de
infecções de feridas, queimaduras e ulcerações da pele, como também, no preparo de
superfícies de enxerto de pele. Topicamente, pode provocar dermatite de contato 29.
2.2. Otimização do Método de Síntese da Nitrofurazona
Após sua origem e comercialização, a síntese da Nitrofurazona passou a ser
pesquisada a fim de se obter um método de otimização de produção para a indústria
farmacêutica. Para a síntese da Nitrofurazona, vários métodos têm sido usados. O material
de partida usado na síntese pode ser: 5-nitro-furfuraldiacetato, 5-nitro-furaldeído, 2-
- 32 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
furaldeído ou nitrofurfuraloxime. Desde que 2-furaldeído seja uma substância econômica e
possa ser usado para produção de Nitrofurazona em escala industrial. O 2-furaldeído foi
utilizado como substância de partida, aplicado a condições variadas de tempo, temperatura,
pH e catalisadores de provas para obtenção de produtos com qualidade adequada,
rendimento e produção suficientemente boa para ser alcançada industrialmente. De acordo
com Tehrani e colaboradores, dos oito métodos testados, chegou-se apenas a obtenção de
um método plausível como procedimento otimizado para preparação piloto para a indústria,
segundo o esquema a seguir (figura 13) 32.
O CHO
1) HNO3, H2SO4
2) (CH3CO)2O O CH(OCOCH3)2O2N
NH2NHCNH2 Cl-O
O CHO2N NNHCNH2
O
Figura 13: Preparação piloto para produção industrial da Nitrofurazona 32.
2.3. Síntese de Análogos da Nitrofurazona
As regras que controlam o desenvolvimento de novos fármacos evoluíram no último
século para garantir a segurança e eficácia de novos medicamentos para a população 33 .
Qualquer fármaco, não importa quão banal sejam suas ações terapêuticas, tem o
potencial de causar dano. As reações adversas são o preço da terapêutica clínica moderna 33
. As substâncias químicas transformadas em fármacos devem ter eficácia terapêutica e ser
seguras. Infelizmente, todas as substâncias químicas têm potencial para causar efeitos
indesejáveis. Por esta razão, durante o desenvolvimento dos fármacos é essencial escolher
- 33 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
compostos químicos que tenham larga margem de segurança entre a dose que produz o
efeito desejado (terapêutico) e a que causa efeitos indesejáveis (tóxicos) 33 .
A modificação molecular, fundamentada no bioisosterismo, latenciação e
homologação, têm permitido a identificação de novos derivados terapeuticamente úteis, por
otimização de um composto protótipo 3 .
A homologação tem se mostrado uma importante estratégia de obtenção de novos
fármacos, na otimização de compostos já existentes 34 .
Dentre as centenas de derivados nitrofurânicos que já foram sintetizados e testados,
alguns ingressaram no arsenal terapêutico e foram mais tarde oficializados, a saber 13 .
• Nitrofurazona (figura 14): foi o primeiro nitrofurano introduzido na
terapêutica no ano de 1946. Suas propriedades antibacterianas foram
descobertas em 1943 por Stilmam e colaboradores, sendo, portanto,
conhecido comercialmente pelo nome de Furacim® (Schering-ploug) 13 ,
sendo mais tarde também comercializada pelos laboratórios Brasmedica
e Lafepe.
Figura 14: Estrutura da Nitrofurazona
• Nitrofurantoína (figura 15): foi introduzido na terapêutica em 1953, é
conhecida comercialmente pelo nome de Furadantin; corresponde
quimicamente à N-(5-Nitro-2-furfuriliena)-1-amino-hidantoína;
O CH=N-NH-C-NH2O2NO
- 34 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
apresenta atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;
sendo bacteriostática e bactericida contra a maioria de espécies de
estafilococos e estreptococos. Tem a mesma ação contra a Escherichia
coli e Aerobacter aerogenes. É inativa contra fungos e vírus. Também é
utilizada no tratamento das infecções bacterianas das vias urinárias por
via oral 13 .
Figura 15: Estrutura da Nitrofurantoína
• Furazolidona (figura 16): conhecida comercialmente com o nome de
Furoxana, foi introduzida na terapêutica em 1958. Quimicamente
corresponde à 3-(5-Nitro-2-furfurilideno)-2-oxazolidiona, sua síntese foi
descrita por Gever e colaboradores em 1955 e é ativa contra vários
microorganismos entéricos Gram-positivos e Gram-negativos, inclusive
espécies de Salmonella, Shigella, Escherichia, Proteus, Estreptococcus
e Estafilococos; apresenta, outrossim, atividade contra protozoários. É
administrada por via oral, no tratamento de diarréias de origem
bacteriana e de enterites. Sob o nome oficial de furaldatona e nome
comercial de Altafur . Indicado como antibacteriano para uso oral, tal
composto provocou freqüentes acidentes tóxicos; por esse motivo, foi
retirado do comércio em novembro de 1961 13 .
ONO2N N
NHO
O
- 35 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
Figura 16: Estrutura da Furazolidona
• Nifurtimox (figura 17): corresponde a porção (3-metil-4-(5’̉̉-nitro-
furfurilidenoamina-tetrahidro-4H-1,4-tiazina-1,1-dioxido) e com o nome
comercial de Lampit . É bastante eficiente no tratamento da doença de
Chagas, fase aguda, nas doses de 8 ou 10 mg 13 .
Figura 17: Estrutura do Nifurtimox
2.4. Nitrofurazona e Derivados: Potentes Agentes Antimicrobianos
A Nitrofurazona é um importante composto dos derivados nitrofurânicos, sendo um
potente agente antimicrobiano 12 .
O mecanismo de ação dos nitrofuranos ainda não está totalmente esclarecido. Eles
inibem muitos sistemas enzimáticos bacterianos, a maioria provavelmente por dano ao
DNA. Uma enzima bacteriana, a nitrorredutase, converte os compostos em intermediários
de vida curta, incluindo radicais oxigenados livres, que interagem com o DNA causando
quebras e posterior dano às bactérias. A resistência bacteriana destes compostos não é
ONO2N N
O
O
ONO2N N
SO
O
- 36 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
medida por plasmídios, mas parece ser causada por uma mutação associada à perda de
atividade da nitrorredutase bacteriana 35 .
Ainda sobre o mecanismo de ação dos nitrofuranos, Paul e colaboradores (1954)
afirmam que a atividade antimicrobiana dos nitrofuranos no geral é devida a interferência
nas fases precoces do ciclo de Krebs, precisamente pela inibição que se processa na
formação anaeróbica da acetil-coenzima A, com conseqüente bloqueio do metabolismo
glicídico das células bacterianas 13 .
Em 1943, as propriedades antibacterianas dos nitrofuranos foram descobertas e
estudadas por Stillman e colaboradores. A presença do grupo nitro é essencial, porquanto
os compostos análogos não nitrados (ou com o grupo nitro reduzido) são inativos. A
Nitrofurazona é ativa tanto in vitro quanto in vivo contra bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas e que conforme a concentração, age como bacteriostático ou como bactericida 28.
Dentre as várias atividades atribuídas aos derivados nitrofuranos, alguns trabalhos
apontam a atividade destes compostos frente ao crescimento e estágio de latência do bacilo
Mycobacterium bovis, sendo o Metronidazol (figura 11) o primeiro composto que possui
atividade frente ao estágio latente deste bacilo, embora o crescimento bacteriano não seja
afetado por este fármaco, atuando como uma pró-droga que requer a redução do seu grupo
nitro para um intermediário reativo que então causa danos para o DNA e subseqüentemente
morte celular. Assim, vários nitrofuranos se mostram ativos frente ao Micobaterium bovis,
uma vez que esta bactéria em condições de hipóxia, encontra-se sensível à ação do oxigênio
radicalar proveniente da redução destes nitrofuranos 36 .
- 37 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
Figura 11: Estrutura do Metronidazol
Em 1995, foram sintetizados derivados da tiossemicarbazona, contendo grupos
cíclicos ou heterocíclicos, como o 1-ciclohexilidino-N(1,2-diidro-2-oxo-3H-indol-3-
ilideno) semicarbazona, N-substituídos com morfina ou piperidina (figura 12),
apresentando boa atividade frente aos microorganismos: E. coli, S. typhimurium, V.
cholerae, Enterobacter, Poteus sp. Mirabilis, Pseudomonas Aeruginosa, S. typhi, S.
paratyphi e Klebsiella. Os melhores resultados foram frente ao V. cholerae e S. typhi, com
diâmetro de halo de inibição na dose de 2,5 mg/mL para 18 e 17 mm respectivamente,
sendo portanto o microorganismo V. cholerae o mais sensível ao derivado substituído com
piperidina 37 .
N O
N C
S
NH NR2
CH2 NH R1
figura 12: Estrutura do 1-ciclohexilidino-N-(1,2-diidro-2-oxo-3H-indol-3-ilideno) semicarbazona, N- substituídos com morfina ou piperidina.
N
N
CH3
CH2CH2OHO2N
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FARIAS, M. P. A.
2.5. Síntese e Avaliação de Agentes Tripanomicidas
2.5.1. Obtenção de Novos Fármacos através da Síntese Orgânica
A quimioterapia atual frente a doença de Chagas ainda está muito inadequada, pois
as duas principais drogas em uso são: Nifurtimox ®, cujo mecanismo de ação envolve a
produção do ânion superóxido que é altamente tóxico para o parasita. E também o
Benznidazol ®, que atua sobre o sistema respiratório do parasita e também inibe a síntese
de DNA. Ambas as drogas apresentam efeitos colaterais indesejáveis e são ineficientes para
o tratamento crônico da doença de Chagas que pode ser considerada como uma doença
ainda sem cura 38 .
O desenvolvimento de novas drogas frente a esta infecção parasitária onde as
pesquisas são geralmente direcionadas para as diferenças chaves entre o metabolismo do
hospedeiro mamífero e no parasito, o metabolismo da tripanotiona redutase (TR) pode ser
observado como alvo para o desenvolvimento de agentes contra as tripanossomatides 38 .
Messeder e colaboradores 39, sintetizaram uma série de compostos guanil hidrazona
e avaliaram frente a forma tripomastigota do T. cruzi. Dentre os compostos sintetizados, o
derivado guanil hidrazona contendo o grupo nitro (figura 18), apresentou melhor atividade
frente ao ensaio, com IC50 = 17,1 µM e cerca de 100 vezes mais potente que o derivado
contendo o grupo amino como substituinte, com IC50 = 220,6 µM.
- 39 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
O
O R
N
H
NH
N H 2
N H 2
C l
R = N O 2, N H 2, H
Figura 18: Derivados guanil-hidrazonas com atividade antitripanossomal.
Cerecetto e colaboradores sintetizaram uma série de 5-nitro-2-furaldeído e 5-nitro-
tiofeno-2-carboxialdeído semicarbazona, na qual a porção N-4 da semicarbazona é
substituída por cadeias alifáticas, arílicas e aminas heterocíclicas (figura 19). Estes
compostos foram planejados pela mimetização da porção espermidine da enzima
tripanotiona redutase (TR), com potencial atividade tripanocida. Os compostos foram
testados in vitro pela sua capacidade em inibir o crescimento das formas epimastigotas do
T. cruzi. Os resultados mostraram que os compostos contendo os substituintes butil e 2-
metox-etil na posição N-4 da semicarbazona foram os mais ativos da série, com boa
correlação entre as propriedades lipofílica-hidrofílica e seus potenciais de redução (Epc1).
Isto sugere que neste quadro de compostos a atividade é mais dependente do comprimento
da cadeia que sobre os efeitos trazidos pela presença do heteroátomo 38 .
- 40 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
Figura 19: Derivados 5-nitro-2-furaldeído e 5-nitro-tiofeno-2-carboxialdeído semicarbazona, substituídos na posição N-4 da semicarbazona por cadeias alifáticas,
arílicas e aminas heterocíclicas.
Uma série de compostos planejados a partir do Megazol [1-metil-2-(5-amino-1,3,4-
tiazol)-5-nitroimidazol], um importante composto-líder com atividade antiparasitária e
antibacteriana e que tem sido empregada em fase experimental na doença de Chagas,
quando esta se apresenta resistente ao Nifurtimox e Benznidazol ( figura 24) 40. Baseado na
estrutura do Megazol, novos bioisostéros, derivados nitrofuranos e nitrotiofênicos foram
obtidos e avaliados em ensaios in vitro frente ao T. cruzi, com resultados satisfatórios,
sendo mais potente que o Megazol, principalmente para os derivados tiofênicos, com
inibição de 100% frente ao T. cruzi e 95% para o T. brucei, na concentração de 1,5µM
(figura 20) 40 .
N
N
NO2
CH3N N
S NH2
Megazol Bioisósteros do Megazol
XNO2N N
S NH2
X = S, O
Figura 20: Novos bioisostéros do Megazol, contendo o anel nitrofurano ou tiofeno 50.
XNO2N
NH NH
O
R
X = O, SFragmentos mimeticos da porção Espermidina (TR)
- 41 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
Chung e colaboradores41, obtiveram e avaliaram in vitro o derivado da
Nitrofurazona, o hidroximetilnitrofurazona (NFOH-121), (figura 21), sintetizado em meio
alcalino de acordo com o método de Yananoaka e colaboradores 42 .
A atividade do NFOH-121 foi evidente tanto nas tripomastigotas quanto nas
amastigotas quando comparadas ao Benznidazol, usado como droga padrão. Com as
amastigotas, o Benznidazol apresentou um percentual de 81,1% de inibição do crescimento,
enquanto que com o derivado NFOH-121 foi de 99,6 e 100%, nas doses de 5 e 10 µM.
Neste mesmo ensaio, na dose de 5 µM, a Nitrofurazona inibe 97,2%. Estes mesmos autores
revelaram que o composto NFOH-121 atua como um pró-fármaco da Nitrofurazona,
apresentando menor potencial mutagênico em relação a Nitrofurazona 41 .
ONO2N NH NH2
O
ONO2N NH NH
O
OH
K2CO3/ H2O, H2CHO 70ºC, 48 hs
NFOH-121
Figura 21: Rota sintética do derivado NFOH-121, pró-fármaco da Nitrofurazona 41
2.6. O Grupo Nitro e Sua Importância na Química Medicinal
Entre os diversos métodos de preparação de pró-fármacos, a adição do grupo nitro é
uma das mais empregadas na obtenção de pró-fármacos nos quais depende da
biotransformação enzimática. Este método é exaustivamente utilizado na obtenção de
quimioterápicos, destacando-se os anti-maláricos e anti-chagásicos 43, 44.
- 42 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
O grupo nitro, numa molécula, proporciona diversos efeitos, dentre os quais
podemos destacar: efeitos físico-químicos, que modifica profundamente a solubilidade e a
lipofilicidade da molécula; efeitos bioquímicos, que se caracterizam pelo metabolismo
específico dos nitroderivados; e efeitos farmacológicos, que se devem a ação indutiva
elétron-atraente do substituinte nitro 14. A ele é atribuído o conceito de grupo parasitóforo
por excelência 14 . A redução do grupo nitro, com geração de espécies oxigenadas reativas
(EOR) é essencial para a maioria das atividades biológicas de nitrocompostos 45. Sua
completa redução envolve a adição de 6 elétrons, formando aminas via intermediários
nitrosos (etapa de 2 elétrons) e hidroxiaminas (etapas de 4 elétrons), como esquematizado
na Figura 22 46.
Figura 22: Esquema simplificado da redução de nitrocompostos, adaptado da referencia 46.
O número de compostos nitrados na natureza é relativamente pequeno. Um clássico
exemplo é o antibiótico cloranfenicol (figura 23), bastante utilizado na quimioterapia
antimicrobiana. Entretanto, a classe de nitrocompostos sintéticos engloba uma variedade
maior de substâncias com larga aplicabilidade terapêutica.
RNO2 RNO2 RNO2HH+
1e-
RNO RNHOH RNH2
DNA
quebras das fitas
1e-, H+
desproporcionamento hidroxilamina amina
RNO2H RNO2
H2O
2e-, 2H+ 2e-, 2H+, -H2O
nitroso
- 43 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
figura 23 : D(1)-treo-1-p-nitrofenil-2-dicloroacetamido-1,3-propanodiol (Cloranfenicol).
Os nitrocompostos exibem toxicidade seletiva para os microorganismos
anaeróbicos. A ação antimicrobiana de nitrofuranos foi primeira descoberta em 1940 e
desde então tem sido aplicado como importantes agentes antimicrobianos, principalmente
para infecções do trato intestinal e urinário 47. Em 1960, o 5-metroimidazol Metronidazol
(figura 11) foi comercializado para o tratamento de vaginites tricomonal e desde então um
grande número de derivados do Metronidazol tornou-se importantes agentes para o
tratamento de doenças protozoárias causadas por Tricomonas vaginalis, Entamoeba
histolytica, Giárdia intestinalis e uma variedade de outras infecções 48. Mais recentemente,
o Metronidazol tem sido efetivo em terapias de úlceras gastroduodenal, envolvendo
infecções por H. pilory 49.
Muitos compostos sintéticos nitrados exibem ação anti-parasitária e entre eles,
talvez os mais importantes sejam os nitrofuranos e nitroimidazois (figura 24).
figura 24: Nitrocompostos de interesse biológicos.
O2N CH C CH2OH
OH H
NH COCHCl2
OO2NN
N SO2
Nifurtimox Benznidazol
N
N
NO2
NH
O
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FARIAS, M. P. A.
O principal parâmetro físico-químico que determina a efetividade dos
nitrocompostos é o potencial de redução Epc do grupo nitro 49. O potencial de redução
quantifica a energia de reações de transferências de elétrons (um elétron é fisicamente
transferido entre duas espécies, resultando em uma mudança química). A relativa facilidade
na redução de muitos nitrofuranos (ou seja, valores positivos de Epc) facilita a sua redução
(e conseqüentemente, ação citotóxica) tanto em células em condições anaeróbicas (parasita)
como também nas células em condições aeróbicas (mamíferos), respondendo assim pela
recorrente toxicidade elevada e severos efeitos colaterais desta classe de drogas 14 .
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FARIAS, M. P. A.
3. Objetivos
3.1. Objetivo Geral
Síntese de derivados do composto Nitrofurazona, com a finalidade de otimizar os
efeitos farmacológicos frente a diversos microorganismos e parasitas e diminuição dos
efeitos tóxicos, com base em estudos detalhados nas estratégias racionais de modificação
molecular.
3.2. Objetivos Específicos
• Sintetizar novos derivados N2 e N2 - N 4-alquilados da Nitrofurazona, por meio da
inédita alquilação regioseletiva em meio aprótico.
• Caracterizar a estrutura química dos compostos sintetizados através de
Espectroscopia de Infravermelho (IVTF) e Ressonância Magnética Nuclear de
Prótons (1H-RMN) e Carbono (13C-RMN), Ponto de Fusão e Rf.
• Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro dos novos produtos frente a bactérias
Gram-positivas, Gram-negativas, fungos filamentosos e leveduras.
• Avaliar a atividade antichagásica, em ensaio in vitro frente a forma epimastigota,
com determinação da IC 50.
• Realizar estudos farmacológicos com determinação da DL 50.
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FARIAS, M. P. A.
Enviado para: Biorganic Medicinal Chemistry
Capítulo 2
Artigo 1 – Synthesis and biological activities of N-alkyl-Nitrofurazone
analogues
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FARIAS, M. P. A.
Synthesis and biological activities of N-alkyl nitrofurazones analogues
Dalci J. Brondani1 *, Maria Patrícia A. de Farias1 , Vânia T. Lima2, Rosa E. de A. da Silva2,
Janete Magali de Araújo2, Ivone Antonia de Souza3, Milena B. P. Soares4, Alice C. Kiperstok4 , Frederico , C. L. Maia5 and Ana Cristina L. Leite1
1LABSINFA – Laboratório de Planejamento, Avaliação e Síntese de Fármacos, Depto de Ciências
Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520, Recife. PE - Brazil
2Laboratório de Genética de Microorganismos, Depto de Antibióticos- CCB, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520, Recife. PE - Brazil
3Laboratório de Cancerologia Experimental, Depto de Antibióticos- CCB, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520, Recife. PE - Brazil
4LETI- Laboratório de Engenharia Tecidual e Imunofarmacologia, Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz, Salvador- BA, Brazil. [email protected]
5Área de Patologia Animal do Departamento de Medicina Veterinária-Universidade Federal Rural de Pernambuco-UFRPE
Abstract In the present study, synthesis, physical and analytical properties of N2-alkyl and N2,N4-dialkyl-nitrofurazone derivatives are described. These new compounds were obtained by regioselectivity N-alkylation in mild conditions, polar aprotic solvent, and characterised by IR, 1H-NMR, 13C-NMR and elemental analysis. The compounds were screened for antibacterial activities against Gram-negative, Gram-positive bacteria, mycobacteria and fungi and as potential antitrypanosomal agents. The N2-butyl and pentyl derivatives have the highest antimicrobial activities against Gram-positive bacteria, mycobacteria and fungi with minimum inhibitory concentrations in the range of less of 10µg/ml. The N2,N4-dialkyl derivatives displayed the highest in vitro activity antitrypanosomal agents. The preliminary toxic activity in vivo was carried through for the N2-monobutyl derivative (more potent antimicrobial derivative), with LD50 = 186mg/kg, showing slightly more toxic than the prototype. Keywords: nitrofurazone derivatives/ alkyl derivatives/ antibacterial activities/ antitrypanosomal activity Corresponding author:
Departamento de Ciências Farmacêuticas
Universidade Federal de Pernambuco
Av. Moraes Rego, s/n Cidade Universitária, Recife- PE, Brasil
Phone/Fax: (+55) 81 2126 8511 E-mail: [email protected]
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FARIAS, M. P. A.
1. Introduction
In recent years, the number of life-threatening infections caused multi-drug resistant
Gran-positive and Gran-negative pathogen bacteria have reached an alarming level in many
countries around the world [1,2]. A number of clinic reports in worldwide have
independently described the emergence of vancomicine intermediate-resistence in
Staphylococcus aureus (VISA) and methicilin-resistence Staphylococcus aureus (MRSA)
isolates and other human pathogen Gran-positives isolates [3]. Infections caused by these
microorganisms pose a serious challenge to the community and need for an effective
therapy has led to a search for novel antibacterial agents.
The flagellate protozoa trypanosomes are the causative parasites of several tropical
diseases, as African sleeping sickness (Trypanosoma gambiense and Trypanosoma
rhodiense) and Chagas’ disease (Trypanosoma cruzi) in humans, and nagana (Trypanosoma
congolense and Trypanosoma brucei) in cattle. According to the World Health
Organization (WHO), 16–18 million people are infected with T. cruzi, 2–3 million
individuals have the clinical symptoms of the chronic stage of Chagas’ disease and, every
year, are reported 21,000 deaths and 300,000 new cases [4]. Moreover, Chagas’ disease is
transmitted not only by Triatomine insects but also by blood transfusion, this latter
mechanism is responsible for the occurrence of Chagas’ disease in regions where it is not
endemic [5]. Currently, this patology is treated with nitroheterocyclic agentes such as
Nifurtimox and Benzinidazole. These two drugs are effective against the circulating form
of the parasite (trypomastigotes) during the acute phase of the disease, but not during
during the chronic stage.
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FARIAS, M. P. A.
Besides, several researchers reported that Nitrofuran compounds, displays a very
important role in medicine as antimicrobial [6] and antiparasitic agents [7]. On the other
hand it has also reported that hydrazide-hydrazones structure posses numerous chemical,
biological and medicinal applications because of their versatile biological activities
appearing as antimicrobial [8], anticonvulsant [9] and antitubercular [10].
Prodrugs are particularly appealing as therapeutic agents because of their selective
toxicity for microorganisms possessing specific activating enzymes [11]. Nitrofurazone, (5-
nitro-2-furaldehyde semicarbazone) is a potent prodrug derivative of nitrofuran that is often
used in combination therapies and as choice second against Gram-positive and Gram-
negatives infections of skin injuries typified by Escherichia coli, Proteus ssp, C.
perfringers, and also S. aureus. [12]. It is also used as a systemic antibacterial agent in
veterinary medicine therapeutically and prophylactically for domestic animals [13]. These
toxic profile of Nitrofurazone have limited its use in medicine.
Over the years, the wide range of 5-nitro-2-furaldehyde derivatives has been
synthesised in view to obtain available information about synthesis, structure-activity
relationship, and toxicity. Previous works [14] related the synthesis and antitrypanosomal
activity of 5-nitro-2-furaldehyde derivatives that presents a N-oxide moiety and a flexible
side chain like a alkylamino semicarbazide group. The butylamino and hexylamino
derivatives were the most active of the series.
Nitrofurazone (NF) presents weak solubility in watery way (clog P = 0.23), as also
in solvent polar, being its total solubility gotten in Dimethylformamide or
Dimethylsulfoxide. The molecular modifications in Nitrofurazone structure so far are
limited alkylation / arylation in the NH of amide or then in reduction of hidrazone group,
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FARIAS, M. P. A.
both modifications do not reveal improvement in the pharmacological optimisation of these
compounds, since the hidrazone group is important for the complexing abilities with metals
and that the free amide is a structural requisite for the antimicrobial action of compounds
containing semicarbazones or thiosemicarbazones [15].
In order to investigate the lipophilicity influence in the biological profile and
toxicity of nitrofurazone structure, in the present study, new N-alkyl and N,N-dialkyl
derivatives of nitrofurazone were synthesised. We have planed the introduction of a flexible
alkyl side chain selectively in the N2-hydrazine position and unselectively N2, N4-
semicarbazide group. To obtain unselectively N2,N4-dialkyl compounds a cinetic control
was realiesed. The obtained compounds were characterised by IR, 1H-NMR, 13C-NMR and
elemental analysis. The new compounds were screened for antibacterial and antiprotozoal
activities, and toxic profile for derivative 2 (more potent antimicrobial derivative).
2. Results and discussion
2.1. Chemistry
The general synthetic route that was chosen for the preparation of alkyl derivatives
of nitrofurazone derivatives included a N2-alkyation using alkyl halides in basic conditions
and aprotic solvent such DMF. N2-alkyl-substituted compounds were obtained at room
temperature. N2,N4-disubstituted compounds were obtained when the reaction was carried
out at 60oC. Our attention was next turned to the cinetic control of the reaction in view to
obtain only a N2-alkyl-substituted derivative.
The obvious synthetic route planned to achieve the new nitrofurazone derivative
compounds 2, 3, 4 and 5 is shown in figure 1.
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FARIAS, M. P. A.
ONO2N NH NH2
O
ONO2N N NH2
O
R1
ONO2N N NH
O
R1 R2
K2CO3 a, bRX, DMF
2 R1 = CH2(CH3)2CH33 R1 = CH2(CH3)3CH3a) RT: 93% of monosubstituted compounds (2,4) 7% of disubstituted compounds (3,5)
4 R1 = R2= CH2(CH3)2CH35 R1 =R2= CH2(CH3)3CH3a) 60ºC: 50% of monosubstituted compounds (2,4) 50% of disubstituted compounds (3,5)
Figure 1: Synthetic route.
The formation of compounds were supported by IR, 1H-NMR, 13C-NMR and
elemental analysis. To the N2-alkyl and N2,N4-dialkyl nitrofurazone derivatives, the IR
spectra the bands representating azometine and carbonyl groups appeared at 3193-3387 cm-
1and 1627- 1671 cm-1. 1H-NMR of compounds 2-5, showed single signals corresponding to
resonances of azomethine protons at 7.42-7.38. The hydrazide-hydrazone N-H protons
(position N2) were observed single signals for NF at 10.81, for derivatives wasn’t observed,
but for NH2 and NHR (position N4) were observed single signals for NF at 6.64, and for
derivatives monosubstituted 6.63 e 6.62 and triplet signals for derivatives disubstituted
NHR at 6.60 e 6.57 and alkyl protons at 0.97-0.98, 1.44-1.32, 1.59-1.49 and triplet signals
at 3.93-3.91 for NCH2 (N2) and duble triplet signals at 3.29 and 3.31 for NHCH2 (N4),
respectively (Fig 1a). 13C-NMR spectra of compounds exhibited resonances arising from
azomethine (C=N) , hydrazide-hydrazone (C=O) and alkyl side chains carbons ressonances
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FARIAS, M. P. A.
at 123.73, 156.08, 40.77, 27.16, 20.03, 13.71 respectively (Figure 2).
Figure 2: 1H-NMR (a) and 13C-NMR (b) spectral data of compound 2
12 3
45 6
7
8
910
OO2NN
N NH2
O156.08151.68
110.76
113.52
123.73151.78
13.71
20.03
27.16
40.77
7.37
12 3
45 6
7
8
910
OO2NN
N NH2
O
6.63
6.80
7.42
0.95
1.45-1.31
1.60-1.47
3.93(a) (b)
3. Biological Investigation
3.1. In vitro evaluation of Antimicrobial activity
All of the strains came from the collection of the Department of Antibiotics (UFPE-
BR). Nitrofurazone prototype was used as reference drug. The inhibition zone in diameter
(mm) around test disc of tested compounds are showed in table 1.
In general the compounds 2, 3, 4, 5 and its prototype Nitrofurazone (NF) exhibited
moderate to good antibacterial activity against almost strain of gram positive bacteria,
mycobacterial, yeast and fungi. Compound 2 (N2-butyl derivative), was found to be the
most active of them all. S. aureus was the most sensitive of the gram positive tested strains,
its inhibition zone was 30 mm. This compound also showed to be active against
mycobacterium strains, with inhibition zone of 40 mm. Concerning gram negative strains,
only E. coli and S. Enteriditis, compound 2 showed inhibition zone of 16 a 3 mm,
respectively.
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FARIAS, M. P. A.
Table 1. Antimicrobial activities of synthesized compounds against the tested bacterial strains and fungi using disc diffusion method (300µg/mL-1). Microorganism / code Inhibition zone in diameter (mm) around test disc* 5 4 3 2 NF S. aureus ATCC 6538 16 26 25 30 23 B. subtilis DAUFPE 16 19 25 22 31 26 P. aeruginosa ATCC 27853 - - - - - E. coli ATCC 25992 - - - 16 22 K. pneumoniae ATCC 29665 - - - 16 22 S. enteridites (DAUFPE 414) - - - - 13 M. luteus (100) ATCC 2225 - - - 20 13 M. phlei (DAUFPE 70) 12 - 11 - - M. smegmatus (DAUFPE 71) 10 15 21 25 30 M. tuberculosis-607(DAUFPE 82) 25 23 40 40 27 S. faecalis (ATCC 6057) 14 20 15 22 17 Cândida sp ((DAUFPE 720) - - - - - Cândida sp (DAUFPE 1224) - - - 13 - Cândida sp (DAUFPE 4249) 17 25 25 29 - Cândida sp (DAUFPE 4224) - 19- 11 15 - C. cruzei (DAUFPE 1002) - - - - - C. albicans (DAUFPE 1007) - - - - - A. niger (DAUFPE 2003) 11 19 13 19 - Neurospora sp - - - 13 - a Each compound was measured three times. DAUFPE is collection from Department of Antibiotics of the University Federal of Pernambuco State, Brazil. ATCC is American Typin Culture Colection.
In according to the literature, Nitrofurazone is active against almost Gram negative
tested strains [12], but, without action against fungi strains. In contrast, N2-alkyl derivatives
revealed an novel activity against some strains of Candida spp and Aspergillus niger. This
data clearly demonstrates a new antimicrobial profile to this class of nitrofuryl compounds.
3.2. Bcteriostatic activity
The bacteriostatic activity for NF and compound 2 was determined in vitro, (table
2). These compound showed a highest potency to B. Subtilis. S. aureus and moderate
activity against Mycobacterium tuberculosis. N2,N4-dialkyl-substituition (2c-d), more
lipophylic of them, do not showed a improvement of activity. Although, our results showed
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FARIAS, M. P. A.
that, both N2-alkyl derivatives have structurally requirements in order to retain activity
against Gram positive bacteria like S. aureus, B. subtilis and novel activity of this
Nitrofuran against Candidas sp.
Table 2: Minimum inhibitory concentration (MIC) of the Nitrofurazone and derivative 2 against several microorganisms. Microrganism CIM valuesa (µg/mL)
Nitrofurazone Compound 2 S. aureus ATCC 6538 8 1-2 B. subtillis DAUFPE 16 2 0,1 M. luteus ATCC 2225 50 19 M. phlei (DAUFPE 70) ND 10 M. tuberculosis (DAUFPE 82) 50 20 S. faecalis ATCC 6057 ND 10 C. albicans (DAUFPE 1007) ND 10 Candida sp (DAUFPE 1224) ND 10 Candida sp (DAUFPE 4224) > 400 90 Candida sp (DAUFPE 4249) ND 10 A. niger (DAUFPE 203) ND 5-6 a See corresponding footnotes in table I. ND is not determined.
3.3. Antiprotozoal activity
The effort to find mechanism based small molecular inhibitior for T. cruzi
biochemistry target are continuous. Two recents publications related the discovery of
semicarbazones and thiosecarbazones as prominsing led compounds against cruzain
(cystein proteinase or also known GP57/61) [16, 17]. These studies investaged substitutions
at NH-1 and C-5 in (thio) semicarbazones group, however, did not investigated
substitutions at NH-3 position of the hydrazone. Therefore, we investigates the chemical
modification at NH-3 of semicarbazone chain to obtain new Structure Activity
Relantionship (SAR) dates for antichagasic nitrocompounds.
In decade of 60, Nitrofurazone was evaluated as antichagasic drug, by researches of
the Institute Oswaldo Cruz (RJ, BRAZIL). This drug administrated by oral route for 53
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FARIAS, M. P. A.
days consecutively in the dose of 100mg/kg/day mice experimentally infected with T. cruzi
cured 95,4% of the animals (62/65) [18]. The clinical studied for acute Chagas disease
showed good results, with few collateral effects, however, the study of chronic cases
obtained good clinical results, but several side effects were observed at the third week of
Nitrofurazone administration (10 to 30mg/kg/day), with suspension of the treatment [19].
Table 3: Culture growth inhibition and bioavailability of developed 5-nitrofurfuryl derivatives.
Y strain Drug IC50 (µM) (±0.5)a
rPGINizb
Bioavailability CLog P c
Nitrofurazone 2,20 PGI = 40% 0,23
2 4,63 0,7 1,57 3 6,64 0,4 2,07 4 4,71 0,7 2,76 5 1,05 1,8 2,85 Benznidazole 1,82 1,2 aThe IC50 values for each drug compound studied in the Y of T. cruzi strain was expressed as mean ± 0.5 for three independent experiments. brPGINiz is ratio of percentage of growth inhibition at 1,5 µM for Nitroturazone (PGI is percentage of growth inhibition at 1,5 µM). c Bioavailability is expressed as log P, calculated using the demo SRC’s LogKow (KowWin) Program software.
Nitrofurazone (NF) and derivatives was characterized for activity against
epimastigote form of T. cruzi ( IC50 in µM ). In this study we used the noninfective
epimastigote form, as has been done in several other studies with other nitrofuran
derivatives as well as other synthetic potential trypanocidal agents, which have also proved
to be efficient against the trypomastigote and amastigote forms [20]. Moreover, the
epimastigote form is a suitable model for studying the mode of action of the compounds
employed in the present study. Since the low molecular weight thiol content in the
trypomastigote and amastigote forms of T. cruzi is lower than in the epimastigote form
[21], should render these compounds more effective in the infective and intracellular
replicative forms.
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FARIAS, M. P. A.
The results are summarized in table 3. The compound N2,N4-dipentyl-Nitrofurazone
(5) was the most potent antitrypanosomal agent (with mean IC50 of 1,08 µM). The simple
extension of the n-butyl of 2 to n-pentyl 3 reduce the in this agents, however, the extension
of n-butyl (compound 4) to n-pentyl (compound 5) gives three times improvement of
activity, with potency equivalent to Benzimidazole ( IC50 = 1,82 µM) and more potent than
prototype, Nitrofurazone (IC50 = 2,20 µM). These results could show that the
Nitrofurazone is an potent antitrypanosomal agent, but, presumably, present limitation in
transport for cross cell membranes. It is well known that compound with low or negative
clog P (bioavailability) values cross the cell membranes very poorly [21]. We interpret
these finding to indicate that the improvement of clog P is important parameter for
optimization of antichagasic agents.
3.4. Preliminary Toxicity Test
The toxicity test (Letal dose or LD50) of 2-butyl-1-(5-
nitrofurfurylidene)semicarbazida (2) was performed in intraperitoneal way. The activity in
vivo was carried through for the derivative 2 (more potent antimicrobial derivative),
revealed LD50 = 186 mg/kg, In this assay, these compounds induce significants behavioral
effects at some dosages, and clinical signals to both doses included motor uncoordination,
hiperactivity, tremors, decrease of muscle tone, prostração and labored brating. In the
present study, we verified that the derivative showed an slightly more toxic than the
prototype (Nitrofurazone showed LD50 = 300 mg/kg), however, this prototype is less
liposoluble than compound 2, with poor power of crossing-cell membrane.
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FARIAS, M. P. A.
3.5. Evaluation of the Preliminary Toxicity in organ
The study of toxicity of organs it showed in turn that, with the increase of the
lipofilia, a bigger reach of the organs for the drug occurs, being lethal in the dose of 305
mg/Kg managed in male albinic mice with 100% of deaths. The study it proves the hepatic
toxicity of the derivative, also present in the archetype, besides disclosing toxicity in other
organs that the archetype for possessing one bad solubility does not obtain to reach, as for
example the brain that revealed well modified what it proves the increase of the lipofilia of
the new derivative for this way through of the brain barrier; the study still it observed a
reach in organs as lung in degree varied of damage, and the kidneys.
However for evaluation end of the toxicity of organs, the study with the evaluation
of the organs of the animals in the dose of 70 becomes thus necessary complementary
mg/Kg managed in male albinic mice with 0% of deaths, being able itself to make a
comparative degree in the doses biggest and lesser in that it refers to the reach of the drug
in the organs.
4. Experimental
4.1. Chemistry
1H-NMR spectra were recorded on a Varian UNITY plus-300 MHz NMR
spectrophotometer using CDCl3 as solvent as tetramethylsilane as an internal standard. IR
spectra were obtained on using KBr pellets. Microanalyses for C, H, N were performed in a
EA1110 apparatus and were within ±0.4% of the required theoretical values. The melting
points were determined using a Thomas Hoover apparatus and the results are given without
correction. Thin-layer chromatography was carried out on silica gel plates having
fluorescence indicator F254 (0.2 mm, E. Merck); the spots were visualised with UV light.
Column chromatography was performed on silica using Kiesegel 60 (230-400 mesh, E.
Merck). All reagents used in the present work were of analytical grade.
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FARIAS, M. P. A.
4.1.1. General Procedure for the synthesis of N2-alkyl-Nitrofurazones derivatives.
To a stirred mixture in dimethylformamide (DMF), as solvent, of Nitrofurazone,
0,02mol, potassium carbonate (K2CO3 0,02mol) and alkyl halide 0,021 mol under room
temerature. After 48h., the mixture was taken up in 100 mL of water and then extracted
with three 20mL portions of ethyl acetate. The organic phase was washed with water,
filtered and dried (Na2SO4). The residue was chromatographed on silica gel with 2% ethyl
acetate in hexane.
4.1.1.1. 2-butyl-1-(5-nitrofurfurylidene)semicarbazida (2): Yield: 65%. m.p. 110-112oC.
Rf: 0.66 (ethyl acetate:hexane 6:4); 1H NMR CDCl3 (δ ppm): 7.42 (s, 1H, CH); 7.37 (d,
1H, Het-H, J= 3.89Hz), 6.80 (d, 1H, Het-H, J= 3.89Hz); 6.63 (s, 2H, NH2), 3.93 (t, 2H,
CH2N, J= 7.19Hz), 1.60-1.47 (m, 2H, CH2), 1.45-1.31 (m, 2H, CH2), 0.95 (t, 3H, CH3, J=
7.19Hz). 13C-NMR CDCl3 (δ ppm): 156.08(C6), 152.68(C1), 151.78 (C4), 123.73(C5),
113.52 (C2), 110.76 (C3), 40.77 (C7), 27.16 (C8), 20.03(C9), 13.71(C10). Anal. Calcd. for
C10H14O4N4: C, 47.24; H, 5.55; N, 22.03. Found: C, 47.25; H, 5.88; N, 22.17.
4.1.1.2. 2-pentyl-1-(5-nitrofurfurylidene)semicarbazida (3): Yield: 70%. m.p. 116-118 oC.
Rf: 0.69 (ethyl acetate:hexane 6:4); 1H NMR CDCl3 (δ ppm): 7.42 (s, 1H, CH); 7.38 (d,
1H, Het-H, J= 3.59Hz), 6.81 (d, 1H, Het-H, J= 3.59Hz); 6.62 (s, 2H, NH2), 3.92 (t, 2H,
CH2N, J=7,49Hz), 1.62-1.42 (m, 2H, CH2), 1.40-1.23 (m, 4H, 2CH2), 0.90 (t, 3H, CH3 J=
6,59Hz). 13C-NMR CDCl3 (δ ppm): 156.12(C6), 152.65(C1), 151.75 (C4), 123.83(C5),
113.51 (C2), 110.80(C3), 41.00 (C7), 28.84 (C8), 24.85(C9), 22.35(C10), 13.93(C11).
Anal. Calcd. for C11H16O4N4: C, 49.24; H, 6.01; N, 20.88. Found: C, 49.08; H, 6.07; N,
20.75.
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FARIAS, M. P. A.
4.1.1.3. 2,4-dibutyl-1-(5-nitrofurfurylidene)semicarbazida (4): Yield: 50%. Yellow oil. Rf:
0.82 (ethyl acetate:hexane 6:4); 1H NMR CDCl3 (δ ppm): 7.38 (s, 1H, CH); 7.37 (d, 1H,
Het-H, J = 3.89Hz), 6.76 (d, 1H, Het-H, J = 3.89Hz); 6,57 (s, 1H, NH), 3.92 (t, 2H, CH2N,
J = 7.19Hz), 3.31 (t, 2H, CH2NH, J=7.19Hz), 1.61-1.45 (m, 4H, 2CH2), 1.44-1.25 (m, 4H,
2CH2), 0.94 (t, 6H, 2CH3, J = 7.19Hz). ). 13C-NMR CDCl3 (δ ppm): 154.86(C6),
153.13(C1), 151.59 (C4), 122.32(C5), 113.62 (C2), 110.28(C3), 41.00 (C7), 40.27 (C11),
32.11(C8), 27.14(C12), 20.06(C9), 20.03(C13), 13.75(C10), 13.70(C14). Anal. Calcd. for
C14H22O4N4: C, 54.18; H, 7.14; N, 18.05. Found: C, 54.26; H, 7.12; N, 18.09.
4.1.1.4. 2,4-dipentyl-1-(5-nitrofurfurylidene)semicarbazida (5): Yield: 45%. Yellow oil.
Rf: 0.85 (ethyl acetate / hexane 6:4); 1H NMR: CDCl3 (δ ppm): 7.38 (s, 1H, CH); 7.37(d,
1H, Het-H, J = 3.89Hz), 6.78 (d, 1H, Het-H, J = 3.89Hz); 6.60 (t, 1H, NH, J = 5.69Hz),
3.91 (t, 2H, CH2N, J =7.49Hz), 3.29 (td, 2H, CH2NH, J =6.89Hz, J =5.69Hz), 1.62-1.44
(m, 4H, 2CH2), 1.41-1.20 (m, 8H, 4CH2), 0.89 (t, 3H, CH3, J =6.59Hz), 0.88 (t, 3H, CH3, J
=6.59Hz). 13C-NMR CDCl3 (δ ppm): 154.61(C6), 153.09(C1), 151.52(C4), 122.29(C5),
113.64 (C2), 110.33(C3), 41.11 (C7), 40.46 (C12), 30.82(C8), 29.66(C13), 28.94(C9),
28.80(C14), 24.72(C10), 22.27(C15), 13.92(C11), 13.85(C16). Anal. Calcd. for
C16H26O4N4: C, 56.55; H, 7.74; N, 16.55. Found: C, 56.48; H, 7.79; N, 16.47.
4.1.1.5. 5-nitro-2-furaldehyde semicarbazone: (1) m.p. 116-118oC. Rf: 0.69 (ethyl acetate /
hexane 6:4); 1H NMR: DMSOd6 (δ ppm): 10.81 (s, 1H, NH); 7.78 (s, 1H, CH); 7.77(d, 1H,
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FARIAS, M. P. A.
Het-H, J = 3.89Hz), 7.23 (d, 1H, Het-H, J = 3.89Hz); 6.64 (s, 2H, NH2). 13C-NMR
DMSOd6 (δ ppm): 157.00(C6), 152.00(C1), 154.00(C4), 128.45(C5), 115.95(C2),
112.80(C3). Anal. Calcd. for C6H6O4N4: C, 36.37; H, 3.05; N, 28.27. Found: C, 36.43; H,
3.02; N, 28.32.
4.2. Biology Properties
4.2.1. Antimicrobial activity
The antimicrobial activity was determined in vitro by disc diffusion method [17]
against S. aureus ATCC 6538, B. subtilis DAUFPE 16, P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli
ATCC 25992, K. pneumoniae ATCC 29665, S. enteridites (DAUFPE 414), M. luteus (100)
ATCC 2225, M. phlei (DAUFPE 70), M. smegmatus (DAUFPE 71), M. tuberculosis-
607(DAUFPE 82), S. faecalis (ATCC 6057), Cândida sp (DAUFPE 720), Cândida sp
(DAUFPE 1224), Cândida sp (DAUFPE 4249), Cândida sp (DAUFPE 4224), C. cruzei
(DAUFPE 1002), C. albicans (DAUFPE 1007), A. niger (DAUFPE 2003) and Neurospora
sp. It is dispensed into Petri dishes to yield a uniform depth of 6mm. Overnight cultures
were grown in adequate broth and temperature and diluted to obtain an opacity equivalent
to 0.5 on the Mc Farland scale. The drugs are weighed and dissolved in acetone to give
concentrations equal to 300µg/mL. The discs were placed in the surface of culture medium
after the complete evaporation of acetone. The plates are incubated for 18 hours at adequate
temperature.
4.2.2. Bacteriostatic Activity
The bacteriostatic activity were determined in vitro. Overnight cultures were grown
at 37oC in Mueller-Hinton broth and afterwards, diluted to obtain an opacity equivalent to
- 65 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
0.5 on the McFarland scale. The compound is solubulized in DMSO and a serial 2-fold
dilution of compound is prepared in water to give concentrations 10-fold higher than the the
final one desired. A series of tubes was prepared by mixing one part of each dilution of
compound with nine parts of Mueller-Hinton broth, previously inoculated and incubated for
18 h at 37ºC. The MIC is considered to be the lowest drug concentration for wich there is
no microbial growth.
4.2.3. Antichagasic Activity
Epimastigotes of T. cruzi (Y strain) were cultivated at 26 °C in Liver Infusion Tryptose
medium (LIT) supplemented with 10% fetal calf serum, 1% hemin, 1% R9 medium and 50
µg/mL gentamycin. Parasites (106 cells/mL) were cultivated in a fresh medium in the
absence or in the presence of the compounds being tested or 0.01 mg/mL benznidazol
(Rochagan, Roche). Cell growth was determined after 11 days of culture by counting viable
forms in a hemacytometer. The compounds were prepared from a stock solution in DMSO.
To determine the IC50, cultures of Y strain epimastigotes in the presence of different
concentrations of the compounds were evaluated after 11 days as described above. IC50
calculation was carried out using non-linear regression on Prism 4.0 GraphPad software.
The percentage of inhibition was calculated in relation to untreated cultures.
4.2.4 Toxicity tests
Male Suiss adult white mice (ca. 25-28g.) were divided in groups and private of eat
20 hours before injections. The drugs were diluted in Tween 80 (two crops) and saline
(0,9%). The single intraperitoneal injections are given and the general effects were
observed during 60 min and continued about 72 hs after injection. The control group
receiving solvent only.
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FARIAS, M. P. A.
4.2.5 Histopathologyc tests of the diverse organs
All the manipulation involving the animals was carried through in accordance with
the international principles for biomedical research involving animal as norms of the
International Guiding Principles animals (CIOMS) - Geneva 1985 Will be Biomedical
Research Involving and all the procedures had been carried through in accordance with the
"Consensus Recommendations carried through on Effective Animal Institutional Care and
Use Committees - NIH and USDA - published by the laboratory of Animal Science, special
edition, January of 1987. [23]
Of all the animals had been harvested fragments of lung, kidneys, liver, heart and
brain, that had been conditioned in solution of tampon formalina 10% and had destined it
the confection of histological blades. The fragments had been submitted to the cleavage,
being after that processed in accordance with the techniques of routine for the paraffin
inclusion block-type, cut in microtome the 3-4 micrometers and blush for the technique of
Hematoxilina-Eosina (H.E.) according to described methodology for Behmer, Tolosa and
Freitas Neto (1976).[24]
It analyzes it of you plate them was carried through in optic microscope. All processing of
the material and optic microscopy had been carried through in the area of animal Pathology
of the Department of Veterinary Medicine of Universidade Federal Rural de Pernambuco.
Acknowledgements
The authors thank from the “Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico” (CNPq), the “Fundação de Amparo a Ciência do Estado de Pernambuco”
(FACEPE) and Banco do Nordeste for financial support. We gratefully acknowledge the
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FARIAS, M. P. A.
Departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) for
recording the 1H-NMR, 13C-NMR and IR spectra and Microanalyses of all compounds.
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- 69 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
[23] Consensus Recomendations on Efective Institutional Animal Care and Use Comites –
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27-80, 257.
- 70 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA
FARIAS, M. P. A.
Submetido ao periódico: Microbiological Research
Capítulo 3
Artigo 2 – Evaluation of Nitrofurazone and N2-alkyl-derivatives against methicillin
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) multi-drug resistance
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FARIAS, M. P. A.
Evaluation of Nitrofurazone and N2-alkyl-derivatives against methicillin
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) multi-drug resistance
Dalci José Brondani1+/ , Maria Nelly Caetano Pisciottano*, Maria Patrícia A. de Farias1, Diogo R. de Magalhães Moreira, Rogério Ribeiro Soares* , Antônio Marcos Saraiva* and
Ana Cristina Lima Leite
1LABSINFA – Laboratório de Planejamento, Avaliação e Síntese de Fármacos, Dept. de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde- Universidade Federal de Pernambuco, CEP.50740-521
Recife, PE, Brasil *GIPDIRA (Grupo Internacional de Pesquisas em Doenças Infecciosas e Resistência Antimicrobiana)-Laboratório de Analise Microbiológica, Dept de Ciências Farmacêuticas, CCS, UFPE
Nitrofurazone (5-nitro-2-furaldehyde semicarbazone) is a potent prodrug derivative of nitrofuran that is often used in combination therapies against skin injuries typically by E. coli, Clostridum perfringens, Proteus ssp and S. aureus. In the present study, Nitrofurazone and novel derivatives N2-alkylated were screened for their antibacterial in vitro activities against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) multi-drug resistance. The butyl derivative had the highest antimicrobial activities than Nitrofurazone, with minimum inhibitory concentrations in the range of less of 16µg/mL.
Keywords: Nitrofurazone - antibacterial activities - Staphylococcus aureus MRSA
Financial support: CNPq, CAPES and FACEPE + Corresponding author. Fax: +55-81-2126.8510. E-mail: [email protected] * GIPDIRA fellowship lead
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FARIAS, M. P. A.
INTRODUCTION
In recent years, the numbers of life-threatening infections caused multi-drug
resistant Gram-positive and Gram-negative pathogen bacteria have reached an alarming
level in many countries around the world (Berber et al. 2003, Mitscher et al. 1999). The
clinic reports in worldwide have independently described the emergence of vancomycin
intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and methicillin-resistance Staphylococcus
aureus (MRSA) isolates and other human pathogen Gram-positives isolates (Lee 1999).
Given the evidence for the rapid global spread of resistant clinical isolates and the
appearance of drug resistence strains among community acquired infections, the needs for
discovery or optimisation of new antimicrobial agents active towards these resistant strains
is of paramount importance (Bradford 2001).
Prodrugs are particularly appealing as therapeutic agents because of their selective
toxicity for microorganisms possessing specific activating enzymes (Abreu et al. 2002).
Nitrofurazone (5-nitro-2-furaldehyde semicarbazone), is a potent prodrug derivative of
nitrofuran that is often used in combination therapies and as choice second against Gram-
negatives and Gram-positives infections of skin injuries typically by E. coli, Proteus ssp, C.
perfringens, and also S. aureus. (Chamberlain 1997). However, resistance to Nitrofurazone
is very common and reduces the efficacy of Nitrofurazone containing regimes and also
toxic profile of this drug has limited its use in medicine. Nitrofurazone presents weak
solubility (clog P = 0.23), as much in watery way as also in solvent polar, being its total
solubility gotten in Dimethylformamide or Dimethylsulfoxide. The molecular
modifications in Nitrofurazone structure so far are limited alkylation / arylation in the NH
of amide or then in reduction of hidrazone group, both modifications do not reveal
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FARIAS, M. P. A.
improvement in the pharmacological optimisation of these compounds (Toscher, 1997). It
is well known that compounds with low or negative C log P values cross cell membranes
very poorly (Gago et al. 1987). In order to investigate the lipophilicity influence in the
biological profile of Nitrofurazone structure, some compounds were synthesised containing
flexible N2-alkyl group (butyl and pentyl) in side chain. In the present study, these novel
derivatives of Nitrofurazone were evaluated against methicillin resistant Staphylococcus
aureus (MRSA) multi-drug resistance.
MATERIALS AND METHODS Drugs – Nitrofurazone (NF) and derivatives NF01 and NF02 was synthesised from
Labsinfa-UFPE (Msc Thesis 2006) and are showed in figure 1. Dimethylsulfoxide (DMSO)
and all other reagents were purchased from Merck, analytical grade.
OO2NN
N NH2
O
RNF R= HNF01 R= butilNF02 R= pentil
Figure 1: Nitrofurazone (NF) and N2-alkyl derivatives NF01 and NF02
Microorganisms - The following microorganisms were used for detecting antibacterial
activity: S. aureus (ATCC 6538), S. aureus (ATCC 6538P), S. aureus (ATCC 25923), and
also 15 clinical isolates of methicillin resistant S. aureus MRSA multiresistant, with
phenotype characterisation determinated (Caetano et al. 2002).
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FARIAS, M. P. A.
Preparation of samples for testing – Nitrofurazone and derivatives was dissolved in 30% of
DMSO. For the minimum inhibitory concentration (MIC) tests, the drugs was first diluted
to the highest concentration (32 µg/mL) and then serial twofold dilutions were performed in
a concentration range from 32µg/mL to 0,125 µg/mL in plates containing Müeller-Hinton
Agar. The final concentration of DMSO into plates was 3%, a value that did not cause
interference in the antimicrobial activity.
Antimicrobial susceptibility testing - MIC of drugs was determined by macrodilution
technique as described by the National Committee for Clinical Laboratory Standards
(1996). The bacteria inoculum was prepared from recent cultures, suspended in saline
solution The cultures were diluted in Müeller-Hinton Agar at a density adjusted to a
McFarland 0.5 BaSO4 standard [1 to 2 x108 colony-forming units (CFU)/mL]. The final
inoculum was of approximately 5 x 105 CFU/mL. To facilitate testing of a large volume of
cultures, the Steers replicator is used, then plates were incubated at 36 ± 1°C for 24 h. The
antimicrobial testing was conducted in duplicate. MIC was the lowest concentration of
antimicrobial agent that completely inhibited growth of the microorganisms in the plates.
RESULTS AND DISCUSSION
We screened antimicrobial activity in vitro for Nitrofurazone (NF) and N2-alkyl
derivatives (NF01 and NF02) against several strains of Staphylococcus aureus (three
reference strains and fifteen clinical isolated MRSA multirestant), using tetracycline
cloridrate as standard drug in assay. The values for minimum inhibitory concentrations of
compound are showed in table.
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FARIAS, M. P. A.
TABLE
TABLE: Activity of Nitrofurazone (NF) and compounds NF01 and NF02 against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) multi-drug resistance
MIC (µg/mL) Strains Origin of the Strains
NF NF01 NF02 TC+ S. aureus ATCC 6538 Reference strain
8.0
8.0
8.0
4.0
S. aureus ATCC 6538P Reference strain
16
4.0
8.0
8.0
S. aureus ATCC 25923 Reference strain 8.0 8.0 8.0 8.0 S. aureus AM-860 Hemoculture 8.0 8.0 8.0 8.0 S. aureus AM-922 Wound of leg 8.0 8.0 16 8.0 S. aureus AM-952 Cavitary liquid 16 8.0 16 16 S. aureus AM-1003 Secretion of wound 8.0 8.0 16 32 S. aureus AM-1004 Catheter tip 16 16 16 32 S. aureus AM-1005 Secretion of leather hair 8.0 8.0 16 16 S. aureus AM-1006 Secretion of surgery wound 8.0 16 16 16 S. aureus AM-1007 Double lumen catheter 8.0 8.0 16 32 S. aureus AM-1008 Tracheal secretion
16
16
16
32
S. aureus AM-1009 Catheter tip 8.0 16 16 32 S. aureus AM-1010 Tracheal secretion 16 16 16 32 S. aureus AM-1011 Tracheal secretion 16 8.0 16 32 S. aureus AM-1012 Catheter exit tip 16 8.0 16 32 S. aureus AM-1013 Catheter tip 16 8.0 16 32 S. aureus AM-1014 Catheter tip
16
8.0
16
32
+TC is Tetracycline, standard drug. AM is Collection of the Laboratory of Analyse Microbiology, UFPE-Brazil. The results had shown that the Nitrofurazone and compounds NF01 and NF02 had been
active for several strains, being distinguished it action against strains AM1004, AM1009,
AM1012, AM1013 and AM1014, this strains with origin from catheter tip. We can also
emphasize that for strains AM922, AM1003 and AM1005, Nitrofurazone and also NF01
shown a moderate activity, strengthening the importance of the nitrocompounds for the
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FARIAS, M. P. A.
treatment of cutaneous infections for Gram-positive agents. In summary, we can affirms
that derivative NF01 is more potent than the Nitrofurazone, considering its good values for
the MIC and that also it has a superior molecular weight, what results in a lesser molar
concentration for the cases where the values of the MIC is equal for the Nitrofurazone. The
gotten results had disclosed that the increase of the liposolubility for the Nitrofurazone is an
important molecular modification for optimisation of this farmaco.
REFERENCES
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FARIAS, M. P. A.
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FARIAS, M. P. A.
Capítulo 4
Conclusões e Perspectivas
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FARIAS, M. P. A.
CONCLUSÕES e PESPECTIVAS
Neste trabalho de dissertação, preocupou-se em desenvolver uma nova metodologia
via de acesso geral e seletiva para a obtenção dos derivados N2 e N2
,N4 da Nitrofurazona,
à partir de reagentes simples, de acesso fácil e de custo satisfatório. Este interesse de
sintetizar novos derivados da Nitrofurazona deve-se ao seu grande espectro de atividade
biológica, bem como sua alta toxicidade.
No primeiro capítulo desta dissertação, realizou-se a revisão bibliográfica do
protótipo Nitrofurazona e seus derivados, abordou-se desde a primeira síntese, para a
Nitrofurazona, até os dias atuais com suas modificações, além de relatar-se toda sua
atividade biológica já estudada.
No segundo capítulo, apresentou-se o primeiro artigo, onde se obteve os novos
derivados alquílicos da Nitrofurazona de boa estabilidade a partir da própria Nitrofurazona
como produto de partida, e halogenetos de alquila, resultando na obtenção de 4 novos
derivados; estes foram caracterizados através de Espectroscopia de Infravermelho e
Ressonância Magnética Nuclear de prótons e de carbono 13; os novos derivados foram
avaliados in vitro frente às bactérias Gram positivas e Gram negativas, além de fungos
filamentosos e leveduras; os resultados revelaram que os derivados N-alquil são mais
potentes que o protótipo Nitrofurazona, principalmente para as bactérias Gram positivas.
O derivado que apresentou maior potencial de inibição para os microorganismos
testados foi o N2 butil (composto 2). O derivado N2
,N4 -dipentil (composto 5) apresentou
maior potencia quando avaliado frente as cepas y de T. cruzi na forma evolutiva
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FARIAS, M. P. A.
epimastigota e na realização de IC50, mostrando melhores resultados para o derivado com
IC50 de 1,05 nm, contra 2,2 nm da nitrofurazona e 1,8 nm do Benznidazol ® ( Rochagan ).
Comprovando-se com este trabalho uma maior potencia deste frente a quimioterapia
antachagasica.
A DL50 do derivado mais ativo o N2 butil foi igual a 186mg/kg, apresentado-se
levemente mais tóxica que o protótipo, a Nitrofurazona. Ainda neste capítulo realizou-se a
avaliação de toxicidade de órgãos, onde se pode observar maior alcance no número de
órgãos pelo derivado, o que é justificável pelo aumento da lipofilia da molécula.
No terceiro capítulo apresentamos o segundo artigo, submetido ao periódico:
Microbiological Research, onde mencionamos a atividade do derivado N2 butil frente às
cepas de Staphylococcus aureus (MRSA), multi-druga resistente, em comparativo com o
protótipo Nitrofurazona, podendo-se constatar a melhor resposta do derivado N2 butil que
apresentou MIC de 4 e 2 vezes melhor que o protótipo para a maioria das cepas avaliadas.
Contudo, apesar da toxicidade do novo derivado ter se revelado levemente mais
elevada, faz-se necessário estudos mais aprofundados com um gráfico de doses respostas,
podendo ainda no futuro todos estes problemas ainda encontrados frente a toxicidade serem
eliminados com o melhoramento da tecnologia farmacêutica com a produção de formas
farmacêuticas inteligentes, sejam fármacos de liberação controladas, sejam com o processo
de nanoencapsulação de derivado, vislumbrando assim sua integração no mercado
farmacêutico como potente fármaco bioativo, haja visto seu potencial observado.
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FARIAS, M. P. A.
Capítulo 5
Anexos
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FARIAS, M. P. A.
Farias, Maria Patrícia Albuquerque de
Novos derivados da nitrofurazona : síntese,avaliação da toxicidade aguda e estudo dasatividades antimicrobiana e antichagásica / MariaPatrícia Albuquerque de Farias. – Recife : O Autor,2006.
90 folhas : il., fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2006.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Ciências farmacêuticas – Síntese de fármacos. 2. Doenças tropicais – Doença de Chagas, Brasil – Aspectos morfológicos, patogenia e transmissão. 3. Derivados nitrofurânicos – testes de toxicidade, atividades antimicrobiana e antichagásica. 4. Novos fármacos – Síntese orgânica – Grupo Nitro – Importância na química medicinal. I. Título.
615.28 CDU (2.ed.) UFPE 615.3 CDD (22.ed.) BC2006-337