O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas Juliana Ramos Pimenta Laboratório de...
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O Papel da Genética do O Papel da Genética do Parasita na Doença de Parasita na Doença de
ChagasChagas
Juliana Ramos Pimenta
Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG
Prevalência:
16 a 18 milhões de infectados (WHO, 1991)
Formas de transmissão:
Transmissão vetorial
Transmissão transfusional
Transmissão congênita
Formas excepcionais de transmissão
Distribuição
Doença de Chagas
Fase Aguda
alta parasitemia
alto parasitismo tissular
edema periorbital (1-2%)
sintomas leves
miocardites/encefalites agudas
Doença de Chagas
Fase Crônica
baixa parasitemia
baixo parasitismo tissular
nenhum sinal aparente
diferentes formas
CardíacaDigestiva
Indeterminada
?
Cardio-digestiva
Doença de Chagas
Trypanosoma cruzi
Formas do parasita
TripomastigotaAmastigota Epimastigota
1.5 a 5 10 a 20 10 a 20
Trypanosoma cruzi
Isolado de um paciente
Cepas X Clones
CEPA
CEPA(MC43)
MC43- Clone1
MC43- Clone2
MC43- Clone3MC43
Trypanossoma cruzi
Trypanossoma cruzi
AspectosGenéticos
AspectosBioquimicos
AspectosBiológicos
Variabilidade do parasita
Trypanossoma cruzi
T. cruzi
T. cruzi I
T. cruzi II
Nova nomenclatura (1999)
Pacientes assintomáticos
Adaptado a marsupiaisCiclo Silvestre
Baixa parasitemia
Alta parasitemia
Pacientes crônicos
Ciclo doméstico
Adaptado a primatas
Trypanossoma cruzi
Ciclo silvestre Ciclo doméstico
Infecções policlonais de T. cruzi
Trypanossoma cruzi
Diferentes parasitas
Diferentes parasitas
Diferentes formas clínicas
Diferentes formas clínicas
Estudos Moleculares
Correlacionar com formas clínicas da doença de Chagas
Caracterizar geneticamente os
parasitas
Microssatélites de DNA
Microssatélites de DNA
Locos de microssatélites em T. cruzi
Loco Repetição
MCLE01 (CA) 9
MCLE08 (CA)2
AA(CA)12
SCLE10 (GT)2
(TG)10
SCLE11 (AC)9
MCLF10 (CA) 2 A (CA)14
MCLG10 (CA) 8
MCLE03 (CT)4 (GT) 2CTAT(GT)15
MCLE05 (TC)9 (GT)4
AAT (AAT) 8TAC (TAC)15TAT (TAT) 20
AAAT (AAAT) 6
AA AB AC BB BC CC
Amplificação de microssatélites (PCR)
alelo A
alelo B
alelo C
ALF
LASER
Análise dos fragmentos
A B
C D
A - Monoclonal (homozigoto)
B - Monoclonal (heterozigoto)
C - Policlonal
D - Policlonal
Perfis dos fragmentos amplificados
MicrossatélitesAnálises filogenéticas
Tecidos de pacientes
chagásicos
Células únicas de T.
cruzi
Análises Filogenéticas
A
B
C
D
A B C DA 0 1 1 0
B 1 0 1 1
C 1 1 0 1
D 0 1 1 0
0 semelhança1 diferença
MATRIZ
Tamanho dos alelos
A D B C
Árvore filogenética
PCR
95/94
200pm
103894
11/94
58/94
27/94
Ig 539
Ig 62
803GLT 593
GLT 564 1931
84Ti
1523
1502 D7
Rb IX
Rb VIGLT 600
Rb I
T. cruzi I
T. cruzi II
Trypanossoma cruzi
Árvore filogenética
Microssatélites
Análises filogenéticas Tecidos de
pacientes chagásicos
Células únicas de T.
cruzi
Epimas tigotas de T. cruzi
PCR de células únicas
Separação das células únicas através do FACS
Fluorescence Activated Cell Sorter
Separação das células únicas através do FACS
Microplacas de 96 wellsEpimas tigotas de T. cruzi
PCR de células únicas
PCR microssatélitesEletroforeseSequenciador
automático de DNA
Fluorescence Activated Cell Sorter
1 - Well contendo 1 célula
2 - Well contendo 1 célula
3 - DNA de JG
4 - DNA de Colombiana
PCR de células únicas
1 cé
lula
DN
A J
G
DN
A C
olom
bia
na
1 cé
lula
1 cé
lula
PM
Con
trol
e -
Eletroforese Sequenciador automático
Microssatélites
Análises filogenéticas Tecidos de
pacientes chagásicos
Células únicas de T.
cruzi
Modelo Histotrópico Clonal
Infecção policlonal
Manutenção de parasitas
in vitro
Parasitas disponíveis para análise
Nem todos os clones são capazes
de estabelecer infecção
Isolamento
REDUÇÃO POPULACIONAL
Trypanossoma cruzi
ATAATAATAATAATAATA 5’3’TATTATTATTATTATTAT5’ 3’
DNA molde inicial
TAT externo F
ATAATAATAATAATAATA 5’3’
TATTATTATTATTATTAT5’ 3’
TAT externo R
ATAATAATAATAATAATA 5’3’
TATTATTATTATTATTAT5’ 3’TAT int. F
TAT int. R
ATAATAATAATAATAATA 5’3’
TATTATTATTATTATTAT5’ 3’
1a amplificação
2a amplificação
Produto final
Full-nested PCR
1a amplificação 2a amplificação Full nested
10 fg DNA
Loco TAT
1 célula humana - 3g DNA
1 célula de T. cruzi - 200fg DNA
Resultado Full-nested PCR
6m
6m
6m
Col+JG(50+50 tripomastigotas)
Col1.7G2(50 tripomastigotas)
JG(50 tripomastigotas)
Reto Coração
Reto Coração
Reto Coração
Infecções experimentais
Amplificação de microssatélites em tecidos de camundongos infectados
Amplificação de microssatélites em tecidos de pacientes
Resultados
DNA hum.
Tecidos de pacientes (1:10)
Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG
“Grupo dos Cruzi”
Jorge
Simone
Renato
Prof. Andréa Macedo
Juliana