Obtendo as sequências moleculares: Amplificação e sequenciamento

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Obtendo as sequências moleculares: Amplificação e sequenciamento Almir R. Pepato

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Obtendo as sequências moleculares: Amplificação e sequenciamento. Almir R. Pepato. Reação da Polimerase em cadeia (PCR). Reação da Polimerase em cadeia (PCR). Otimizando as reações de PCR. Extração Polimerase Mg++ Iniciadores (Primers) DNTP Tampão Substâncias facilitadoras. - PowerPoint PPT Presentation

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Obtendo as sequências moleculares: Amplificação e sequenciamento

Almir R. Pepato

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Reação da Polimerase em cadeia (PCR)

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Reação da Polimerase em cadeia (PCR)

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Otimizando as reações de PCRExtração PolimeraseMg++ Iniciadores (Primers) DNTPTampãoSubstâncias facilitadoras

Temperatura e tempo :

-Denaturação

-Anelamento

-Extensão

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ExtraçãoContaminação

Deve- se usar um controle negativo.

Autoclavar ponteiras, frascos etc.

Aliquotar as soluções (isso restringe a

contaminação)

Planejar o espaço físico do laboratório.

Degradação e quantidade:

Quantidade:

Ideal: 0.1-1 μg DNA /100 μl de solução para o PCRMuito DNA: Amplificações espúrias.

O DNA degradado pode ser eventualmente “restaurado”.

Substâncias que inibem o PCR: álcool, formol, fenol, detergentes polares, vários metais.

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Cloreto de Magnésio (Mg++) e DNTP

O Mg++ forma complexos com dNTPs, primers e DNA, mas o efeito do dNTPs é mais pronunciado.

Pouco Mg++, pouco produto de PCR/Muito Mg++, baixa especificidade

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Iniciadores (Primers)

0,4 mM

0,2 mM

O desenho de primers será objeto de aula a parte. Alguns elementos:

Devem ter de 0-24 nucleotídeos de comprimentoO conteúdo de GC deve estar em 40%-60% Não deve ser auto-complementar nem parear com o seu reversoO par de primers não devem ter Tm’s (veja abaixo) diferindo em mais de 5°CÉ uma boa idéia ter uma timina na extremidade 3’ para primers universais e GC para primers específicos

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Substâncias facilitadoras

Substâncias como DMSO (2%-5%), glicerol (500-20%), detergentes apolares, formamida (5%) e BSA podem aumentar o produto das reações ou melhorar a especificidade .

Algumas reações só funcionam com eles!

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Ciclo de temperaturasO número de ciclos, temperaturas e tempo de duração de cada etapa do ciclo também é objeto de otimização! Os principais parâmetros são a temperatura de anelameto, o número de ciclos e a duração do tempo de extensão.

Para oligos com < 25nts, Tm ± 4 (G + C) + 2 (A + T). A diferença entre as temperaturas dos primers não deve ser maior que uns 5°C.

A temperatura ideal de anelamento deve ser uns 5°C menor que Tm.

Temperatura ótima esperada: 56,5°C. Inferida pelo gradiente: 63°C

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E quando mais nada funciona?

Santa Rita de Cássia, santa das causas impossíveis.

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PCR AninhadosConsiste em amplificar um fragmento menor a partir de um produto inespecífico ou escasso de outro PCR.

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“Touchdown” e “Hot start”Touchdown: A cada ciclo a temperatura é reduzida, tornando o anelamento cada vez menos específico, mas mais eficiente

Hotstart: A Taq polimerase só é adicionada quando a temperatura atingiu um valor mínimo.

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Sequenciamento: Método de Sanger

Originalmente:

Quatro reações diferentes com cada uma das quatro bases modificadas por vez (mais as versões normais de todas)

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Sequenciamento: Método de Sanger