OF FOOD TECHNOLOGY Enzimática do Amido de Mandioca...

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AUTORESAUTHORS

RESUMO

PALAVRAS-CHAVEKEY WORDS

SUMMARY

Modificação Hidrotérmica (“Annealing”) e Hidrólise Enzimática do Amido de Mandioca

Annealing and Enzymatic Hydrolysis of Cassava Starch

2Polyana de Oliveira SERRANO*2Célia Maria Landi FRANCO

2UNESP - Universidade Estadual Paulista,

Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos,

Rua Cristóvão Colombo, 2265, CEP: 15054-000,

J. Nazareth, São José do Rio Preto, SP, Brazil,

*e-mail: [email protected]

“Annealing” é o processo no qual uma suspensão de amido é exposta à temperatura superior à de transição vítrea e inferior à de gelatinização. Neste trabalho, amido de mandioca foi submetido ao “annealing” sendo suspenso em água (50% p/v) durante 48 horas a 50, 55 e

o60 C. Essas temperaturas foram escolhidas devido à temperatura inicial de gelatinização do oamido de mandioca estar próxima a 60 C. Após tratamento, os amidos foram hidrolisados com

oa-amilase bacteriana durante 48 horas a 37 C. Propriedades térmicas e de pasta foram determinadas por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) e Rápido Visco Analisador (RVA), respectivamente. Teor de amilose foi determinado por titulação potenciométrica. Análises de difração de raios-x e observações em microscópio eletrônico de varredura dos amidos natural e tratados física e/ou enzimaticamente foram realizadas. Temperaturas de gelatinização e entalpia aumentaram, enquanto a faixa de temperatura de gelatinização diminuiu com o “annealing”. Temperaturas de pasta e viscosidades de pico aumentaram. O tratamento físico não mudou o padrão de difração do amido de mandioca. Observou-se aumento do índice de cristalinidade

odos amidos tratados a 50 e 55 C de 21,6 para 23,3 e 25,8% respectivamente, e diminuição para o19,3% para o amido tratado a 60 C. Amidos submetidos ao “annealing” foram mais suscetíveis

à hidrólise quanto maior a temperatura de tratamento. O teor de amilose (~20%) não se alterou com o “annealing” e/ou hidrólise. Através de microscópio eletrônico de varredura,

oporos e fissuras foram observados na superfície dos grânulos tratados a 55 C. Os resultados sugeriram reorganização molecular dos grânulos com maior perfeição dos cristais e aumento

oda cristalinidade do amido provocada pelo tratamento a 50 e 55 C. Apesar da maior ordem nos cristais, o “annealing” alterou o padrão de hidrólise do amido aumentando a acessibilidade das regiões amorfas dos grânulos pelas enzimas. Gelatinização parcial dos grânulos pode ter

oocorrido ao amido tratado a 60 C, devido à temperatura de tratamento coincidir com a temperatura inicial de gelatinização do amido de mandioca.

Annealing is a treatment that involves heating starch granules in excess water at a temperature above the glass transition temperature but below the gelatinization temperature.

oIn this work, cassava starch was annealed in excess water (50% p/v) for 48 hr at 50, 55 and 60 C. These temperatures were chosen since the onset gelatinisation temperature of cassava starch is

onear to 60 C. Natural and annealed starches were submitted to bacterial a-amylase action for o48 hr at 37 C. The thermal and pasting properties were determined by Differential Scanning

Calorimetry (DSC) and using the Rapid Visco Analyzer (RVA), respectively. The amylose content

was determined by potentiometric titration. X-ray diffraction and scanning electron microscopy

of the starches were carried out. Annealing caused increases in the gelatinisation temperatures and enthalpy whereas the gelatinisation temperature range became narrower. The pasting

temperatures and viscosity peaks also increased with the treatment. Annealing did not change the X-ray diffraction pattern of cassava starch. The crystallinity indexes of the starches annealed

oat 50 and 55 C increased from 21.6 to 23.3 and 25.8%, respectively, whereas it decreased from o21.6 to 19.3% for starch annealed at 60 C. Annealed starches were more susceptible to

enzymatic hydrolysis. The amylose content of the starches (~20%) did not change with annealing and/or hydrolysis. Using scanning electronic microscopy, pores and fissures were

observed on the granule surface of starch annealed at 55oC. The results suggested that annealing provided molecular reorganization of the granules with the formation of more perfect crystals, and increased the crystallinity of the starches treated at 50 and 55oC. Annealing altered the pattern of starch hydrolysis, facilitating enzyme penetration from the surface to the inner part of the granules, increasing the accessibility of the amorphous regions

to enzymes, despite higher crystalline order. A partial gelatinisation of the granules probably occurred in the starch annealed at 60oC, due to the annealing temperature coinciding with the

onset gelatinisation temperature of the cassava starch.

amido, mandioca, “annealing”,

hidrólise enzimática.

starch, cassava, annealing,

enzymatic hydrolysis.

Braz. J. Food Technol., v.8, n.3, p. 220-232, jul./set. 2005

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1. INTRODUCÃO

O amido é encontrado em abundância na natureza, só competindo em quantidade com a celulose. Os depósitos permanentes desse polissacarídeo nas plantas ocorrem principalmente nos órgãos de reserva como é o caso dos amiloplastos de grãos de cereais, tubérculos, raízes, e leguminosas (LEONEL ; CEREDA, 2002).

Além de ser utilizado como fonte de energia, o amido é largamente empregado pela indústria de alimentos nacional e internacional como ingrediente em sistemas alimentícios. Dependendo de sua fonte botânica e de sua natureza nativa ou modificada ele pode, entre outras funções, facilitar o processamento, fornecer textura, servir como espessante, fornecer sólidos em suspensão ou proteger os alimentos durante o processamento. Assim, o amido desempenha um importante papel no controle das características de um grande número de alimentos processados.

O Brasil é um grande produtor de mandioca e seu amido é largamente utilizado em vários processos industriais, principalmente no setor alimentício. O amido de mandioca apresenta forma arredondada com uma das extremidades truncada apresentando tamanho de grânulos que variam de 5 a 40 µm (JANE et al, 1994) e teor de amilose variando de 18,6 a 23,6% (HOOVER, 2001). Quando aquecido em água este amido apresenta alta viscosidade a quente, alta viscosidade de quebra e baixa tendência a retrogradação (SWINKELS, 1985).Sua pasta é transparente e apresenta boa claridade. Dentre os amidos de raízes e tubérculos, é um dos que apresenta menor temperatura inicial de gelatinização que em média gira em

otorno de 60 C (HOOVER, 2001). Apesar da pouca estabilidade térmica que o gel de amido de mandioca apresenta, sua baixa temperatura de pasta, baixa tendência a retrogradação, alta claridade da pasta, além do sabor neutro, o qualificam como um bom ingrediente a ser utilizado em diversos produtos alimentícios.

Nem sempre o amido, na sua forma nativa, possui as propriedades físico-químicas adequadas a determinados tipos de processamento. Deste modo, amidos modificados são largamente utilizados na fabricação de alimentos preparados, principalmente em países desenvolvidos. Na maioria das vezes, a modificação química é usada, mas há um crescente interesse na modificação física do amido, especialmente para aplicações em alimentos. Os amidos modificados fisicamente são considerados materiais naturais de alta segurança. A demanda por produtos mais naturais e normas mais rigorosas de proteção a consumidores, têm dificultado o desenvolvimento de amidos alimentares a partir de modificações, principalmente químicas. Novos reagentes para a modificação de amidos, ou novos derivados de amidos para uso alimentar são cada vez mais difíceis de serem aprovados (BeMILLER, 1997).

“Annealing” é o processo físico no qual uma suspensão de amido é exposta à temperatura superior àquela de transição vítrea e ligeiramente inferior à temperatura de gelatinização, o que permite uma discreta reorganização molecular com formação de uma estrutura mais organizada de menor energia livre (BLANSHARD, 1987). TESTER e DEBON (2000) reconhecem que este processo possa estar associado a uma gelatinização parcial dos grânulos, mas acreditam que a definição de “annealing” deva ser aplicada somente em casos

em que a gelatinização ainda não ocorreu e assim, a temperatura inicial de gelatinização (T ) não deve ser excedida o

durante o processo.

O processo de ”annealing” afeta as propriedades funcionais do amido tais como suas propriedades de pasta e térmicas. As temperaturas de gelatinização inicial e de pico são aumentadas, enquanto a faixa de temperatura de gelatinização e a mudança de entalpia diminuem com o tratamento (JACOBS et al, 1998b; TESTER et al, 2000). Já o efeito do “annealing” sobre as propriedades de pasta dos amidos ainda não está bem esclarecido. Alguns autores observaram redução da viscosidade a quente, enquanto outros observaram um aumento deste parâmetro, estando possivelmente essas diferenças relacionadas com as características estruturais dos amidos e em última análise, à fonte botânica dos mesmos.

Pesquisas dessa natureza são importantes do ponto de vista industrial, pois processos como a moagem úmida de

omilho (onde o grão é aquecido em água à cerca de 50 C) provocam o “annealing” do amido (BRANDERMARTE et al, 2004). Além disso, alguns pesquisadores (TESTER et al, 1997) têm demonstrado que o “annealing” pode acontecer até

omesmo a 15 C ou mais, abaixo da temperatura inicial de gelatinização, podendo acarretar implicações nos processos de extração de alguns amidos de raízes e tubérculos.

Devido aos efeitos marcantes que o processo de “annealing” provoca nas propriedades funcionais do amido, é importante que os eventos moleculares básicos sejam elucidados (TESTER; DEBON, 2000). Esses autores reconhecem que o processo fornece um modelo útil para investigar a cristalização da amilopectina, sendo uma técnica simples, capaz de fornecer informações sobre a estrutura dos grânulos de amido.

A hidrólise enzimática também tem sido utilizada como técnica que possibilita a compreensão da estrutura física e química do grânulo de amido e de seus componentes. A taxa de hidrólise dos grânulos de amido depende, fortemente, da origem botânica do sistema enzimático utilizado e do tamanho dos grânulos, entre outros fatores. Amidos que naturalmente apresentam superfície porosa, como o de milho, são degradados mais facilmente que aqueles cuja superfície é lisa, como o de mandioca e grânulos de menor diâmetro são mais suscetíveis às enzimas que aqueles de maior diâmetro (FRANCO; CIACCO, 1992; FRANCO et al, 1998).

Informações sobre a relação entre “annealing” e hidrólise enzimática do amido são relativamente escassas.

Neste trabalho o impacto do “annealing” sobre a hidrólise enzimática do amido de mandioca e a caracterização dos amidos natural e tratados antes e após a hidrólise com a-amilase bacteriana foram estudados. Três temperaturas (50,

o55 e 60 C) foram utilizadas e os amidos antes e após o tratamento físico foram tratados com a-amilase bacteriana. As temperaturas de “annealing” foram escolhidas em função da temperatura inicial de gelatinização do amido de mandioca,

ousado neste experimento, ser 59,82 C. Os amidos naturais, submetidos ao “annealing” e tratados enzimaticamente foram estudados quanto às suas características estruturais tais como: teor de amilose, cristalinidade, microscopia eletrônica de varredura e propriedades térmicas. Os amidos naturais e submetidos ao “annealing” também foram analisados quanto às suas propriedades de pasta.


SERRANO, P. O. & FRANCO, C. M. L.

221Braz. J. Food Technol., v.8, n.3, p. 220-232, jul./set. 2005

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2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material

Raízes recém-colhidas de mandioca (Maniot esculenta) da variedade comercial Branca de Santa Catarina, com idade de 12 meses, foram obtidas na região de São José do Rio Preto-SP e utilizadas neste trabalho. O solo da região é o Agisolo vermelho/amarelo. As raízes foram colhidas manualmente, ao amanhecer e transportadas em caixas de 20 Kg para o laboratório, onde foram imediatamente processadas. Alfa-amilase bacteriana A6380 (Sigma), foi utilizada nos experimentos de hidrólise.

2.2 Isolamento do amido

O amido foi isolado de raízes recém-colhidas de mandioca segundo metodologia descrita por SARMENTO (1997).

2.3 “Annealing” do amido

Porções de 30g (b.s.) de amido, amostradas em triplicata, foram suspensas em água (50% p/v) por 48 horas, a

o50, 55 e 60 C, segundo procedimento de JACOBS et al. (1998a), com modificações. As temperaturas de “annealing” foram escolhidas devido a temperatura inicial de gelatinização do amido de mandioca, usado neste experimento, ser de

o59,82 C. Gotas de tolueno foram adicionadas como agente bacteriostático. As amostras foram incubadas nas diferentes temperaturas em shaker com agitação orbital a 200 rpm. Após o período de “annealing”, as amostras foram recuperadas por centrifugação, lavadas com água destilada e etanol e secas em estufa com circulação forçada de ar a 40ºC, por 24 horas.

2.4 Propriedades de pasta e térmicas

As propriedades de pasta e térmicas dos amidos natural e submetidos ao “annealing” foram determinadas usando-se um Rápido Visco Analisador RVA-4 (Newport Scientific, Austrália) e um Calorímetro Diferencial de Varredura Pyris 1- (Perkin Elmer, USA), respectivamente, de acordo com FRANCO et al. (2002).

2.5 Hidrólise enzimática

Amidos natural e submetidos ao “annealing” nas diferentes temperaturas foram submetidos à hidrólise enzimática seguindo metodologia descrita por FRANCO e CIACCO (1987). Amidos (10 g, b.s.) foram suspensos em 48,5 mL de solução tampão fosfato 0,2M, pH 6,0. À suspensão, foi adicionado 1 mL de solução (0,25% p/v) de enzima a-amilase bacteriana Sigma (A6380), com atividade declarada no rótulo, de 2150 unidades/mg de sólidos e 0,5 mL de solução de azida de sódio (10% p/v). Esta última foi adicionada para evitar crescimento microbiano durante o período de incubação das amostras. As dispersões de amido foram incubadas em shaker com agitação orbital (120rpm) durante 48 horas a 37ºC. A extensão da hidrólise foi determinada pela quantidade de

açúcares redutores presentes no sobrenadante (SOMOGY, 1945). Após o período de incubação, as suspensões foram acidificadas a pH 3,0 com HCl 0,1N, agitadas durante 15 minutos, para inativação enzimática, neutralizadas com NaOH 0,1N e centrifugadas a 2740 x G por 20 minutos. Os resíduos obtidos, após centrifugação, foram lavados com água destilada,

o filtrados e secos em estufa com circulação de ar a 40 C.

2.6 Afinidade com iodo e teor de amilose

As amostras desengorduradas foram dispersas em uma solução de 90% de DMSO (Dimetil sulfóxido) em um banho de água fervente por 1 h como descrito por FRANCO et al (2002). Afinidades com iodo dos amidos foram determinadas de acordo com o método reportado por KASEMSUWAN et al (1995), usando-se um autotitulador potenciométrico (716SM titrino, Brinkmann Instrument, Westbury, NY). Teores de amilose foram calculados dividindo a afinidade com iodo do amido por 18,6% de acordo com procedimentos descritos por TAKEDA e HIZUKURI (1987) e KASEMSUWAN et al (1995).

2.7 Difração de raios-X

Os padrões de difração de raios-X dos amidos natural, submetidos ao “annealing” e hidrolisados foram determinados por difractogramas de raios-X (Laboratório de Cristalografia Instituto de Física de São Carlos - IFSC USP), utilizando-se uma unidade RINT2000 (Wide Angle Goniometer), com radiação de

oCu, linha K, L= 1,542 Å. A velocidade de varredura foi de 1 por minuto e as condições de uso foram 50Kv e 100 mA.

O índice de Cristalinidade Relativa (IC) foi quantitativamente estimado de acordo com o método proposto por HERMANS e WEIDINGER (1948 apud SEBIO, 2003) e modificado por RABEK (1980 apud SEBIO, 2003). O IC é definido como a razão entre a área da região cristalina (Ac) e a área total coberta pela curva (Ac+Aa), composta pela área da região cristalina (Ac) e a área da região amorfa (Aa), a partir da equação 1.

0

4

8

12

16

20

0 10 20 30 40 50

tempo (horas)

gg

lico

se/1

00g

am

ido

Natural 50ºC 55ºC 60ºC

Figura 1 Quantidade de açúcar redutor, produzida por 100 g de amido em função do tempo de incubação durante a hidrólise dos amidos de mandioca natural e submetidos ao “annealing” a diferentes temperaturas.




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2.8 Propriedades térmicas dos amidos hidrolisados

As propriedades térmicas dos amidos hidrolisados foram determinadas segundo o procedimento descrito no item 2.4

2.9 Microscopia eletrônica de varredura

A microscopia eletrônica de varredura foi realizada através de um Microscópio Eletrônico de Varredura, modelo

Ac

Ac + Aa 1. IC =

0 10 20 30 40 50 600

2000

4000

6000

8000

10000

4

32

1

Aa

Ac

Inte

nsid

ade

(cps

)

Ângulo de Difração (2theta)

0 10 20 30 40 50 600

2000

4000

6000

8000

10000

4

32

1

Aa

Ac

Inte

nsid

ade

(cps

)


0 10 20 30 40 50 600

2000

4000

6000

8000

10000

4

32

1

Aa

Ac

Inte

nsid

ade

(cps

)


0 10 20 30 40 50 600

2000

4000

6000

8000

10000

4

32

1

Aa

Ac

Inte

nsid

ade

(cps

)


Figura 2 Difractogramas de raios-x dos amidos de mandioca natural e submetidos ao “annealing”. a: amido natural; b: amido tratado o o oa 50 C; c: amido tratado a 55 C; d: amido tratado a 60 C

DSM 960 ZEISS - ”Digital Scanning Microscope" (Laboratório de Microscopia - Instituto de Física de São Carlos - IFSC USP). Uma pequena quantidade de amostra de amido foi colocada sobre uma fita adesiva de carbono, aderida a um disco metálico o qual foi conduzido a um Metalizador Balzers, modelo SCD 050, para aplicação de uma camada de ouro de 20 nm. As amostras assim preparadas foram observadas no microscópio eletrônico de varredura e imagens com aumentos de 1500 e 3500 X foram obtidas.

2.10 Delineamento experimental e análise estatística dos resultados

O efeito das diferentes temperaturas de “annealing”




0 10 20 30 40 50 600

2000

4000

6000

8000

10000

4

32

1

Aa

Ac

Inte

nsid

ade

(cps

)


0 10 20 30 40 50 600

2000

4000

6000

8000

10000

4

32

1

Aa

Ac

In

tens

idad

e(c

ps)


0 10 20 30 40 50 600

2000

4000

6000

8000

10000

432

1

Aa

Ac

Inte

nsid

ade

(cps

)


0 10 20 30 40 50 600

2000

4000

6000

8000

10000

4

32

1

Aa

Ac

Inte

nsid

ade

(cps

)


Figura 3 Difractogramas de raios-x dos amidos de mandioca natural e submetidos ao “annealing” tratados enzimaticamente. a: amido o o onatural; b: amido tratado a 50 C; c: amido tratado a 55 C; d: amido tratado a 60 C.

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sobre as propriedades térmicas e de pasta dos amidos foi analisado utilizando-se um delineamento inteiramente casualizado, que incluiu o controle e as três temperaturas, perfazendo-se um total de quatro tratamentos. Todas as análises foram feitas no mínimo em triplicata e a significância da influência de cada tratamento nas propriedades térmicas e de pasta do amido foram avaliadas através das análises de variância (Programa ESTAT) e da comparação de médias (Tukey) dos resultados obtidos, com nível de significância de 5% de probabilidade.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os amidos submetidos ao “annealing” apresentaram

cor, aparência e consistência similares às do amido natural.

3.1 Propriedades de pasta e térmicas

O amido natural apresentou um perfil de viscosidade típico para amido de mandioca com baixa temperatura de pasta

o (65,2 C), aumento acentuado de viscosidade até seu pico máximo (261 RVU), seguido de queda rápida da mesma sob agitação (Tabela 1). Este comportamento sugeriu a existência de forças associativas fracas mostrando um amido com baixa resistência à agitação mecânica. No ciclo de resfriamento, a pasta apresentou baixa tendência a retrogradação (83 RVU). De acordo com SWINKELS (1985), os baixos teores de amilose de grande peso molecular seriam responsáveis pela baixa




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Pico

c261 2

a283 4

ab278 11

bc267 4

Quebra

b178 1

a194 2

b179 6

c161 3

Final

b165 2

b168 3

b166 7

a182 7

Tendência Retrogradação

a83 0

b78 1

c67 3

b74 2

c65,2 0,0

c65,6 0,1

b67,8 0,3

a69,0 0,2

c5,83 0,0

b6,11 0,0

b6,24 0,0

a7,02 0,1

Natural

050 C

055 C

0 60 C

Viscosidade (RVU)Amostra

0Temp.pasta ( C) Tempo pico (min)

Tabela 1 Propriedades de pasta das amostras de amidos de mandioca natural e submetidos ao “annealing”.

Cada valor representa a média de seis replicatas. Viscosidade: Unidade RVU; valores seguidos pela mesma letra na mesma coluna não são significativamente diferentes (P < 0.05).

Amostra

Natural

050 C

055 C

060 C

0T ( C)o

d_59,82 + 0,14

c_61,67 + 0,29

b_64,29 + 0,45

a_65,85 + 0,68

0T ( C)p

c_63,18 + 0,20

c_63,78 + 0,08

b_66,46 + 0,47

a_67,33 + 0,22

0T ( C)f

b_68,29 + 0,33

b_67,20 + 0,64

a_70,28 + 0,51

a_70,92 + 0,48

0[T -T ] ( C) f o

8,47

5,53

5,99

5,07

H (J/g)

c6,27 0,70

b7,80 0,48

a11,49 0,45

a12,48 0,69

Tabela 2 Características de gelatinização das amostras de amidos de mandioca natural e submetidos ao “annealing”.

(T ), (T ), (T ): Temperaturas inicial, de pico, e final, respectivamente; (H): variação de entalpia; Faixa de temperatura de gelatinização = [T T ]. Valores são médias de seis replicatas o p f f o

de cada amostra. Valores seguidos pela mesma letra, na mesma coluna não são significativamente diferentes (P < 0.05).

Amostras de Amido

Natural

o50 C

o55 C

o 60 C

%Amilose

_20,22 + 0,55

_20,21 + 0,26

_20,73 + 0,34

_20,01 + 0,02

Amostras hidrolisadas

Natural

o 50 C

o55 C

o 60 C

% Amilose

_20,40 + 0,23

_20,16 + 0,04

_21,00 + 0,41

_20,97 + 0,39

a Tabela 3 Teor de amilose dos amidos de mandioca natural, submetidos ao “annealing” e hidrolisados

aos valores são médias de pelo menos três replicatas.

tendência a retrogradação do amido de mandioca.

O “annealing” alterou, de modo significativo, as propriedades de pasta dos amidos (Tabela 1). A viscosidade de pico aumentou principalmente para os amidos tratados a 50 e

o55 C. A temperatura de pasta aumentou, sendo maior quanto maior a temperatura do tratamento. A tendência a retrogradação diminuiu, sendo esta redução mais pronunciada

opara o amido tratado a 55 C. O “annealing” também provocou oaumento na viscosidade de quebra para a temperatura de 50 C,

oenquanto que à temperatura de 60 C observou-se um decréscimo no valor desta propriedade, sugerindo comportamento mais estável para o amido tratado a esta temperatura.

Dados obtidos sobre o efeito do “annealing” nas propriedades de pasta de diferentes amidos são bastante controversos. Maior temperatura de pasta, menor pico de viscosidade e maior viscosidade no resfriamento foram observados para amido de batata submetido ao “annealing” (HOOVER; VASANTHAN, 1994; STUTE, 1992, JACOBS et al, 1995, 1996), enquanto viscosidade de pico e viscosidade sob

resfriamento dos amidos de trigo, ervilha e arroz submetidos ao “annealing” aumentaram (JACOBS et al, 1996). Os dados apresentados na literatura e os observados neste trabalho sugerem que o efeito do “annealing” sobre as propriedades de pasta de amidos depende das características estruturais de cada um, e do instrumento de medida. Tanto o Rápido Visco Analisador como o Viscoamilógrafo Brabender são úteis na determinação do efeito do “annealing” sobre as propriedades de pasta de amidos. No entanto, segundo JACOBS et al (1996), o modo pelo qual o perfil de viscosidade do amido é afetado por este tratamento depende principalmente das taxas de aquecimento/resfriamento aplicadas no instrumento. Dependendo da taxa de aquecimento, os amidos submetidos ao “annealing” podem resistir melhor ao aquecimento e ao atrito que os amidos normais. A determinação das propriedades de pasta realizada no RVA seguiu um método sugerido pelo fabricante em que a taxa de aquecimento

outilizada foi de 6 C/min. Essa taxa de aquecimento relativamente alta pode ter omitido modificações mais sutis na pasta de amido que poderiam ter sido percebidas com um viscoamilógrafo Brabender.




Natural

o50 C

o55 C

o60 C

Natural hidrolisado

o 50 C hidrolisado

o55 C hidrolisado

o60 C hidrolisado

1

6868

7374

7408

6972

7395

6772

6690

7318

2

8871

9146

9219

8403

9600

8149

8395

8838

3

8775

8945

8870

8393

9566

7997

8419

8953

4

8171

8669

8118

7796

8651

7480

7717

8032

IC

(%)

21,6

23,3

25,8

19,3

20,0

23,20

23,30

24,40

Intensidades (CPS*)

Amido

Tabela 4 Intensidade dos principais picos dos difractogramas de raios-X e índice de cristalinidade relativa dos amidos natural e tratados fisicamente, submetidos ou não à hidrólise enzimática.

*CPS Contagens por Segundo; IC: Indice de Cristalinidade.

Amidos Hidrolisados

Natural

050 C

055 C

060 C

0T ( C)o

d_58,99 + 0,29

c_61,68 + 0,09

b_65,48 + 0,05

a_67,43 + 0,31

0T ( C)p

d_62,60 + 0,25

c_64,22 + 0,07

b_67,36 + 0,11

a_69,46 + 0,36

0T ( C)f

d_67,76 + 0,23

c_68,67 + 0,16

b_70,01 + 0,21

a_73,81 + 0,06

0[T -T ] ( C) f o

8,77

6,99

4,53

6,38

H (J/g)

b_6,32 + 0,42

ab_6,74 + 0,63

c_4,41 + 0,08

a_8,07 + 0,01

Tabela 5 Características de gelatinização dos amidos de mandioca natural e submetidos ao “annealing” após tratamento enzimático.

(T ), (T ), (T ): Temperaturas inicial, de pico, e final, respectivamente; (H): variação de entalpia; Faixa de temperatura de gelatinização = [T T ]. Valores são médias de seis replicatas o p f f o

de cada amostra. Valores seguidos pela mesma letra, na mesma coluna não são significativamente diferentes (P < 0.05).

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TESTER e DEBON (2000) sugerem que a falta de consistência nos resultados obtidos por diferentes autores para diferentes amidos se deve principalmente ao fato de que as propriedades de pasta são fortemente influenciadas pelo tamanho dos grânulos e pela solubilização dos polissacarídeos, mais do que seriam as determinações das propriedades térmicas de gelatinização (determinadas por DSC) e poder de inchamento. De fato, a distribuição do tamanho dos grânulos de amido varia enormemente com a fonte botânica. Grânulos de amido de mandioca apresentam tamanho que pode variar de 5 a 40 mm, enquanto os de batata variam de 15 a 75mm, os de milho de 5 a 20mm e os de arroz de 3 a 8mm (JANE et al, 1994). Muitos autores têm mostrado que o tamanho dos grânulos afeta as características estruturais e a composição dos amidos, o que em última análise afeta suas propriedades funcionais (FRANCO; CIACCO 1992; RAEKER et al, 1998; PETERSON; FULCHER, 2001), podendo desta maneira contribuir para os diferentes comportamentos observados. No entanto, dados específicos relacionando distribuição de

tamanho dos grânulos e “annealing” não foram encontrados.

O amido de mandioca natural apresentou temperaturas de gelatinização inicial (T ), de pico (T ) e final (T ) o p f

o o ode 59,82 C, 63,18 C e 68,29 C, respectivamente e variação de entalpia ( D H) de 6,27 J/g (Tabela 2). A literatura apresenta grande variação na faixa de temperatura de gelatinização deste

oamido podendo (T ) ser tão baixa quanto 58,0 C (ASAOKA et al, oo1992) e (T ) tão alta quanto 68,3 C (JANE et al, 1999), mas em p

omédia T encontra-se próxima a 60 C (HOOVER, 2001). Tais o

diferenças sugerem que a variação genética e condições ambientais afetam as propriedades funcionais do amido.

Os amidos submetidos ao “annealing” mostraram que essas temperaturas aumentaram com o tratamento, sendo este aumento mais pronunciado quanto maior a temperatura utilizada. A entalpia de gelatinização também aumentou, significativamente com o aumento da temperatura de “annealing”. Esses resultados concordam com a grande maioria dos apresentados na literatura, indicando que o




a b

c d

e f

g

h

Figura 4 Grânulos de amidos de mandioca natural e submetidos ao “annealing” observados ao microscópio eletrônico de varredura com aumentos de 1500 e 3500 X: a, b: amido natural;

oc, d: amido tratado a 50 C; e, of: amido tratado a 55 C;

og, h: amido tratado a 60 C.

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“annealing” provoca um rearranjo das moléculas de amilose e amilopectina aumentando a estabilidade e perfeição dos cristais com a formação de uma estrutura mais ordenada (KISELEVA et al, 2004; TESTER et al, 2000; JACOBS et al, 1998a).

oO amido tratado a 60 C mostrou um discreto aumento das temperaturas e entalpia de gelatinização em relação à amostra

otratada a 55 C. Da Tabela 1 também foi observado que a oviscosidade de pico do amido tratado a 60 C não diferiu

significativamente daquela encontrada para o amido natural. O fato da temperatura de tratamento praticamente coincidir com a temperatura inicial de gelatinização do amido natural

o(59,82 C), pode sugerir que alguns grânulos desta amostra tenham sido parcialmente gelatinizados durante o tratamento.

A faixa de temperatura de gelatinização (T -T ) diminuiu f o

para os amidos submetidos ao “annealing” (Tabela 2). Esses resultados concordam com aqueles reportados por JACOBS et al. (1998a) e TESTER et al (2000). O estreitamento na faixa de temperatura de gelatinização pode ser atribuído a um aumento na homogeneidade dos cristais de amido (ZOBEL (1992) apud PEREZ et al., 2001), a alterações das forças de ligação entre a matriz amorfa e os cristais (STUTE, 1992), a perfeição dos cristais (LARSSON; ELIASSON, 1991), a maior orientação cristalina (KRUEGER et al., 1987), ou a interação entre as cadeias de amilose e amilopectina (KNUTSON, 1990).

3.2 Hidrólise enzimática dos amidos de mandioca natural e submetidos ao “annealing” nas diferentes temperaturas

A Figura 1 mostra as porcentagens de açúcares redutores produzidas, em função do tempo, pelos amidos natural e submetidos ao “annealing” a diferentes temperaturas, durante a hidrólise. A suscetibilidade enzimática dos amidos aumentou com o tratamento e foi maior quanto maior a temperatura utilizada. O “annealing” provavelmente provocou alterações nas áreas amorfas dos grânulos tornando-as mais acessíveis à ação da enzima.

Como difundido na literatura (LEACH ;SCHOCH, 1961; PLANCHOT et al, 1995; JACOBS et al., 1998a), a cinética da a-amilase é caracterizada por uma etapa inicial em que ocorre uma alta taxa de hidrólise, seguida de uma segunda etapa mais lenta. A redução na taxa de hidrólise seria causada, provavelmente, pela inibição do produto da atividade de a-amilase (COLONNA et al, 1988). Além disso, como sugerido por outros autores (PLANCHOT et al, 1995; JACOBS et al, 1998a), as áreas amorfas dos grânulos de amido são mais rapidamente degradadas pelas -amilases bacterianas e pancreáticas do que as áreas cristalinas e assim, para a hidrólise de uma área cristalina seria necessário inicialmente, um desembaraço das cadeias pela enzima (COLONNA et al, 1988). Neste experimento, todas as amostras estudadas apresentaram claramente estas duas fases. Na primeira, uma taxa de hidrólise mais rápida foi observada até aproximadamente 24 h de tratamento, enquanto na segunda, de 24 a 48 h, a taxa de hidrólise decresceu havendo tendência à estabilização.

Os dados apresentados na literatura são controversos com relação à suscetibilidade enzimática dos amidos de diferentes fontes botânicas quando submetidos ao “annealing”. Enquanto alguns estudos indicam que amidos de trigo, cevada e sagu submetidos ao “annealing” são mais

facilmente hidrolisados pelas a-amilases que os seus amidos de origem, outros trabalhos apresentam resultados contrários para amidos de trigo, lentilha e batata (TESTER; DEBON, 2000).

É possível que o “annealing” crie poros ou fissuras que alterem o padrão de hidrólise com a-amilase, da superfície até a área interna dos grânulos (WANG et al, 1997). Desse modo, apesar das lamelas amorfas e cristalinas dos grânulos tornarem-se mais ordenadas com o tratamento, a acessibilidade das áreas amorfas pela enzima seria facilitada.

3. 3 Teor de amilose dos amidos de mandioca natural, submetidos ao “annealing” e hidrolisados

O “annealing” não provocou modificação no teor de amilose dos amidos (Tabela 3). Como este tratamento ocorre a temperaturas abaixo da temperatura de gelatinização, não se esperava que o mesmo provocasse lixiviação deste polímero.

oNem mesmo o tratamento a 60 C, praticamente a mesma temperatura inicial de gelatinização do amido de mandioca (Tabela 2), foi suficiente para promover alteração da amilose. Esses resultados concordam com os obtidos por KNUTSON (1990) e HOOVER e VASANTHAN (1994).

O tratamento enzimático também não provocou alteração no teor de amilose dos amidos natural e tratados fisicamente. FRANCO e CIACCO (1987, 1992) não observaram qualquer modificação no teor de amilose do amido de mandioca granular, após tratamento enzimático com a-amilase bacteriana e glucoamilase. Isso indica que a hidrólise enzimática ocorreu principalmente na fração ramificada do amido.

3.4 Difração de raios-X

As Figuras 2 e 3 mostram os difractogramas de raios-X dos amidos de mandioca natural e tratados a diferentes temperaturas submetidos ou não à hidrólise enzimática, respectivamente. Os números 1, 2, 3 e 4 representam os maiores picos detectados nos difractogramas, listados na Tabela 4. A Tabela 4 também mostra os valores de intensidade, medidos em Contagens por Segundo (CPS), encontrados para cada pico apresentado nos difractogramas, e o Índice de Cristalinidade (IC) de cada amido.

O amido de mandioca natural apresentou um difractograma de raios-X caracterizado como padrão tipo A, confirmando resultados encontrados por FRANCO et al (1988). O 'annealing” a diferentes temperaturas estudadas não alterou o padrão do amido natural, mantido como tipo A.

oPara os amidos tratados a 50 e 55 C houve um aumento da intensidade dos picos em relação ao amido natural, e um aumento do IC que passou de 21,6% do amido original para

o23,3 e 25,8% para os amidos tratados a 50 e 55 C, respectivamente. Esse aumento na cristalinidade dos amidos

otratados a 50 e 55 C sugeriu um rearranjo das moléculas de amido com o fortalecimento das ligações internas dos grânulos e, conseqüentemente maior grau de associação das cadeias de amido. Esses resultados explicam as maiores temperaturas de gelatinização determinadas por DSC para esses amidos. O

oamido, tratado a 60 C, mostrou picos menos resolvidos e

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a b

c d

e f

g h

Figura 5 Grânulos de amido de mandioca natural e submetidos ao “annealing” tratados enzimaticamente, observados ao microscópio eletrônico de varredura, com aumentos de 1500 e 3500 X. a,b: amido natural; c,d: amido

otratado a 50 C; e,f: amido otratado a 55 C; g,h: amido otratado a 60 C.

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diminuição do IC, em relação ao amido natural (19,3%). Isso pode ser explicado em função da temperatura de tratamento ser praticamente a mesma que a temperatura inicial de gelatinização do amido de mandioca. Apesar da maior entalpia observada para este amido a partir dos resultados de DSC (Tabela 2), é possível que a essa temperatura de “annealing”, tenha ocorrido uma gelatinização parcial de alguns grânulos, causando a diminuição da cristalinidade.

O tratamento enzimático propiciou, em relação ao amido original, uma diminuição da intensidade dos picos bem

ocomo do IC, para os amidos tratados a 50 e 55 C (Figura 3, Tabela 4).

Esses resultados suger i ram que a enzima provavelmente hidrolisou tanto as áreas amorfas quanto as áreas cristalinas dos grânulos. Para o amido natural hidrolisado, apesar do IC ter diminuído, observou-se um aumento na intensidade dos picos. O amido submetido ao “annealing” a

o60 C e submetido ao tratamento enzimático mostrou aumento da intensidade dos picos e do IC. Os resultados de hidrólise apresentados na Figura 1 mostraram uma maior taxa de

ohidrólise para o amido tratado a 60 C sugerindo que nesse caso houve maior degradação das moléculas de amido sendo as áreas amorfas as mais afetadas, causando um aumento relativo das regiões cristalinas. Isso também pode ter ocorrido em

ofunção da gelatinização parcial dos grânulos tratados a 60 C. Porém, não foi observado mudança no teor de amilose dos amidos como esperado (Tabela 3).

3.5 Propriedades térmicas dos amidos natural e submetidos ao “annealing” após tratamento enzimático

Não houve mudanças significativas nas temperaturas e entalpia de gelatinização do amido natural após tratamento enzimático (Tabelas 5 e 2). JACOBS et al (1998a) sugeriram que a hidrólise enzimática ocorre seletivamente grânulo a grânulo caracterizando-se como uma ação enzimática desuniforme em relação a toda a população de grânulos. A taxa de hidrólise do amido natural não foi suficiente para provocar alteração nas temperaturas de gelatinização deste amido.

oO amido tratado à 50 C e submetido à hidrólise mostrou temperaturas inicial e de pico muito próximas àquelas mostradas antes da ação enzimática, enquanto o amido

otratado a 55 C hidrolisado apresentou temperaturas inicial e de pico levemente superiores, àquelas encontradas para este

oamido antes da hidrólise. Já para o amido tratado a 60 C e hidrolisado o aumento nas temperaturas de gelatinização foi mais pronunciado quando comparado aos valores obtidos antes da hidrólise (Tabela 2). Como observado da Tabela 4, o IC

oaumentou para o amido tratado a 60 C e submetido à hidrólise indicando que tanto regiões amorfas como cristalinas foram hidrolisadas, provocando o aumento da cristalinidade relativa do resíduo da hidrólise. Isso contribuiu para o aumento mais pronunciado das temperaturas de gelatinização deste amido. Se a entalpia de gelatinização reflete principalmente a perda da ordem das duplas hélices em uma escala molecular (COOKE; GIDLEY, 1992), a diminuição da entalpia para os amidos submetidos ao “annealing” e hidrolisados (Tabela 5), em relação àqueles apenas submetidos ao “annealing” (Tabela 2), pode indicar um aumento na susceptibilidade das estruturas de

duplas hélices no grânulo frente à ação enzimática, como resultado do tratamento físico explicando a maior taxa de hidrólise observada para esses amidos.

3.6 Microscopia eletrônica de varredura

O amido de mandioca natural, quando observado em microscópio eletrônico de varredura, apresentou superfície lisa e grande variação de tamanho, predominando o formato redondo com alguns grânulos apresentando uma extremidade truncada (Figura 4a, b). Não foram constatadas diferenças evidentes entre os grânulos submetidos ao “annealing” a 50 e

o60 C (Figura 4 c, d, g, h). Por outro lado, para os grânulos de oamido tratados a 55 C observou-se formação de poros ou

fissuras sobre a superfície de alguns grânulos [Figura 4 e, f ()] deixando sua superfície com aspecto esponjoso, como já observado por WANG et al (1997). Também foi possível observar uma maior fragilidade dos grânulos com possíveis quebras aumentando o número de fragmentos granulares. Dos resultados obtidos neste trabalho observa-se que o amido

osubmetido a 55 C foi o mais afetado pelo tratamento. É possível oque para a temperatura de 50 C, fosse necessário maior tempo

de tratamento para que as fissuras ou poros viessem a aparecer na superfície dos grânulos.

Vários grânulos de amido de mandioca natural, submetidos à ação da a-amilase apresentaram evidências do ataque enzimático através da formação de uma superfície rugosa com pequenas depressões (Figura 5 a, b). Não foi observada a presença de canais radiais. Para os amidos submetidos ao “annealing”, pode-se observar uma maior taxa de degradação enzimática quanto maior a temperatura utilizada (Figura 5 c,d, e, f, g, h), confirmando os resultados observados no item 3.2 deste trabalho.

A enzima atacou principalmente os grânulos tratados a o55 e 60 C. Para esses amidos houve uma extensa exocorrosão

da superfície granular, causando em alguns casos a fragmentação dos grânulos [Figura 5 e, g ()]. Não foi possível observar grandes diferenças no modo de ataque da enzima sobre os grânulos tratados a diferentes temperaturas, apesar

odos grânulos de amido tratados a 55 C terem apresentado muitas fissuras e poros antes do tratamento enzimático. Como discutido anteriormente, o “annealing” pode provocar fissuras na superfície dos grânulos expondo mais suas áreas acessíveis à ação da enzima, explicando assim a maior taxa de hidrólise para o amido que apresentou também a maior cristalinidade. Esses resultados sugeriram que o “annealing” altera o padrão de hidrólise do amido, facilitando a penetração das enzimas, da superfície para o interior dos grânulos. Apesar das lamelas amorfas e cristalinas dos grânulos de amidos submetidos ao “annealing” tornarem-se mais ordenadas, a acessibilidade às

4. CONCLUSÕES

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O “annealing” do amido de mandioca provocou rearranjo das regiões cristalinas dos grânulos que foi evidenciado pelas maiores temperaturas de gelatinização e entalpia dos amidos tratados. Houve acréscimo da

ocristalinidade dos amidos tratados a 50 e 55 C, enquanto o




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oamido tratado a 60 C apresentou-se com menor cristalinidade. Os amidos submetidos ao “annealing” foram mais suscetíveis à hidrólise enzimática com a-amilase quanto maior a temperatura de tratamento. As fissuras observadas na superfície dos

ogrânulos tratados a 55 C facilitaram a penetração das enzimas aumentando a suscetibilidade enzimática dos grânulos, apesar da maior cristalinidade dos mesmos. A menor cristalinidade e

omaior taxa de hidrólise apresentada pelo amido tratado a 60 C sugeriram uma gelatinização parcial dos grânulos em função da temperatura de “annealing” coincidir com a temperatura inicial de gelatinização do amido de mandioca.

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