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Orientações para Coleta, Transporte, Processamento, Análise e Meios de Cultura.Análise e Meios de Cultura.

•• ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;•• CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;•• CASOS CLÍNICOS;CASOS CLÍNICOS;

blog do professor:blog do professor:http://chitoteixeira.wordpress.comhttp://chitoteixeira.wordpress.com

Colheita de Amostras

Quando se suspeita de doença infecciosaTécnicas dirigidas à detecção

sorológica de antígenos e anticorpos

Sondas de DNA - PCR

Cultivos apropriados

Anticorpos monoclonais

Sondas de DNA - PCR

Outros procedimentos sem cultivo


É possível que a colheita apropriada de umaamostra para cultivo seja a etapa misimportante na confirmação final de que ummicrorganismo é responsável pelo processode enfermidade infecciosa.

Na instituição de uma terapia incorreta e aindadanosa, caso o tratamento seja dirigido paraum comensal.

Uma amostra mal colhida:

de enfermidade infecciosa.

Fracasso no isolamento demicrorganismos importantes.

Exemplo: (caso clínico)

Klebsiella pneumoniae foi isolada do escarrode um paciente com pneumonia clínica;

Escarro colhido de forma inadequada sendoconstituído principalmente de saliva;

Klebsiella pneumoniae

pneumonia Nasofaringe

O pior:

O tratamento seria inadequado e sóresultaria efetivo, por casualidade, se aespécie causadora da pneumonia tivesse umpadrão de susceptibilidade a antibióticossimilar à de K. pneumoniae.

Pseudomonas aeruginosasimilar à de K. pneumoniae.

A terapia eleita poderia ter sidoerrônea.

Pseudomonas aeruginosa

• A amostra deve ser material do sítio real deinfecção, devendo ser colhida com o mínimode contaminação dos tecidos, órgãos e

Considerações fundamentais na colheita de amostras.


de contaminação dos tecidos, órgãos esecreções adjacentes;

• Deve-se estabelecer o momento ótimo para acolheita de amostras, com o objetivo decontar com melhor possibilidade de isolarmicrorganismos causadores de enfermidades;

• Deve-se obter uma quantidade suficiente deamostra para realização das técnicas de

Enviar ao laboratório swab seco ou secreções escassas é uma prática inútil e de custo



Calcularam que o rendimento do isolamento

Swabs retais para isolar espécies de Shigella, o material

amostra para realização das técnicas decultivo solicitadas;

escassas é uma prática inútil e de custo considerável para o paciente;

• Devem ser utilizados dispositivos de colheita,recipientes de amostras e meios de culturaapropriados para assegurar isolamento ótimode microrganismos.;

rendimento do isolamento de microrganismos a partir

de culturas de sangue aumentava em cerca de 3% por mL de sangue colhido; (Mermel e Maki).

Com demasiada freqüência, são enviados ao laboratório 0,5 mL ou menos de material identificado como “escarro” ou “lavado

brônquico”;bactérias anaeróbicas

espécies de Shigella, o material colhido deve ser inoculado

diretamente na superfície de ágar Mac Conkey ou caldo

enriquecido para gram-negativos



• Sempre que possível, deve-se obter amostrasantes da administração de antibióticos;Etiqueta legível com nome, antes da administração de antibióticos;Etiqueta legível com nome, número de idenficacção,

origem, médico e a data/hora da colheita;

Garganta

Neisseria gonorrhoea

Amostrasgeniturinárias

Haemophilus influenzae

Neisseria meningitidis

Líquido cefalorraquidiano (LCR)• O recipiente da amostra deve ser rotulado de

forma correta;


Outros exemplos importantes.

O objetivo primário no transporte deamostras para diagnóstico consiste emmanter a amostra o mais próximo possívelde seu estado original, com deterioração

Transporte de Amostras

de seu estado original, com deterioraçãomínima, e minimizar os riscos para ostransportadores das amostras, utilizando-sedispositivos protetores do recipiente daamostra inseridos no interior de umrecipiente adequado.


Deve-se evitar:

Condições ambientais adversas

Frio

Calor extremo

Mudanças na pressão


Se for previsto:

Um atraso prolongado (acima de 4 dias porexemplo) antes da amostra ser processada;

É preferível congelar a amostra a-70ºC, podendo ser utilizado umcongelador a -20ºC, se o períodode estocagem for breve.


As amostras de escarro colhidas principalmentepara o isolamento:

Podem ser remetidas sem qualquer tratamentodesde que colhidas em recipientes de propilenoou polietileno esterilizados.micobactérias fungos


A maioria das amostras líquidas, em particularamostra de urina, deve ser transportada aolaboratório o quanto antes possível:

Contexto hospitalar

Recomenda-se um limitemáximo de 2 horas entrea colheita e a chegada daamostra ao laboratório.


O limite de tempo representa um problemaquando as amostras são colhidas emconsultórios particulares.

Podem ser utilizados

Amostras de urina

Podem ser utilizados recipientes contendo uma pequena quantidade de

ácido bórico, se o transporte rápido não for

possível.


Para a maioria das amostras pode ser utilizadoum meio de manutenção ou transporte,seguindo-se as instruções do fabricante.

Meio detransporte Stuart

Solução tampão, isenta denutrientes e fatores decrescimento, conserva aviabilidade sem permitir amultiplicação das bactériasdurante o transporte.


• Tioglicolato de sódio – tem função de agenteredutor para melhorar o isolamento debactérias anaeróbias;

• Ágar (pequena quantidade) – proporcionauma consistência semi-sólida que impede aoxigenação e o derrame durante otransporte;


Solução de borato de sódio

Tampão com sacarose, fosfato e glutamato


As amostras devem ser embaladas de modo asuportar golpes ou mudanças de pressão quepodem ocorrer durante a manipulação ecausar vazamento do conteúdo;

Um recipiente que vaza não apenas predispõea amostra a uma potencial contaminação, mastambém expõe os microrganismos ao pessoalque transporta ou recebe a amostra;


Técnica apropriada para embalar e rotularagentes etiológicos:

Recipiente primário com tampa à prova d’água

Recipiente secundário de preferência de metal

Embalagem para envio fabricada em cartão

ondulado, cartão grosso ou gomaespuma

Recepção de Amostras

jalecos

luvas

máscaras

Processamento de Amostras

• Ingresso de dados essenciais em um livro deregistros ou em um terminal de computador;

• Exame visual e determinação do cumprimento de todos os critérios para cumprimento de todos os critérios para

aceitação da amostra;

• Para certas amostras, o exame microscópicode montagens úmidas ou de esfregaçoscorados, para estabelecer um diagnósticopresuntivo;


USO DE CORANTES EM MICROBIOLOGIA:

É recomendável que os microbiologistasefetuem exames microscópicos diretos dasamostras enviadas para cultivo;amostras enviadas para cultivo;

Rápido diagnóstico presuntivo Guia para selecionar os meios

de cultura apropriados


Coloração de Gram

• Cristal violeta – serve como coloraçãoprimária, unindo-se à parede celularbacteriana após tratamento com umasolução de iodo fraca (mordente para asolução de iodo fraca (mordente para aligação do corante);

• Descorante (mistura etanol 95% e acetona) –as bactérias que retêm o corante aparecemazuladas se observadas ao microscópio esão denominadas gram-positivas;


Coloração de Gram

• Contracorante Safranina – certas bactériasperdem a coloração primária com cristalvioleta quando são tratadas com odescorante e captam a contracoloração comdescorante e captam a contracoloração comsafranina e aparecem em vermelho quandoobservadas ao microscópio, denominando-se gram-negativas;

A coloração de Gram pode ser utilizada paraefetuar identificações presuntivas.


Colorações de àlcool-ácido-resistência

Recobertas por um espesso material ceroso que resiste à coloração,

entretanto, uma vez entretanto, uma vez coradas, resistem à

descoloração mesmo por solventes orgânicos fortes,

como o álcool-ácido.

Fenômeno descoberto por Ziehl e Neelsen (1881).

micobactérias


OUTROS CORANTES:

Laranja de acridina

Azul de toluidina e Azul de Metileno

Coloração com Prata

Coloração com Wright-Giemsa

Ácido periódico de Schiff

Processamento dos Cultivos

Após recebimento de amostras para cultivo nolaboratório de microbiologia, devem sertomadas as seguintes decisões:

• Selecionar os meios de cultura primários• Selecionar os meios de cultura primáriosapropriados para o tipo de amostraparticular;

• Determinar a temperatura e aatmosfera de incubação paraisolar todos os microrganismospotencialmente significativos;

Processamento dos Cultivos

• Determinar qual dos microrganismosisolados em meios primários requer umamaior caracterização;

• Determinar se são necessárias provas desuscetibilidade a antibióticos, uma vezsuscetibilidade a antibióticos, uma vezconhecida a identidade do organismo;

Comum a todos é o reconhecimento dasdificuldades envolvidas na manutenção daqualidade dos serviços, em vista das políticas deredução de custos, cada vez mais rigorosas;

Seleção de Meios de Cultura Primários

Meios não-seletivos – são isentos de inibidorese permitem o crescimento de microrganismosencontrados freqüentemente em laboratóriosclínicos;clínicos;

Ágar com 5% de sangue de carneiro

Ágar com sangue de cavalo ou de ovelha

Haemophilus influenzae

Ágar com sangue humano

Gardnerella vaginalis


Pode-se tornar o ágar sangue seletivo mediantea adição de um ou mais antibióticos ou decertas substâncias químicas;

Ágar sangue

Colistina e o ácido nalidíxico

Inibe gram-negativos e favorece o crescimento de

gram-positivos

Ágar-KV

Canamicina e vancomicina

Bacilos gram-negativos anaeróbios (bacteroides)

Ágar McConkey Ágar EMB

Inibem gram-positivos


O caldo de enriquecimento é empregado paraisolar microrganismos patogênicos deamostras, como fezes, nas quais existe umaelevada concentração de microrganismoselevada concentração de microrganismoscomensais;

Salmonella e Shigella

Escherichia coli e outros comensais entéricos

Fase logaritmica

Fase de latência

Uma vez que a amostra tenha ultrapassado osvários critérios para rejeição e tenha sidoaceita para cultivo, porções apropriadas damesma devem ser transferidas aos vários

Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas

mesma devem ser transferidas aos váriosmeios de cultura descritos no item anterior.Essa atividade também é usualmente realizadaem uma parte separada de outras áreas dolaboratório, conhecida como área de“semeadura”;jalecos

luvas

máscaras


O equipamento necessário para a inoculaçãoprimária de amostras é relativamente simples:


Espalhamento nos quatro quadrantes

UFC


O meio nos tubos pode ser líquido, semi-sólido(0,3 a 0,5% de ágar) ou sólido. O ágar semi-sólido é adequado para as provas demotilidade;motilidade;


Os microrganismos diferem quanto à temperatura ótima de incubação. Porém, a maioria dos microrganismos cresce a 35ºC;

assim, se o laboratório dispõe apenas de uma assim, se o laboratório dispõe apenas de uma estufa, esta deve estar ajustada para 35ºC;

O crescimento da maior parte dos microrganismos é potencializado por uma

atmosfera de 5% a 10% de CO2;


Mais importante que o modo de incubação é a prevenção de amplas flutuações na

temperatura. Deve-se cuidar para que os tubos e placas fiquem protegidos de correntes de ar-e placas fiquem protegidos de correntes de ar-

condicionado ou de fluxos de calor;

O controle da umidade no interior da estufa também é importante. A maioria dos

microrganismos tem crescimento máximo quando a umidade é de 70% ou superior;

Interpretação dos Cultivos

A identificação dos cultivos primários após 24a 48 horas de incubação requer umaconsiderável habilidade;

Essa avaliação se faz:

O microbiologista deve avaliar o crescimentodas colônias e decidir se são necessáriosprocedimentos adicionais;


• Anotando as características e o númerorelativo de cada tipo de colônia isolada emmeios de ágar;

• Determinando a pureza, reação à coloração• Determinando a pureza, reação à coloraçãode Gram e morfologia das bactérias em cadatipo de colônia;;

• Verificando mudanças no meio que circunda as colônias, o que reflete atividades metabólicas específicas de bactérias

isoladas;


Características macroscópicas das colônias

OBRIGADOOBRIGADO

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