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Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental Mestrado em Engenharia Ambiental OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO COM PARTIÇÃO EM BAIXA TEMPERATURA DE MICROCONTAMINANTES ORGÂNICOS EM AMOSTRAS DE ESGOTO E ANÁLISE POR CG-EM Bárbara Diniz Lima Ouro Preto, MG 2013
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Universidade Federal de Ouro Preto
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO
COM PARTIÇÃO EM BAIXA TEMPERATURA DE
MICROCONTAMINANTES ORGÂNICOS EM AMOSTRAS DE
ESGOTO E ANÁLISE POR CG-EM
Bárbara Diniz Lima
Ouro Preto, MG
2013
Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
Bárbara Diniz Lima
OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO
COM PARTIÇÃO EM BAIXA TEMPERATURA DE
MICROCONTAMINANTES ORGÂNICOS EM AMOSTRAS DE
ESGOTO E ANÁLISE POR CG-EM
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Ambiental,
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
dos requisitos necessários para a obtenção do
título de Mestre em Engenharia Ambiental.
Área de Concentração: Meio Ambiente
Orientador: Prof. Dr. Robson José de Cássia
Franco Afonso
Ouro Preto, MG
Abril de 2013
Catalogação: [email protected]
L732o Lima, Bárbara Diniz. Otimização e validação de extração líquido-líquido com partição em
baixa temperatura de microcontaminantes orgânicos em amostras de esgoto e análise por CG-EM [manuscrito] / Bárbara Diniz Lima. – 2013.
104 f. : il. color.; tabs. Orientador: Prof. Dr. Robson José de Cássia Franco Afonso. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto
de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas e Pós-Graduação em Recursos Hídricos. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental.
Área de concentração: Meio Ambiente.
1. Microcontaminantes orgânicos - Teses. 2. Esgotos - Teses. 3. Extração (Química) - Teses. 4. Derivatização - Teses. 5. Cromatografia gasosa - Teses. 6. Espectrometria de massa - Teses. I. Afonso, Robson José de Cássia Franco. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.
CDU: 628.35:66.061.35
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por estar sempre me guiando e me propiciando
graças. Aos meus pais, Vera e José Geraldo e meu irmãos Gustavo e Caio, por terem abraçado
esse sonho comigo e me auxiliado em todos os momentos sendo sempre o meu porto seguro.
Amo vocês!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Robson José de Cássia Franco Afonso, pela
oportunidade, profissionalismo e por ser um verdadeiro mestre. Foi uma honra trabalhar com
você e poder usufruir dos seus ensinamentos e experiências.
Aos professores da pós-graduação pela transmissão de conhecimentos e ao Prof. Dr.
Maurício Xavier Coutrim pela disposição em ajudar sempre que preciso e pela convivência.
Aos amigos do laboratório de Caracterização Molecular e Espectrometria de Massas e
dos laboratórios parceiros: Amanda, Keila, Regiane, Júlia, Bruno, Diego, Marina, André,
Cíntia, Francine, Luide, Ramon, Tereza, Cláudia, Daniela, Oscar, Rafaela, Débora, Jéssica e
Carlúcio, pelo companheirismo, ajuda e por tornarem os dias de trabalho mais agradáveis.
À Ananda Lima Sanson por ter me ajudado em todas as etapas deste trabalho, pela
paciência, por ter sido uma “co-orientadora”. Além de ter se tornado uma amiga querida.
Muito obrigada!
À Taynara, Wanda e Jéssica por estarem ao meu lado em todos os momentos de
alegria e tristeza. Amigas queridas, meus maiores presentes de Ouro Preto. Amo vocês!
À amada República Joselitas por ter sido meu lar nessa caminhada e a todas as “Sem
Noção”. Foram ensinamentos diários, momentos inigualáveis e amizades para a vida toda.
Obrigada por terem sido minha família em Ouro Preto!
Aos amigos de Viçosa e Sete Lagoas por estarem sempre na torcida mesmo de longe.
À Fapemig pela concessão da bolsa de estudos.
Enfim, agradeço a todos que fizeram parte desse capítulo da minha história.
“Tudo posso Naquele que me fortalece”
Filipenses 4:13
RESUMO
Os microcontaminantes emergentes são uma classe de contaminantes que vêm
chamando a atenção da sociedade científica quanto às consequências que estes podem trazer
para o meio ambiente mesmo em concentrações muito baixas (na faixa de ng/L e µg/L). São
várias as substâncias assim classificadas sendo: fármacos e produtos de higiene pessoal,
medicamentos veterinários, perturbadores endócrinos e nanomateriais. A rota de
contaminação ambiental passa, na maioria das vezes, pela ingestão, excreção e uso tópico por
humanos e animais destas substâncias, que atingem os esgotos e cursos d’água. As estações
de tratamento de esgotos (ETEs) podem não ser eficazes no tratamento e remoção destes
compostos. O presente trabalho apresenta a otimização do método de extração líquido-líquido
com partição em baixa temperatura (ELL-PBT) de microcontaminantes dentre eles fármacos
(ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, paracetamol, genfibrozila e diclofenaco), hormônios
naturais e sintéticos (estrona, estradiol, etinilestradiol e estriol) e fenóis (bisfenol A, 4-
nonilfenol e 4-octilfenol) em amostras de esgoto doméstico. Foram avaliadas condições de
extração como volume de solvente extrator, força iônica e pH da amostra através de um
planejamento fatorial completo com ponto central. Com essa abordagem foi possível
determinar como melhores condições para maior recuperação da maioria dos analitos o ajuste
do pH da amostra para 2, 4 mL de amostra de esgoto, adicionar a ela 3 porções de 3 mL de
acetonitrila como solvente extrator e resfriamento por 3 horas para cada extração. Os extratos
foram secos em N2 gasoso e submetidos a reação de derivatização com o reagente
BSTFA+1% TCMS seguido de análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massas (CG/EM). O método foi validado pelos parâmetros: linearidade com faixa de trabalho
de 0,1 a 200 µg/L (R2 > 0,98); limites de detecção e quantificação do método (inferiores a
0,21 e 0,96 µg/L, respectivamente); precisão com desvios padrão relativos de 0,578 a 8,00%;
exatidão e efeito matriz foram avaliados a partir da amostra e spike de extratos. Amostras
reais de esgoto bruto e efluentes UASB e FBP foram submetidas ao método proposto onde
foram encontrados ácido acetil salicílico, paracetamol, bisfenol A, estrona e estriol.
Palavras-chave: Microcontaminantes emergentes, extração líquido-líquido com partição em
baixa temperatura (ELL-PBT), cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
(CG-EM)
ABSTRACT
Emergent microcontaminants are substances that have been drawing the attention of the
scientific society due to the consequences they may bring to the environment, even in very
low concentrations (in the range of ng/L to µg/L). There are several substances classified as
emerging organic pollutants such as: drugs and personal care products, veterinary products,
endocrine disruptors and nanomaterials. The environmental contamination route for these
substances are, in most cases, due to the ingestion, excretion, topic use on humans and
animals, leading to sewage and waterways. Sewage treatment plants (STPs) may not be
effective in the treatment and removal of these compounds. This work presents an analytical
optimized method using liquid-liquid extraction with low temperature partition (LLE-LTP)
for emerging microcontaminants in domestic sewage samples, among them drugs (aspirin,
ibuprofen, acetaminophen, diclofenac and gemfibrozil), natural and synthetic hormones
(estrone, estradiol, ethinylestradiol and estriol) and phenols (bisphenol A, 4-octylphenol and
4-nonylphenol). The extraction conditions were assessed varying extractor solvents, the
solvent volumes, ionic strength and sample pH, through a center point complete factorial
experimental design. With this approach it was possible to determine the conditions for the
best extraction recoveries for the majority of analytes. The optimized conditions where:
sample pH = 2, 4 ml sewage samples, multistage 3 x 3 mL of acetonitrile as solvent extractor,
3 hours freezing for each extraction. The extracts were dried under nitrogen subjected to
derivatization reaction with 70% BSTFA + 1% TCMS plus 30% pyridine, followed by gas
chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS) analysis. The method was validated
by the parameters: linearity, with working range from 0,1 to 200 µg/L (R2 > 0,98); method
detection and quantification limits (0,21 and 0,96 µg/L, respectively); precision relative
standard deviations in the range of 0,84 to 18,17%; accuracy and matrix effect was also
evaluated through sample and extract spikes. Real samples of raw sewage and effluents from
UASB and FBP treatment were analyzed by the proposed method, where acetyl salicylic acid,
acetaminophen, bisphenol A, estrone and estriol were found.
Keywords: emerging microcontaminantes, liquid-liquid extraction with low temperature
partition (LLE-LTP), gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS)
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 16
2.1 Microcontaminantes Emergentes .................................................................................... 16
2.1.1 Fármacos ...................................................................................................................... 17
2.1.1.1 Anti-inflamatórios ................................................................................................. 18
2.1.1.2 Reguladores Lipídicos ........................................................................................... 19
2.1.1.3 Estimulantes .......................................................................................................... 20
2.1.2 Desreguladores Endócrinos ......................................................................................... 21
4-Nonilfenol (4NP) .................................................................................................... 26
4-Octilfenol (4OP) ..................................................................................................... 26
Bisfenol A (BPA) ........................................................................................................ 26
Estrona (E1) ............................................................................................................... 27
Estradiol (E2) ............................................................................................................ 27
Etinilestradiol (EE2) .................................................................................................. 28
Estriol (E3) ................................................................................................................ 30
2.2 Esgoto ............................................................................................................................. 30
2.3 Métodos Analíticos para Determinação de Microcontaminantes ................................... 31
2.3.2 Espectrometria de Massas (EM) .................................................................................. 40
2.3.3 Métodos de preparação de amostras ............................................................................ 42
2.3.3.1 Extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura (ELL-PBT) .......... 43
2.3.4 Derivatização ............................................................................................................... 45
2.3.4.1 Reação de sililação ............................................................................................... 46
2.4 Validação ........................................................................................................................ 47
2.5 Planejamento Experimental e Tratamento de Dados ...................................................... 51
3 OBJETIVOS ................................................................................................. 53
3.1 Objetivos específicos ...................................................................................................... 53
4 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 54
4.1 Reagentes e vidrarias ...................................................................................................... 54
4.2 Filtração e armazenamento das amostras ........................................................................ 55
4.3 Preparo das soluções padrão ........................................................................................... 55
4.3- Múltipla extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura (ELL-PBT) ..... 59
4.4- Derivatização ................................................................................................................. 60
4.5- Condições Cromatográficas e de Detecção ................................................................... 61
4.5.1 Relação Massa / Carga dos microcontaminantes .................................................... 63
4.6 Validação do método de quantificação dos microcontaminantes ................................... 65
4.7 Análise de amostras reais ................................................................................................ 67
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 69
5.1 Otimização do método de extração ................................................................................. 69
5.2 Validação do método ...................................................................................................... 74
5.2.1 Seletividade .............................................................................................................. 74
5.2.2 Curva analítica e ajuste ........................................................................................... 77
5.2.3 Limite de detecção e de quantificação ..................................................................... 82
5.2.4 Precisão .................................................................................................................... 83
5.2.5 Exatidão e precisão do método ................................................................................ 85
5.2.6 Efeito Matriz ............................................................................................................. 87
5.3 Análise de amostras reais ................................................................................................ 88
6 CONCLUSÕES ............................................................................................ 91
7 TRABALHOS FUTUROS ........................................................................... 92
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 93
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1- Esquema das possíveis rotas de entrada dos microcontaminantes no meio
ambiente. Fonte: Adaptado de KUMAR et al (2012) .............................................................. 17
Figura 2.2- Ácido Acetilsalicílico ........................................................................................... 18
Figura 2.3- Ibuprofeno ............................................................................................................ 18
Figura 2.4- Naproxeno ............................................................................................................ 18
Figura 2.5- Diclofenaco Sódico ............................................................................................... 18
Figura 2.6- Acetaminofeno ...................................................................................................... 19
Figura 2.7- Genfibrozila .......................................................................................................... 20
Figura 2.8- Cafeína .................................................................................................................. 20
Figura 2.9- Disfunções endócrinas: a) resposta natural, b) efeito agonista, c) efeito
antagonista. Fonte: (GHISELLI e JARDIM, 2007). ................................................................ 22
Figura 2.10- Representação esquemática da principal via de entrada de disruptores
endócrinos hormonais em sistemas aquáticos. Adaptado de Filho et al., 2006 ....................... 24
Figura 2.11- Estrutura química do 4-nonilfenol ...................................................................... 26
Figura 2.12- Estrutura química do 4-octilfenol ....................................................................... 26
Figura 2.13- Estrutura química do bisfenol A ......................................................................... 27
Figura 2.14- Estrutura química da estrona .............................................................................. 27
Figura 2.15- Estrutura química do estradiol ............................................................................ 28
Figura 2.16- Estrutura química do etinilestradiol .................................................................... 29
Figura 2.17- Estrutura química do estriol ................................................................................ 30
Figura 2.18- Diagrama de um espectrômetro de massas ......................................................... 41
Figura 2.19- Mecanismo genérico da reação de sililação, onde X varia de acordo com os
diferentes derivatizantes. Fonte: (BECKER, 2012) ................................................................. 47
Figura 4.1- Esquema da extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura .......... 60
Figura 4.2 - Diagrama da seringa para reação de derivatização on line .................................. 61
Figura 4.3- GCMS-QP2010 plus (Shimadzu®) ....................................................................... 62
Figura 4.4- Esquema dos pontos de coleta .............................................................................. 68
Figura 5.1- Procedimento de preparação de amostra .............................................................. 74
Figura 5.2- Cromatograma e espectro de massa dos íons monitorados do ibuprofeno ........... 75
Figura 5.3- Cromatograma e espectro de massa dos íons monitorados do 4-octilfenol .......... 76
Figura 5.4- Cromatograma e espectro de massa dos íons monitorados da estrona ................. 77
Figura 5.5- Curva analítica para o ácido acetil salicílico (0,1 a 200 µg/L) ............................. 79
Figura 5.6- Curva analítica para o ibuprofeno (2,5 a 175 µg/L) ............................................. 79
Figura 5.7- Curva analítica para o ácido paracetamol (2,5 a 200 µg/L) .................................. 79
Figura 5.8- Curva analítica para o 4-octilfenol (2,5 a 200 µg/L) ............................................ 79
Figura 5.9- Curva analítica para o 4-nonilfenol (2,5 a 200 µg/L) ........................................... 80
Figura 5.10- Curva analítica para a genfibrozila (2,5 a 200 µg/L) .......................................... 80
Figura 5.11- Curva analítica para o bisfenol A (0,1 a 200 µg/L) ............................................ 80
Figura 5.12- Curva analítica para o diclofenaco (2,5 a 200 µg/L) .......................................... 80
Figura 5.13- Curva analítica para a estrona (0,1 a 200 µg/L) ................................................. 81
Figura 5.14- Curva analítica para o estradiol (1 a 200 µg/L) .................................................. 81
Figura 5.15- Curva analítica para o etinilestradiol (0,1 a 175 µg/L) ....................................... 81
Figura 5.16- Curva analítica para o estriol (2,5 a 20 µg/L) ..................................................... 81
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1- Compostos desreguladores endócrinos, suas fontes e efeitos estudados em
laboratório. ................................................................................................................................ 23
Tabela 2.2- Substâncias químicas classificadas como DE ....................................................... 25
Tabela 2.3- Dados de monitoramento de microcontaminantes em amostras ambientais ......... 32
Tabela 4.1- Informações e características físico-químicas dos microcontaminantes em estudo
.................................................................................................................................................. 56
Tabela 4.2- Planejamento fatorial 23 com ponto central com os níveis codificados e
decodificados. ........................................................................................................................... 59
Tabela 4.3- Condições da reação de derivatização ................................................................... 61
Tabela 4.4- Parâmetros e valores utilizados na metodologia de determinação de
microcontaminantes por CG-EM.............................................................................................. 63
Tabela 4.5- Tempos de retenção e relação m/z dos analitos derivatizados .............................. 64
Tabela 5.1- Porcentagem de recuperação estimada pela razão das áreas para os tempos de 1, 3
e 12 horas de resfriamento. ....................................................................................................... 69
Tabela 5.2- Valores dos efeitos e do parâmetro p (α = 0,05) para cada variável estudada no
planejamento fatorial completo 23 com quadruplicata no ponto central. Os valores em
destaque são os que se mostraram significativos de acordo com o valor de p (p < 0,05). ....... 70
Tabela 5.3- Porcentagem de extração dos analitos em cada ensaio do planejamento fatorial
completo 23. .............................................................................................................................. 73
Tabela 5.4- Faixa de trabalho de cada analito, média da razão da área do microcontaminante
pela área do padrão interno de 3 replicatas de injeção e coeficiente de variação dessa média 78
Tabela 5.5- Limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) do equipamento CG-
EM. ........................................................................................................................................... 82
Tabela 5.6- Limites de detecção (LDM) e limites de quantificação (LQM) do método. ......... 83
Tabela 5.7- Valores do coeficiente de variação de cinco replicatas em três níveis para cada
microcontaminante ................................................................................................................... 84
Tabela 5.8- Índice de recuperação da ELL-PBT para três níveis de concentração .................. 85
Tabela 5.9- Efeito de matriz para cada analito em três níveis de concentração ....................... 87
Tabela 5.10- Concentrações dos analitos encontrados em amostras de esgoto bruto e efluentes
UASB e FBP ............................................................................................................................. 89
LISTA DE NOTAÇÕES
4-NP: 4-nonilfenol
4-OP: 4-octilfenol
AAS: Ácido acetilsalicílico
AINH: Anti-inflamatórios não
hormonais
APCI: Atmospheric pressure
chemical ionization
BPA: Bisfenol-A
BSTFA: N,O-bis (trimetilsilil)
trifluoroacetamida
CAF: Cafeína
CAS: Chemical Abstracts Service
CePTS: Centro de Pesquisa e
Treinamento em Saneamento
CG: Cromatografia gasosa
CLAE: Cromatografia líquida de
alta eficiência
CV: Coeficiente de variação
DCF: Diclofenaco
DE: Desreguladores endócrinos
E1: Estrona
E2: Estradiol
EE2: Etinilestradiol
E3: Estriol
EFS: Extração em fase sólida
ELL: Extração líquido-líquido
EM: Espectrometria de massas
EPA: Environmental Protection
Agency
ESI: Electrospray Ionization
ETE: Estação de tratamento de
esgoto
FBP: Filtro biológico percolado
GEN: Genfibrozila
IBU: Ibuprofeno
IE: Ionização por impacto de
elétrons
IUPAC: International Union of
Pure and Applied Chemistry
LD: Limite de detecção
LQ: Limite de quantificação
MEFS: Microextração em fase
sólida
MM: Massa molecular
NPX: Naproxeno
PI: Padrão interno
SCAN: Scanning íon
SIM: Selected ion monitoring
PCT: Paracetamol
Kow: Coeficiente de partição
octanol/água
PE: Ponto de ebulição
POP: Poluentes Orgânicos
Persistentes
PPCP: Produtos de Higiene Pessoal
e Produtos Farmacêuticos
TCMS: Trimetilclorosilano
UASB: Upflow anaerobic sludge
blanket
UE: União Europeia
UV: Ultra violeta
14
1 Introdução
Atualmente, um dos tópicos mais relevantes na química ambiental é a qualidade das
águas. A preocupação com micropoluentes (poluentes que estão presentes no meio ambiente
em concentrações da ordem de μg/L e ng/L) tem aumentado expressivamente nos últimos
anos. Fármacos, desreguladores endócrinos e poluentes orgânicos persistentes (POPs) são
classes de substâncias muito investigadas devido, principalmente, aos seus possíveis efeitos
no meio ambiente. Uma grande preocupação relacionada a essas classes de substâncias é que
podem produzir efeitos adversos aos organismos expostos em concentrações muito baixas
(BILA e DEZOTTI, 2007). Incluem não só as substâncias originais, mas também seus
subprodutos ou metabólitos, ou seja, produtos da degradação química e biológica dos
compostos originais. Os microcontaminantes representam uma mudança no conceito
tradicional sobre contaminação ambiental, pois muitos são produzidos industrialmente e estão
dispersos no ambiente pelo uso doméstico, comercial e industrial.
A classe de Produtos de Higiene Pessoal e Produtos Farmacêuticos (PPCPs) é a mais
diversa categoria de substâncias emergentes. Nesta classe de microcontaminantes, se
encontram as drogas de prescrição terapêutica, medicamentos veterinários, fragrâncias,
aditivos de cosméticos, protetores solares, agentes de diagnóstico, nutracêuticos (ex.
vitaminas) e drogas ilícitas (anfetaminas, cocaína, etc.). Muitos destes compostos são solúveis
em água e são expostos aos compartimentos ambientais através de águas residuárias
(industriais e municipais), fossas sépticas, drenagem do lodo de esgotos, estrume de animais,
chorume e lixiviado de aterros sanitários. A rota de contaminação passa, na maioria das vezes,
pela ingestão e uso tópico por humanos e animais, ou pela exposição involuntária nas águas e
nos alimentos. Devido às propriedades recalcitrantes e antibióticas destes compostos, as
estações de tratamento de esgotos (ETEs) podem não ser eficazes no seu tratamento e
remoção (KÜMMERER, 2010).
Os compostos classificados como desreguladores endócrinos são produtos químicos
hormonalmente ativos capazes de interferir no sistema endócrino de animais (KUMAR et al.,
2012). Além dos efeitos no desenvolvimento e na reprodução, há também uma crescente
preocupação de que os distúrbios metabólicos na biota podem estar ligados com os
desreguladores endócrinos. A taxa de obesidade global tem aumentado drasticamente ao
longo das últimas três décadas em adultos, crianças e adolescentes, especialmente em países
desenvolvidos. A obesidade é frequentemente associada a distúrbios metabólicos (incluindo
15
diabetes tipo 2, síndrome metabólica, complicações pulmonares e cardiovasculares, além de
doenças do fígado), bem como outras questões de saúde, como problemas psicológicos e ou
sociais, problemas reprodutivos e algumas formas de câncer (HATCH et al., 2010; SAAL et
al., 2012).
Pesquisadores do mundo inteiro vêm se empenhando no desenvolvimento de métodos
analíticos suficientemente sensíveis, com limites de detecção na ordem de μg/L e ng/L para
detecção desses compostos em diversas matrizes ambientais. A preparação e concentração de
dos analitos das amostras são extremamente importantes quando se trata de análise de traços.
Dentre as técnicas mais utilizadas a extração em fase sólida (EFS), microextração em fase
sólida (MEFS) têm se destacado (BUENO et al., 2012; SHIN e OH, 2012; GOMES et al.,
2011). Os equipamentos utilizados nestas determinações, em geral, são bastante sofisticados e
apresentam elevada detectabilidade, enquanto que os procedimentos de extração e
concentração dos produtos farmacêuticos e de higiene pessoal e dos possíveis interferentes
endócrinos são bastante minuciosos. Dentre os métodos de análise, a cromatografia gasosa e
líquida acoplada a espectrometria de massas têm ganhado destaque.
O presente trabalho propõe o desenvolvimento de um método de extração simples,
eficaz e de baixo custo para análise de vários compostos presentes em amostras de esgoto. A
análise simultânea de microcontaminantes em amostras de esgoto doméstico foi realizada por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas.
16
2 Revisão Bibliográfica
2.1 Microcontaminantes Emergentes
Os microcontaminantes emergentes são uma classe de contaminantes que vêm
chamando a atenção da sociedade científica quanto às consequências que estes podem trazer
para o meio ambiente aquático mesmo em concentrações muito baixas (na faixa de ng/L e
µg/L). De acordo com a EPA, 2008 as substâncias classificadas como microcontaminantes
são:
Poluentes orgânicos persistentes (POP) tais como éteres difenílicos polibromados
utilizados em retardantes de chama, plastificantes, assim como ácidos orgânicos
perfluorados;
Fármacos e produtos de higiene pessoal incluindo os fármacos de uso humano com
prescrição ou venda livre, bactericidas, protetores solares e fragrâncias;
Medicamentos veterinários, como os antibióticos, antifúngicos e hormônios;
Perturbadores endócrinos que inclui hormônios naturais e sintéticos, pesticidas,
alquilfenois, etc; e
Nanomateriais: nanotubos de carbono, dióxido de titânio particulado em nano
escala, etc.
A figura 2.1 ilustra as várias rotas de entrada dos microcontaminantes no meio
ambiente.
17
Figura 2.1- Esquema das possíveis rotas de entrada dos microcontaminantes no meio
ambiente. Fonte: Adaptado de KUMAR et al (2012)
Dentre os microcontaminantes citados, uma revisão bibliográfica acerca da ocorrência e
procedimentos analíticos para alguns fármacos e perturbadores endócrinos avaliados neste
trabalho é apresentada.
2.1.1 Fármacos
A indústria farmacêutica cresce a cada ano e está presente no cotidiano da população
mundial. Com isso, estes microcontaminantes vêm sendo cada vez mais detectados no meio
ambiente. No entanto, pouco se sabe sobre seu impacto ambiental. A ocorrência de
medicamentos humanos e veterinários no meio ambiente tem sido um assunto de
preocupação, pois muitos destes contaminantes emergentes têm demonstrado persistência no
solo e na água (CELIZ et al., 2009).
Os fármacos chegam ao meio ambiente via excreção, parte em sua forma ativa e parte
em forma de metabólitos, além de muitas vezes serem descartados de maneira inadequada no
vaso sanitário (KUMMERER, 2010). Efluentes de indústrias farmacêuticas e efluentes rurais
também contribuem, e muito, para a descarga desses contaminantes no meio ambiente. A
baixa volatilidade dos produtos farmacêuticos indica que a distribuição no ambiente ocorre,
principalmente, pelo transporte aquático e pelos alimentos na dispersão de cadeia (FENT,
2006).
Estudos recentes têm demonstrado que, apesar das concentrações relativamente baixas
de medicamentos no meio ambiente, há a preocupação quanto aos efeitos adversos causados
no longo prazo, em humanos e animais expostos a esses compostos. Assim, vários
18
pesquisadores estão investigando as condições operacionais na eficiência de remoção de
produtos farmacêuticos em águas residuais de modo a minimizar a sua liberação para os
sistemas terrestres e aquáticos. Além disso, as avaliações de riscos e monitoramento
ambiental estão sendo realizados a fim de obter informações suficientes que permitam o
monitoramento e regulação de produtos farmacêuticos (CELIZ et al., 2009).
2.1.1.1 Anti-inflamatórios
Os anti-inflamatórios não hormonais (AINH) fazem parte de um grupo de
medicamentos dos mais comercializados em todo o mundo e estão entre os fármacos mais
encontrados no meio ambiente (SANTOS et al., 2010).
Os AINHs constituem um grupo heterogêneo de compostos de um ou mais anéis
aromáticos ligados a um grupamento ácido funcional. São ácidos orgânicos fracos que atuam,
principalmente, nos tecidos inflamados e ligam-se, significativamente, à albumina plasmática
(CHAHADE et al., 2008). As figuras 2.2 a 2.5 representam as estruturas químicas dos AINHs
estudados neste trabalho.
Figura 2.2- Ácido Acetilsalicílico
O
O
OCH3
OH
Figura 2.3- Ibuprofeno
O
CH3
CH3
OH
CH3
Figura 2.4- Naproxeno
O
OH
OCH3
Figura 2.5- Diclofenaco Sódico
NaO
NHCl
Cl
O
19
O acetaminofeno (N-acetil-p-aminofenol, 4-acetamidofenol, paracetamol),
apresentado na figura 2.6, é um composto p-aminofenólico que apresenta atividades
analgésica e antipirética. Este fármaco não possui atividade anti-inflamatória, mesmo assim é,
provavelmente, o antipirético-analgésico de segunda escolha, principalmente aos pacientes
alérgicos ao ácido acetilsalicílico ou que sofram de úlceras pépticas (BECKER, 2012).
Figura 2.6- Acetaminofeno
O
OHNH
CH3
Gómez e colaboradores (2007) monitoraram uma estação de tratamento de esgoto
(ETE) no sul da Espanha por um ano para análise simultânea de 14 contaminantes orgânicos.
Dentre os estudados, encontraram ibuprofeno, acetaminofeno e diclofenaco nas concentrações
médias de 84, 134 e 1,5 µ/L respectivamente, antes do tratamento. No efluente encontraram
uma média de 7,1, 0,22 e 0,9 µ/L. As análises foram feitas por cromatografia gasosa acoplada
a espctrometria de massa (CG-EM).
Também na Espanha, Bueno e colaboradores (2012) monitoraram 100 compostos
orgânicos durante dois anos em cinco ETEs municipais. Dentre os compostos que
representaram a maior parte da poluição do efluente, não apenas pelas concentrações, mas
também pelo número de vezes em que foram detectados, estão os AINHs ibuprofeno,
diclofenaco, naproxeno; o regulador lipídico genfibrozila e o estimulante cafeína.
2.1.1.2 Reguladores Lipídicos
Reguladores lipídicos são medicamentos que reduzem o nível de colesterol total e de
triglicérides e utilizados para o tratamento de doenças coronarianas e infarto do miocárdio.
A figura 2.7 ilustra a estrutura química do regulador lipídico genfibrozila, que é um
ácido fenoxipentanóico não-halogenado, estudado neste trabalho.
20
Figura 2.7- Genfibrozila
OCH3
CH3
CH3
CH3
O
OH
Bendz (2005) e colaboradores monitoraram vários compostos farmacêuticos ativos em
uma ETE na Suécia. Dentre esse compostos a genfibrozila foi encontrada na concentração de
0,71 µg/L e sendo obtida uma eficiência de remoção de 75% da planta em questão deste
composto.
2.1.1.3 Estimulantes
Cafeína
A cafeína é um alcalóide, identificado como 1,3,7-trimetilxantina, cuja estrutura
contém um esqueleto de purina (Figura 2.8). Este alcaloide é encontrado em grande
quantidade nas sementes de café e nas folhas de chá verde (Camilla sinensis). Também pode
ser achado em outros produtos vegetais, particularmente no cacau (Theobroma cocoa), no
guaraná (Paullinia cupana) e na erva-mate (Ilex paraguayensis). Embora uma parcela
pequena da população consuma cafeína na forma de fármacos, como, por exemplo,
antigripais, grande parte deste alcalóide é ingerida na forma de bebidas. Uma xícara de café
pode conter em média cerca de 80 mg de cafeína, enquanto uma lata de coca-cola em torno de
34-41 mg (MARIA e MOREIRA, 2007).
Figura 2.8- Cafeína
CH3
CH3
CH3
O
O N
NN
N
O consumo de quantidades moderadas de cafeína aumenta a disponibilidade de
energia, aumenta o gasto energético diário, diminui a fadiga, diminui a sensação de esforço
associado à atividade física, melhora o desempenho físico, aumenta a performance motora,
melhora o desempenho cognitivo, diminui a fadiga mental, aumenta a precisão de reações,
21
aumenta a capacidade de concentração, aumenta a memória de curto prazo, aumenta a
capacidade de resolver problemas que exigem raciocínio, aumenta a capacidade de tomar
decisões corretas e aumenta a capacidade de funcionamento cognitivo e de coordenação
neuromuscular (GLADE, 2010).
A cafeína é considerada por muitos autores um marcador químico de contaminação
antropogênica (DANESHVAR et al., 2012; BUERGE et al., 2003). No entanto, tal função é
limitada a áreas em que não há relevantes fontes naturais e industriais de cafeína (BUERGE et
al., 2006).
2.1.2 Desreguladores Endócrinos
Há evidências de que uma ampla gama de produtos químicos presentes no meio
ambiente são capazes de interferir no sistema endócrino de animais selvagens, incluindo aves,
peixes, mamíferos, répteis e moluscos. Estes produtos químicos hormonalmente ativos,
conhecidos como desreguladores endócrinos (DE), podem atingir os sistemas ribeirinhos
através de uma variedade de entradas, incluindo fluxos de resíduos urbanos, rurais, industriais
e de atividades de agricultura intensiva (KUMAR et al., 2012).
Alguns efeitos citados na literatura, tais como diminuição na eclosão de ovos de
pássaros, peixes e tartarugas; feminização de peixes machos; problemas no sistema
reprodutivo em peixes, répteis, pássaros e mamíferos e, alterações no sistema imunológico de
mamíferos marinhos, têm sido associadas à exposição de espécies de animais aos
desreguladores endócrinos. Em alguns casos esses efeitos podem conduzir ao declínio da
população. Em seres humanos esses efeitos incluem a redução da quantidade de esperma, o
aumento da incidência de câncer de mama, de testículo e de próstata e a endometriose (BILA
e DEZOTTI, 2007).
Segundo a União Europeia (UE), os desreguladores endócrinos podem: danificar
diretamente um órgão endócrino; alterar diretamente a função de um órgão endócrino;
interagir com um receptor de hormônios ou, alterar o metabolismo de um hormônio em um
órgão endócrino. A USEPA (United States Environmental Protection Agency) propõe uma
definição mais detalhada que reflete a diversidade de mecanismos envolvidos na perturbação
do sistema endócrino. De acordo com a agência, um interferente endócrino é um agente
exógeno que interfere na síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de
hormônios naturais que são responsáveis pela manutenção da homeostase, reprodução,
desenvolvimento e/ou comportamento (U.S. EPA, 1997).
22
Os estrogênios ambientais podem causar respostas antagônicas e agônicas, por
mecanismos de ação via receptores hormonais. A atividade agonista é a capacidade de uma
substância acoplar-se ao receptor de hormônios esteróides e elucidar uma resposta. Em
contrapartida, a atividade antagonista é a habilidade de uma substância acoplar-se ao receptor
de estrogênio e bloquear a ação do ligante natural e, assim, sua resposta não será elucidada
(BILA e DEZOTTI, 2007).
Figura 2.9- Disfunções endócrinas: a) resposta natural, b) efeito agonista, c) efeito
antagonista. Fonte: (GHISELLI e JARDIM, 2007).
A tabela 2.1 mostra alguns efeitos causados por vários compostos classificados como
desreguladores endócrinos.
Uma grande parte da evidência dos possíveis efeitos dessas substâncias em seres
humanos foi obtida a partir da experiência envolvendo mulheres grávidas que tomaram o
estrogênio sintético dietilestilbestrol, prescrito para evitar o aborto espontâneo e promover o
crescimento do feto, no período entre 1948 e 1971. Muitas filhas dessas mulheres são hoje
estéreis, enquanto uma minoria tem desenvolvido um tipo raro de câncer vaginal. Os homens
adultos mostram uma maior incidência de anormalidade em seus órgãos sexuais, apresentam
contagem média de espermatozoides diminuída e podem sofrer um risco maior de
desenvolver câncer nos testículos. (GHISELLI, 2006).
23
Tab
ela 2.1
- Com
posto
s desreg
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TG
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itelogen
ina
24
Os hormônios excretados através da urina e fezes seguem para a rede coletora,
adentrando depois ao ambiente. O lançamento de efluentes in natura ou mesmo processados
são as principais vias de contaminação do ambiente aquático, seja pelo déficit de
infraestrutura em saneamento, seja pela ineficiência (tecnológica e/ou operacional) das
estações de tratamento. Apesar de possuírem meia-vida relativamente curta quando
comparados a outros compostos orgânicos (como alguns pesticidas), os estrógenos naturais
são continuamente introduzidos no ambiente o que lhes concede um caráter de persistência.
Estudos relatam que até 40% das doses ministradas de estrógenos sintéticos podem ser
disponibilizadas para o ambiente. A Figura 2.10 exemplifica o modo de entrada destes
contaminantes para os ecossistemas (FILHO et al., 2006).
Figura 2.10- Representação esquemática da principal via de entrada de disruptores
endócrinos hormonais em sistemas aquáticos. Adaptado de Filho et al., 2006
A tabela 2.2 abaixo apresenta alguns compostos classificados como desreguladores
endócrinos e suas classes.
25
Tabela 2.2- Substâncias químicas classificadas como DE
Ftalatos Pesticidas
dietil ftalato (DEP)
di-iso-butil ftalato (DIBP)
di-n-butil ftalato (DBP)
butilbenzil ftalato (BBP)
diciclohexilo ftalato (DCHP)
di-2-(2-etil-hexil) ftalato (DEHP)
di-n-octil ftalato (DOP)
di-isooctil ftalato (DIOP)
di-iso-nonil ftalato (DINP)
di-iso-decil ftalato (DIDP
Inseticida
DDT (2,2 bis-p-clorofenil-1,1,1-tricloroetano)
DDE (2,2 bis-p-clorofenil-1,1-dicloroetileno)
deltametrina
carbofurano
Herbicidas
atrazina
linuron
Fungicidas
vinclozolina tridemorfos
carbendazina procimidona
penconazol epoxiconazol
procloraz
Pesticidas organoclorados
Lindano (1,2,3,4,5,6-hexacloroexano)
Alquilfenóis
nonilfenol nonilfenol etoxilado
octilfenol octilfenol etoxilado
Organoclorados
dibenzo-p-dioxina
TCDD (2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina)
TCDF (2,3,7,8-tetraclorodibenzofurano) Compostos orgânicos de estanho
Bisfenol Tributilestanho (TBT)
Trifenilestanho (TPT) Bisfenol A
Parabenos Policlorados de bifenilas
benzilparabeno isobutilparabeno
butilparabeno n-propilparabeno
etilparabeno metilparabeno
2,4,4’-triclorobifenil
2,2’,5,5’-tetraclorobifenol
2,2’,4,5,5’-pentaclorobifenil
2,3,4,4’,5-hexaclorobifenil
2,2’3,4,4’,5- hexaclorobifenil
2,2’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenil
2,2’,3,4,4’,5,5’-heptaclorobifenil
Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
Naftalina
Acenaftileno
Fluoreno
Fenantreno
Antraceno
Fluoranteno
Pireno
Benzo[a]antraceno
Criseno
Benzo[b]fluoranteno
Benzo[k]fluoranteno
Benzo[a]pireno
Indeno[123-cd] pireno
Dibenzo[ah]antraceno
Benzo[ghi]perileno
Retardantes de chama bromado
Polibromobifenila( PPB)
polibromobifenila( PPB)
2,2’,4,4’-tetrabromodifenil éter 2,2’,4,4’,5-
pentabromodifenil éter 2,2’,4,4’,6-
pentabromodifenil éter
2,2’,4,4’,5,5’-hexabromodifenil éter
2,2’,4,4’,5,6-hexabromodifenil éter
2,2’,3,4,4’,5,6-heptabromodifenil éter
octabromodifenil éter (BDE octa)
decabromociclodifenil éter (BDE 209)
hexabromociclododecano (HBCD)
tetrabromobisfenol A (TBBA)
Metais pesados
Cádmio
Mercúrio
Chumbo
Zinco
Agentes terapêuticos e farmacêuticos
Dietilestilbestrol (DES)
17α-etinilestradiol (EE2) Fitoestrogênios
Estrogênios naturais
Isoflavona: daidzeína e genisteína
Lignanas: metaresinol e enterodiol Estrona (E1)
17β-estradiol (E2)
Estriol (E3)
Fonte: (BILA e DEZOTTI, 2007)
Dentre os compostos apresentados no quadro acima alguns foram estudados neste
trabalho.
26
4-Nonilfenol (4NP)
A liberação do 4-nonilfenol para o meio ambiente pode ser resultante dos resíduos de
vários produtos uma vez que são utilizado na preparação de lubrificantes, aditivos de óleo,
resinas, plastificantes, agentes tenso ativos, antioxidantes para borrachas e plásticos, e como
material de partida para a produção de resinas fenólicas. O 4-nonilfenol foi identificado em
água potável, águas subterrâneas, rios e lagos, estação de tratamento de efluentes, e é um
contaminante de destaque no lodo de esgoto (“PUBCHEM, 2012”).
Figura 2.11- Estrutura química do 4-nonilfenol
OH
CH3
Liu e colaboradores (2012) confirmaram que desreguladores endócrinos, entre eles o
4-nonilfenol, se acumulam nos músculos de peixes quando estes são expostos a efluentes
contendo este microcontaminantes. Esta acumulação pode explicar vários efeitos biológicos
nas espécies em estudo.
4-Octilfenol (4OP)
O 4-octilfenol, junto com o 4-nonilfenol, são produtos da degradação do dos
alquilfenóis etoxilados, que são surfactantes usados em formulações de detergentes de uso
industrial e doméstico. Também são usados na produção de resinas fenólicas, como aditivos
plásticos, emulsificantes, agentes umificantes e em formulações de agrotóxicos. A principal
fonte desses compostos para o meio aquático é proveniente do uso doméstico de surfactantes
(RAIMUNDO, 2007).
Figura 2.12- Estrutura química do 4-octilfenol
OH
CH3
Bisfenol A (BPA)
Bisfenol A é utilizado principalmente na indústria como um intermediário importante
na produção das seguintes resinas e polímeros: policarbonato, epóxi, polisulfona, poliacrilato,
polieterimida, poliéster insaturado e fenólicos. Pode ser encontrado em uma grande variedade
27
de materiais e produtos (por exemplo, garrafas, tubos, revestimentos, selantes dentários,
embalagens de alimentos, esmaltes e materiais retardadores de chama). Devido a sua ampla
utilização a população humana pode facilmente entrar em contato com o BPA no dia-a-dia
(ASIMAKOPOULOS et al., 2012).
Figura 2.13- Estrutura química do bisfenol A
CH3
CH3
OHOH
Uma grave consequência da exposição ao BPA foi relatada por Aldad e colaboradores
(2011) que expuseram fêmeas de macacos a este composto e comprovaram que o BPA,
indiretamente, aumenta a ação de estrogênios. Esse efeito pode explicar doenças como
endometriose, hiperplasia do endométrio, câncer, além de poder estar associado a abortos
espontâneos.
Estrona (E1)
A estrona é um estrogênio natural mais potente que o estriol e menos que o estradiol.
É o principal estrógeno circulante após a menopausa e a maior parte está conjugada sob a
forma de sulfato. É muito utilizada para avaliação do hipogonadismo, avaliação da puberdade
precoce (completa ou parcial), diagnóstico de tumores feminilizantes e acompanhamento de
reposição hormonal na menopausa, em alguns casos (NOBEL, 2012).
Figura 2.14- Estrutura química da estrona
O
OH
No trabalho de Salste et al (2007) a estrona foi o único estrogênio encontrado acima
do limite de quantificação indicando que ele é o principal contribuinte para a atividade
estrogênica do efluente de uma estação de tratamento da cidade de Turku, na Finlândia.
Estradiol (E2)
O 17β-estradiol é um estrógeno natural responsável pelas características sexuais
femininas secundárias e pela menstruação normal. Na menopausa seu nível cai
28
consideravelmente. Além disso, também é responsável pela manutenção dos tecidos do
organismo, garantindo a elasticidade da pele e dos vasos sanguíneos e a reconstituição óssea,
entre outras funções (GOODMAN GILMAN, 2005). É metabolizado principalmente no
fígado, sendo os principais metabólitos a estrona e o estriol e seus conjugados, os quais são
consideravelmente menos potente do que o estradiol. A maior parte dos metabólitos são
excretados na urina como glucuronídeos e sulfatos (BALFOUR, J.A. e HEEL, R.C.,1990)
Figura 2.15- Estrutura química do estradiol
OH
OH
Estradiol e os seus ésteres semi-sintéticos (valerato de estradiol, especialmente), são os
principais estrogênios utilizados no tratamento de perturbações da menopausa. A sua
utilização também tem sido proposta para a prevenção de doenças cardiovasculares (IARC,
2012).
Devido ao uso do estradiol para tratamentos, além de ser um estrogênio natural, há a
preocupação quanto a sua ocorrência no meio ambiente. No trabalho de Svenson e
colaboradores (2003) foi relatado que, em efluentes de estações de tratamento de esgoto
doméstico da Suécia, havia compostos estrogênicos correspondentes ao estradiol nas
concentrações de 0,1-15 ng / L. Além disso, baixos níveis de atividade estrogênica também
foram encontrados em um rio que recebe efluentes municipais, tomada a cerca de 3,5-35 km a
jusante de uma estação de tratamento de esgoto. Já em esgoto não tratado, as concentrações de
estradiol estava em torno de 1-30 ng de estradiol / L.
Etinilestradiol (EE2)
O 17α- etinilestradiol é um estrogênio sintético amplamente utilizado em pílulas
contraceptivas (30–50 µg/pílula/dia). Possui maior potencial estrogênico quando comparado
com o estradiol e seus metabólitos, além de ser mais resistente ao metabolismo. Tais fatos
ocorrem devido a adição de um grupo etinil na sua estrutura (ANDREW et al., 2010;
TOMŠÍKOVÁ et al., 2012).
29
Figura 2.16- Estrutura química do etinilestradiol
CHOH
OH
O uso de medicamentos contendo estrógenos sintéticos possuem muitos pontos
negativos e entre os mais graves, o desenvolvimento e evolução de câncer de mama. Tais
compostos possuem maior potencial endócrino e são excretados na urina de mulheres que
usam os contraceptivos (TOMŠÍKOVÁ et al., 2012).
Vários estudos já comprovaram que a exposição de animais aquáticos ao EE2, e outros
estrógenos, causam mudanças no fenótipo como falha nos órgão reprodutivos, feminização
(ou demasculinização) de machos, formação de hermafroditas e aumento na produção da
proteína vitelogenina (proteína sintetizada pelas fêmeas durante a maturação óocita)
(SUMPTER e JOHNSON, 2008).
Kidd e colaboradores (2007) expuseram peixes da espécie Pimephales promelas, em
uma lagoa experimental no Canadá, a baixas concentrações de EE2 (5-6 ng/L) durante sete
anos. Eles constaram a feminização de machos da espécie devido a produção da proteína
vitelogenina, alterações no desenvolvimento gonadal comprovada pela presença de peixes
hermafroditas e mudanças na oogênese de fêmeas. Por fim, houve uma diminuição
significativa da população dos peixes no lago.
Tompsett e colaboradores (2012) expuseram girinos da espécie Xenopus laevis a três
níveis de concentração de EE2 (0,09, 0,84, ou 8,81mg/L) e em todos eles foi observado
atrasos significativos no tempo de metamorfose. Houve um grande número de anfíbios com
genótipo masculino que exibia fenótipo dos dois sexo (hermafroditismo), além do aumento na
produção da proteína vitelogenina em ambos os sexos.
Devido a esses fatos há a grande preocupação em avaliar a remoção desse
contaminante nas estações de tratamento de esgoto uma vez que os efluentes vão para rios e
mananciais e podem chegar ao consumo humano.
30
Estriol (E3)
O estriol é um estrógeno natural, altamente sintetizado durante a gravidez e pode ser
originado pelo metabolismo do estradiol e da estrona sendo menos ativo que estes
(RAIMUNDO, 2007). É amplamente utilizado na reposição hormonal na menopausa uma vez
que o estriol induz a normalização do epitélio vaginal, cervical e uretral, ajudando a restaurar
a microflora normal e o pH fisiológico da vagina. Além disso, aumenta a resistência das
células para inflamação e infecção (VOOJIS e GEURTS, 1995).
Figura 2.17- Estrutura química do estriol
Em amostras do rio Dourados, no estado do Mato Grosso do Sul, que devido a criação
extensiva de gado na região pode receber excrementos destes animais, foram feitas análises de
estrógenos naturais. O estriol foi o encontrado em maior quantidade, com concentrações na
faixa de 11 e 130 ng/L (ZOCOLO et al., 2010).
2.2 Esgoto
A palavra esgoto costuma ser usada para definir tanto a tubulação condutora das águas
servidas de uma comunidade, como também o próprio líquido que flui por estas canalizações.
Hoje este termo é usado quase que apenas para caracterizar os despejos provenientes das
diversas modalidades do uso e da origem das águas, tais como as de uso doméstico,
comercial, industrial, as de utilidades públicas, de áreas agrícolas, de superfície, de infiltração,
pluviais, e outros efluentes sanitários.
Os esgotos costumam ser classificados em dois grupos principais: os esgotos sanitários
e os industriais. Os primeiros são constituídos essencialmente de despejos domésticos, uma
parcela de águas pluviais, águas de infiltração, e eventualmente uma parcela não significativa
de despejos industriais, tendo características bem definidas.
Os esgotos domésticos ou domiciliares provém principalmente de residências, edifícios
comerciais, instituições ou quaisquer edificações que contenham instalações de banheiros,
lavanderias, cozinhas, ou qualquer dispositivo de utilização da água para fins domésticos.
31
Compõem-se essencialmente da água de banho, urina, fezes, papel, restos de comida, sabão,
detergentes, águas de lavagem.
Os esgotos industriais, extremamente diversos, provêm de qualquer utilização da água
para fins industriais, e adquirem característicos próprias em função do processo industrial
empregado. Assim sendo, cada indústria deverá ser considerada separadamente, uma vez que
seus efluentes diferem até mesmo em processos industriais similares (JORDÃO, 1995).
O esgoto doméstico é uma matriz bastante complexa do ponto de vista analítico. Ele
pode conter muitos compostos orgânicos tais como, ácidos húmicos e fúlvicos, proteínas,
lipídeos, além de detergentes do tipo alquilbenzeno-sulfonados de cadeia linear (LAS),
surfactantes aniônicos que são amplamente utilizados e estão no esgoto em altas
concentrações (cerca de 10mg/L). Devido sua abundância e atividade surfactante esses
compostos são interferentes importantes encontrados na matriz esgoto, que podem competir
com os analitos de interesse no sistema cromatográfico.
2.3 Métodos Analíticos para Determinação de Microcontaminantes
Os microcontaminantes entram no meio ambiente constantemente, porém em
concentrações muito baixas na ordem de µg/L e ng/L. As amostras ambientais (água
superficial, efluente de ETE, esgoto bruto), são amostras muito complexas fazendo necessário
o desenvolvimento de técnicas eficientes de preparação e concentração das mesmas
(KOSTOPOULOU e NIKOLAOU, 2008).
Técnicas cromatográficas, líquida e gasosa, são as mais utilizadas para análises desses
compostos. O acoplamento da espectrometria de massas a essas técnicas é o mais apropriado
devido a sua grande seletividade. A cromatografia gasosa ainda exige um passo a mais que é a
derivatização dos analitos para que seja possível a adição de grupamentos que levam a
diminuição do ponto ebulição, para que assim sejam passíveis a esse tipo de análise (GABET
et al., 2007). A Tabela 2.3 apresenta alguns dados de monitoramento de microcontaminantes
estudados neste trabalho em amostras ambientais encontrados na literatura.
32
Tab
ela 2.3
- Dad
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e mo
nito
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39
2.3.1 Técnicas cromatográficas
Nos últimos anos, muitos métodos para a análise de contaminantes emergentes em
amostras de águas foram publicados. Dentre as técnicas instrumentais disponíveis para
quantificação de perturbadores endócrinos e fármacos em amostras ambientais a
cromatografia é sem dúvida a mais utilizada. A cromatografia é uma técnica físico-química de
separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura,
que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase
estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna
uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação (DEGANI et al, 1998).
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o tipo mais versátil e mais
amplamente empregado de cromatografia por eluição. Essa técnica é utilizada para separar e
determinar espécies em uma grande variedade de materiais orgânicos, inorgânicos e
biológicos. Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido, o qual contém a
amostra na forma de uma mistura de solutos (SKOOG, 2005). Dentre os detectores para a
CLAE podemos destacar absorbância no UV/Vis, fluorescência e, o mais recentemente usado,
espectrômetros de massas.
As principais fontes de ionização empregadas em CLAE/EM são: ionização por
eletronebulização (electrospray ionization, ESI), ionização química à pressão atmosférica
(atmospheric pressure chemical ionization, APCI). No entanto, tais métodos de ionização são
suscetíveis a efeitos de matriz, principalmente quando se trata de matrizes complexas como as
ambientais, levando aos efeitos de supressão ou aumento do sinal analítico. Tem sido relatado
que a ionização por APCI é menos sensível a efeitos de matriz que a ionização por eletrospray
(WICK et al., 2010; BUCHBERGER, 2011).
Cromatografia Gasosa (CG)
Na cromatografia gasosa, os componentes de uma amostra vaporizada são separados
em consequência de sua partição entre uma fase móvel gasosa e uma fase estacionária líquida
ou sólida contida dentro da coluna. Ao realizar-se uma separação por cromatografia gasosa a
amostra é vaporizada e injetada na coluna cromatográfica. A eluição é feita por um fluxo de
fase móvel gasosa inerte que, em contraste com muitos outros tipos de cromatografia, não
40
interage com as moléculas do analito; sendo sua única função transportar o analito através da
coluna (SKOOG, 2005).
Essa técnica é recomendada para amostras voláteis e termicamente estáveis. No
entanto, reações de derivatização podem ser feitas para compostos não voláteis. A
derivatização consiste em uma reação em que o peso molecular da amostra é aumentado pela
substituição de um grupo proveniente do reagente derivatizante e seu ponto de ebulição é
então diminuído pela redução na polaridade, tornando-se passível de análise por CG. Dentre
os vários reagentes derivatizantes podemos citar o pentafluorobenzil (PFBr), N,O-bis
(trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA) e o N-(tert-butildimetilsilil)-N-metil-
trifluoracetamida (MTBSTFA) que conduzem a formação de derivados contendo grupos
trimetilsilil (TMS) e tributilsilil (TBS).
Todavia, quando se deseja identificar e quantificar compostos, apenas a separação
deles pela coluna cromatográfica e comparação dos tempos de retenção não é suficiente,
tornando necessário o emprego de um detector. Vários são os detectores para a cromatografia
gasosa os quais podemos citar: ionização em chama, condutividade térmica, captura de
elétrons, espectrômetro de massas, termiônico, condutividade eletrolítica, fotoionização,
infravermelho com transformada de Fourier. Neste trabalho foi adotada a cromatografia
gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM).
2.3.2 Espectrometria de Massas (EM)
Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de
massas. No caso de um CG, a amostra está na forma de vapor e a entrada deve ser
interfaceada entre a pressão atmosférica do sistema de CG e a baixa pressão (10–5
a 10–8
) do
sistema do espectrômetro de massas. Um sistema complexo de vácuo é necessário para
manter a pressão baixa. No espectrômetro de massas, as moléculas da amostra entram em uma
fonte de ionização para a consequente ionização da mesma. As fontes de ionização para a
espectrometria de massas são energéticas o suficiente para quebrar as ligações químicas das
moléculas da amostra, mas não suficientemente energéticas para decompor as moléculas da
amostra em seus átomos constituintes, assim como acontece em espectrometria atômica
(SKOOG, 2005).
41
Figura 2.18- Diagrama de um espectrômetro de massas
As fontes de ionização em CG/EM produzem fragmentos, os quais podem também ser
ionizados. Portanto, os íons das moléculas da amostra, denominados íons moleculares, íons de
fragmentos e moléculas não-ionizadas, saem da fonte de ionização. As moléculas não-
carregadas e os fragmentos são normalmente extraídos da fonte de íons através de bombas de
vácuo empregadas para produzir o ambiente de baixa pressão. A próxima seção do
espectrômetro de massas é o estágio analisador. O analisador serve para selecionar os íons de
acordo com seus valores de massa carga (m/z). Os íons separados são então detectados e um
gráfico contendo a intensidade do sinal gerado pelo íon versus m/z é produzido pelo sistema
de dados (SKOOG, 2005).
A fonte de ionização do espectrômetro de massas utilizado neste trabalho é a ionização
por elétrons (IE). Nessa fonte, as moléculas são bombardeadas com um feixe de elétrons de
alta energia. Isso produz íons positivos (radicais cátions), íons negativos e espécies neutras.
Os íons positivos são dirigidos para o analisador por repulsão eletrostática. Em IE, o feixe de
elétrons é tão energético que muitos fragmentos são produzidos. Esses fragmentos, contudo,
são muito úteis na identificação das espécies moleculares (SKOOG, 2005).
O modo de varredura do espectrômetro de massas é um requisito instrumental
importante para que a análise seja realizada. O mais conveniente é a varredura em uma faixa
de massas completa. Nesse modo SCAN, o espectrômetro realiza uma varredura sobre uma
faixa de massas cobrindo todos os íons moleculares e fragmentos produzidos para uma
amostra complexa de múltiplos componentes. Massas menores (50 Da) são excluídas porque
podem fazer parte do background do ar e do gás de arraste. O limite superior é baseado na
volatilidade dos analitos. Muitos compostos acima da massa molecular de 600 Da, com a
exceção de derivados voláteis especificamente preparados, têm pressão de vapor insuficiente
para as análises. Por isso, para muitos espectrômetros isso representa o máximo da faixa de
massas ao usar uma coluna capilar, porque o uso de velocidades de varredura de 0,5 seg/scan
tornam-se mais difíceis acima dessa faixa (BECKER, 2012).
42
Outro modo de varredura muito utilizado é o monitoramento seletivo de íon (SIM).
Nesse método o analisador de massas pode ser programado para amostrar um ou mais valor
de m/z no decorrer da separação cromatográfica. No monitoramento de apenas um valor de
m/z, a sensibilidade é aumentada em três ordens de magnitude, dependendo da faixa de
massas, assim o aparelho não gasta tempo no registro de razões m/z que não correspondem
aos compostos de interesse. Essa técnica é útil pata análise quantitativa de compostos alvos
onde o pico base do anlito é normalmente escolhido para o monitoramento de m/z. A análise
por SIM sintetiza a seletividade e sensibilidade do CG-EM (BECKER, 2012).
A espectrometria de massa acoplada à cromatografia gasosa e líquida são técnicas
ideais para a determinação de contaminantes orgânicos em águas residuais devido ao recurso
de separação do CG e CLAE atrelado a seletividade e sensibilidade do espectrômetro de
massas. Este acoplamento da cromatografia com detecção de massa seletiva permite a
determinação de muitos contaminantes em concentrações por partes por trilhão (ppt) ou
inferiores (KANDA e GLENDINNING, 2011).
2.3.3 Métodos de preparação de amostras
Embora o uso de EM permita aumentar a sensibilidade, um procedimento de pré-
concentração do analito é quase sempre necessário para atingir limites de detecção baixos o
suficiente para determinar os níveis residuais em que os contaminantes emergentes estão
presentes no ambiente (RODRIGUEZ-MOZAZ et al., 2007).
As técnicas mais utilizadas para extração ou pré-concentração de compostos são:
extração líquido-líquido (ELL) ou liquid-liquid extraction (LLE), extração em fase sólida
(EFS) ou solid phase extraction (SPE), microextração em fase sólida (MEFS) ou solid phase
microextraction (SPME) e extração com fluido supercrítico (EFS) ou supercritical fluid
extraction (SFE).
A EFS baseia-se principalmente na imobilização física ou adsorção de certos
compostos orgânicos na superfície de alguns sólidos orgânicos ou inorgânicos modificados ou
não que são os suportes que preenchem o cartucho de extração. A seleção dos suportes é
geralmente baseada nas propriedades dos analitos de interesse a serem extraídos (DAS et al.,
2012). O ajuste do pH da amostra muitas vezes é necessário para que haja protonação ou
desprotonação dos compostos tornando-os compatíveis com o recheio e, consequentemente,
aumentando a eficiência da extração (BUCHBERGER, 2011). Quando se trata de matrizes
complexas alguns componentes destas podem coeluir com os analitos de interesse durante a
43
extraçao. Por isso, em alguns casos, é necessária a etapa de clean-up da amostra
(BIZKARGUENAGA et al., 2012).
A microextração em fase sólida (MEFS) é uma técnica recentemente usada para
análise de multirresíduos em amostras ambientais. O princípio da técnica é a extração de
compostos a partir da adsorção destes em uma fibra (polímero ou sólido adsorvente) que
recobre um tubo de fibra de vidro capilar. A quantidade do composto captada pela fibra é
proporcional à sua concentração na amostra à medida que o equilíbrio é atingido com auxílio
de agitação. Após a extração, a fibra de MEFS é transferida para a porta de injeção do CG,
onde os compostos são dessorvidos (FATTA-KASSINOS et al., 2011). Para compostos
voláteis é feita a extração indireta (headspace), já que a fibra não entra em contato direto com
a solução. A amostra é aquecida e os componentes voláteis são extraídos para a fibra pelo
processo de sorção ou partição (OLIVEIRA et al., 2008).
O princípio da extração líquido-líquido (ELL) de dois líquidos imiscíveis (fase aquosa
e fase orgânica) para a extração da substância de interesse se dá pelo coeficiente de partição
do analito entre as duas fases imiscíveis. A eficiência da extração, portanto, depende da
afinidade do soluto pelo solvente extrator e da razão entre as duas fases. No entanto, a ELL
tem várias limitações tais como baixa recuperação, necessidade de um grande volume de
amostra, baixa seletividade além da limitação para a extração de compostos hidrofílicos
(KOLE et al., 2011). Uma variação da ELL convencional foi desenvolvida utilizando baixas
temperaturas para facilitar a partição de fases com polaridades próximas.
2.3.3.1 Extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura (ELL-PBT)
A partição em baixa temperatura foi primeiramente relatada por Anglin e McKinley
(1960) que extraíram cera utilizando acetona a -70 oC durante o clean up de extratos de
plantas para determinação de DDT (Dicloro-Difenil-Tricloroetano). Em 1997, Juhler extraiu
organofosforados em matizes gordurosas da mesma forma, no entanto, a temperatura utilizada
foi de -10 oC.
Em 2008, Goulart desenvolveu uma metodologia simples e de baixo custo, para
análise de deltametrina e cipermetrina em leite. Este método denominado extração líquido-
líquido e purificação por precipitação a baixa temperatura, consiste em colocar a amostra
líquida ou sólida em contato com um solvente menos denso que a água e com ponto de fusão
abaixo de -20 oC. O sistema é agitado e levado ao freezer. Após um determinado período de
tempo a fase aquosa é congelada e o solvente orgânico ainda na fase líquida é separado e
44
analisado por cromatografia. Esta técnica permitiu determinar piretróides em leite por
cromatografia gasosa, sem a necessidade de etapas de clean up. Segundo Goulart 2004, foram
avaliados alguns parâmetros relevantes na recuperação dos analitos. O solvente acetonitrila
proporcionou recuperação maior que 70% para cipermetrina e deltametrina. A proporção
amostra/solvente que obteve melhores resultados foi 1:2 (20 mL de leite para 40 mL de
acetonitrila). Segundo ele, outros solventes e mesmo as extrações múltiplas não melhoraram a
eficiência da extração. O tempo de contato do solvente com a amostra também foi avaliado
durante agitação em mesa agitadora. Os resultados indicaram melhores recuperações no
tempo de 20 minutos de agitação a 175 oscilações por minuto. Além disso, observou-se que
entre 6 h e 48 h de congelamento não houve diferença na recuperação dos analitos.
Posteriormente, Vieira et al., (2007) otimizou a técnica de ELL-PBT para a extração
simultânea de quatro piretróides: λ-cialotrina, permetrina, deltametrina e cipermetrina, em
amostra de água previamente contaminada com padrões dos piretróides. Na otimização foi
empregado um planejamento fatorial completo, 23, para avaliação do comportamento
simultâneo de três fatores: proporção entre o volume de água e acetonitrila (1:1 e 1:2), força
iônica pela adição de sal (0,020 mol/L e 0,100 mol/L de NaCl) e tempo de extração (15 min e
30 min). Pela análise cromatográfica, baseando em porcentagem de recuperação, o método
otimizado consistiu em proporção amostra/solvente de 1:2, adição de sal na concentração de
0,020 mol/L, uma vez que o aumento da força iônica dificultou a separação das fases. E por
último, os tempos de extração estudados não tiveram contribuição consideráveis para os
resultados, portanto optou-se pelo tempo de 15 minutos.
Os extratos obtidos do procedimento de purificação por precipitação a baixa
temperatura apresentam um aspecto limpo, o que pode ser observado por simples inspeção
visual. Outro ponto a ser considerado é o menor número de etapas necessárias para se obter
um extrato adequadamente limpo para análise cromatográfica. Isto permite reduzir os riscos
de contaminação e perdas de amostras, proporcionando um nível mais alto de recuperação e
de forma mais reprodutiva quando comparado com os procedimentos tradicionais
(GOULART, 2004).
Em 2010, Goulart analisou três tipos de carbamato (aldicarbe, carbofuran e carbaril)
em água. Foi utilizado um planejamento fatorial completo 23 para definir as melhores
condições da técnica de extração. As variáveis estudadas foram tempo de extração em banho
ultrassônico (2 min e 10 min), força iônica (0% m/v e 1,5% m/v) e proporção de volume de
45
amostra/solvente (1:1 e 1:2). Após análise cromatográfica (CLAE-UV) as condições que
tiveram melhores porcentagens de recuperação (> 90%) foram banho ultrassônico por 10
minutos, força iônica 1,5% m/v de NaCl e proporção de amostra/solvente 1:2 (2 ml de
amostra para 4 ml de acetonitrila). A técnica foi então validada e aplicada em amostras de
água mineral de diferentes marcas e amostras de água de rio da região da Zona da Mata.
A ELL-PBT foi utilizada por Magalhães e colaboradores (2012) para análise em LC-
MS de diazepínicos em urina de usuários destas drogas. O método foi otimizado levando em
conta três variáveis relevantes do método: (1) tipo de congelamento (1 h no freezer e 8 s em
nitrogênio líquido), (2) força iônica da solução (0 mol/L e 2,0 mol/L de NaCl) e (3) proporção
de volume amostra /solvente (1:1 e 2:1). Os resultados obtidos indicaram que para variável (1)
o tipo de congelamento mais lento obteve recuperação mais elevada. Para a variável (2) o
aumento da força iônica aumentou a recuperação para todos os analitos. Já para a variável (3)
foi concluído que a proporção 1:1 de amostra/solvente foi a otimizada uma vez que a
proporção 2:1 (1 mL de urina para 0,5 mL de acetonitrila) não proporcionou separação das
fases. O método otimizado foi então validado e aplicado em amostras de urina de usuários dos
diazepínicos. Os resultados demonstram claramente que a metodologia proposta é simples,
rápida e sensível o suficiente para ser usado como um procedimento de rotina para a
determinação de benzodiazepínicos na urina.
2.3.4 Derivatização
A análise de fármacos por CG muitas vezes é inviabilizada devido a algumas
características dessas moléculas como polaridade acentuada, baixa volatilidade e instabilidade
térmica, o que faz da CLAE a técnica de escolha. Entretanto a técnica de CG por ser mais
simples, possuir elevado poder de resolução, sensibilidade adequada, reprodutibilidade e
baixo custo se mostra como interessante alternativa para as análises de fármacos. Para que
isso seja possível é necessário converter moléculas polares ou não voláteis em suas formas
voláteis, sendo necessários processos de derivatização (XU, et al., 2009).
Compostos que contém grupos funcionais tais como carboxila (-COOH), hidroxila (-
OH), tiol (-SH), amino (-NH2) e imino (=NH) são de difícil análise por CG, pois não
apresentam volatilidade suficiente além da possibilidade de interações com os grupos silanóis
remanescentes da fase estacionária ou até mesmo com as impureza do sistema
cromatográfico, resultando em pior resolução bem como menor detecção (SCHUMMER et
al., 20b09).
46
A derivatização é a substituição dos hidrogênios livres ativos das funções químicas
citadas por grupamentos mais apolares que não apresentam a característica de formação de
ligações de hidrogênio. Essa substituição resulta em modificações da estrutura química do
analito e também do perfil de fragmentação do mesmo, possibilitando assim análise por CG.
Com isso, a introdução de alguns elementos ou grupos através de derivatização química pode
aumentar a resposta do detector ou gerar espectros de massa úteis para a elucidação das
características estruturais dos analitos e também melhorar a detecção dos analitos em
amostras complexas (SEGURA et al., 1998).
Apesar dos processos de derivatização, em geral, serem demorados e onerosos,
técnicas de derivatização in situ ou online podem ser feitas sem consumo adicional de tempo,
visto que estas envolvem simplesmente a adição do reagente na amostra líquida ou a injeção
simultânea do derivatizante no cromatógrafo (FERNANDES et al., 2008; XU et al., 2010). A
derivatização é crucial para muitas aplicações em química analítica, por exemplo, para
assegurar que o analito seja convertido em sua forma adequada à análise, tornando possível ou
aumentando sua detectabilidade (XU et al., 2009).
A reação de derivatização pode ser realizada após o processo de extração
(derivatização pós-extração), isto é, converter os analitos em suas formas compatíveis com os
processos de separação e detecção subsequentes. Esse processo pode ser feito tanto fora do
cromatógrafo a gás (derivatização off-line) quanto dentro do sistema cromatográfico
(derivatização online). Nessa configuração a derivatização é feita, na maioria das vezes,
injetando simultaneamente o derivatizante e a amostra extraída, e pode ser chamado de
“Injection port derivatization” ou “on-column derivatization” (BASHEER e LEE, 2004;
ZHANG e LEE, 2006; MIKI et al., 2008; ZHANG e LEE, 2009).
A derivatização no injetor (online) tem como grande vantagem a redução significativa
do volume de reagente derivatizante que normalmente é entre 25 e 200 µL para reações off
line. Além disso, o tempo gasto para esta reação é eliminado (MIGOWSKA et al., 2012;
ZHANG et al., 2006; NIE et al., 2009). Os principais derivatizantes utilizados em processos
de derivatização no injetor são agentes de sililação como N,O-bis-(Trimetilsilil)
trifluoroacetamida (BSTFA) (DOCHERTY e ZIEMANN, 2001; BAI-JUAN et al., 2007; WU
et al., 2009; TZING e DING, 2010) e de trifluoroacetilação como o n-metil bis-
trifluoroacetamida (MBTFA) (HIDVÉGI et al., 2006; MIKI et al., 2008).
2.3.4.1 Reação de sililação
47
A sililação é o método mais comumente utilizado na derivatização de compostos
orgânicos que possuem hidrogênio ativo, sendo que compostos de trimetilsilil (TMS) são os
mais utilizados. Essas reações caracterizam-se por serem simples, rápidas, reprodutíveis, em
única etapa e por apresentarem alto rendimento sob condições brandas. Ao realizar uma
sililação, bloqueia-se sítios próticos, havendo uma redução de interações do tipo dipolo-
dipolo, elevando a volatilidade dos compostos, resultando em picos estreitos e simétricos
(BECKER, 2012). A reação ocorre através de um ataque nucleofílico do tipo SN2. A figura
2.18 representa o mecanismo genérico da reação de sililação. Diferente da derivatização por
acilação, a sililação geralmente não exige o passo de purificação e os derivados podem ser
injetados diretamente no CG (SCHUMMER et al., 2009).
Figura 2.19- Mecanismo genérico da reação de sililação, onde X varia de acordo com os
diferentes derivatizantes. Fonte: (BECKER, 2012)
O reagente derivatizante BSTFA (N,O-bis-(Trimetilsilil) trifluoroacetamida) é
largamente utilizado uma vez que reage rapidamente com os compostos que possuem
hidrogênio ativo, tanto o BSTFA quanto seus subprodutos possuem elevada volatilidade
resultando em não-coeluição dos primeiros picos eluídos e baixa degradação térmica. Além
disso, é solúvel em solventes orgânicos comumente utilizados nas reações de derivatização
(HERNANDO et al., 2004).
2.4 Validação
O bom desempenho de qualquer técnica analítica depende crucialmente de dois
parâmetros: a qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatística dos cálculos
envolvidos no seu processamento. Uma forma de assegurar a aplicabilidade e o alcance de um
método durante as operações de rotina de um laboratório é estabelecendo os limites destes
parâmetros por meio da estimativa das figuras de mérito, numa etapa conhecida como
validação (RIBEIRO et al., 2008).
A validação de determinado procedimento analítico objetiva demonstrar que o mesmo
é adequado aos objetivos propostos, ou seja, que os parâmetros de desempenho avaliados
atendem aos critérios de aceitação preconizados. Trata-se de um estudo experimental e
48
integralmente documentado. Além disso, visa garantir a qualidade metrológica dos resultados
analíticos, conferindo-lhes rastreabilidade, comparabilidade e confiabilidade para a tomada de
decisões (MAPA, 2011).
Segundo Ribani e colaboradores (2004) existem dois tipos de validação: a validação
no laboratório, que consiste das etapas de validação realizadas dentro de um laboratório; e a
validação completa, cujo estudo é realizado interlaboratorial. Para a validação no laboratório,
a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) confeccionou um guia
denominado Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis
(THOMPSON, M. et al., 2002), o qual foi selecionado para a validação do método proposto
neste trabalho, sendo tomadas as devidas adequações de acordo com o ambiente operacional.
Os parâmetros a serem utilizados no decorrente trabalho seguem abaixo:
Aplicabilidade
Um protocolo deve ser elaborado com identificação dos analitos, a faixa de
concentração utilizada durante a validação, bem como a matriz estudada. Deve estar descrito
todo o aparato experimental utilizado desde o armazenamento das amostras até a análise das
mesmas, deixando claro qualquer cuidado especial que se deve ter.
Seletividade
É a garantia de que o método analítico é capaz de quantificar com precisão os analitos
de interesse na presença de interferentes. No entanto, quando se utiliza o espectrômetro de
massas como detector, este garante a seletividade.
Curva analítica e linearidade
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente
proporcionais à concentração da substância em exame, dentro de uma determinada faixa de
aplicação. No entanto, apenas o coeficiente de correlação não indica a qualidade de ajuste.
Pode-se avaliar a linearidade também por meio da distribuição do ruído (que é o valor do erro
entre o valor estimado e o medido). Sendo a distribuição deste ruído homogênea, pode-se
afirmar que o método tem homocedasticidade, ou seja, que a distribuição dos seus erros é
homogênea. Caso a distribuição seja heterogênea, afirma-se que os dados de calibração são
heterocedásticos e, portanto, devem ser analisados por uma regressão ponderada para garantir
uma redução do erro na faixa baixa de concentração.
49
Para a construções da curva analítica são necessários:
Seis ou mais níveis de calibração
Os níveis de calibração devem estar uniformemente espaçados na faixa de
concentração
A faixa de concentração deve ser de 0 a 150% ou de 50 a 150% do valor de
concentração esperado em amostras reais, e
Os níveis de calibração devem ser analisado em, no mínimo, duplicatas e
preferencialmente em triplicatas ou mais números de repetição.
A quantificação do composto de interesse em validação pode ser obtida através dos
métodos de padronização externa; padronização interna; superposição de matriz; adição
padrão. Neste trabalho foi utilizado o método de padronização interna que consiste na
preparação das soluções padrão de concentrações conhecidas da substância de interesse, às
quais se adiciona uma quantidade conhecida de um composto chamado padrão interno (PI).
Após análise dessas soluções, constrói-se um gráfico, relacionando a razão de áreas dos picos
cromatográficas (área da substância/área do padrão interno, que tem concentração constante)
com a concentração (variada) da substância. A amostra também é analisada após a adição da
mesma quantidade conhecida do padrão interno. Idealmente, a substância usada como padrão
interno deve ser similar à substância a ser quantificada, ter tempo de retenção próximo a esta
substância, não reagir com a substância ou outro componente da matriz, não fazer parte da
amostra e, quando cromatografada, ficar separada de todas as demais substâncias presentes na
amostra. Porém, quando se trata de uma análise de múltiplos compostos, o uso de um PI por
analito é muitas vezes inviável, ainda mais levando em consideração que o PI ideal para este
tipo de amostra é o padrão deuterado do analito em estudo e, este tipo de PI tem custo elevado
(RIBANI et al, 2004).
Efeito matriz
Adicionam-se os compostos de interesse em uma matriz, de preferência ausente destes
compostos, e analisa-a para verificar o comportamento das respostas dos analitos na mesma
em relação aos padrões em solvente.
50
Exatidão
Para verificar se o método é capaz de quantificar a concentração real presente na
amostra, realiza-se a verificação da sua exatidão. Esta confirmação pode ser realizada de três
maneiras:
análise de material certificado, o qual contém uma concentração definida dos
analitos de interesse e se compara a resposta obtida pelo método em validação com
os valores naturais;
uma amostra pode ser analisada pelo método em processo de validação e seu
resultado comparado com a análise da mesma amostra por outro método de
referência; e
quando não há disponível um material certificado, nem um método de referência,
pode-se mensurar a exatidão realizando a adição de uma concentração conhecida
em uma amostra e verificando se o método é capaz de retornar o resultado com o
valor verdadeiro adicionado. Esta técnica de conferência também é denominada de
“adição e recuperação”.
Precisão
Esta característica confere a proximidade entre as medições realizadas pelo método. O
valor que indica uma maior ou menor precisão é o desvio padrão ou o desvio padrão relativo
(também conhecido como coeficiente de variação (C.V.)). A ratificação desta figura de mérito
deve ser calculada das seguintes maneiras: repetitividade ou precisão intra-dia: observa-se a
variação (C.V.) em replicatas de amostra analisada no mesmo dia.
Limite de detecção (LDM) e Limite de quantificação (LQM)
O limite de detecção do equipamento (LD) refere-se à menor concentração do analito
que pode ser distinguida do zero (ou do branco); enquanto o limite de quantificação (LQ) do
equipamento indica a menor concentração que pode ser analisada com uma precisão e
exatidão dentro dos limites aceitáveis.
Estes limites podem ser calculados por três maneiras:
51
método visual: soluções padrão diluídas são injetadas e visualmente observa-se e
constata-se como LD a menor concentração que pode ser detectada e que se difere do
sinal analítico ruído, e o LQ como a menor concentração quantificável;
método da relação sinal-ruído: é aplicado para procedimentos que possuam ruído na
linha de base. Sua estimativa é feita analisando injeções de amostra branco, e admite-
se o LD como tendo uma relação sinal-ruído de 3:1 ou 2:1, e o LQ com relação de
10:1; e
método baseado em parâmetros da curva analítica: neste caso o LD será 3,3 vezes o
desvio padrão / coeficiente angular da curva analítica, enquanto o LQ será 10 vezes.
Para definir os limites de detecção (LDM) e quantificação (LQM) do método é
necessário considerar o fator de concentração do procedimento de extração e o índice de
recuperação da extração, o LD e LQ do equipamento e o efeito matriz.
2.5 Planejamento Experimental e Tratamento de Dados
Otimização e modelo experimental são ferramentas que são usadas para examinar,
sistematicamente, diferentes tipos de problemas que surgem no âmbito, por exemplo, da
investigação, do desenvolvimento e da produção. Quando experimentos são realizados
aleatoriamente os resultados obtidos também serão aleatórios. Portanto, é necessário planejar
os experimentos para que sejam obtidas informações estatisticamente consistentes. Quando as
variáveis a serem investigadas são definidas, um modelo experimental é escolhido de forma
que estime a influência das diferentes variáveis sobre os resultados (LUNDSTEDT, 1998). No
estudo de triagem, as interações entre as variáveis, interações principais e de segunda ordem,
podem ser obtidas, normalmente, pelos planejamentos fatoriais completos ou fracionários.
Esse tipo de planejamento experimental é de extrema importância para a compreensão do
comportamento de sistemas (TEÓFILO, 2006).
Em um planejamento fatorial são investigadas as influências de todas as variáveis
experimentais de interesse e os efeitos de interação na resposta ou respostas. Normalmente, os
níveis dos fatores quantitativos (i.e. concentrações de uma substância, valores de pH, etc.) são
nomeados pelos sinais – (menos) para o nível mais baixo e + (mais) para o nível mais alto,
porém o que importa é a relação inicial entre o sinal dado e o efeito obtido, não sendo um
critério definido a nomeação dos sinais (TEÓFILO, 2006).
Em muitos casos, a realização de repetições autênticas pode ser algo inconveniente por
diversas razões. Para contornar este infortúnio e obter uma boa estimativa dos erros, um
52
experimento é normalmente incluído no centro do planejamento em que o valor médio dos
níveis de todas as variáveis é empregado. São os conhecidos experimentos no ponto central
(nível zero). O ponto central é recomendado, pois o risco de perder a relação não linear entre
os intervalos é minimizado e é possível estimar um modelo razoável e verificar se há falta de
ajuste. Logicamente não há como fugir das repetições, mas o número destas, na maioria dos
casos, é significativamente reduzido (TEÓFILO, 2006).
Após a realização dos experimentos de triagem, os fatores significativos são
selecionados e uma metodologia para a otimização das condições experimentais pode ser
executada, por exemplo, análise de superfícies de respostas. Neste sentido, otimizar significa
encontrar os valores das variáveis que irão produzir a melhor resposta desejada, isto é,
encontrar a região ótima na superfície definida pelas influências dos fatores. A metodologia
de superfície de resposta baseia-se na construção de modelos matemáticos empíricos que
geralmente empregam funções polinomiais lineares ou quadráticas para descrever o sistema
estudado e, consequentemente, possibilitam condições de explorar (modelar e deslocar) o
sistema até sua otimização. Dentre os planejamentos de superfície de resposta o Composto
Central (CCD – Central Composite Design) e Doehlert são os mais utilizados para ajustar
modelos quadráticos (TEÓFILO, 2006).
53
3 Objetivos
O presente trabalho teve como principal objetivo a análise simultânea de 14
microcontaminantes em amostras de esgoto doméstico extraídos utilizando a técnica de
extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura (ELL-PBT) e analise por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Os analitos alvo foram fármacos
(ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, paracetamol, genfibrozila naproxeno e diclofenaco),
hormônios naturais e sintéticos (estrona, estradiol, etinilestradiol e estriol), fenóis (bisfenol A,
4-nonilfenol e 4-octilfenol) e cafeína.
3.1 Objetivos específicos
Otimizar, através de planejamento experimental, a técnica de extração ELL-PBT
Validar a técnica ELL-PBT utilizando as condições cromatográficas adequadas para
os analitos em questão,.
Aplicar a técnica validada em amostras reais de esgoto bruto e efluentes a fim de
avaliar a remoção dos microcontaminantes em várias etapas de um sistema de
tratamento de esgoto (ETE).
54
4 Materiais e Métodos
Em todas as etapas do desenvolvimento analítico deste trabalho foram empregados
procedimentos fundamentados no uso de técnicas com baixo índice de contaminação, como o
manuseio dos materiais com luvas de látex. Todas as vidrarias foram previamente lavadas
com o detergente não iônico Extran® 12,5 % com o auxílio de uma escova, enxaguadas
exaustivamente com água corrente e, em seguida, enxaguadas com quantidade suficiente de
água ultrapura para retirar os vestígios de água de torneira. Após esta etapa, todas as vidrarias
foram mantidas imersas, durante 24 h, em solução de ácido nítrico 10 % e, em seguida,
enxaguadas exaustivamente com água ultrapura. As vidrarias não volumétricas foram levadas
à estufa para sua secagem e as vidrarias volumétricas secaram-se naturalmente em uma
bancada limpa.
4.1 Reagentes e vidrarias
Padrões: 4-nonilfenol, 4-octilfenol, bisfenol A, cafeína, diclofenaco, estradiol,
etinilestradiol, estriol, estrona, genfibrozila, ibuprofeno, naproxeno, ácido acetil salicílico e
paracetamol; todos Sigma® ou Fluka
®. Padrão interno: 4-nonilfenol deuterado (4-n-
nonylphenol-2,3,5,6-d 4 ,OD) CDN isotopes®.
Reagentes (grau HPLC): acetonitrila (J. T. Backer®), metanol (J. T. Backer
®),
hidróxido de amônio (Synth®
), ácido clorídrico (Proquimios®),
bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com 1% de trimetilclorosilano (BSTFA: 1% TMCS,
Sigma®
), piridina (Merck®).
Frascos de vidro âmbar de 22 mL e 1.000 mL com tampa e batoque em teflon.
Sistema para filtração à vácuo (funil de vidro, base suporte em vidro esmerilhado,
conexão para vácuo, grampo em alumínio e erlenmeyer (2000 mL)), Phox®;
Filtros de membrana de celulose (25 µm e 8 µm), Unifil®;
Filtros de fibra de vidro (1,2 µm), Sartorius®;
Micropipetas de volumes variados (5,000 mL, 1,000 mL, 200,0 µL e 20,00 µL)
(Eppendorf®);
pHmetro digital (Tecnal®
);
Coluna cromatográfica ZB-5HT Inferno - (5 % fenil 95 % dimetil polisiloxano, 30 m
× 0,25 mm × 0,10 µm);
55
Cromatógrafo a gás acoplado ao espectrômetro de massas – CG/EM- Shimadzu
QP2010S – Plus (Shimadzu®), equipado com amostrador automático e controle eletrônico de
fluxo;
4.2 Filtração e armazenamento das amostras
As amostras de esgoto bruto coletadas na ETE da bacia do ribeirão Arrudas em Belo
Horizonte foram filtradas em um sistema a vácuo em papéis de filtro de celulose de 25 µm
seguidos dos de 8 µm para retirar os particulados de maior diâmetro. Depois disso, usou-se o
filtro de fibra de vidro de 1,2 µm. Foram adicionados 10 mL de metanol a cada 1 litro de
amostra filtrada a fim de evitar a degradação microbiológica dos analitos de interesse e
armazenadas na geladeira até o momento da extração.
4.3 Preparo das soluções padrão
Para realizar as análises e construir as curvas de calibração analítica foram preparadas
soluções dos padrões de microcontaminantes, listados na tabela 4.1, em metanol, sendo a
concentração da solução estoque de 1000 mg/L e, a partir desta, foram realizadas diluições
para soluções de trabalho.
O 4-nonilfenol deuterado, usado como padrão interno, foi preparado em piridina uma
vez que esse foi o solvente escolhido para ressuspender o extrato da amostra para posterior
derivatização e análise.
56
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59
4.3- Múltipla extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura (ELL-
PBT)
A técnica de extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura trata de uma
técnica simples, de fácil execução e de menor custo, quando comparada a técnicas comumente
usadas para extração de microcontaminantes. Além do mais, não é relatado na bibliografia o
uso da mesma para análise destes compostos em amostras de esgoto e efluentes.
A partir de testes preliminares alguns parâmetros puderam ser definidos. Entre eles a
escolha da acetonitrila como solvente extrator e a adaptação da técnica para múltipla extração
utilizando 3 extrações consecutivas sendo cada uma delas realizadas após 3 horas de
resfriamento.
Portanto, na etapa de triagem, foi realizado um planejamento fatorial completo 23 com
ponto central onde algumas variáveis consideradas importantes para que houvesse boa
recuperação puderam ser avaliadas, bem como suas interações. As variáveis estudadas foram:
V(1) volume do solvente extrator, V(2) força iônica e V(3) pH da amostra. A tabela 4.2 ilustra
o planejamento realizado.
Tabela 4.2- Planejamento fatorial 23 com ponto central com os níveis codificados e
decodificados.
Ensaio Volume do solvente
(mL)
Força iônica (Na2HPO4)
(mol/L) pH
1 - (3) - (0) - (2)
2 + (4) - (0) - (2)
3 - (3) + (0,02) - (2)
4 + (4) + (0,02) - (2)
5 - (3) - (0) + (10)
6 + (4) - (0) + (10)
7 - (3) + (0,02) + (10)
8 + (4) + (0,02) + (10)
9 0 (3,5) 0 (0,010 0 (6)
O ensaio 9, correspondente ao ponto central, foi realizado em quadruplicata. A figura
4.1 ilustra o esquema da extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura. O
solvente extrator, acetonitrila, é adicionado 3 vezes no intervalo de 3 horas de resfriamento e
após a extração da fase orgânica.
60
A técnica de extração consistiu, então, no ajuste do pH de 4,0 mL de amostra em 2, 6
ou 10; adição de 0, 0,01 ou 0,02 mol/L de Na2HPO4 à amostra, e adição de acetonitrila no
volume de 3,0, 3,5 ou 4,0 mL. A mistura é agitada em vórtex por 30 segundos e levado ao
freezer por 3 horas. Após o tempo de resfriamento a fase orgânica é recolhida e mais uma
porção de acetonitrila no volume correspondente ao ensaio é adicionada à amostra, novamente
agitada e levada ao freezer. Essa etapa é realizada três vezes. Após o recolhimento total da
fase orgânica, aproximadamente 9 mL, a mesma é seca sob fluxo de nitrogênio. Ao frasco
seco é adicionando 1 mL de metanol e agitado por 1 minuto em vórtex afim de ressuspender o
extrato seco, concentrando os analitos. Essa solução é, então, transferida de 100 em 100 µL e
seca sob nitrogênio em um vial contendo um insert no volume de 200 µL. Essa etapa é
necessária para concentrar ainda mais os analitos e para realizar a reação derivatização. Após
secar todo o volume no insert adiciona-se os reagentes derivatizantes e o vial é levado à estufa
durante 30 minutos a 80 oC para posterior análise cromatográfica.
Figura 4.1- Esquema da extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura
4.4- Derivatização
O reagente derivatizante bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), adicionado de
uma pequena quantidade (1%) do catalisador trimetilclorosilano (TCMS) para aumentar a
eficiência da reação, é um dos mais utilizados para análise de microcontaminantes em
61
amostras ambientais (JIANG et al., 2005; HUANG et al., 2011; STANFORD e WEINBERG,
2007).
As condições de derivatização (tabela 4.3) para os analitos deste estudo foi a otimizada
em trabalho anterior no laboratório em que a pesquisa foi desenvolvida (SANSON, 2012).
Tabela 4.3- Condições da reação de derivatização
Volume do reagente derivatizante Volume do solvente Temperatura Tempo
75 µL BSTFA + 1% TCMS 25 µL Piridina 80 oC 30 min
A piridina foi selecionada como solvente por solubilizar bem todos os analitos
estudados e por ser usada em várias referências como Migowska et al., 2012, Zhang et al.,
2006 e Vallejo et al., 2010. O volume adicionado já continha o 4-nonilfenol deuterado,
utilizado como padrão interno, de modo que sua concentração final nos 100 µL fosse 50 µg/L.
Foram realizados testes utilizando derivatização on line e bons resultados foram
obtidos. Para isso o modo de injeção foi modificado para que amostra e reagente derivatizante
fossem injetados simultaneamente permitindo que a reação ocorresse no injetor. A figura 4.2
ilustra o diagrama da seringa para esse tipo de reação.
Figura 4.2 - Diagrama da seringa para reação de derivatização on line
No entanto, devido a contaminações na coluna cromatográfica provenientes da
análises de ácidos graxos na mesma, não foi possível continuar utilizando esse método de
derivatização e o procedimento off line foi retomado.
4.5- Condições Cromatográficas e de Detecção
Os microcontaminantes foram analisados por cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massas (CG/EM) utilizando o equipamento GCMS-QP2010 plus,
(Shimadzu®). As condições cromatográficas (Tabela 4.4) utilizadas nesta pesquisa foram as
mesmas otimizadas no trabalho de Sanson (2011) para esses mesmos analitos.
62
Figura 4.3- GCMS-QP2010 plus (Shimadzu®)
63
Tabela 4.4- Parâmetros e valores utilizados na metodologia de determinação de
microcontaminantes por CG-EM
Parâmetro Valor
Cromatógrafo a gás
Injetor
Temperatura 280 oC
Modo de injeção Splitless
Tempo de
splitless
0,5 min
Forno da coluna
Coluna ZB-5HT (30 m × 0,25 mm × 0,10 µm)
Rampa de
Temperatura
40°C (1 min), aumento para 200 °C a 10 °C/min;
aumento para 260 °C a 15 °C/min; e aumento
para 280 °C a 3 °C/min (1 min)
Fase Móvel
Gás de arraste Hélio
Modo de
controle da vazão
Velocidade Linear
Pressão ~ 109,1 kPa
Vazão Total 55,3 mL/min
Vazão da coluna 1,46 mL/min
Velocidade
linear
45,0 cm/s
Razão de divisão 20
Espectrômetro de
massas
Fonte de
ionização
250 oC
Interface 280 oC
Tempo de corte
do solvente
10,5 min
Voltagem do
detector
1,07 kV
Tempo total de
análise
28,67 min
4.5.1 Relação Massa / Carga dos microcontaminantes
Para identificação e quantificação dos analitos em estudo foram selecionados os
valores da razão m/z de cada um, para a análise no modo de monitoramento de íons SIM, bem
como os tempos de retenção. Os íons monitorados foram selecionados através do software da
Shimadzu e a biblioteca do National Institute of Standards and Technology (NIST®). Os íons
64
de maior intensidade foram escolhidos para a quantificação e outros dois monitorados para a
identificação (Tabela 4.5). A figura 4.4 ilustra o cromatograma completo dos íons de
quantificação.
Tabela 4.5- Tempos de retenção e relação m/z dos analitos derivatizados
Analito Tempo de retenção
(min)
m/z para
quantificação
m/z para
identificação
AAS 12,1 267 209; 249
IBU 13,3 160 263; 234
PCT 13,5 206 280; 116
4-OP 15,5 179 180; 278
4-NP
deuterado 16,5 183 281; 296
4-NP 16,5 179 292; 277
GEN 16,6 201 122; 194
BPA 19,1 357 372; 207
E1 19,2 342 257; 218
DCF 19,5 214 277; 242
E2 21,9 416 285; 326
EE2 22,7 425 300; 285
E3 23,5 504 311; 345
65
Figura 4.4- Cromatograma dos íons de quantificação dos doze analitos estudados.
4.6 Validação do método de quantificação dos microcontaminantes
Seletividade: Como a espectrometria de massas garante a seletividade do método, a
mesma foi obtida a partir da comparação dos tempos de retenção e dos cromatogramas dos
três íons selecionados para monitoramento.
Curva analítica e ajuste: a curva analítica foi resultante de três injeções de padrões
derivatizados nas concentrações de 0,1 µg/L a 200 µg/L e o padrão interno na concentração
fixa de 50 µg/L. A linearidade foi obtida plotando-se a média das replicatas de cada ponto,
com a demonstração do coeficiente de variação (CV) das replicatas, bem como a verificação
do coeficiente de correlação.
Efeito matriz: o efeito matriz foi avaliado adicionando a 450 µL do extrato da amostra
um volume de 50 µL de padrão na concentração de 100 µg/L, que após ser seco sob
nitrogênio foi ressuspendido para o volume de 100 µL. Deste modo a concentração final
adicionada (spiked) foi de 50 µg/L. O efeito matriz sobre o analito foi calculado a partir do
fator de correção do efeito matriz (FEM). As equações 1 e 2 indicam como os cálculos foram
realizados.
66
Onde,
Aspike = Área do pico do analito no extrato fortificado com 50 µg/L de padrão
Aamostra = Área do pico do analito no extrato da amostra
A padrão de 50 µg/L = Área do padrão na concentração de 50 µg/L em solvente, isento da
matriz
FEM = Fator de correção do efeito matriz
Exatidão: a exatidão do método foi verificada por adição e recuperação do método de
extração em três níveis de concentração sendo os níveis baixo (10 µg/L) e alto (100 µg/L) em
triplicata e o nível médio (50 µg/L) realizado em sete replicatas. Considerando a
indisponibilidade de um branco da matriz esgoto isenta dos analitos, o índice de recuperação
da extração foi obtido pela relação da área do pico no extrato da amostra adicionado de
padrão (Aamostra) descontada da área do pico do analito no extrato da amostra sem adição de
padrão (Abranco) comparada com a área da solução padrão (Asolução padrão) correspondente ao
nível corrigida do efeito matriz. A equação 3 expressa a fórmula utilizada.
Onde,
Aamostra = Área do pico do analito no extrato da amostra
Abranco = Área do pico do analito no extrato da amostra sem adição de padrão
Asolução padrão = Área da solução padrão correspondente ao nível em solvente, isenta de
matriz
FEM = Fator de correção do efeito matriz
Precisão: a precisão do aparelho foi verificada pelo coeficiente de variação de
triplicatas de injeção realizadas no mesmo dia, pelo mesmo analista e no mesmo aparelho, em
curto espaço de tempo.
Limite de detecção do método (LDM) e limite de quantificação do método (LQM)
Para estabelecer os limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) do
equipamento CG-EM foram injetadas concentrações decrescentes dos padrões. Para a
67
determinação do LD utilizou-se o método da relação sinal-ruído pelo software CG-EM
solutions em que se considerou os valores de concentração cujo sinal analítico fosse três vezes
o ruído. O LQ foi definido como a menor concentração cujo sinal analítico fosse 10 vezes o
ruído.
Para determinar os limites de detecção do método (LDM) e limites de quantificação do
método (LQM) foi considerado o fator de concentração e índice de recuperação do
procedimento de extração, e o efeito matriz. Os LD e LQ foram tomados como valores de
referência assim como os índices de recuperação do menor nível de concentração (10 µg/L)
estudado. Como descrito na equação 3, para o cálculo do índice de recuperação foi considerado
o efeito matriz na resposta dos analitos. Tais considerações foram feitas de acordo com a
equação 4.
Onde,
L = Limite de detecção ou limite de quantificação do equipamento
FC = Fator de concentração do procedimento de extração (neste caso FC = 40)
%R = Índice de recuperação do menor nível de concentração estudado
4.7 Análise de amostras reais
As amostras de esgoto foram coletadas do Centro de Pesquisa e Treinamento em
Saneamento (CePTS) da UFMG, contígua à estação de tratamento de esgotos (ETE) da bacia
do ribeirão Arrudas, em Belo Horizonte. Foram analisadas amostras de esgoto bruto (P1) e de
efluentes UASB (P2) seguido de filtro biológico percolado (P3) com rotosponge como
material de suporte (Figura 4.4). Foi feita apenas uma coleta para verificar a eficiência do
método validado bem como avaliar a eficiência de remoção dos microcontaminantes nos
tratamentos citados.
68
Figura 4.5- Esquema dos pontos de coleta
As amostras coletadas foram filtradas como descrito no item 4.2, extraídas pelo
método validado, derivatizadas e analisadas por CG/EM.
69
5 Resultados e Discussão
5.1 Otimização do método de extração
Na literatura, o método de extração de microcontaminantes em matrizes ambientais
mais comumente usado é a extração em fase sólida (EFS). Buscando o desenvolvimento de
um método simples, de fácil execução e de menor custo, foram feitos testes preliminares para
a execução do método de extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura (ELL-
PBT).
Na maioria dos trabalhos em que foi utilizada a técnica ELL-PBT, o solvente extrator
que obteve melhores recuperações foi a acetonitrila (GOULART, 2004; VIEIRA et al, 2007,
GOULART et al, 2010; MAGALHÃES et al, 2012). Em 2010, Pinho e colaboradores
extraíram pesticidas (clorpirifós, cialotrina, cipermetrina e deltametrina) em amostras de mel
utilizando a ELL-PBT. No entanto, o melhor solvente extrator foi a misturas de 4,33 : 1 de
acetonitrila e acetato de etila. O acetato de etila é um excelente solvente extrator e, por ser
menos polar (log Kow = 0,73) que a acetonitrila (log Kow = -0,34), a mistura de ambos é uma
boa opção. Neste trabalho optou-se por não utilizar o acetato de etila por se tratar de amostras
de esgoto e, portanto, muito complexas, podendo ser extraídos interferentes dos analitos de
interesse e componentes da amostra que poderiam comprometer a corrida cromatográfica.
Foi avaliado previamente o tempo de resfriamento da extração. Foram testados os
tempos de 1, 3 e 12 horas no freezer para extração dos analitos na concentração de 12,5 µg/L
em 4 mL de amostra e 8 mL de acetonitrila. Os extratos foram derivatizados como descrito no
item 4.4 e analisados por CG-EM. Os resultados da porcentagem de recuperação para os três
tempos estão apresentados na tabela 5.1.
Tabela 5.1- Porcentagem de recuperação estimada pela razão das áreas para os tempos de 1, 3
e 12 horas de resfriamento.
Analito 1 h 3 h 12 h
AAS 36,2 32,2 31,9
IBU 33,9 31,4 32,0
PCT 50,1 39,3 39,1
4-OP 42,0 44,8 47,4
CAF 40,9 43,1 32,2
NPX 33,8 29,4 31,6
4-NP 72,5 62,7 64,8
GEN -4,7 30,3 31,5
70
Tabela 5.1- Porcentagem de recuperação estimada pela razão das áreas para os tempos de 1, 3
e 12 horas de resfriamento (continuação)
Analito 1 h 3 h 12 h
BPA 61,2 55,6 63,3
DCF 72,6 66,7 66,6
E1 62,7 59,7 55,2
E2 61,6 56,3 56,9
EE2 54,2 51,6 50,2
É possível observar que não houve grande diferença na recuperação dos analitos para
os três tempos de resfriamento estudado, exceto para a genfibrozila que não foi extraída no
tempo de 1 hora. Porém, para esse mesmo tempo, houve dificuldade na extração da fase
orgânica cujo volume foi bem menor do que dos outros dois tempos. A partir disso, com o
objetivo de obter uma melhor recuperação de todos os analitos, foi decidido utilizar o método
de extração múltipla. Foi posto que seriam realizadas três extrações e cada uma delas com
tempo de resfriamento de 3 horas.
Foi realizado o planejamento fatorial completo 23 com ponto central para o estudo
mais completo de variáveis que poderiam influenciar na extração dos analitos. O volume de
amostra de esgoto utilizado foi fixo em 4 mL e contaminado com padrão de todos os analitos
obtendo uma concentração de 10 µg/L. A tabela 5.2 apresenta quais varáveis são
significativas para cada analito.
Tabela 5.2- Valores dos efeitos e do parâmetro p (α = 0,05) para cada variável estudada no
planejamento fatorial completo 23 com quadruplicata no ponto central. Os valores em
destaque são os que se mostraram significativos de acordo com o valor de p (p < 0,05).
Analito Média p
V1
(volume de
solvente)
p V2 (força
iônica) p
V3 (pH da
amostra) p
AAS 2,748 0,0008 0,5394 0,5107 -0,7236 0,3882 1,232 0,1749
IBU 1,085 8E-05 0,1978 0,2864 -0,2077 0,2664 0,08622 0,6206
4-OF 2,842 1E-06 -0,3803 0,0619 0,6306 0,01300 -0,4494 0,0384
CAF 1,013 3E-06 0,2768 0,0123 0,04561 0,5147 0,09025 0,2306
4-NF 4,307 1E-06 -1,915 0,0012 0,1194 0,6363 -0,7902 0,0278
GEN 2,020 8E-06 -0,05535 0,7564 -0,1593 0,3930 -0,2155 0,2654
NPX 1,736 2E-05 0,1860 0,3853 -0,2923 0,2008 -0,2322 0,2910
71
Tabela 5.2- Valores dos efeitos e do parâmetro p (α = 0,05) para cada variável estudada no
planejamento fatorial completo 23 com quadruplicata no ponto central. Os valores em
destaque são os que se mostraram significativos de acordo com o valor de p (p < 0,05)
(continuação).
Analito Média p
V1
(volume de
solvente)
p V2 (força
iônica) p
V3 (pH da
amostra) p
BPA 8,188 1E-06 -0,1185 0,7919 -0,3154 0,4947 -1,131 0,05460
DCF 0,8338 0,0001 -0,2746 0,1077 -0,3680 0,05040 -0,6058 0,01040
E1 1,852 1E-05 -0,09351 0,6148 -0,2073 0,2937 -0,1556 0,4157
E2 1,851 6E-07 -0,1513 0,1301 -0,2035 0,06290 -0,1815 0,08470
E3 0,6540 2E-06 0,01620 0,6947 -0,1451 0,01940 -0,09111 0,07650
EE2 1,362 4E-07 -0,08897 0,1622 -0,2556 0,00790 -0,1950 0,01990
Para que uma extração líquido-líquido seja eficiente a proporção amostra/volume do
solvente é um fator de grande importância. Espera-se que quanto maior o volume de solvente
extrator usado maior será a quantidade de analito extraído. No entanto, é possível observar
pela tabela acima que a variável 1 volume de solvente se mostrou significativa para apenas
dois analitos, sendo para a cafeína significativa no nível positivo (maior volume de solvente) e
para o 4-nonilfenol no nível negativo (menor volume de solvente).
A força iônica é uma variável interessante de ser estudada uma vez que a presença de
sal diminuiria a solubilidade do solvente em água devido o efeito de solvatação das moléculas
de água pelos íons de sal. Com isso, os analitos de interesse seriam extraídos com maior
eficiência devido a maior disponibilidade de solvente extrator. No entanto, esta variável se
mostrou significativa para apenas três analitos, sendo que para dois deles foi significativa no
nível negativo (sem adição de sal). Por fim, o pH teve influência para quatro analitos e para
todos eles no nível negativo (pH baixo).
Para definir quais seriam as condições ótimas de extração bem como analisar se
haveria necessidade de realizar um planejamento mais aprofundado, como uma superfície de
resposta, por exemplo, também foi calculada a porcentagem de extração dos analitos em cada
ensaio realizado no planejamento. Esse cálculo foi realizado comparando as áreas dos analitos
extraídos com as áreas de um padrão na concentração de 400 µg/L considerando o fator de
concentração do método de extração de 40 vezes. Um branco de cada ensaio foi feito para que
pudesse ser descontado nos valores das áreas antes de realizar o cálculo. A tabela 5.3 mostra
72
as porcentagens encontradas. Cabe ressaltar que os valores de índice de recuperação são
relativos, pois, não consideraram o efeito da matriz na resposta dos analitos nos extratos de
esgoto quando comparados com soluções em solvente. O paracetamol não está representado
na tabela abaixo devido ao fato de que o mesmo não obteve resposta cromatográfica quando
as análises foram realizadas. Mais tarde, no entanto, foi possível analisá-lo.
73
Tab
ela 5.3
- Porcen
tagem
de ex
tração d
os an
alitos em
cada en
saio d
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fatorial co
mpleto
23.
En
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2
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2
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1
83
,3
75
,0
52
,9
46
,2
82
,4
94
,2
56
,6
90
,8
65,3
9
7,1
8
5,9
1
03
,5
90
,1
2
10
0,0
7
6,0
4
5,5
69
,2
39
,3
74
,0
58
,8
82
,8
55,6
8
4,5
7
0,8
8
2,8
7
9,8
3
43
,4
42
,3
47
,2
61
,8
61
,9
71
,3
39
,7
76
,4
67,7
8
0,3
6
0,5
7
6,1
6
0,9
4
59
,6
66
,1
31
,4
82
,6
34
,1
74
,4
51
,1
88
,2
60,0
8
0,6
6
6,8
7
5,9
7
0,3
5
10
0,8
6
7,1
3
5,4
69
,0
51
,1
69
,0
45
,0
77
,5
53,8
8
5,7
6
6,9
8
0,8
7
1,6
6
11
1,5
7
5,0
1
2,3
81
,2
24
,2
72
,7
48
,9
71
,5
49,0
7
9,5
6
2,0
7
8,2
7
1,0
7
97
,5
62
,2
39
,6
58
,5
48
,1
68
,1
42
,9
74
,1
27,2
7
4,1
6
8,5
6
5,9
5
5,8
8
11
4,2
7
4,8
6
4,0
74
,6
58
,3
73
,6
45
,0
71
,8
-8,2
7
6,8
6
0,4
6
9,2
6
4,1
9
58
,3
55
,5
40
,1
66
,8
46
,1
67
,0
41
,8
84
,4
43,5
7
5,6
6
9,6
7
5,7
7
1,2
10
5
3,4
5
5,9
4
0,7
63
,9
50
,0
64
,7
38
,7
79
,2
25,5
6
8,1
6
3,6
7
5,4
7
0,6
11
5
1,1
5
0,0
3
5,5
56
,8
43
,0
63
,2
38
,2
73
,7
42,4
6
8,4
6
2,0
7
2,9
6
7,2
12
4
8,6
4
6,8
4
3,4
61
,5
51
,2
63
,6
41
,3
70
,3
42,2
6
9,3
6
2,5
7
2,8
5
8,7
74
Segundo a tabela acima é possível observar que o ensaio 1 obteve maiores
recuperações para a maioria dos analitos. Tal ensaio foi realizado com todas as variáveis no
nível negativo, ou seja, menor volume de solvente extrator estudado, sem adição de sal e
amostra com pH ácido. Este resultado é coerente com a análise da influência das variáveis,
que na maioria das vezes, se apresentaram significativas no nível mais baixo. Portanto, não se
fez necessário um estudo mais detalhado das variáveis e considerou-se como condições
ótimas para o método de múltipla extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura
em amostras de esgoto: 4 mL de amostra com pH 2, três porções de 3 mL de acetonitrila e
sem adição de sal, cujo procedimento está exposto na figura 5.1.
Figura 5.1- Procedimento de preparação de amostra
5.2 Validação do método
Para que o método de extração de microcontaminantes em amostras de esgoto
apresente confiabilidade foi realizada a validação do mesmo. Abaixo seguem os parâmetros
avaliados.
5.2.1 Seletividade
O trabalho foi desenvolvido utilizando espectrometria de massas que, por si só,
garante a seletividade do método levando em conta os tempos de retenção dos analitos e a
relação entre os íons selecionados para monitoramento como descritos na tabela 4.5.
75
As figuras 5.2, 5.3 e 5.4 indicam os cromatogramas e os espectros de massa dos íons
monitorados para p ibuprofeno, 4-octilfenol e estrona, respectivamente.
Figura 5.2- Cromatograma e espectro de massa dos íons monitorados do ibuprofeno
76
Figura 5.3- Cromatograma e espectro de massa dos íons monitorados do 4-octilfenol
77
Figura 5.4- Cromatograma e espectro de massa dos íons monitorados da estrona
5.2.2 Curva analítica e ajuste
As curvas analíticas e ajuste foram obtidas através da injeção de padrões derivatizados
em faixas de concentrações específicas para cada analito. Foi adicionada a cada padrão a
concentração de 50 µg/L do 4-nonilfenol deuterado usado como padrão interno. As curvas
foram construídas relacionando a média da razão da área do analito pela área do PI pela
concentração dos analitos em µg/L.
A tabela 5.4 mostra a faixa de concentração usada para cada analito bem como as
médias das razões áreas e o coeficiente de variação destas.
78
T
abela 5
.4- F
aixa d
e trabalh
o d
e cada an
alito, m
édia d
a razão d
a área do m
icroco
ntam
inan
te pela área d
o p
adrão
intern
o d
e 3 rep
licatas de in
jeção e co
eficiente
de v
ariação d
essa méd
ia
An
alito
s P
arâ
metro
s
estatístico
s
C
on
centra
ções u
tilizad
as (µ
g/L
)
0,1
1,0
2,5
5
10
15
25
50
75
100
125
150
175
200
AA
S
Méd
ia
CV
(%)
0,0
45
5,5
0
,082
2,7
0,1
0
5,2
0,2
2
0,4
5
0,2
2
1,9
0,3
1
2,5
0,5
2
0,9
4
0,6
3
2,5
1,2
0,7
6
1
,6
2,6
IBU
M
édia
CV
(%)
0,0
095
2,2
0,0
3
5,4
0,1
4
1,4
0,2
7
2,2
0,4
1
4,8
0,5
8
3,2
0,7
3
4,4
0,9
0
0,3
6
0,9
8
0,5
7
PC
T
Méd
ia
CV
(%)
0,0
069
0,8
4
0
,03
7
4,5
0,0
92
16
,6
0,2
4
7,3
0,3
8
4,6
0,6
3
2,5
0,7
4
3,9
0,9
7
2,6
0,8
4
1,5
1,3
8
8,0
4O
P
Méd
ia
CV
(%)
0,0
21
3,0
0,1
3
7,5
0,5
4
1,6
1,1
1,6
1,5
0,4
7
2,1
0,6
9
2,6
0,7
4
3,2
0,6
1
4
,5
1,2
4N
P
Méd
ia
CV
(%)
0,0
49
4,7
0,1
5
0,8
5
0
,62
1,3
1,3
1,0
1,9
0,8
8
2,5
0,8
9
3,3
0,0
88
3,9
0,8
7
4,1
0,9
6
5,4
0,3
5
GE
N
Méd
ia
CV
(%)
0,0
079
6,0
0,0
42
8,0
0,1
2
5,2
0,3
2
3,4
0,4
9
0,9
8
0,6
7
1,8
0,8
9
0,4
7
1,1
0,9
0
1,2
0,1
8
1,5
0,5
5
BP
A
Méd
ia
CV
(%)
0,0
39
2,4
7
0
,12
3,2
0,2
0
3,8
0,5
2
1,6
0,9
9
4,7
1,9
0,8
3
2,8
1,6
3,7
1,0
5,0
2,7
5,7
2,0
6,0
1,2
7,6
2,1
DC
F
Méd
ia
CV
(%)
0,0
01
2
2,1
0,0
036
5,0
0,0
07
2
8,7
0,0
35
7,0
0,0
87
4,6
0,1
4
4,8
0,2
2
1,3
0,2
7
4,1
0,3
5
2,7
0,3
8
2,0
E1
Méd
ia
CV
(%)
1,9
0,8
2
2,1
7,2
2,2
3,0
3,7
1,3
3,9
2,2
4,3
2,6
6,0
5,8
7,0
1,8
7,4
1,7
8,2
5,0
E2
Méd
ia
CV
(%)
0
,00
58
3,3
0,0
098
6,4
0,0
38
5,2
0,1
6
1,9
0,3
2
0,9
7
0,4
6
2,9
0,6
3
1,9
0,8
5
4,0
1,0
2,9
1,0
1,1
1,3
2,1
EE
2
Méd
ia
CV
(%)
0,0
07
1
2,8
0,0
099
7,7
0,0
23
8,5
0,0
37
7,3
0,0
1
2,4
0,1
4
3,2
0,2
0
5,3
0,2
7
10
,9
0,3
6
0,6
6
0,4
1
3,4
E3
Méd
ia
CV
(%)
0,0
02
9
1,9
0
,01
9
4,0
0,0
3
4,9
0,0
70
2,9
0,1
1
1,6
0,1
5
2,1
0,2
0
3,3
0,2
4
5,7
0,2
6
1,1
0,3
4
3,0
79
A
s figu
ras 5.5
a 5.1
6 m
ostram
as curv
as de calib
ração b
em co
mo as eq
uaçõ
es lineares o
u q
uad
ráticas dep
end
endo d
o an
alito e o
s valo
res
de co
eficiente d
e correlação
(R2).
Fig
ura
5.5
- Curv
a analítica p
ara o ácid
o acetil salicílico
(0,1
a 200
µg/L
)
Fig
ura
5.6
- Curv
a analítica p
ara o ib
upro
feno (2
,5 a 1
75 µ
g/L
)
Fig
ura
5.7
- Curv
a analítica p
ara o ácid
o p
aracetamol (2
,5 a 2
00
µg/L
)
Fig
ura
5.8
- Curv
a analítica p
ara o 4
-octilfen
ol (2
,5 a 2
00 µ
g/L
)
y = -33
.63
8x
2 + 18
5.5
4x - 1
2.7
89
R
² = 0.9
92
1
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
0
0.5
1
1
.5
2
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
y = 16
9.3
x + 2.3
25
9
R² = 0
.99
74
0
50
10
0
15
0
20
0
0
0.5
1
1
.5
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
y = -32
.56
x2 + 1
85
.28
x + 4.8
89
7
R² = 0
.99
83
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
0
0.5
1
1
.5
Concetração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
y = 44
.92
x + 3.9
93
R
² = 0.9
96
2
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
0
1
2
3
4
5
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
80
Fig
ura
5.9
- Curv
a analítica p
ara o 4
-nonilfen
ol (2
,5 a 2
00 µ
g/L
)
Fig
ura
5.1
0- C
urv
a analítica p
ara a gen
fibro
zila (2,5
a 200 µ
g/L
)
Fig
ura
5.1
1- C
urv
a analítica p
ara o b
isfenol A
(0,1
a 200 µ
g/L
)
Fig
ura
5.1
2- C
urv
a analítica p
ara o d
iclofen
aco (2
,5 a 2
00 µ
g/L
)
y = 38
.32
7x + 2
.35
59
R
² = 0.9
93
8
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
0
1
2
3
4
5
6
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
y = 13
6.9
8x + 5
.64
23
R
² = 0.9
94
2
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
0
0.5
1
1
.5
2
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
y = 26
.92
2x - 0
.67
42
R
² = 0.9
95
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
0
2
4
6
8
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
y = 41
8.1
7x + 8
.52
6
R² = 0
.99
37
0
50
10
0
15
0
20
0
0
0.1
0
.2
0.3
0
.4
0.5
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
81
Fig
ura
5.1
3- C
urv
a analítica p
ara a estron
a (0,1
a 200 µ
g/L
)
Fig
ura
5.1
4- C
urv
a analítica p
ara o estrad
iol (1
a 200 µ
g/L
)
Fig
ura
5.1
5-
Curv
a an
alítica para
o
etinilestrad
iol
(0,1
a
175
µg/L
)
Fig
ura
5.1
6- C
urv
a analítica p
ara o estrio
l (2,5
a 20 µ
g/L
)
y = 1.9
87
3x
2 + 11
.70
6x - 2
8.5
29
R
² = 0.9
82
7
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
1
3
5
7
9
Concentração (µg/L)
Árae
/Áre
a PI
y = 14
9.6
9x + 1
.92
64
R
² = 0.9
94
2
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
0
0.5
1
1
.5
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
y = -36
7.3
8x
2 + 56
8.9
8x - 1
.50
91
R
² = 0.9
96
7
0
50
10
0
15
0
20
0
0
0.1
0
.2
0.3
0
.4
0.5
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
y = 60
3.8
8x + 5
.98
11
R
² = 0.9
91
1
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
0
0.1
0
.2
0.3
0
.4
Concentração (µg/L)
Áre
a/Áre
a PI
82
Foram obtidas regressões lineares ou quadráticas dependendo do analito em questão.
Os coeficientes de correlação (R2) encontrados foram sempre maiores que 0,98 para todos os
analitos, o que atende ao critério de linearidade do INMETRO que aceita um valor maior que
0,90.
5.2.3 Limite de detecção e de quantificação
Para verificar os limites de detecção e de quantificação do equipamento CG-EM foram
injetadas soluções padrão na faixa entre 0,1 e 10 µg/L. O limite detecção estimada foi
estabelecido pelo calculo da relação sinal/ruído. A confirmação do LD e LQ do equipamento
foi feita pela diluição dos padrões até a concentração estimada, sendo considerada para LD a
menor concentração em que o sinal observado do analito fosse três vezes maior que o ruído da
linha de base. Já o limite de quantificação foi estabelecido como sendo a menor concentração
cujo sinal analítico fosse dez vezes maior que o ruído. A tabela 5.5 aponta os limites de
detecção e de quantificação do equipamento.
Tabela 5.5- Limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) do equipamento CG-
EM.
Analito LD (µg/L) LQ (µg/L)
AAS 0,036 0,12
IBU 0,21 0,70
PCT 1,02 3,4
4-OP 0,18 0,60
4-NP 0,41 1,4
GEN 0,49 1,6
BPA 0,074 0,25
DCF 0,33 1,1
E1 0,0020 0,0066
E2 0,031 0,10
EE2 0,024 0,078
E3 0,1 0,33
Para os limites de detecção e quantificação do método foi levado em consideração o
fator de concentração de 40 vezes da ELL-PBT, o índice de recuperação e o efeito matriz. Os
valores de LD e LQ do aparelho foram usados como referência para o cálculo, bem como os
valores de recuperação e efeito matriz encontrados para o menor nível de concentração
estudado (10 µg/L). A tabela 5.6 mostra os valores encontrados para limites de detecção e
quantificação do método.
83
Tabela 5.6- Limites de detecção (LDM) e limites de quantificação (LQM) do método.
Analito LDM (µg/L) LQM (µg/L)
AAS 0,00060 0,0020
IBU 0,0064 0,021
PCT 0,0031 0,011
4-OP 0,0038 0,013
4-NP 0,0038 0,013
GEN 0,0021 0,0070
BPA 0,0013 0,0046
DCF 0,00053 0,0018
E1 0,000089 0,00030
E2 0,00095 0,0032
EE2 0,00041 0,0014
E3 0,0045 0,015
Os resultados obtidos de LDM e LQM são satisfatórios quando comparados com
algumas literaturas. Gomes e colaboradores (2011) obtiveram para o ibuprofeno, estrona e
estradiol em amostras de esgoto e efluentes analisados em CG/EM valores de limites de
detecção de 0,105, 0,16 e 0,0952 µg/L, respectivamente e limite de quantificação de 0,5 µg/L
para todos eles. Os hormônios estrona, estradiol, etinilestradiol e estriol, também analisados
por CG/EM, foram estudados por Migowska e colaboradores 2012 que encontraram limites
de detecção, em µg/L, de: 0,0085 (E1), 0,010 (E2), 0,0081 (EE2) e 0,0068 (E3).
5.2.4 Precisão
Para avaliar a precisão do equipamento foi calculado o coeficiente de variação de
cinco replicatas de injeção de padrão dos microcontaminantes em três níveis de concentração
de acordo com a faixa de trabalho utilizada para cada analito. Os padrões foram preparados e
injetados pelo mesmo analista, no mesmo dia, no mesmo equipamento e em curto espaço de
tempo. Os resultados obtidos estão apresentados na tabela 5.7.
84
Tabela 5.7- Valores do coeficiente de variação de cinco replicatas em três níveis para cada
microcontaminante
Analito Concentrações
(µg/L)
Média
(área/área PI) C.V. (%)
AAS
200 1,60 2,59
75 0,52 0,94
2,5 0,082 2,65
IBU
175 0,98 0,57
75 0,41 4,81
2,5 0,0095 2,14
PCT
200 1,38 8,00
75 0,38 4,58
2,5 0,0069 0,84
4-OP
200 4,53 1,23
75 1,53 0,466
2,5 0,021 2,95
4-NP
200 5,36 0,35
75 1,89 0,88
2,5 0,049 4,66
GEN
200 1,48 0,559
75 0,493 0,982
2,5 0,0079 5,98
BPA
200 7,57 2,07
75 2,76 1,61
2,5 0,119 3,19
DCF
175 0,389 2,01
75 0,141 4,83
2,5 0,0012 2,29
E1
200 8,24 4,99
75 4,34 2,64
2,5 2,08 7,19
E2
200 1,34 2,14
75 0,46 2,87
2,5 0,0098 6,36
EE2
175 0,409 3,44
75 0,14 3,16
2,5 0,0099 7,71
E3
200 0,34 2,96
75 0,10 1,61
2,5 0,0032 1,86
85
Para todos os analitos foi obtido C.V. variando de 0,578 a 8,00 e, portanto, menor que
20% para os três níveis estudados o que está de acordo com o critério de precisão do
INMETRO.
5.2.5 Exatidão e precisão do método
Quando não há disponível um material de referência certificado, nem um método de
referência, pode-se mensurar a exatidão realizando a adição de uma concentração conhecida
em uma amostra e verificando se o método é capaz de retornar o resultado com o valor
verdadeiro adicionado. Esta técnica de conferência também é denominada de “adição e
recuperação (THOMPSON et al., 2002).
Para tanto foram avaliadas as recuperações do método de extração em três níveis
sendo os níveis baixo e alto realizados em triplicata e o nível médio em sete replicatas. A
recuperação média, calculada de acordo com a equação 3, e o coeficiente de variação das
replicatas do método para cada analito nos níveis de 10, 50 e 100 µg/L estão apresentados na
tabela 5.8.
Tabela 5.8- Índice de recuperação da ELL-PBT para três níveis de concentração
Analito Concentração
(µg/L)
Recuperação
média (%) C.V. (%) n
AAS
10 148,70 3,09 3
50 121,04 9,18 7
100 103,11 3,08 3
IBU
10 82,45 2,99 3
50 45,24 18,17 7
100 64,78 7,37 3
PCT
10 811,86 7,22 3
50 109,68 13,20 7
100 40,00 7,60 3
4-OP
10 115,96 1,24 3
50 29,34 14,83 7
100 29,95 2,17 3
4-NP
10 263,64 0,84 3
50 47,38 17,01 7
100 38,67 5,73 3
GEN
10 582,20 2,795 3
50 70,41 12,92 7
100 61,42 13,71 3
86
Tabela 5.8 – Índice de recuperação da ELL-PBT para três níveis de concentração
(Continuação).
Analito Concentração
(µg/L)
Recuperação
média (%) C.V. (%) n
BPA
10 135,87 2,41 3
50 26,96 14,28 7
100 34,06 6,97 3
DCF
10 1536,08 0,872 3
50 146,82 7,11 7
100 299,34 5,68 3
E1
10 55,37 5,27 3
50 18,79 12,23 7
100 45,65 5,70 3
E2
10 82,46 16,71 3
50 18,37 15,81 7
100 21,97 14,24 3
EE2
10 141,08 9,51 3
50 63,50 16,17 7
100 81,62 8,70 3
E3
10 55,52 9,29 3
50 21,17 15,40 7
100 29,67 11,16 3
Os valores de C.V. encontrados estão variando entre 0,84 até 18,17sendo todos abaixo
de 20% descrito como ideal pelos guias de validação. É possível observar que para a maioria
dos analitos foi obtida uma recuperação satisfatória uma vez que se trata de extração
simultânea de compostos com características físico-químicas distintas. Além disso, trata de
uma amostra muito complexa em que pode haver preferência por interferentes pelo solvente
extrator.
Índices de recuperação maiores que 100 % podem ser atribuídos ao efeito da matriz na
transferência de massa do liner do injetor para a coluna cromatográfica. No trabalho de Erney
e colaboradores (1993), em que analisaram pesticidas organoclorados em matrizes
gordurosas, foi observado um aumento nas respostas dos analitos no extrato da matriz em
relação às respostas em solvente puro. Isso pode ser explicado pelo fato de que quando os
analitos estão no extrato da matriz a adsorção no liner é afetada pela competição com co-
extrativos matriciais. Com isso, quantidades maiores de analitos são transferidos para a coluna
cromatográfica resultando em maior resposta pelo detector.
87
O mesmo fato foi observado por Pinho e colaboradores (2012) que estudaram o a
resposta de dois pesticidas, clorpirifós e deltametrina. Eles relataram que, na presença da
deltametrina, a resposta do clorpirifós é aumentada. Apesar da deltametrina ser a menos polar
dos dois pesticidas ela tem maior peso molecular e temperatura de ebulição, fazendo com que
ela seja adsorvida preferencialmente nos componentes do injetor (liner, lã de vidro e início da
coluna). Desta forma, levando a menor interação do clorpirifós com os componentes do
injetor.
5.2.6 Efeito Matriz
O efeito de supressão ou aumento do sinal cromatográfico conhecido como efeito
matriz é muito discutido na análise de traços em amostras complexas. Em cromatografia
gasosa componentes da matriz tendem a bloquear locais ativos, principalmente grupos
silanóis livres, na coluna cromatográfica e na entrada do CG ocasionando um aumento na
resposta (MASTOVSKA et al., 2005).
Para determinar o efeito de matriz e seu fator de correção (FEM) foi realizado um spike
no extrato da amostra, ou seja, foi adicionada uma concentração de 50 µg/L de padrão aos
extratos das amostras que foram inicialmente fortificadas para obterem as concentrações
finais dos níveis utilizados na etapa de exatidão.
Quando o efeito matriz é maior que 1 indica um efeito aumentativo e se menor que 1
um efeito supressivo. A tabela 5.9 indica os valores do fator de correção de efeito de matriz e
o efeito para cada analito em três níveis de concentração.
Tabela 5.9- Efeito de matriz para cada analito em três níveis de concentração
Analito Concentração
(µg/L) FEM
Supressão ou
aumento do sinal
AAS
10 1,61 Aumento de 61%
50 1,99 Aumento de 99%
100 2,04 Aumento de 104%
IBU
10 1,29 Aumento de 29%
50 1,34 Aumento de 34%
100 1,76 Aumento de 76%
PCT
10 1,97 Aumento de 97%
50 1,13 Aumento de 13%
100 0,79 Supressão de 21%
88
Tabela 5.9– Efeito de matriz para cada analito em três níveis de concentração (Continuação)
Analito Concentração
(µg/L) EM
Supressão ou
aumento do sinal
4-OP
10 1,03 Aumento de 3%
50 1,07 Aumento de 7%
100 1,20 Aumento de 20%
4-NP
10 1,06 Aumento de 6%
50 1,05 Aumento de 5%
100 1,14 Aumento de 14%
GEN
10 0,98 Supressão de 2%
50 0,99 Supressão de 1%
100 1,36 Aumento de 36%
BPA
10 1,18 Aumento de 18%
50 1,05 Aumento de 5%
100 1,43 Aumento de 43%
DCF
10 1,68 Aumento de 68%
50 1,92 Aumento de 92%
100 2,78 Aumento de 178%
E1
10 0,97 Supressão de 3%
50 0,71 Supressão de 29%
100 1,26 Aumento de 26%
E2
10 0,89 Supressão de 11%
50 0,72 Supressão de 18%
100 1,03 Aumento de 3%
EE2
10 1,49 Aumento de 49%
50 1,25 Aumento de 25%
100 1,95 Aumento de 95%
E3
10 0,99 Supressão de 1%
50 0,86 Supressão de 14%
100 1,33 Aumento de 33%
Para a maioria dos analitos, nos três níveis de concentração estudados, foi observado
um aumento do sinal cromatográfico devido a matriz. O esgoto doméstico é uma matriz
bastante complexa constituída de muitos componentes que competem com os analitos de
interesse no sistema cromatográfico causando tais resultados.
5.3 Análise de amostras reais
As amostras de esgoto foram coletadas do Centro de Pesquisa e Treinamento em
Saneamento (CePTS) da UFMG, contígua à estação de tratamento de esgotos (ETE) da bacia
89
do ribeirão Arrudas, em Belo Horizonte. Foram analisadas amostras de esgoto bruto (P1) e de
efluentes UASB (P2) seguido de filtro biológico percolado (P3) com rotosponge como
material de suporte.
Os filtros biológicos percoladores são sistemas aeróbios de tratamento de esgotos,
podendo ser aplicados como etapa de pós-tratamento de efluentes de reatores UASB.
Assumindo a etapa de pós-tratamento, o efluente do reator UASB é distribuído na parte
superior do Filtro Biológico Percolador (FBP), onde o fluxo de esgoto passa a ter uma
trajetória descendente através de um material de enchimento. A biomassa presente no volume
reacional de filtros biológicos percoladores se desenvolve caracteristicamente aderida ao meio
suporte e assume importante papel na conversão de constituintes presentes nos esgotos. O
FBP aberto não possui compartimento de decantação, sendo que o biofilme desprendido do
meio suporte sai junto com o efluente tratado. Não há também paredes laterais e laje de fundo
falso, proporcionando economias adicionais de concreto. Uma das grandes vantagens de
utilização dos filtros percoladores reside no fato de que a transferência de oxigênio ocorre
naturalmente, a partir da circulação do ar atmosférico pelo material de enchimento, sem a
necessidade de equipamentos mecânicos. No FBP aberto, a circulação de ar é maior devido à
inexistência de paredes (CEPTs, 2012). A tabela 5.10 mostra as concentrações dos analitos
encontrados em cada amostra.
Tabela 5.10- Concentrações dos analitos encontrados em amostras de esgoto bruto e efluentes
UASB e FBP
Analito Esgoto bruto (µg/L) UASB (µg/L) FBP (µg/L)
AAS 72,64 14,23 6,74
PCT 237,49 - -
BPA 10,71 9,02 5,00
E1 436,46 55,30 54,16
E3 8,10 7,62 7,01
Foi possível detectar nas amostras de esgoto bruto os fármacos ácido acetilsalicílico
(AAS) e paracetamol (PCT) que são medicamentos largamente utilizados sem prescrição; o
plastificante bisfenol A (BPA) que está presente em embalagens plásticas em geral; e os
hormônios naturais estrona (E1) e estriol que é metabólito da estrona e do estradiol (E3). No
primeiro tratamento (UASB) houve redução significativa do AAS e da E1, além de não ter
sido encontrado o PCT. No entanto, se mostrou pouco eficiente para o BPA e E3. O segundo
90
tratamento (FBP), que ocorre depois do UASB, se mostrou pouco eficiente para a remoção
destes compostos uma vez que foram encontrados nesse efluente em concentrações próximas
às do efluente anterior.
Os demais microcontaminantes não foram encontrados em nenhuma amostra
analisada.
91
6 Conclusões
Os microcontaminantes têm despertado a atenção da sociedade científica quanto a
ocorrência destes em amostras ambientais e os efeitos causados à saúde da biota. A entrada
destes compostos no meio ambiente é recorrente de várias rotas humanas e pouco se sabe
sobre a remoção nos sistemas de tratamento de esgoto doméstico. O fato de estarem em
concentrações muito baixas e se tratarem de compostos com variadas características físico-
químicas é importante obter um método de concentração e extração eficiente para a análise
simultânea.
Neste trabalho foi desenvolvido o método de múltipla extração líquido-líquido com
partição em baixa temperatura (ELL-PBT) para análise simultânea em CG-EM de doze
microcontaminantes (AAS, IBU, PCT, 4-OP, 4-NP, GEN, DCF, BPA, E1, E2, EE2 e E3) em
amostra de esgoto doméstico. O método consiste em ajuste do pH da amostra para 2, 3
porções de 3 mL de acetonitrila como solvente extrator e resfriamento por 3 horas para cada
extração. O extrato é então seco em N2, ressuspenso em 1 mL de metanol e seco novamente
em vial com insert de 100 µL. A esse vial adiciona-se 25 µL de piridina e 75 µL de BSTFA +
1% TCMS e a mistura é levada para a estufa a 80 oC durante 30 minutos para a reação de
derivatização necessária para tornar os analitos passíveis de análise em CG. O extrato foi
então analisado e os microcontaminantes identificados e quantificados por CG-EM nas
condições previamente otimizadas.
O método foi validado e aplicado em amostras reais de esgoto bruto e efluentes
tornando possível a avaliação da remoção de alguns microcontaminantes encontrados durante
o tratamento.
92
7 Trabalhos Futuros
A partir deste trabalho temos como sugestões para trabalhos futuros
Testar outros solventes e misturas destes como solvente extrator;
Analisar outras classes de microcontaminantes que sejam passíveis de derivatização;
Utilizar a derivatização on line a fim de consumir o mínimo de reagente derivatizante
possível bem como diminuir o tempo do preparo de amostra;
Usar o método de extração para análise em CLAE-EM.
93
8 Referências Bibliográficas
ALDAD, T. S.; RAHMANI, N.; LERANTH, C.; TAYLOR, H. S. Bisphenol-A exposure
alters endometrial progesterone receptor expression in the nonhuman primate. Fertility and
Sterility, v. 96, n. 1, p. 175-179, jul 2011.
ANDREW, M. N.; O’CONNOR, W. A.; DUNSTAN, R. H.; MACFARLANE, G. R.
Exposure to 17α-ethynylestradiol causes dose and temporally dependent changes in intersex,
females and vitellogenin production in the Sydney rock oyster. Ecotoxicology, v. 19, n. 8, p.
1440-1451, 11 ago 2010.
ANGLIN, C.; MCKINLEY, W. P. Procedure for Cleanup of Plant Extracts Prior to Analyses
for DDT and Related Pesticides. Agricultural and Food Chemistry, v. 8, n. 3, p. 186-189,
1960.
ASIMAKOPOULOS, A. G.; THOMAIDIS, N. S.; KOUPPARIS, M. A. Recent trends in
biomonitoring of bisphenol A, 4-t-octylphenol, and 4-nonylphenol. Toxicology Letters, v.
210, n. 2, p. 141-54, 25 abr 2012.
BAI-JUAN, Y.; FENG-HUA, J.; XIAO-QIN, X.; JUN-HUI, C.; LEE, F. S. C. Determination
of Alkylphenols in Water by Solid-Phase Extraction with On-column Derivatization Coupled
with Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Chinese Journal os Analytical Chemistry,
v. 35, n. 5, p. 633-637, 2007.
Balfour, J.A. & Heel, R.C. (1990) Transdermal estradiol: A review of its pharmacodynamic
and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy in the treatment of menopausal
complaints. Drugs, 40, 561–582
BARONTI, C.; CURINI, R.; ASCENZO, G. D. et al. Monitoring Natural and Synthetic
Estrogens at Activated Sludge Sewage Treatment Plants and in a Receiving River Water.
Environmental Science & Technology, v. 34, n. 24, p. 5059-5066, 2000.
BASHEER, C.; LEE, H. K. Analysis of endocrine disrupting alkylphenols, chlorophenols and
bisphenol-A using hollow fiber-protected liquid-phase microextraction coupled with injection
port-derivatization gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A,
v. 1057, p. 163-169, 2004.
BEAMAN, J.; CO-CHAIR, W.; EIGNOR, D.; HUFF, L. AQUATIC LIFE CRITERIA FOR
CONTAMINANTS OF EMERGING CONCERN. Environmental Protection, 2008.
94
BECKER, R. W. Determinação de anti-inflamatórios em efluente urbano na região de
Porto Alegre-RS por SPE, derivatização e GC-MS. [S.l.]: Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, 2012.
BEHERA, S. K.; KIM, H. W.; OH, J.-E.; PARK, H.-S. Occurrence and removal of
antibiotics, hormones and several other pharmaceuticals in wastewater treatment plants of the
largest industrial city of Korea. The Science of the total environment, v. 409, n. 20, p. 4351-
60, 15 set 2011.
BENDZ, D.; PAXÉUS, N. A.; GINN, T. R.; LOGE, F. J. Occurrence and fate of
pharmaceutically active compounds in the environment, a case study: Hoje River in Sweden.
Journal of Hazardous Materials, v. 122, p. 195-204, 2005.
BILA, D.; DEZOTTI, M. Fármacos no Meio Ambiente. Química Nova, v. 26, n. 4, p. 523-
530, 2003.
BILA, D.; DEZOTTI, M. Desreguladores Endócrinos no Meio Ambiente: Efeitos e
Consequências. Química Nova, v. 30, n. 3, p. 651-666, 2007.
BIZKARGUENAGA, E.; ROS, O.; IPARRAGUIRRE, A. et al. Solid-phase extraction
combined with large volume injection-programmable temperature vaporization-gas
chromatography-mass spectrometry for the multiresidue determination of priority and
emerging organic pollutants in wastewater. Journal of Chromatography. A, v. 1247, p. 104-
17, 20 jul 2012.
BUCHBERGER, W. W. Current approaches to trace analysis of pharmaceuticals and personal
care products in the environment. Journal of chromatography. A, v. 1218, n. 4, p. 603-18,
28 jan 2011.
BUENO, M. M. J.; GOMEZ, M. J.; HERRERA, S. et al. Occurrence and persistence of
organic emerging contaminants and priority pollutants in five sewage tratment plants of
Spain: Two years pilot survey monitoring. Environmental Pollution, v. 164, p. 267-273,
2012.
BUERGE, I. J.; POIGER, T.; MULLER, M. D.; BUSER, H.-RUDOLF. Caffeine , an
Anthropogenic Marker for Wastewater Contamination of Surface Waters. Production, v. 37,
n. 4, p. 691-700, 2003.
95
BUERGE, I. J.; POIGER, T.; MULLER, M. D.; BUSER, H.-RUDOLF. Combined Sewer
Overflows to Surface Waters Detected by the Anthropogenic Marker Caffeine.
Environmental Science & Technology, v. 40, n. 13, p. 4096-4102, 2006.
CELIZ, M. D.; TSO, J.; AGA, D. S. Pharmaceutical Metabolites in the Environment :
Aanalytical Challenges and Ecological Risks. Environmental Toxicology, v. 28, n. 12, p.
2473-2484, 2009.
CEPTS. Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento. [S.l: s.n.], [S.d.]. p. 31, 2012
CHAHADE, W. H.; DALVA, R.; GIORGI, N.; SZAJUBOK, J. C. M. Antiinflamatórios não
hormonais. Einstein, v. 6, n. Supl 1, p. 166-174, 2008.
ChemSpider. .Disponível em: <http://www.chemspider.com>. Acesso em: 26/12/2012
DANESHVAR, A.; ABOULFADL, K.; VIGLINO, L. et al. Evaluating pharmaceuticals and
caffeine as indicators of fecal contamination in drinking water sources of the Greater
Montreal region. Chemosphere, v. 88, n. 1, p. 131-9, jun 2012.
DAS, D.; GUPTA, U.; DAS, A. K. Recent developments in solid phase extraction in
elemental speciation of environmental samples with special reference to aqueous solutions.
TrAC Trends in Analytical Chemistry, v. 38, p. 163-171, set 2012.
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve ensaio. Química
Nova na Escola, v. 7, p. 21-25, 1998.
DOCHERTY, K. S.; ZIEMANN, P. J. On-line, inlet-based trimethylsilyl derivatization for
gas chromatography of mono- and dicarboxylic acids. Journal of Chromatography A, v.
921, p. 265-275, 2001.
ERNEY, D. R.; GILLESPIE, A. M.; GILVYDIS, D. M. Explanation of the matrix-induced
chromatographic response enhancement of organophosphorus pesticides during open tubular
column gas chromatography with splitless or hot on-column injection and flame photometric
detection. Journal of Chromatography, v. 638, p. 57-63, 1993.
FATTA-KASSINOS, D.; MERIC, S.; NIKOLAOU, A. Pharmaceutical residues in
environmental waters and wastewater: current state of knowledge and future research.
Analytical and bioanalytical chemistry, v. 399, n. 1, p. 251-75, jan 2011.
96
FENT, K.; WESTON, A. A; CAMINADA, D. Ecotoxicology of human pharmaceuticals.
Aquatic toxicology (Amsterdam, Netherlands), v. 76, n. 2, p. 122-59, 10 fev 2006.
FERNANDES, C.; HOECK, E. VAN; SANDRA, P.; LANÇAS, F. M. Determination of
fluoxetine in plasma by gas chromatography-mass spectrometry using stir bar sorptive
extraction. Analytica Chimica Acta, v. 614, n. 2, p. 201-7, 5 maio 2008.
FILHO, R. W. R.; ARAÚJO, J. C.; VIEIRA, E. M. Hormônios Sexuais Estrógenos:
Contaminantes Emergentes. Química Nova, v. 29, n. 4, p. 817-822, 2006.
GABET, V.; MIÈGE, C.; BADOS, P.; COQUERY, M. Analysis of estrogens in
environmental matrices. Trends in Analytical Chemistry, v. 26, n. 11, p. 1113-1131, dez
2007.
GISLAINE GHISELLI. Avaliação da Qualidade das Águas Destinadas ao Abastecimento
Público na Região de Campinas : Ocorrência e Determinação dos Interferentes
Endócrinos ( IE ) e Produtos Farmacêuticos e de Higiene Pessoal ( PFHP ) Aluna :
Gislaine Ghiselli Orientador : Wilson. [S.l.]: Universidade Estadual de Campinas, 2006.
GHISELLI, G.; JARDIM, F. W. Interferentes Endócrinos no Ambiente. Química Nova, v.
30, n. 3, p. 695-706, 2007.
GLADE, M. J. Caffeine-Not just a stimulant. Nutrition (Burbank, Los Angeles County,
Calif.), v. 26, n. 10, p. 932-8, out 2010.
GOODMAN GILMAN, A. Goodman & Gilman, As bases farmacológicas da terapêutica. 10a
ed. Mc Graw Hill, 2005.
GOMES, P. C. F. DE L.; BARLETTA, J. Y.; NAZARIO, C. E. D. et al. Optimization of in
situ derivatization SPME by experimental design for GC-MS multi-residue analysis of
pharmaceutical drugs in wastewater. Journal of separation science, v. 34, n. 4, p. 436-45,
fev 2011.
GÓMEZ, M. J.; BUENO, M. M. J.; LACORTE, S.; FERNÁNDEZ-ALBA, A. R.; AGUERA,
A. Pilot Survey monitoring pharmaceuticals and related compounds in a sewage treatment
plant located on the Mediterranean coast. Chemosphere, v. 66, p. 993-1002, 2007.
97
GOULART, S. M.; QUEIROZ, M. E. L. R. DE; NEVES, A. A.; QUEIROZ, J. H. DE. Low-
temperature clean-up method for the determination of pyrethroids in milk using gas
chromatography with electron capture detection. Talanta, v. 75, n. 5, p. 1320-3, 15 jun 2008.
GOULART, S. M.; ALVES, R. D.; NEVES, A. A. et al. Optimization and validation of
liquid-liquid extraction with low temperature partitioning for determination of carbamates in
water. Analytica chimica acta, v. 671, n. 1-2, p. 41-7, 25 jun 2010.
HATCH, E. E.; NELSON, J. W.; STAHLHUT, R. W.; WEBSTER, T. F. Association of
endocrine disruptors and obesity: perspectives from epidemiological studies. International
journal of andrology, v. 33, n. 2, p. 324-32, abr 2010.
HEBERER, T. Tracking persistent pharmaceutical residues from municipal sewage to
drinking water. Journal of Hydrology, v. 266, n. 3-4, p. 175-189, set 2002.
HERNANDO, M. D.; MEZCUA, M.; GÓMEZ, M. J. et al. Comparative study of analytical
methods involving gas chromatography–mass spectrometry after derivatization and gas
chromatography–tandem mass spectrometry for the determination of selected endocrine
disrupting compounds in wastewaters. Journal of Chromatography A, v. 1047, p. 129-135,
2004.
HIDVÉGI, E.; PÉTER, F.; HIDEG, Z.; SOMOGYI, G. GC–MS determination of
amphetamines in serum using on-line trifluoroacetylation. Forensic Science International, v.
161, p. 119-123, 2006.
HUANG, B.; PAN, X.-J.; WAN, X. et al. Simultaneous Determination of Steroid Endocrine
Disrupting Chemicals in Water by Solid Phase Extraction-Derivatization-Gas
Chromatographic-Mass Spectrometry. Chinese Journal of Analytical Chemistry, v. 39, n. 4,
p. 449-454, 2011.
IARC, ESTROGEN-ONLY MENOPAUSAL THERAPY. IARC Monographs, 2012.
INMETRO- Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial. DOQ-
CGCRE-008: Orientações sobre validação de métodos analíticos. Rio de Janeiro, n.3, p.1-20
2010.
98
JARDIM, W. F.; MONTAGNER, C. C.; PESCARA, I. C. et al. An integrated approach to
evaluate emerging contaminants in drinking water. Separation and Purification
Technology, v. 84, p. 3-8, jan 2012.
JIANG, J. Q.; YIN, Q.; ZHOU, J. L.; PEARCE, P. Occurrence and treatment trials of
endocrine disrupting chemicals (EDCs) in wastewaters. Chemosphere, v. 61, n. 4, p. 544-50,
out 2005.
JORDÃO, E.P; PESSOA, C.A. Tratamento de Esgotos Domésticos. 3.ed., Rio de Janeiro:
Associação Brasileira de Engenharia Sanitária – ABES, 1995 – 681 p.
JUHLER, R. K. Optimized method for the determination of organophosphorus pesticides in
meat and fatty matrices. Journal of chromatography. A, v. 786, n. 1, p. 145-53, 24 out 1997.
KANDA, R.; GLENDINNING, R. Mass spectrometry for environmental and wastewater
monitoring. Spectroscopy Europe, v. 23, n. 5, 2011.
KIDD, K. A.; BLANCHFIELD, P. J.; MILLS, K. H. et al. Collapse of a fish population after
exposure to a synthetic estrogen. Procedings of the Nacional Academy of Sciences, v. 104,
n. 21, p. 8897-8901, 2007.
KOLE, P. L.; VENKATESH, G.; KOTECHA, J.; SHESHALA, R. Recent advances in sample
preparation techniques for effective bioanalytical methods. Biomedical chromatography :
BMC, v. 25, n. 1-2, p. 199-217, jan 2011.
KOSTOPOULOU, M.; NIKOLAOU, A. Analytical problems and the need for sample
preparation in the determination of pharmaceuticals and their metabolites in aqueous
environmental matrices. Trends in Analytical Chemistry, v. 27, n. 11, p. 1023-1035, dez
2008.
KUMAR, A.; WILLIAMS, M.; WOODS, M. et al. Treated effluent in the aquatic
environment : impact assessment of endocrine disrupting chemicals. [S.l: s.n.], 2012.
KÜMMERER, K. Pharmaceuticals in the Environment. Annual Review of Environment
and Resources, v. 35, n. 1, p. 57-75, 21 nov 2010.
LIU, J.; WANG, R.; HUANG, B. et al. Biological effects and bioaccumulation of steroidal
and phenolic endocrine disrupting chemicals in high-back crucian carp exposed to wastewater
treatment plant effluents. Environmental Pollution, v. 162, p. 325-31, mar 2012.
99
LUNDSTEDT, T.; SEIFERT, E.; ABRAMO, L. et al. Experimental design and optimization.
Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, v. 42, n. 1-2, p. 3-40, ago 1998.
MAGALHÃES, E. J.; NASCENTES, C. C.; AUGUSTI, R. et al. Fast Determination of
Benzodiazepines in Human Urine via Liquid-Liquid Extraction with Low Temperature
Partitioning and LC-HRMS. American Journal of Analytical Chemistry, v. 03, n. 02, p.
118-124, 2012.
MAGNÉR, J.; FILIPOVIC, M.; ALSBERG, T. Application of a novel solid-phase-extraction
sampler and ultra-performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass
spectrometry for determination of pharmaceutical residues in surface sea water.
Chemosphere, v. 80, n. 11, p. 1255-60, set 2010.
MAPA. Validação e Controle de Qualidade Analítica: fármacos em produtos para
alimentaçao e medicamentos veterinários. [S.l: s.n.], 2011. p. 72
MARIA, C. A. B.; MOREIRA, R. F. A. Cafeína: revisão sobre métodos de análises. Química
Nova, v. 30, n. 1, p. 99-105, 2007.
MARTÍN, J.; CAMACHO-MUÑOZ, D.; SANTOS, J. L.; APARICIO, I.; ALONSO, E.
Occurrence of pharmaceutical compounds in wastewater and sludge from wastewater
treatment plants: Removal and ecotoxicological impact of wastewater discharges and sludge
disposal. Journal of hazardous materials, v. 239-240, p. 40-7, 15 nov 2012.
MARTÍN, J.; CAMACHO-MUÑOZ, M. A D.; SANTOS, J. L.; APARICIO, I.; ALONSO, E.
Distribution and temporal evolution of pharmaceutically active compounds alongside sewage
sludge treatment. Risk assessment of sludge application onto soils. Journal of
Environmental Management, v. 102, p. 18-25, 15 jul 2012.
MASTOVSKÁ, K.; LEHOTAY, S. J.; ANASTASSIADES, M. Combination of Analyte
Protectants To Overcome Matrix Effects in Routine GC Analysis of Pesticide Residues in
Food Matrixes. Analytical Chemistry, v. 77, n. 24, p. 8129-8137, 2005.
MIGOWSKA, N.; CABAN, M.; STEPNOWSKI, P.; KUMIRSKA, J. Simultaneous analysis
of non-steroidal anti-inflammatory drugs and estrogenic hormones in water and wastewater
samples using gas chromatography-mass spectrometry and gas chromatography with electron
capture detection. The Science of the total environment, v. 441, p. 77-88, 15 dez 2012.
100
MIKI, A.; KATAGI, M.; ZAITSU, K.; NISHIOKA, H.; TSUCHIHASHI, H. Development of
a two-step injector for GC-MS with on-column derivatization, and its application to the
determination of amphetamine-type stimulants (ATS) in biological specimens. Journal of
Chromatography. B, v. 865, n. 1-2, p. 25-32, 1 abr 2008.
NIE, Y.; QIANG, Z.; ZHANG, H.; ADAMS, C. Determination of endocrine-disrupting
chemicals in the liquid and solid phases of activated sludge by solid phase extraction and gas
chromatography-mass spectrometry. Journal of chromatography. A, v. 1216, n. 42, p. 7071-
80, 16 out 2009.
NOBEL. Disponível em http://laboratorionobel.com.br Acesso em 27/12/2012
NÖDLER, K.; LICHA, T.; BESTER, K.; SAUTER, M. Development of a multi-residue
analytical method, based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry, for the
simultaneous determination of 46 micro-contaminants in aqueous samples. Journal of
chromatography. A, v. 1217, n. 42, p. 6511-21, 15 out 2010.
OLIVEIRA, A. R. M.; MAGALHÃES, I. R. DOS S.; SANTANA, F. J. M.; Bonato, P. S.
Microextração em Fase Líquida (LPME): Fundamentos da Técnica e Aplicações na Análise
de Fármacos em Fluidos Biológicos. Química Nova, v. 31, n. 3, p. 637-644, 2008.
PINHO, G. P.; SILVÉRIO, F. O.; NEVES, A. A.; QUEIROZ, M. E. L. R. DE. Evaluation of
pesticide adsortion in gas chromatographic injector and column. Química Nova, v. 35, n. 4,
p. 738-742, 2012.
RAIMUNDO, C. C. M. Ocorrência de interferentes endócrinos e produtos farmacêuticos
nas águas superficiais da bacia do rio Atibaia. [S.l.]: Universidade Estadual de campinas,
2007.
RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C.
Validação em Métodos Cromatográficos e Eletroforéticos. Química Nova, v. 27, n. 5, p. 771-
780, 2004.
RIBEIRO, F. A. DE L.; FERREIRA, M. M. C.; MORANO, S. C.; SILVA, L. R.;
SCHNEIDER, R. P. Planilha De Validação: Uma Nova Ferramenta para Estimar Figuras de
Mérito na Validação de Métodos Analíticos Univariados. Fabiana Alves de Lima Ribeiro e
Márcia Miguel Castro Ferreira*. Química Nova, v. 31, n. 1, p. 164-171, 2008.
101
RODRIGUEZ-MOZAZ, S.; LOPEZ DE ALDA, M. J.; BARCELÓ, D. Advantages and
limitations of on-line solid phase extraction coupled to liquid chromatography-mass
spectrometry technologies versus biosensors for monitoring of emerging contaminants in
water. Journal of Chromatography. A, v. 1152, n. 1-2, p. 97-115, 8 jun 2007.
SAAL, F. S. VOM; NAGEL, S. C.; COE, B. L.; ANGLE, B. M.; TAYLOR, J. A. The
estrogenic endocrine disrupting chemical bisphenol A (BPA) and obesity. Molecular and
cellular endocrinology, v. 354, n. 1-2, p. 74-84, 6 maio 2012
SALSTE, L.; LESKINEN, P.; VIRTA, M.; KRONBERG, L. Determination of estrogens and
estrogenic activity in wastewater effluent by chemical analysis and the bioluminescent yeast
assay. The Science of the Total Environment, v. 378, n. 3, p. 343-51, 1 jun 2007.
SALVIA, M.-V.; VULLIET, E.; WIEST, L.; BAUDOT, R.; CREN-OLIVÉ, C. Development
of a multi-residue method using acetonitrile-based extraction followed by liquid
chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of steroids and veterinary and
human drugs at trace levels in soil. Journal of chromatography. A, v. 1245, p. 122-33, 6 jul
2012.
SANTOS, L. H. M. L. M.; ARAÚJO, A N.; FACHINI, A. et al. Ecotoxicological aspects
related to the presence of pharmaceuticals in the aquatic environment. Journal of hazardous
materials, v. 175, n. 1-3, p. 45-95, 15 mar 2010.
SANSON, A. L. Metodologia para Determinação Simultânea de Microcontaminantes
Orgânicos em Água Superficial por CG-EM e Quimiometria. [S.l.]: Universidade Federal
de Ouro Preto, 2012.
SEGURA, J.; VENTURA, R.; JURADO, C. Derivatization procedures for gas
chromatographic-mass spectrometric determination of xenobiotics in biological samples, with
special attention to drugs of abuse and doping agents. Journal of chromatography. B,
Biomedical sciences and applications, v. 713, n. 1, p. 61-90, 21 ago 1998.
SCHUMMER, C.; DELHOMME, O.; APPENZELLER, B. M. R.; WENNIG, R.; MILLET,
M. Comparison of MTBSTFA and BSTFA in derivatization reactions of polar compounds
prior to GC/MS analysis. Talanta, v. 77, n. 4, p. 1473-82, 15 fev 2009.
102
SHIN, H.-S.; OH, J.-A. Simultaneous determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs
in river water by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Separation Science, v.
35, n. 4, p. 541-7, fev 2012.
SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J. Fundamentos de Química Analítica. 8. ed.
[S.l: s.n.], 2005. p. 1124
STANFORD, B. D.; WEINBERG, H. S. Isotope dilution for quantitation of steroid estrogens
and nonylphenols by gas chromatography with tandem mass spectrometry in septic, soil, and
groundwater matrices. Journal of chromatography. A, v. 1176, n. 1-2, p. 26-36, 28 dez
2007.
SUMPTER, J. P.; JOHNSON, A. C. 10th Anniversary Perspective: Reflections on endocrine
disruption in the aquatic environment: from known knowns to unknown unknowns (and many
things in between). Journal of environmental monitoring, v. 10, n. 12, p. 1476-85, dez
2008.
SVENSON, A.; ALLARD, A. S.; EK, M. Removal of estrogenicity in Swedish municipal
sewage treatment plants. Water Research, v. 37, n. 18, p. 4433-43, nov 2003.
TEÓFILO, R. F.; FERREIRA, M. M. C. Quimiometria II: Planilhas Eletrônicas para Cálculos
de Planejamentos Experimentais, Um Tutorial. Química Nova, v. 29, n. 2, p. 338-350, 2006.
The PubChem Project. Disponível em: <http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/>. Acesso em:
26/12/2012
THOMPSON, M.; ELLISON, S. L. R.; WOOD, R. HARMONIZED GUIDELINES FOR
SINGLE- LABORATORY VALIDATION OF METHODS OF ANALYSIS. Pure and
Applied Chemistry, v. 74, n. 5, p. 835-855, 2002.
TOMŠÍKOVÁ, H.; AUFARTOVÁ, J.; SOLICH, P. et al. High-sensitivity analysis of female-
steroid hormones in environmental samples. Trends in Analytical Chemistry, v. 34, p. 35-
58, abr 2012.
TOMPSETT, A. R.; WISEMAN, S.; HIGLEY, E. et al. Effects of 17α-ethynylestradiol on
sexual differentiation and development of the African clawed frog (Xenopus laevis).
Comparative bBochemistry and Physiology, Part C, v. 156, n. 3-4, p. 202-10, nov 2012.
Toxnet. Disponível em: <http://toxnet.nlm.nih.gov/>. Acesso em: 26/12/2012.
103
TZING, S.-H.; DING, W.-H. Determination of melamine and cyanuric acid in powdered milk
using injection-port derivatization and gas chromatography–tandem mass spectrometry with
furan chemical ionization. Journal of Chromatography A, v. 1217, p. 6267-6273, 2010.
U.S. EPA. Special Report on Environment Endocrine Disruption: An Efects Assessment and
Analysis. 1997.
U.S. EPA. Method 1694 : Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water , Soil ,
Sediment , and Biosolids by HPLC / MS / MS. 2007.
VALLEJO, A; FERNÁNDEZ, L. A; OLIVARES, M. et al. Optimization of large volume
injection-programmable temperature vaporization-gas chromatography-mass spectrometry
analysis for the determination of estrogenic compounds in environmental samples. Journal of
Chromatography. A, v. 1217, n. 52, p. 8327-33, 24 dez 2010.
VEGA-MORALES, T.; SOSA-FERRERA, Z.; SANTANA-RODRÍGUEZ, J. J.
Determination of alkylphenol polyethoxylates, bisphenol-A, 17α-ethynylestradiol and 17β-
estradiol and its metabolites in sewage samples by SPE and LC/MS/MS. Journal of
hazardous materials, v. 183, n. 1-3, p. 701-11, 15 nov 2010.
VIEIRA, H.; NEVES, A.; QUEIROZ, M. Otimização e validação da técnica de extração
líquido-líquido com partição em baixa temperatura (ELL-PBT) para piretróides em água e
análise por CG. Química Nova, v. 30, n. 3, p. 535-540, 2007.
VOOJIS, G. P.; GEURTS, T. B. P. Review of the endometrial safety during intravaginal
treatment with estriol. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive
Biology, v. 62, p. 101-106, 1995.
WICK, A.; FINK, G.; TERNES, T. A. Comparison of electrospray ionization and
atmospheric pressure chemical ionization for multi-residue analysis of biocides, UV-filters
and benzothiazoles in aqueous matrices and activated sludge by liquid chromatography-
tandem mass spectrometry. Journal of chromatography. A, v. 1217, n. 14, p. 2088-103, 2
abr 2010.
WU, J.; HU, R.; YUE, J.; YANG, Z.; ZHANG, L. Determination of fecal sterols by gas
chromatography–mass spectrometry with solid-phase extraction and injection-port
derivatization. Journal of Chromatography A, v. 1216, p. 1053-1058, 2009.
104
XU, L.; BASHEER, C.; LEE, H. K. Chemical reactions in liquid-phase microextraction.
Journal of chromatography. A, v. 1216, n. 4, p. 701-7, 23 jan 2009.
XU, L.; JIANG, M.; LI, G. Injection port derivatization following sonication-assisted ion-pair
liquid-liquid extraction of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Analytica Chimica Acta, v.
666, n. 1-2, p. 45-50, 7 maio 2010.
ZHANG, Z. L.; HIBBERD, A; ZHOU, J. L. Optimisation of derivatisation for the analysis of
estrogenic compounds in water by solid-phase extraction gas chromatography-mass
spectrometry. Analytica chimica acta, v. 577, n. 1, p. 52-61, 1 set 2006.
ZHANG, J.; LEE, H. K. Application of liquid-phase microextraction and on-column
derivatization combined with gas chromatography-mass spectrometry to the determination of
carbamate pesticides. Journal of chromatography. A, v. 1117, n. 1, p. 31-7, 2 jun 2006.
ZHANG, J.; LEE, H. K. Application of dynamic liquid-phase microextraction and injection
port derivatization combined with gas chromatography-mass spectrometry to the
determination of acidic pharmaceutically active compounds in water samples. Journal of
Chromatography. A, v. 1216, n. 44, p. 7527-32, 30 out 2009.
ZOCOLO, G. J.; SOUSA, A. C.; LOPES, M. N. T.; MARCHI, M. R. R. Determination of
estrogens (estriol, estradiol, estrone and ethynylestradiol) in river water from a rural area in
Midwest Brazil. Toxicology Letters, v. 196, n. 2010, p. S62-S63, jul 2010.
