Padrões oscilatórios espontâneos no córtex ... · Agradeço a toda equipe do Instituto do...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

INSTITUTO DO CÉREBRO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS

Padrões oscilatórios espontâneos no córtex somatossensorial em modelo de autismo

ALUNA: SUZYANNE XAVIER MACIEL

ORIENTADOR: RODRIGO NEVES ROMCY-PEREIRA

NATAL – RN

2017

SUZYANNE XAVIER MACIEL

Padrões oscilatórios espontâneos no córtex somatossensorial de ratos modelo de autismo

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em neurociências do Universidade Federal do Rio Grande do Norte como pré-requisito para obtenção do título de mestre em neurociências.

ORIENTADOR: Dr. Rodrigo Neves Romcy-Pereira

NATAL – RN

2017

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento - Instituto do Cérebro - ICE

Maciel, Suzyanne Xavier.

Padrões oscilatórios espontâneos no córtex somatossensorial em

modelo de autismo / Suzyanne Xavier Maciel. - Natal, 2017.

64f.: il.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Instituto do

Cérebro, Programa de Pós-Graduação em Neurociências.

Orientador: Rodrigo Neves Romcy-Pereira.

1. Oscilações corticais. 2. Estados eletrofisiológicos. 3.

Córtex somatossensorial. 4. Autismo. 5. VPA. I. Romcy-Pereira,

Rodrigo Neves. II. Título.

RN/UF/Biblioteca Setorial "Árvore do Conhecimento" - Instituto

do Cérebro CDU 612.8

Elaborado por - CRB-

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao amor e dedicação incondicional de minha mãe e pai, Maria Augusta e Ronaldo.

Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Rodrigo Pereira, pelos diversos aprendizados.

Agradeço a minha banca de acompanhamento, prof. Dr. Marcos Romualdo Costa e prof. Dr.

Sandro José de Souza, por todo aconselhamento.

Agradeço a minha banca avaliadora, prof. Dr. Eduardo Bouth Sequerra e prof. Dr. Cleiton

Lopes Aguiar, por aceitarem o convite e por serem sempre tão solícitos.

Agradeço a toda equipe do Instituto do Cérebro, corpo técnico, administrativo e terceirizado,

por fazer com que tudo funcione e tornar o ambiente acolhedor.

Agradeço aos amigos do laboratório, Juliana, Carol, Olga, João, Rafael, Helena, Rodolfo, por

todo apoio, amizade e por sempre estarem dispostos a ajudar e aconselhar.

Agradeço a todos os amigos que criei no ICe, a todos que passaram pelo container dos alunos,

que me ajudaram quando procurei e aqueles que me incentivaram nesse final de mestrado,

Lockmann, Davi, Bruna, Ana Raquel, Dani, Andréa, Brisa, Marina, Rafael, Kelly, Bárbara,

Thawann, Annara.

Dedico também aos amigos da graduação, especialmente a Joaquim, Victor, Maíra, Marina e

Luana, e aos amigos que me acompanharam mesmo quando longe, Danielly, Tayana, Geanne, Ana

Clara, Thamires, Carolinne, Alice, Rafael, Poliana, Luci, César, Tia Cris, Ivan, Mahalla, Daniel B.

RESUMO

A sincronização rítmica da excitabilidade neuronal em todas as populações neurais é um

mecanismo crucial nos processos de integração de informações entre redes neurais. Nos transtornos

do espectro autista (TEA) acredita-se que haja um déficit na capacidade de acoplar eficientemente

redes neurais funcionais usando esse mecanismo conhecido coletivamente como oscilações. Além

disso, distúrbios sensoriais são um dos mais prevalentes sintomas do autismo, que podem ser

caracterizados como hiper-responsividade ou hipo-responsividade, se estendendo a múltiplos

sistemas sensoriais, como também na integração sensório-motora.

No modelo animal de autismo induzido por exposição pré-natal a ácido valpróico (VPA) foram

observadas alterações comportamentais e celulares semelhantes às observadas em pacientes com

autismo. Entretanto ainda são poucos os estudos avaliando os padrões eletrofisiológicos corticais

com ênfase nessas oscilações. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade

eletrofisiológica oscilatória espontânea no córtex somatossensorial em ratos modelo de autismo

(ratos VPA) e ratos controle. Os grupos, experimental (n=04) e controle (n=04), foram gerados

através da administração de VPA (500 mg/Kg; i.p.) ou salina em ratas grávidas em E12.5,

respectivamente. Quando adultos, os animais foram anestesiados com uretano e registros de

potenciais de campo local foram realizados no córtex somatossensorial utilizando matrizes de

eletrodos. A análise de dados avaliou a densidade de potências espectrais, a ocorrência de eventos

discrepantes na atividade neuronal e a dinâmica oscilatória global.

Nossos achados mostram que ratos VPA apresentam maior variabilidade de estados

eletrofisiológicos quando avaliados através de “mapas de estado” derivados de características

espectrais de LFPs em diferentes estados comportamentais de roedores. Esta variabilidade é

influenciada principalmente por frequências acima de 20 Hz (20-55 Hz). Entretanto, não observamos

mudanças significativas na análise global de potência em bandas espectrais delta (0,5-4Hz), teta (4-

12Hz), beta (12-30Hz) e gama (30-100Hz) entre ratos VPA e controle. Por fim, todos os ratos VPA

que analisamos apresentaram atividade do tipo epileptiforme no córtex somatossensorial.

Palavras-chave: Oscilações corticais, estados eletrofisiológicos, córtex somatossensorial, autismo,

VPA.

ABSTRACT

The rhythmic synchronization of neuronal excitability in neural populations is a crucial

mechanism to integrate information between neural networks. In autism spectrum disorders (ASD), it

is believed that there is a deficit in the ability to efficiently couple functional neural networks using

this mechanism, collectively known as oscillations. In addition, sensory disturbances are one of the

most prevalent symptoms in autism, which can be characterized as hyper-responsiveness or

hypersensitivity, extending to multiple sensory systems, as well as sensorimotor integration.

In the animal model of autism induced by prenatal exposure to valproic acid (VPA), it is

observed behavioral and cellular alterations similar to those observed in patients with autism.

However, there are still few studies evaluating cortical electrophysiological patterns with an

emphasis on these oscillations. Therefore, the aim of this study was to evaluate the spontaneous

oscillatory activity in local field potentials (LFP) recorded from the somatosensory cortex of rats

exposed to VPA and controls. Experimental (n=04) and control (n=04) groups were generated by

administration of VPA (500 mg / kg, i.p.) or saline in pregnant rats at E12.5 respectively. When

adults, these were anesthetized with urethane and LFP recordings were obtained in the

somatosensory cortex using arrays of microelectrodes. Data analysis evaluated the density of spectral

power, the occurrence of discrepant events in neuronal activity and the global oscillatory dynamics.

Our findings showed that VPA rats have a higher variability of electrophysiological states

when evaluated by state-maps derived from spectral characteristics of LFPs in distinct behavioral

states. Such variability is mainly influenced by frequencies above 20 Hz (20-55Hz). However, we

did not find significant changes in the global analysis of power spectrum bands delta (0.5-4Hz), theta

(4-12Hz), beta (12-30Hz) and gamma (30-100Hz). Finally, all VPA animals showed some form of

epileptiform activity in the somatosensory cortex in contrast to controls.

Keywords: Cortical oscillations, electrophysiological states, somatosensory cortex, autism, VPA.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Propriedades das oscilações neurais. (A) Origens neurais das oscilações. (B)

Propriedades dos sinais oscilatórios. (C) hierarquia oscilatória............................................................ 3

FIGURA 2: Fenótipo típico com cauda curva/torcida em modelo VPA............................................. 7

FIGURA 3: Visão dorsolateral de um cérebro de rato com áreas somatossensíveis........................... 8

FIGURA 4: Processamento somatossensorial pelas vibrissas mistaciais em roedores. (A) Caminho

percorrido pelas terminações nervosas das vibrissas ao córtex (B) Representação da citoarquitetura

das vibrissas no focinho e nos barris corticais (C) Conectividade entre núcleos talâmicos e camadas

corticais (D) Representação da conectividade entre o córtex somatossensorial primário com o contra-

lateral, o somatossensorial secundário e o motor primário................................................................. 9

FIGURA 5: Delineamento da geração de modelo............................................................................. 13

FIGURA 6: Localização de entrada dos eletrodos no córtex............................................................. 14

FIGURA 7: Modelo esquemático da matriz de eletrodos e silicon probe ........................................ 15

FIGURA 8: Aparato de registro de estimulação ............................................................................... 19

FIGURA 9: Padronização da estimulação de vibrissas ..................................................................... 20

FIGURA 10: Espectro de potência global médio ao longo de ~60min de registros corticais .......... 21

FIGURA 11: Potência espectral média em duas bandas delta, 0,5-4 Hz e 2-4 Hz ........................... 22

FIGURA 12: Atividade paroxística cortical em animais VPA ......................................................... 23

FIGURA 13: Atividade epileptiforme cortical em animais modelo de epilepsia e de autismo ........ 24

FIGURA 14: Espectrogramas dos animais experimentais ................................................................ 26

FIGURA 15: Características espectrais dos estados ativado e desativado em animal VPA ............ 27

FIGURA 16: Alternância de comportamento espectral em animal controle .................................... 28

FIGURA 17: Distribuição dos valores de mediana e percentil ......................................................... 29

FIGURA 18: Mapas de estado dos animais controle ........................................................................ 30

FIGURA 19: Mapas de estado dos animais VPA ............................................................................. 31

FIGURA 20: Distribuição dos valores de R1 para as épocas dos animais controle e VPA ............. 31

FIGURA 21: Dispersão de estados nos grupos VPA e controle ....................................................... 32

FIGURA 22: Evolução temporal das razões espectrais ao longo de 1 hora de registro ................... 33

FIGURA 23: Padronização das respostas corticais evocadas por estimulação de vibrissas ............ 34

FIGURA 24: Respostas corticais evocadas por pulsos de ar nas vibrissas ...................................... 35

FIGURA 25: Ilustração dos potenciais de campo locais e estados comportamentais ...................... 37

FIGURA SUPLEMENTAR 1: Potência normalizada de delta e gama ao longo dos registros dos

animais ............................................................................................................................................... 52

FIGURA SUPLEMENTAR 2: Razão das potências espectrais delta e teta ao longo do tempo .... 53

FIGURA SUPLEMENTAR 3: Análise do mapa de densidade de corrente ................................... 54

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AP: Ântero-Posterior

CDC: Centro de Controle de Prevenção de Doenças

CEUA: Comitê de Ética para Uso de Animais em Experimentação

CS: Somatossensorial caudal

CTL: Animal controle

DSM: Manual Diagnóstico e Estatístico de Doenças Mentais

EEG: Eletroencefalograma

fMRI: Ressonância magnética funcional

GABA: Ácido Gamaaminobutírico

GAD65: Glutamato descarboxilase 65kDa

GAD67: Glutamato descarboxilase 67kDa

H2O2: Peróxido de hidrogênio

HDAC: Histona desacetilase

ip: Intraperitonal

IRM: Imagem por Ressonância Magnética

LFP: Potencial de Campo Local

M1: Córtex motor primário

M2: Córtex pré-motor/Córtex motor secundário

MEG: Magnetoencefalografia

ML: Médio-Lateral

NaCl: Cloreto de sódio

NMDA: N-Metil D-Aspartato

OMS: Organização Mundial de Saúde

PB: Tampão fosfato

PDD-NOS: Transtorno generalizado do desenvolvimento não-especificado

PFA: Paraformaldeído

PND: Dia pós-natal

PSD: Densidade de potência espectral

PV: Área parietal ventral

REM: Movimento rápido dos olhos

RNAm: Ácido Ribonucleico mensageiro

S1: Córtex somatossensorial primário

S2: Córtex somatossensorial secundário

TEA: Transtorno do Espectro Autista

V1: Córtex visual primário

VPA: Ácido Valpróico

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ ................................................ 1

1.1 AUTISMO ..................................................................................................................... .................................. 1

1.2 DISFUNÇÕES DE PROCESSAMENTO SENSORIAL NO TEA ................................................................ 2

1.3 SINCRONIA E EXCITABILIDADE DE CIRCUITOS NO TEA .................................................................. 2

1.4 MODELOS DE AUTISMO ............................................................................................................................. 5

1.5 MODELO EXPERIMENTAL DE AUTISMO UTILIZANDO ÁCIDO VALPRÓICO ................................. 6

1.6 PROCESSAMENTO SENSORIAL NO MODELO VPA ............................................................................... 7

2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................. ............................................. 11

3 OBJETIVOS ................................................................................................................. .................................................. 12

3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................................................... 12

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... ............................... 12

4 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................... .............................. 13

4.1 MODELO ANIMAL DE AUTISMO COM VPA ......................................................................................... 13

4.2 ANESTESIA E CIRURGIA .................................................................................................... ....................... 14

4.3 REGISTROS ELETROFISIOLÓGICOS ................................................................................... .................... 16

4.4 PERFUSÃO E PREPARAÇÃO DO TECIDO ........................................................................... ................... 16

4.5 ANÁLISE DE DADOS ELETROFISIOLÓGICOS ................................................................... ................... 17

4.5.1 PRÉ-PROCESSAMENTO DOS DADOS .................................................................. .................. 17

4.5.2 COMPOSIÇÃO ESPECTRAL NO CÓRTEX SOMATOSSENSORIAL .................................... 17

4.5.3 DINÂMICA DE PADRÕES ELETROGRÁFICOS NO CÓRTEX SOMATOSSENSORIAL ... 18

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................... ................................................... 18

4.7 IMPLEMENTAÇÃO DE APARATO PARA ESTIMULAÇÃO DE VIBRISSAS....................................... 19

5 RESULTADOS ...................................................................................... ........................................................................ 21

5.1 COMPOSIÇÃO ESPECTRAL NO CÓRTEX SOMATOSSENSORIAL ..................................................... 21

5.2 ATIVIDADE PAROXÍSTICA DE ANIMAIS TRATADOS COM VPA ..................................................... 23

5.3 DINÂMICAS DE PADRÕES ELETROGRÁFICOS NO CÓRTEX SOMATOSSENSORIAL .................. 25

5.3.1 ANÁLISE DO PERFIL ESPECTRAL AO LONGO DO REGISTRO ........................................ 25

5.3.2 MAPAS DE ESTADO NO CÓRTEX DE ANIMAIS VPA ......................................................... 29

5.4 IMPLEMENTAÇÃO DE APARATO PARA ESTIMULAÇÃO DE VIBRISSAS....................................... 33

5.4.1 INDUÇÃO SENSORIAL DE ATIVIDADE NEURAL NO CÓRTEX BARRIL ........................ 33

5.4.2 RESPOSTAS EVOCADAS AO LONGO DE 16 CANAIS NO CÓRTEX BARRIL .................. 35

6 DISCUSSÃO ................................................................................................................. .................................................. 36

7 REFERÊNCIAS ................................................................................................................. ............................................ 39

8 ANEXOS ...................................................................................................................... ................................................... 50

9 FIGURAS SUPLEMENTARES ................................................................................................................................... 51

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 AUTISMO

Os transtornos do espectro autista (TEA) são desordens do neurodesenvolvimento que se

expressam nos primeiros anos de vida, resultando em prejuízos comportamentais, usados como

critério diagnóstico (Kanner, 1943). Déficits de interação social, comunicação verbal e

comportamentos inflexíveis, expressos por interesses e atividades restritos e repetitivos, são

características que se apresentam de forma heterogênea e definem o critério diagnóstico do Manual

de Diagnóstico e Estatística de Doenças Mentais, DSM (Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders – AAP, 2013). Alterações cognitivas no domínio da atenção e memória, alterações de

humor, distúrbios do sono, crises epilépticas e hipersensibilidade a estímulos táteis, sonoros e

luminosos também são comuns no TEA (Geschwind, 2009). Problemas sensoriais passaram a ser

incluídos como parte dos principais sintomas do TEA no perfil de diagnóstico somente a partir da

quinta edição do DSM, em 2013. Portanto, o uso do termo autismo se refere de forma genérica a

qualquer grau do distúrbio dentro do TEA.

A prevalência do autismo na população americana, avaliada pelo Centro de Controle de

Prevenção de Doenças dos EUA (Center for Disease Control, CDC; 2014) foi de 14,7 crianças com

autismo a cada 1000 crianças normotípicas até 8 anos (1 em cada 68). A estatística ainda mostra que

o TEA é ~5 vezes mais prevalente entre indivíduos do sexo masculino - 1:42 do sexo masculino

comparado a 1:189 crianças do sexo feminino (Baio, 2014; CDC, 2014). Entretanto, a média de

idade para diagnóstico é de 53 meses, o que demonstra a necessidade de diagnósticos precoces mais

eficazes a fim de otimizar as estratégias de intervenção/tratamento pós-natais.

A etiologia do TEA ainda é pouco compreendida, sendo considerada multifatorial, com

influência genética e ambiental agindo de forma complexa em distintas populações (Rosenberg et al.,

2009; Hallmayer et al., 2011; Miles, 2011; Coghlan et al., 2012). Estudos mostram que o autismo

apresenta uma das mais altas taxas de herdabilidade entre os transtornos neuropsiquiátricos, avaliado

através de estudos com gêmeos monozigóticos (Willians, 2012). Por outro lado, diversos fatores

ambientais apresentam papel significativo no desencadeamento do transtorno (Sandin et al, 2014),

uma vez que as alterações genéticas por si só não explicam mais que 25% do total de casos (Miles,

2011). Dentre os diversos agentes externos e moduladores que agem durante o período embrionário e

podem aumentar o risco de TEA, podemos citar infecção viral materna e exposição a agentes

xenobióticos, como ao ácido valpróico - um medicamento utilizado no tratamento de enxaqueca,

epilepsia e transtorno bipolar (Onore et al., 2012; Christensen et al., 2013; Idring et al., 2014).

2

1.2 DISFUNÇÕES DE PROCESSAMENTO SENSORIAL NO TEA

Anormalidades sensoriais são um dos mais prevalentes sintomas do TEA, sendo reportadas em

mais de 87% dos indivíduos (Le Couteur et al., 1989; Lord, 1995). Podem ser caracterizadas como

hiper- ou hipo-responsividade à estimulação (Mikkelsen M et al., 2017; Marco et al., 2011), e

tipicamente não se restringem a uma única modalidade. Estendem-se a sistemas sensoriais múltiplos

incluindo visão, audição, gustação, olfação, propriocepção e o tato. (Baranek et al., 2006; Dawson &

Watling, 2000; Karasi & Sigman, 1997; Kern et al., 2007; Kientzs & Dunn, 1997; O’Neill &Jones,

1997; Rogers et al., 2003; Talay-Ongan & Wood, 2000; Watling et al., 2001; Wing & Potter, 2002).

A integração da informação através dos diferentes sentidos é um processo essencial na

construção de representações perceptuais, e pode ser visto como um elemento básico para a

construção de representações e habilidades cognitivas (Baum et al. 2015). Falhas na construção

precisa e significativa do mundo que nos rodeia desencadeia uma cascata de dificuldades de ordem

superior incapacitando a interação social e com o ambiente (Stevenson et al., 2014). Diferenças na

percepção sensorial são frequentemente correlacionadas à gravidade de alguns sintomas, como

comunicação social (Foss-Feig et al., 2012; Kern et al., 2007). Em um estudo recente, os

investigadores demonstraram um distúrbio de representação cortical do rosto e mão de indivíduos

adultos com TEA utilizando mapeamento somatossensorial por magnetoencefalografia (MEG)

(Coskun et al., 2009). Assim, avaliações neurofisiológicas do processamento sensorial podem servir

como valiosos biomarcadores para diagnóstico e monitoramento de intervenções terapêuticas, como

também revelar alvos para estratégias de intervenção em regiões cerebrais específicas.

1.3 SINCRONIA E EXCITABILIDADE DE CIRCUITOS NO TEA

A motivação de se estabelecer a origem neurofisiológica e significância funcional da atividade

elétrica neural estão presentes desde as primeiras medições não-invasivas (Berger, 1929). Estudos

sistemáticos da atividade elétrica cerebral têm como objetivo quantificar as flutuações de natureza

rítmica (oscilações) e relacioná-las, quando possível, com a atividade individual dos neurônios da

região. No nível celular do ambiente extracelular cerebral, essa atividade rítmica corresponde a

flutuação do potencial de campo local resultante da atividade populacional de neurônios na

proximidade do eletrodo de registro, medida como uma diferença de potencial elétrico, em

microVolts (Buzsaki et al., 2012; Figura 1A). As oscilações são agrupadas, de acordo com a

3

frequência, em: delta: 1-4 Hz, teta: 4-8 Hz, alfa: 8-14 Hz, beta: 15-30 Hz e gama: 30-100 Hz, embora

os intervalos exatos variem na literatura.

Anormalidades de sincronização estão relacionadas a disfunções locais de comunicação celular, a

alterações de grande escala na organização de uma rede neural e a distúrbios de processamentos

sensorial e perceptual (Simon et al., 2016). Eventos como as respostas evocadas, que consistem em

respostas em fase após apresentação de um estímulo sensorial ou perceptivo, demonstram ser

dependentes do estado oscilatório (Jansen e Brandt, 1991; Makeig et al., 2002).

Investigações que examinam a conectividade em escalas de tempo rápidas utilizando

eletroencefalografia (EEG) (Coben et al., 2014) e magnetoencefalografia (MEG) (Ye et al., 2014)

indicam alterações de conectividade que podem ser propostas como possível biomarcardor que

contribuem para as disfunções presentes na desordem do espectro autista (Geschwind & Levitt,

2007).

Figura 1: Propriedades das oscilações neurais. (A) Origens neurais das oscilações. A atividade pós-sináptica gera

flutuações rítmicas no potencial da membrana neuronal (vermelho). O campo extracelular (potencial de campo local,

azul) representa o somatório dessas flutuações de potencial de membrana. Potenciais de campo local suficientemente

intensos podem ser indexados por EEG e MEG. (B) Propriedades dos sinais oscilatórios. Frequência, potência e fase são

necessárias para descrever completamente as propriedades dos sinais medidos pelo EEG e MEG. A freqüência define a

taxa de oscilação, amplitude/potência define a robustez da oscilação, e a fase define o tempo relativo aos picos e vales

oscilantes. (C) hierarquia oscilatória. A fase das oscilações de baixa frequência determina o poder das oscilações de

frequência mais altas em um processo conhecido como acoplamento de amplitude de fase. A fase das oscilações delta

(inferior) influencia a amplitude das oscilações teta (meio). A fase das oscilações delta e teta influencia a amplitude das

oscilações gama (superior) (Simon & Wallace, 2016).

4

Eventos de sincronização neuronal na faixa de gama e teta têm sido associadas a melhor

desempenho em tarefas perceptivas e cognitivas (Uhlhaas et al., 2010). Enquanto que, prejuízos na

geração de oscilações gama (30-100Hz) no córtex pré-frontal de crianças autistas durante tarefa de

processamento visual direcional (Richard et al., 2013), alterações no padrão de conectividade inter-

regional em estado basal, com aumento de conectividade entre regiões frontais, temporais e

subcorticais na faixas beta (13-30Hz) e gama, e redução de conectividade entre regiões parietais e

occipitais na faixa teta (4-7Hz) e alfa (8-13Hz), são descritas em indivíduos com TEA (Ye et al.,

2014). Estes dados sugerem uma hiper-sincronia basal, associada a um prejuízo de sincronia durante

tarefas visuais em circuitos pré-frontais. Crises epilépticas, por exemplo, predominam em

aproximadamente 30% dos indivíduos com TEA (Gillberg e Billstedt, 2000). Isto é consistente com

estudos que associam distúrbios de excitabilidade ao autismo (Tuchman & Cuccaro, 2011) e a dados

coletados de crianças apresentando atividade elétrica anormal durante o sono (Lewine et al., 1999).

Na tentativa de correlacionar essas alterações aos substratos e microcircuitos celulares vários

estudos têm focado atenção a distúrbios no equilíbrio excitação-inibição (Rubenstein & Merzenich,

2003). Alterações funcionais ou estruturais envolvendo interneurônios inibitórios que modulam

oscilações de alta frequência têm sido propostas como subjacentes aos distúrbios de sincronização na

banda gama (Orekhova EV, et al. 2007; Sohal et al., 2009). Além disso, estudos neuroanatômicos e

pós-mortem apontam para alterações na distribuição neuronal nas camadas corticais e na organização

em micro e mini-colunas (Casanova et al., 2006; McKavanagh et al., 2015), além de diminuição de

subtipos neuronais, em especial neurônios inibitórios de camadas mais profundas do córtex cerebral

de indivíduos com TEA (Amaral et al., 2008). Observa-se também aumento na densidade de

espinhas dendríticas apicais de neurônios piramidais da camada II dos lobos frontal, temporal e

parietal, assim como aumento na camada V restrita ao lobo temporal ( Hutsler and Zhang, 2010).

Disfunções na ação dos neurotransmissores glutamato e GABA é uma das hipóteses mais

frequentes para explicar o desequilíbrio excitatório-inibitório. Um conjunto de estudos mostram que

os níveis das enzimas sintetizadoras de GABA, descarboxilase do ácido glutâmico 65 (GAD65) e 67

(GAD67) estão reduzidas no cerebelo e córtex parietal de indivíduos autistas pós-mortem (Fatemi et

al., 2002). No hipocampo e córtex cingulado posterior ensaios de ligação mostraram uma redução de

receptores GABA-A (Blatt et al., 2001; Oblak et al., 2009), além da redução da subunidade GABA-

b3 no córtex cingulado (Oblak et al., 2011).

De modo complementar, estudos de associação gênica revelam a existência de diversas mutações

no autismo relacionadas a formação e função das sinapses (Huguet et al., 2013; Kenny et al., 2014).

Estudos de transcriptoma mostram variações na expressão de RNAm de genes relacionados a função

sináptica (Voineagu et al., 2011). E por fim, síndromes como a síndrome do X frágil e esclerose

5

tuberosa (Auerbach et al., 2011), assim como animais geneticamente modificados com fenótipos

similares ao autismo, apresentam modificações sinápticas dentre suas principais características

(Delorme et al., 2013).

1.4 MODELOS DE AUTISMO

Os modelos animais de doenças neurológicas em roedores são amplamente utilizados como

ferramentas no estudo experimental de diversos aspectos celulares e comportamentais, permitindo

acessibilidade e replicabilidade. Alguns modelos são gerados em camundongos knock-out para

diversos genes (nrxn1, nlgn3, reelina, shank-3 e mecp2), animais geneticamente selecionados

(camundongos BTBR T+tf/J), por lesões de estruturas límbicas (amígdala e hipocampo ventral), ou

por exposição a substâncias que interferem no neurodesenvolvimento, como no caso do modelo de

exposição pré-natal de ácido valpróico.

Um exemplo de modelo é o camundongo heterozigoto para o gene Scn1a que codifica uma

subunidade do canal de sódio presente em neurônios GABAérgicos. Este modelo tem sido útil em

elucidar os mecanismos envolvidos em comportamentos atípicos presentes na síndrome de Dravet,

que é um distúrbio neuropsiquiátrico da infância, com quadro de convulsões intratáveis recorrentes,

déficit cognitivo e comportamentos típicos do TEA (Han et al., 2012). Neste modelo animal, a

sensibilidade olfativa é mantida, porém novos odores de alimentos e odores sociais são aversivos aos

camundongos Scn1a+/-. Este canal iônico, interessantemente, está presente em diversos

interneurônios corticais, incluindo aqueles imuno-positivos para parvalbumina e somatostatina

(Kearney et al. 2015), o que sugere uma possível anormalidade no equilíbrio excitatório/inibitório de

redes neurais corticais.

Os modelos de autismo por exposição ao VPA e camundongos que apresentam a síndrome do X

frágil demonstraram deficiência crônica na regulação da concentração intracelular de íons cloreto.

Após o nascimento (Dia pós-natal, do inglês “postnatal day”, PND 0) os neurônios do hipocampo

nestes modelos apresentam níveis elevados de cloreto intracelular, aumento de GABA excitatório, de

atividade glutamatérgica e oscilações gama elevadas (Tyzio et al., 2014).

Além disso, animais expostos intra-útero ao VPA apresentam aumento das subunidades NR2A e

NR2B do receptor NMDA (Rinaldi et al., 2007), sendo NR2A importante para o processo de

epileptogênese (Chen et al., 2007). Alterações no modelo VPA serão abordadas em maior detalhe em

seguida.

6

1.5 MODELO EXPERIMENTAL DE AUTISMO UTILIZANDO VPA

O VPA é um ácido graxo de cadeia curta obtido da planta Valeriana officinalis, e amplamente

usado como droga anticonvulsivante nos últimos 40 anos (Nalivaeva et al., 2009). Além de

apresentar grande eficiência no controle de crises epilépticas generalizadas em adultos e na infância é

também utilizado como profilático para cefaleia, e no tratamento de transtorno bipolar. Sua

utilização durante o período gestacional está associada a Síndrome Fetal do Valproato (Diliberti et

al., 1984). Esta síndrome se caracteriza por malformações nos ossos cranianos, atraso no

desenvolvimento psicomotor e estrabismo, dentre outros sintomas. O estudo desta síndrome

possibilitou a descrição de um período de sensibilidade ao VPA, durante a fase de fechamento do

tubo neural, podendo levar a teratogenicidade. Em fases mais tardias a exposição ao VPA está

associada a distúrbios mais sutis não envolvendo malformações. Recentemente, um estudo

epidemiológico realizado na Dinamarca com todos os indivíduos nascidos vivos entre 1996 e 2006

quantificou um aumento significativo do número de crianças com TEA nascidos de mães que haviam

utilizado VPA durante o período gestacional (Christensen et al., 2013). Desde então, a avaliação de

outros estudos confirmam que o uso de VPA por mulheres grávidas, em doses entre 600-2500

mg/dia, pode aumentar o risco de autismo (Moore et al., 2000; Arndt et al., 2005; Rasalam et al.,

2005; Bromley et al., 2008; Bromley et al., 2013; Christensen et al., 2013).

O VPA age na potencialização da neurotransmissão GABAérgica e é um inibidor das enzimas

histona desacetilases (HDAC), afetando mecanismos de programação epigenética no sistema

nervoso. Ele promove um aumento da expressão de genes comumente silenciados durante a

embriogênese, interferindo na expressão de genes importantes para a especificação celular, migração

neuronal e histogênese cortical (Gottlicher et al., 2001).

Estudos em roedores expostos ao VPA intra-útero demonstram o surgimento de alterações no

cerebelo e tronco encefálico semelhantes às descritas em pacientes com autismo (Rodier et al, 1996).

Atualmente o modelo VPA vem sendo amplamente utilizado para se estudar aspectos celulares e

comportamentais do autismo. Como ele surgiu de dados clínicos, apresenta características análogas

àquelas presentes em indivíduos com TEA e tem demonstrado responder a drogas que aliviam

sintomas de autismo, é considerado um modelo de alta validade de face, constructo e preditiva

(Rodier et al., 1996; Schneider & Przewlocki, 2005). Mais recentemente, por exemplo, ele foi

utilizado para testar os efeitos da risperidona, droga anti-psicótica com efeito no sistema

dopaminérgico, que reverteu os comportamentos autistas, o comprometimento da memória de

7

reconhecimento, bem como a redução da densidade espinhas dendríticas no córtex pré-frontal e no

hipocampo de roedores (Hara et al., 2017).

Dentre os comportamentos apresentados por animais expostos ao VPA podemos citar aumento de

comportamentos repetitivos e estereotipados (auto-limpeza; ou grooming), redução da interação

social, alto nível de ansiedade, maior persistência de memória aversiva e baixa sensibilidade à dor

(Schneider and Przewlocki, 2005; Rinaldi et al., 2008; Markram and Markram, 2010; Bambini-

Junior et al., 2011; Brandão & Romcy-Pereira, 2013; Bristot Silvestrin et al., 2013). Além disso,

apresenta fenótipo típico de cauda curva, característica macroscópica que vem sendo utilizada como

indicador de ação do fármaco (Figura 2). Em laboratório, o modelo pode ser gerado através da

administração sistêmica de VPA, em dose única, durante a gestação de ratos ou camundongos em

período embrionário correspondente ao início da corticogênese (E11.5-E13.5).

Figura 2: Fenótipo típico com cauda curva/torcida em modelo utilizando ratos por exposição pré-natal a ácido valpróico

(VPA). Modelo já estabelecido em nosso laboratório no Instituto do Cérebro (Brandão & Romcy-Pereira, 2013; Anomal et al., 2015)

1.6 PROCESSAMENTO SENSORIAL NO MODELO VPA

A percepção tátil é uma importante modalidade sensorial para mapeamento de posição, forma,

tamanho e textura do ambiente físico próximo. Em roedores, proporciona uma melhor capacidade de

se orientarem e locomoverem de acordo com as condições do meio. A representação sensorial do

corpo, em ratos, está organizada de maneira topográfica no córtex somatossensorial (S1, S2 e parietal

ventral) (Figura 3) por informações conduzidas através de projeções talâmicas (Woolsey, 1967;

Chapin & Lin, 1984; Campi & Krubitzer, 2010). As estruturas sensoriais mais utilizadas são as

vibrissas mistaciais (ou grandes vibrissas; 3-40 mm) localizadas no focinho e organizadas de maneira

geométrica em 5 fileiras (A-E) com 5-9 colunas (2/cm2) (Woolsey, 1967; Petersen, 2007).

8

Figura 3: Visão dorsolateral de um cérebro de rato com localização de áreas somatossensíveis. Essas áreas incluem

a área primária, S1 do córtex 'granular' que contém uma representação dos receptores tácteis da superfície do corpo

contralateral. Duas representações menores laterais a S1 são organizados somatotopicamente e respondem ao toque: a

segunda área somatossensorial (S2) e a área somatossensorial ventricular parietal (PV). Uma faixa de córtex caudal a S1,

a área somatossensorial caudal (CS), obtém entradas de S1. As áreas somatossensoriais fornecem insumos para o córtex

motor primário (M1) e córtex motor secundário (M2, córtex pré-motor). O córtex visual primário (V1) e o córtex

auditivo (Aud) são mostrados como referência. (Adaptado de Brain Mapping: A Encyclopedic Reference, 2015)

Os estímulos sensoriais provenientes das grandes vibrissas mistaciais de ratos são representados

em uma sub-região, em agregados de células granulares na camada IV que estão organizados em

forma de barril (córtex barril: com neurônios excitatórios formando as paredes de uma estrutura

circular em forma de barril). Embora as vibrissas representem apenas uma fração da superfície

corporal, o córtex barril domina o mapa somatotópico do roedor (Woolsey & Van der Loos, 1970;

Woolsey et al., 1975; Welker, 1971). A representação topográfica das vibrissas é precisamente

definida pela correspondência de cada vibrissa com um barril cortical. Do ponto de vista ontológico,

o desenvolvimento das conexões tálamo-corticais depende criticamente da estimulação das vibrissas

durante o período pós-natal (Petersen, 2007) (Fig. 4).

Ratos expostos ao VPA apresentam sinais de hipersensibilidade tátil durante os dias pós-natais

30-50, menor sensibilidade à dor e prejuízos de respostas sensório-motoras desencadeadas por

estímulo acústico (PND 90-120) (Schneider et al., 2005; Markram et al., 2008).

9

Figura 4: Processamento somatossensorial pelas vibrissas mistaciais em roedores. (A) terminações nervosas

presentes no folículo das vibrissas, organizadas no focinho, enviam informação tátil para o tronco encefálico (1: N. do

nervo trigêmio), que por sua vez projetam-se para o tálamo contralateral (2: N. Ventromedial). Do tálamo, a informação é

direcionada para o córtex barril ipsilateral (3). (B) No córtex cada vibrissa é representada em uma região com

citoarquitetura semelhante a um barril. (C) Neurônios do tálamo ventromedial projetam-se para o centro dos barris e

neurônios do tálamo posteromedial projetam-se para regiões entre os barris. (D) Barris corticais recebem projeções intra-

corticais (Pettersen, 2007)

Além disso, animais VPA apresentaram déficits em comportamentos dependentes do colículo

superior, um centro de integração multissensorial, com diminuição das respostas de sobressalto,

inibição de pré-pulso e respostas nociceptivas em ratos jovens (PND 22-28), com alguns déficits

revertidos na idade adulta (PND > 60) (Dendrinos et al., 2011). Análises estereológicas, mostraram

que o colículo apresentava redução significativa de neurônios imuno-positivos para parvalbumina, o

que também foi encontrado no córtex cingulado anterior e córtex pré-límbico em trabalho recente do

nosso laboratório (Brandão & Romcy-Pereira, 2013). Estes achados sugerem alterações celulares

persistentes, desequilíbrio na excitação/inibição e anormalidades de comportamentos adaptativos em

tarefas que requerem processamento sensorial.

Registros eletrofisiológicos no córtex auditivo primário do modelo apresentaram distorções nos

mapas auditivos primários com uma maior representação de altas frequências, alterações nos campos

receptivos e limiares de intensidade de som mais altos, em comparação com os controles (Anomal et

10

al., 2015). Foram encontradas também alterações no processamento de informação no córtex visual

primário em animais expostos ao VPA (Pohl-Guimaraes et al., 2011).

A avaliação de circuitos de neurônios piramidais in vitro provenientes de ratos expostos a VPA

constatou um aumento de plasticidade sináptica no córtex somatossensorial primário (Silva et al.,

2009) e aumento na conectividade de sinapses glutamatérgicas locais em micro-regiões localizadas

na amígdala (Markram et al., 2008) e no córtex somatossensorial primário (Rinaldi et al., 2008).

A despeito destes estudos, pouco ainda se sabe sobre o desenvolvimento de padrões de atividade

oscilatória no córtex somatossensorial em ratos expostos ao VPA intra-útero. Tendo isto em vista a

relevância para a compreensão das circuitarias neurais subjacentes ao autismo, nos propusemos neste

estudo avaliar a atividade elétrica espontânea cortical deste modelo na fase adulta.

11

2 JUSTIFICATIVA

Desequilíbrios da atividade oscilatória encefálica se apresentam como promissores

marcadores de diagnóstico, assim como podem auxiliar na compreensão geral dos distúrbios

cerebrais presentes em indivíduos com TEA. O interesse do trabalho é identificar padrões

oscilatórios no córtex somatossensorial de animais modelo de autismo que estariam correlacionadas

as alterações na integridade dos circuitos corticais já descritos (Gogolla et al., 2009; Brandão &

Romcy-Pereira, 2013; Tyzio et al. 2014), além de avaliar se outras perturbações poderiam estar

passando despercebidas na caracterização da desordem.

12

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Caracterizar a atividade eletrofisiológica no córtex somatossensorial primário em animais

expostos ao VPA pré-natal usando eletrofisiologia in vivo.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Identificar alterações na composição espectral do LFP durante registro sob uretano em animais

tratados com VPA e compará-los aos animais controle.

2. Descrever os ciclos de atividade eletrográfica em animais tratados com VPA e compará-los aos

animais controle.

3. Identificar possíveis padrões oscilatórios espontâneos no córtex somatossensorial de ratos tratados

com VPA que os distingam de animais controle.

13

4 – MÁTERIAIS E METODOS

4.1 - MODELO ANIMAL DE AUTISMO COM VPA

Figura 5: Delineamento da geração de grupos até o momento do registro.

Foram utilizados ratos Wistar machos e fêmeas adultos provenientes do biotério do Instituto

do Cérebro da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN. Para a geração dos animais

VPA, fêmeas com ciclos de fertilidade controlados foram colocadas para acasalar com machos não

relacionados consanguineamente durante o período noturno. A fecundação e a determinação do dia

embrionário 0 (E0) foram confirmados pela combinação dos seguintes critérios: presença do tampão

vaginal, presença de espermatozoides no esfregaço vaginal e estabilização do ciclo estral em diestro

na semana seguinte ao acasalamento. Passados 12 dias da fertilização (E12.5), correspondendo a um

período marcado pelo início da corticogênese nestes animais, as fêmeas receberam uma injeção

intraperitoneal de valproato de sódio (VPA, 500 mg/kg, i.p.; Sigma) dissolvido em solução salina

(NaCl 0,9%) na concentração de 250 mg/mL. A dose foi ajustada de acordo com o peso corporal do

animal no dia da injeção. A distribuição dessa dose em ratos durante embriogênese tem mostrado

como resultado níveis máximos de VPA no plasma materno em menos de 1h, com meia-vida de

eliminação plasmática de 2,3h (Binkerd et al., 1988). Animais controle receberam uma injeção de

salina sob mesmos parâmetros. Todas as ninhadas e suas mães foram mantidas em mini-isolador de

polisulfona para ratos com 15 trocas de ar/hora, da marca Alesco (48,7cm de comprimento x 33,1 cm

de largura x 21,4 cm de altura), com maravalha de pinnus no assoalho, numa sala com temperatura

(23 2 °C), umidade e ciclo de claro-escuro (de 12-12h; ligado às 6:00h e desligado às 18:00h)

controlados e com livre acesso à comida e água, além de serem mantidos na caixa de origem após o

nascimento para possibilitar a amamentação por no mínimo 21 dias. Todos procedimentos

14

experimentais foram previamente aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais em Pesquisa

(CEUA) da UFRN pelo parecer nº 001.010/2017 (Anexo).

Animal Idade

(PND)

Peso Sexo Dose total de

uretano

Hora da última

dose

Ínicio do Registro

Espontâneo

CTL1 57 180g Fêmea 1,4 g/kg 15:55 18:33

CTL2 154 395g Macho 1,5 g/kg 16:00 18:24

CTL3 59 280g Macho 1,4 g/kg 11:48 15:00

CTL4 90 158g Fêmea 1,2 g/kg 10:15 20:17

VPA1 94 380g Macho 1,7 g/kg 12:07 19:01

VPA2 80 200g Fêmea 1,5 g/kg 14:49 19:59

VPA3 86 200g Fêmea 2 g/kg 12:36 16:43

VPA4 96 415g Macho 1,5 g/kg 16:03 19:37

Tabela 1: Animais experimentais, caracterização e parâmetros de anestesia. Distribuídos igualmente entre machos e

fêmeas e separados em 2 grupos, um controle e um modelo exposto ao VPA no período pré-natal, foram utilizados ao

todo 8 animais adultos, com idades entre PND57 - PND154, com a idade dos animais VPA distribuídos mais

uniformemente e medialmente entre PND80 e PND96. Todos receberam o anestésico uretano diluído em salina (NaCl

0,9%), sendo a dose mínima total para alcançar analgesia de 1,2 g/Kg, em um animal controle, e máxima de 2g/Kg, em

um animal VPA. Não houve perda de animais durante experimentos.

4.2 ANESTESIA E CIRURGIA

Os animais foram anestesiados com uma dose intraperitoneal de uretano (0,5 - 1,5g/kg;

Sigma) seguido de complementos de 15-20% da dose inicial para manutenção da sedação/analgesia.

Após confirmação do efeito da anestesia por pinçamento da pata posterior, o animal foi posicionado

no estereotáxico (Insight Ltda), teve a superfície torácica protegida por papel toalha e posto sobre

bolsa térmica, para manutenção da temperatura do animal

em 37±2°C, durante todo o procedimento de registro. Em

seguida, realizamos tricotomia do escalpo, limpamos a

área com iodo 1% e aplicamos injeção subcutânea de

cloridrato de lidocaína/ epinefrina 1:200.000 para

analgesia local e efeito vasoconstritor.

O acesso ao córtex foi realizado através de uma

incisão no escalpo, exposição da superfície do crânio,

limpeza com peróxido de hidrogênio 3% (H2O2) e salina

(NaCl 0,9%, Isoforma) usando hastes de algodão e

remoção de um fragmento da calota craniana sobre o

córtex barril.

Foram utilizadas as posições do bregma e lambda para ajustar o alinhamento da cabeça do

animal, assim como para a demarcação da região do crânio (abertura retangular) a ser removida, de

aproximadamente 3 x 3 mm, centrada nas coordenadas estereotáxicas do córtex barril (AP: -1,5 a -

FIGURA 6: Localização do córtex barril.

Posição-alvo dos eletrodos no córtex do barril

obitda com uso de coordenadas estereotáxicas e

da artéria cerebral média e seus ramos.

15

4,5 mm; ML: 3,5 a 6,0 mm). A identificação da artéria cerebral média foi utilizada como referência

para posicionar o feixe de eletrodos no córtex somatossensorial barril. A descida dos eletrodos

somente foi realizada após a remoção da dura-máter. Sangramento durante a remoção da dura-mater

foi evitado. Implantamos um micro-parafuso soldado a um fio de prata sobre o cerebelo que serviu

como aterramento/referência.

As matrizes de eletrodos utilizadas neste estudo foram montadas em nosso laboratório,

utilizando placa de circuito impresso, micro-pinos de ouro e conector 18-pinos Würth e, então

galvanizadas para redução da impedância até valores finais de 100-200 kOhm. O processo de

galvanização dos eletrodos (electroplating) consistiu em depositar íons de ouro metálico sobre a

superfície dos eletrodos de tungstênio (35 m) através da aplicação de um campo elétrico em solução

de ouro metálico. Para isto, mergulhamos as pontas dos eletrodos em uma solução de ouro (Sifco,

ASC) contendo nanotubos de carbono (CheapTubes) e aplicamos uma série de pulsos de corrente

utilizando o equipamento NanoZ (Neuralynx).

FIGURA 7: A, Modelo esquemático da matriz de eletrodos. 16 eletrodos de 35 mm de diamêtro posicionados em arranjo

4x4 com 200 mm de espaçamento horizontal. B, Silicon probe A1x16-5mm-50-703-A16 (B, figura adaptada do Probe

Catalog Neuronexus, 2017).

Para o posicionamento dos eletrodos no córtex barril, descemos a matriz de eletrodos

perpendicularmente à superfície cortical ou ao eixo entre as orelhas (50-100 m de descida a cada 5

min). Cada matriz consistia de 16 fios de tungstênio revestidos com teflon, 35 µm de diâmetro;

posicionados em arranjo 4x4 com 200 µm de espaçamento entre fileiras e colunas (California Fine

Wire, EUA; Figura 7A). Em um animal controle utilizamos um feixe linear de 16 eletrodos em

16

substrato ultrafino (Silicon Probe A1x16-5mm-50-703-A16; Neuronexus). Cada contato condutor

consistia de um disco com área de 177 m2 (15 m de diâmetro) espaçados verticalmente por 50 m

(Figura 7B).

As matrizes e a Silicon probe foram movidas através dos braços de micromanipulação do

aparelho estereotáxico até uma profundidade de 300-500 µm da superfície cortical de acordo com

Milebaev et al. (2011).

4.3 REGISTROS ELETROFISIOLÓGICOS

Registro de atividade oscilatória espontânea –

Os sinais eletrofisiológicos corticais foram registrados após pelo menos 2 horas de

estabilização do animal anestesiado, tempo de todo o preparo do animal, ajuste de posicionamento e

entrada dos eletrodos. Em alguns animais as vibrissas mistaciais foram estimuladas para confirmação

de posicionamento dos eletrodos no córtex barril pelo aparecimento de potencial evocado (Figura

27). Usamos o sistema de aquisição de dados RHA2000 (Intan Technologies), com taxa de

amostragem de 25 kHz (A/D 16 bits) e pré-amplificador (headstage) digital de alta impedância de

entrada com ganho de 200X e filtro 0.1-7.5KHz. De cada animal, foram coletados sinais de potencial

de campo local (LFP) e atividade multi-unitária extracelular em arquivos de 1-min de duração por

pelo menos 60 minutos. Nenhum filtro foi utilizado para prevenir ruído de 60 Hz. Todos os registros

foram realizados com o animal dentro de uma gaiola de Faraday aterrada.

4.4 PERFUSÃO E PREPARAÇÃO DO TECIDO

Após os registros eletrofisiológicos, cada animal recebeu uma dose suplementar de uretano

(50% da dose anestésica; i.p.) e foram perfundidos transcardiacamente com 150 ml de salina (NaCl

0,9%) a temperatura ambiente, seguido por solução gelada de paraformaldeído (PFA; ~300ml) 4%,

ambos tamponados com fosfato de sódio (PB) 0,01M e 0,1M, pH 7,4 respectivamente. Os cérebros

foram retirados da caixa craniana, e pós-fixados através da imersão em paraformaldeído por 24-48h e

posteriormente crioprotegidos em solução PB 0,1M + sacarose 30%. Os cérebros foram congelados

em solução de isopentano resfriado e armazenados em freezer na temperatura de -80 ºC.

17

4.5 ANÁLISE DE DADOS ELETROFISIOLÓGICOS

4.5.1 – Pré-processamento dos dados

Após a coleta dos dados, os arquivos gerados pelo sistema de aquisição RHA (.int) foram

convertidos em arquivos de leitura do software MATLAB (.mat), decimados e concatenados em uma

época de ~60 minutos através de rotinas de MATLAB produzidas em nosso laboratório. O processo

de decimação consiste em filtrar e re-amostrar os dados digitais de forma a diminuir a taxa de

amostragem de 25 kHz para 1kHz sem introduzir distorções. Este procedimento remove altas

frequências supérfluas para a análise de LFPs reduzindo também o tamanho dos arquivos a serem

processados. Como nosso objetivo inicial foi estudar LFP corticais, restringimos nossa faixa de

frequência para 500Hz (o que permite a observação até de fast ripples epilépticas, 250-400Hz) com

taxa de amostragem de 1KHz.

Em seguida, criamos uma estrutura de dados para facilitar o acesso às informações dos

registros de cada animal: identidade do animal, canais ordenados, arquivo de registro, identidade do

grupo experimental e trechos de ruído. Anotamos e retiramos da lista de canais da estrutura de dados

aqueles que apresentaram impedâncias elevadas (> 4MOhm) durante o experimento e, após

visualização de todos os canais, retiramos também aqueles que por ventura apresentavam ruído

aparente. Por fim, plotamos os registros de todos os animais e por inspeção visual anotamos trechos

de ruídos pontuais. Assim, todos os ruídos observados (macro e micro) foram eliminados das

análises subsequentes. Como nossos experimentos foram realizados em animais anestesiados, nossas

fontes de ruído se restringiram aos momentos de aplicação de salina sobre o córtex do animal, aos

acionamentos de equipamentos eletrônicos presentes na sala ou de eventuais esbarros do

experimentador na gaiola de Faraday.

Uma vez os registros organizados e os segmentos de ruído identificados, escolhemos um

canal representativo para a análise de cada animal. Dos animais registrados com matrizes todos os

canais se encontravam aproximadamente na mesma camada cortical e o sinal de melhor qualidade foi

escolhido. Já do animal registrado com Silicon probe, selecionamos o canal de maior resposta

evocada após estimulação das vibrissas (i.e, posicionado na camada IV do córtex barril).

4.5.2 – Composição espectral no córtex somatossensorial

Analisamos a composição espectral dos LFPs corticais com o objetivo de compararmos os

conteúdos oscilatórios entre os registros de animais VPA e controle. A densidade espectral auxilia

18

na captura de frequências predominantes e identifica periodicidades. Calculamos o espectro de

potência (PSD) global ou janelado dos registros de LFP utilizando o método do periodograma

modificado por Welch (função pwelch.m) com resolução de frequência de 0.25Hz e janela de 1-

segundo quando aplicado. A potência espectral, medida em µV²/Hz, foi normalizada em função da

soma das potências do registro completo e apresentada como média por grupo. Inicialmente

avaliamos a composição espectral do registro completo (~60 min) de cada animal, em seguida

analisamos por bandas de frequência (delta: 0.5-4Hz; teta: 4-12Hz; beta: 12-30Hz; gama: 30-100Hz)

e por fim, calculamos PSDs em janelas de 1-segundo deslizantes (sem sobreposição) ao longo de

todo o registro e avaliamos o curso temporal da potência em várias bandas de oscilação.

4.5.3 – Dinâmica de padrões eletrográficos no córtex somatossensorial sob efeito de uretano

Com o intuito de avaliar a dinâmica de comportamentos oscilatórios ao longo do registro,

além da visualização do rolamento do EEG, plotamos o espectrograma de cada animal para

frequências entre 0 – 20 Hz e de 20 – 100 Hz. Para identificarmos períodos de maior proeminência

em oscilações lentas em torno de 1 Hz, definimos uma razão de delta (entre 0.2 a 2 Hz), sobre teta

(entre 4 a 10 Hz), em épocas de 1 segundo com suavização a cada 50 pontos (média de pontos, sem

sobreposição). Considerando valores com o percentil acima de 75% definimos o tempo em

oscilações lentas, e com o valor desse ponto no eixo do gráfico, e com o valor da mediana de valores

dessa razão de cada animal definimos uma comparação entre os grupos.

Além disso, analisamos mapas de estado construídos a partir dos LFPs corticais de animais

controle e VPA, de acordo com Gervasoni et al. (2004). Para isto, calculamos duas razões (R1 e R2)

entre potencias de bandas espectrais: R1 = 0,5 – 20 Hz/0.5 – 55 Hz e R2 = 0,5 – 4 Hz/0.5 – 9 Hz para

janelas de 1-segundo ao longo de todo o registro de LFP, sem sobreposição. Cada mapa de estado se

constitui de um gráfico de dispersão de pontos onde plotamos R1 na abscissa e R2 na ordenada para

cada época de 1-segundo de cada animal. Uma vez que a faixa de frequência do numerador foi

incluída no denominador, as razões assumem valores entre 0 e 1. Os valores de numerador e

denominador foram determinados de modo que permitisse no mapa de dispersão uma melhor

separação de estados de vigília.

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados através de testes não paramétricos conforme as condições de

normalidade do nosso número amostral. Utilizamos principalmente o teste de Mann-Whitney para

19

comparar grupo controle e experimental. O grau de significância estatística adotado de 5%. As

análises foram realizadas com o auxílio do programa Prism 6 (GraphPad).

4.7 – IMPLEMENTAÇÃO DE APARATO PARA ESTIMULAÇÃO DE VIBRISSAS

Na perspectiva de avaliar a atividade eletrofisiológica dos animais através de novos métodos,

desenvolvemos e testamos aparato que possibilitasse a estimulação de vibrissas com pulsos de ar

controlados (Figura 8). Utilizamos para essa análise o animal CTL4 adulto, e iniciamos análise de

animais PND20-21 (Tabela Suplementar 1).

Pulsos TTL (Transistor-Transistor Logic) são gerados a partir de um sistema de arduino

(Figura 8F), previamente montado carregado por uma bateria de 24V, que enviam sinais para a

abertura de uma válvula solenoide (Bio-chem) (Figura 8B). Dessa forma, a abertura da válvula

permite a passagem de ar produzida por uma bomba (Figua 8C) e é conduzida por tubo adaptado a

uma agulha direcionada as vibrissas do animal (Figura 8A / Figura 9).

O arduíno é conectado também a entrada auxiliar do sistema de registro (Intan) (Figura 8D),

sendo registrado a entrada e duração dos eventos que são então sincronizados temporalmente com os

registros de potenciais de campo local.

Figura 8: Aparato de registro de estimulação. A) Agulha de sopro de ar; B) Válvula solenóide (Bio-chem); C) Bomba

de ar (JAD, S510 series; pressão = 1.45 psi); D) Sistema de registro Intan + arduino; E) Silicon probe 16 canais

(Neuronexus, A16).

A partir de scripts escritos em nosso laboratório para o software Arduino 1.6.12 todo o

sistema é controlado. Podemos definir o tempo de estímulo dos pulsos de ar, o intervalo entre os

pulsos, a quantidade de pulsos, ou até mesmo trens de estímulos com diferentes parâmetros.

20

Construímos e adaptamos um protocolo de estímulo, baseados no menor estímulo para gerar

resposta evocada, a profundidade no córtex com respostas de menor latência com o uso da Silicon

Probe de disposição linear (Figura 8E), e definimos uma distância da saída de ar até a vibrissa

principal para esses experimentos (Figura 9).

Figura 9: Padronização da estimulação de vibrissas. Distância da agulha para a vibrissa. Pulsos de

durações diferentes foram usados para calcular uma curva de entrada-saída.

Dados dos potenciais de campo local e unidades extracelulares foram analisados por scripts

baseados em programas de MATLAB. A atividade mutli-unitária de cada canal de registro foi obtida

a partir da seleção das unidades com amplitude acima de 6 desvios padrões da média do sinal

filtrado. Regiões de artefato, quando presentes, foram excluídas da análise. Foram armazenadas as

seguintes informações de cada potencial de ação extracelular: (1) tempo de ocorrência (timestamp),

(2) forma de onda (série temporal: 0.8 ms antes e 1.8 ms após o ponto de máxima amplitude).

Localização anatômica aproximada de cada local de gravação foi estimada pela profundidade

e pela localização da resposta com menor latência gerada pelo estímulo.

21

5 RESULTADOS

5.1 – COMPOSIÇÃO ESPECTRAL NO CÓRTEX SOMATOSSENSORIAL

Inicialmente avaliamos a composição espectral global da atividade oscilatória no córtex

somatossensorial dos animais VPA e controle, calculando o PSD médio por grupo ao longo de ~60

min de registro (Figura 10). Na Figura 10, plotamos o PSD em escala linear entre 0.5-20 Hz e em

escala logarítmica entre 20-100 Hz para melhor visualização das baixas e altas frequências,

respectivamente.

Figura 10: Espectro de potência global médio ao longo de ~60min de registros no córtex

somatossensorial de animais VPA e controle. Aplicado teste não paramétrico Mann-Whitney, p > 0,05.

Embora não tenhamos observado diferenças estatisticamente significativas entre as

composições espectrais definidas pelas bandas delta, teta, beta e gama, observamos que os LFPs

corticais de pelo menos metade dos animais VPA apresentaram maior potência nas frequências altas

(12-100 Hz). Por volta de 2 Hz até ~4 Hz, a potência espectral nos animais VPA foram abaixo dos

22

valores da densidade de potências dos animais controle. Enquanto que, a partir dos 20 Hz as curvas

correspondentes aos animais tratados permaneceram com valores acima em relação aos animais do

grupo controle. O fato de um dos animais VPA apresentar espículas epileptiformes ao longo do

registro gerou a presença de harmônicos múltiplos de ~6Hz no PSD promediado (Figura 10, PSD de

baixo). Notamos que nas baixas frequências ocorrem picos nos animais VPA entre 4-5 Hz e 17-18

Hz. Em síntese, os harmônicos são o resultado físico de um mecanismo de ressonância, em que uma

série de frequências refletem o comportamento de uma frequência fundamental, mais baixa, e por

isso ocorre em intervalos regulares múltiplo desta frequência.

Para avaliarmos se a banda espectral delta entre 2 – 4 Hz, estaria alterada em animais VPA

em relação ao controle conforme indicado na Figura 10, analisamos também o PSD médio nesta

faixa. Entretanto, mesmo nesse intervalo não foi encontrado significância estatística (Figura 11).

Figura 11: Potência espectral média em duas bandas delta, 0,5-4 Hz e 2-4 Hz. Não foi observada

diferença estatística na comparação entre os grupos. Aplicado teste de Mann-Whitney. Delta1 (0,5-4 Hz): U =

6; p = 0,65 e Delta 2 (2-4 Hz): U = 4; p = 0,34.

23

5.2 – ATIVIDADE PAROXÍSTICA EM ANIMAIS TRATADOS COM VPA

Avaliamos a presença ou ausência de atividade epileptiforme nos grupos controle e VPA

através da inspeção visual dos registros. Definimos atividade paroxística como toda atividade

espontânea aberrante registrada no LFP cortical (em qualquer dos 16 canais de registro) composta

por uma das seguintes características: (1) despolarizações rápidas em formato espicular (espículas)

isoladas ou em salvas de amplitude >300 V; e (2) sincronizações atípicas (excluindo-se

sincronizações fisiológicas como complexos K de sono, fusos [spindles], sharp-waves e ripples)

(Figuras 12-14). Atividade epileptiforme foi encontrada nos 4 animais do grupo VPA, enquanto que

não foram visualizadas em nenhum registro dos animais controle (Figura 12).

Figura 12: Atividade paroxística cortical em animais VPA. Períodos de 30 s de LFP com ampliação de segmentos de

5 s, e segmentos de 1 s identificados por traçado, com ocorrência de eventos que destoam da linha de base do registro dos

animais (VPA1 e VPA3 em vermelho).

24

A presença de atividade epileptiforme foi observada, por vezes, em mais de um canal,

ocorrendo em diversos momentos do registro. Para compararmos a atividade paroxística observada

nos animais VPA com a atividade epileptiforme de modelos de epilepsia experimental, a Figura

13A-B mostra espículas e sincronizações anômalas observadas em ratos que receberam injeção intra-

hipocampal de pilocarpina e ácido caínico.

Figura 13: Atividade epileptiforme cortical em animais modelo de epilepsia e de autismo. (A) LFP de animal

modelo de epilepsia utilizando pilocarpina; (B) LFP de modelo de epilepsia utilizando ácido caínico; (C) Trecho de 30s

LFP de animal VPA1 com ampliação de trechos de dispersos de 5s; (D) Segmentos de 30s com atividade epileptiforme

no animal VPA3 nos eletrodos 3 e 16 ocorrendo simultaneamente. (Cortesia de Rafael Bessa, 2016)

25

Considerando a fração de animais VPA que apresentaram tais eventos com relação aos

animais controle, verificamos a existência de atividade oscilatória paroxística em todos os animais

VPA e ausência nos animais controle. Isto indica que este modelo de autismo apresenta uma

disfunção excitatório-inibitória cortical espontânea no adulto que pode estar correlacionada aos

déficits comportamentais observados em percepção sensorial.

5.3 – DINÂMICAS ELETROGRÁFICAS DE PADRÕES NO CÓRTEX

SOMATOSSENSORIAL EM ANIMAIS TRATADOS COM VPA SOB URETANO

5.3.1 – Análise do perfil espectral no córtex somatossensorial ao longo do registro

Para avaliarmos de forma contínua as transições entre estados eletrofisiológicos distintos,

presentes em animais sob anestesia de uretano, plotamos inicialmente espectrogramas de todo o

registro (~60 min por animal) de um canal cortical selecionado (Clement et al., 2004; Lopes-Aguiar

et al., 2014). Ao avaliarmos os espectrogramas, assim como durante a análise de potências espectrais

globais dos animais, nos deparamos com presença de harmônicos, correspondendo a linhas verticais

de azul mais claro, que indicam um aumento de densidade, ocorrendo com intervalos iguais e

múltiplos (Figura 14). Além disso, através do espectrograma podemos avaliar a predominância de

frequências específicas ou a ocorrência de padrões espectrais. Para facilitar a visualização, dividimos

o espectrograma em duas faixas de frequência: 0 – 20 Hz e 20 – 100 Hz.

26

Figura 14: Espectrogramas da atividade elétrica cortical dos animais experimentais. Potências espectrais

ao longo de ~60 min (3600 s) de registro. Estados ativados (predomínio de oscilações rápidas, > 4 Hz) e desativados

(predomínio de oscilações lentas, < 3 Hz) podem ser observados. Na coluna à esquerda, animais controle. Na coluna à

direita, animais expostos a VPA.

A partir disso decidimos avaliar as alternâncias no comportamento espectral de cada animal, levando

em consideração a anestesia. Animais anestesiados com uretano apresentam alternâncias espontâneas

27

e cíclicas de estados, convencionalmente conhecidos como estados ativados ou desativados, que

correspondem a períodos de maior e menor sincronização, e seu comportamento durante a anestesia

se assemelha aos estados ativados e desativados que ocorrem durante o sono (Clement et al., 2004;

Dickson et al., 2008).

Figura 15: Características espectrais dos estados ativado e desativado em animal VPA. (A) Registro de LFP cortical

de um animal VPA (em branco) sobreposto ao espectrograma dividido em duas faixas: 0–20 Hz e 20–100 Hz. Barras

verticais coloridas indicam segmentos em estado desativado e ativado, respectivamente; (B) Segmento de 1-min de LFP

durante 1 minuto após 500s de registro, correspondendo a oscilações com maior amplitude; estado desativado; (C)

Potencial de campo durante 1 minuto após 1750s do início do registro, correspondendo a período com oscilações com

menores amplitudes; estado ativado; (D) Densidade de potência espectral dos 60s apresentados na letra B, com maior

proeminência de potência espectral por volta dos 1Hz; (E) Densidade de potência espectral dos 60s apresentados na letra

C, com potências espectrais proeminentes também em maiores frequências.

28

Durante o estado ativado, o córtex mostra atividade rápida com baixa voltagem, enquanto

durante o estado desativado há uma proeminente mudança para frequências mais lentas (~1 Hz) com

um considerável aumento da amplitude dos traços de LFP. Assim, a alternância de estados pode ser

observada por flutuações na amplitude do sinal (Figura 15-16). Inicialmente, para avaliarmos os

períodos desativados calculamos a razão delta (0,2-2 Hz) sobre teta (4-10 Hz) ao longo de todo o

registro (Figura suplementar 3; Figura 16). Os momentos em que a razão é mais elevada

correspondem aos períodos desativados.

Figura 16: Alternância de comportamento espectral em animal controle. (A) Registro do potencial de campo local

de animal controle após retirada de artefatos; (B) Espectograma ao longo do registro com a potência das oscilações em

bandas de frequência entre 20 – 100 Hz (acima) e de 0 – 20 Hz (abaixo). A mais proeminente flutuação de potência

espectral ocorre entre 1 e 6 Hz; (C) Razão de delta (0.2 – 2 Hz) por teta (4 – 10 Hz), com pontos suavizados em épocas

de 1 segundo, para determinação de períodos com predominância de oscilações lentas (delta). O tracejado vermelho

29

indica quando os pontos correspondem a valores de razão igual a 1, em que as onda delta e teta estão com valores

equivalentes de potência espectral. Os tracejados verdes delimitam os menores e maiores valores da razão em todo o

registro.

Além disso, definimos dois parâmetros para comparar os grupos: a mediana e o percentil

75% das razões ao longo do tempo para cada animal. O percentil 50% (mediana) e o percentil 75%

delimitam os valores de razão abaixo dos quais se encontram ½ e ¾ dos valores de razão,

respectivamente. A figura 17 mostra a distribuição das medianas e percentis 75% dos grupos

controle e VPA. Não encontramos diferenças significativas entre os grupos em nenhum dos dois

parâmetros. Assim, utilizamos outra metodologia para compararmos os estados eletrofisiológicos

entre os grupos controle e VPA.

Figura 17: Distribuição das razões delta(0.5-4Hz) /teta(4-12Hz) de mediana e percentil 75% ao longo de

todo o registro eletrofisiológico. Teste de Mann-Whitney; (A) Para mediana: p= 0,82; (B) Para percentil 75%: p=0,34.

5.3.2 – Mapa de estado no córtex de animais VPA

Estudos eletrofisiológicos em roedores sugerem que é possível distinguir os principais

estados comportamentais presentes ao longo do ciclo sono-vigília através da construção de mapas de

estado a partir de informações presentes no LFP (Gervasoni et al., 2004; Gradwohl et al., 2015; Stitt

et al., 2017). Assim, computamos os mapas de estado de animais VPA e controle para avaliarmos a

dinâmica dos estados cerebrais espontâneos durante a anestesia de uretano.

Sabendo que todos os segmentos de dados com saturação de amplitude foram descartados,

duas razões de amplitude espectral foram calculadas integrando a amplitude espectral (valor

absoluto) sobre bandas de freqüência selecionadas para cada janela de dados. Essas proporções são

resultantes de uma busca minuciosa de parâmetros visando a melhor separação de estados

comportamentais. As medidas de proporção foram projetadas para produzir valores normalizados

com distribuições mais simétricas, de modo que cada ponto represente 1s de atividade cerebral em

A B

30

curso. A densidade de pontos reflete a abundância relativa dos diferentes estados cerebrais, e as

distâncias entre dois pontos consecutivos de dados a velocidade das mudanças espectrais.

Inicialmente avaliamos todas as épocas combinadas dos animais presentes nos grupos

controle e VPA (Figura 18A; Figura 19A). Para analisar o comportamento espectral de cada animal,

plotamos seus valores individuais no espaço, assim como os histogramas em linha à margem de cada

gráfico de dispersão, indicando o acúmulo de épocas correspondente às razões de cada eixo (R1 e

R2; Figura 18B; Figura 19B).

Figura 18: Mapas de estado dos animais controle. (A) Mapa de distribuição de duas razões de amplitudes espectrais

dos potenciais de campo local cortical dos animais controle. Cada ponto corresponde a uma janela de 1 s, na qual as

amplitudes das razões foram calculadas [R1 (0.5 – 20 Hz/ 0.5 – 55 Hz) no eixo da abcissa e R2 (0.5 – 4 Hz/ 0.5 – 9 Hz)

no eixo das ordenadas]. A determinação do centro de massa da distribuição de pontos é indicada pelo ponto azul e os

tracejados verdes correspondem ao percentil de 25% da densidade de pontos. Plotado acima e à esquerda do mapa de

estado, histogramas com números de épocas distribuídas ao longo do eixo. (B) Épocas correspondentes a cada animal do

grupo controle separado por cores e seus respectivos percentis de 25% indicados pelos tracejados verdes.

Nos animais controle observamos uma maior densidade de pontos próximo ao valor 1,0 para

ambas as razões (R1 e R2). Apenas 25% do total de pontos se localizando abaixo de 0,5 em R2 e o

ponto demarcando esse percentil em R1 estando próximo a 0,9. O ponto médio, ou centro de massa

de todos os pontos, encontrou-se na localização 0,57 para o eixo das abcissas e 0,95 no eixo das

ordenadas.

Para os animais tratados com VPA essa tendência de valores próximos a 1,0 permaneceu,

entretanto, para R1 percebeu-se uma dispersão maior de pontos (Figura 20). Nesse eixo, em que

frequências maiores estão inseridas (20–55 Hz), final da banda de beta e inicio de gama,

influenciaram nessa variabilidade. A localização média do total de pontos desse grupo foi de 0,86

para o eixo R1 e 0,57 para o eixo R2.

A B

31

Quando avaliamos os perfis de cada animal individual nos mapas de estado, percebemos que

a variabilidade no eixo R1 sofreu a influência de vários animais (Figura 20). Dentre eles, um animal

apresentou valor de percentil 25% apenas para valores abaixo de 0,6, e somente 1 se assemelhava aos

animais controle (Figura 19B, Figura 20).

Figura 19: Mapas de estado dos animais VPA. (A) Mapa de distribuição de duas razões de amplitudes espectrais dos

potenciais de campo local cortical dos animais VPA. Cada ponto corresponde a uma janela de 1 s para o qual as

amplitudes das razões foram calculadas [R1 (0.5 – 20 Hz/ 0.5 – 55 Hz) no eixo da abcissa e R2 (0.5 – 4 Hz/ 0.5 – 9 Hz)

no eixo das ordenadas]. A determinação do centro de massa de distribuição de pontos indicado pelo ponto azul e os

tracejados verdes correspondendo ao percentil de 25% da densidade de pontos. Acima e à esquerda do mapa de estado,

histogramas com números de épocas distribuídas ao longo do eixo. (B) Épocas correspondentes a cada animal do grupo

separado por cores e o respectivo percentil de 25% cada indicado pelos tracejados verdes.

Figura 20: Distribuição dos valores de R1 para as épocas dos animais do grupo controle e VPA. Razão 1

corresponde a fração (valores entre 0,0-1,0) de energia na banda 0,5-20Hz no intervalo 0,5-55Hz para cada época de 1 s.

Distribuição mais dispersa das épocas dos animais VPA comparada aos animais controle que apresentam valores mais

uniformemente distribuídos próximo 1,0.

A B

32

Sobrepomos os pontos correspondentes a épocas dos dois grupos no mapa de estado (Figura

21), e sua variação foi mensurada utilizando os centros de massa e o desvio padrão da média. Para os

animais controle o desvio foi de 0,04 para eixo das abscissas (R1) e de 0,12 para as ordenadas (R2).

Já para os animais VPA, os valores de desvio padrão foram de 0,14 e 0,14 respectivamente.

Figura 21: Dispersão de estados nos grupos VPA e controle. (A) Mapa de distribuição de pontos calculados a partir

das razões 1 e 2 para todos os animais dos grupos controle (em preto) e VPA (em vermelho) [R1 (0.5 – 20 Hz/ 0.5 – 55

Hz) no eixo da abcissa e R2 (0.5 – 4 Hz/ 0.5 – 9 Hz) no eixo das ordenadas]. Os pontos no centro das linhas indicam o

centro de massa da distribuição respectiva de cada grupo e as linhas, correspondem ao desvio padrão de cada grupo. (B)

Mapa de estado dos grupos com os centros de massa da distribuição está representado pelo ponto amarelo para animais

VPA e pelo ponto azul para os animais controle. A linha tracejada verde corresponde ao percentil de distribuição de 25%

dos pontos de cada grupo para cada eixo. A elipse vermelha e a preta correspondem ao melhor ajuste (elipse fitting) por

mínimos quadrados dos dados de cada grupo.

Posteriormente, para que pudéssemos definir se essas diferenças na distribuição de R1

estariam ocorrendo ao longo de todo o registro, ou até mesmo definir a existência de algum outro

padrão temporal nas dispersões de pontos que não fosse perceptível na avaliação do mapa,

calculamos a média das razões distribuídas ao longo do registro, com suavização a cada 60 pontos

(60s), separados por grupos, e com as duas razões avaliadas de modo separado.

A B

33

Figura 22: Evolução temporal das razões ao longo de 1 hora de registro. Visão de todas as épocas de 1 seg com

suavização de 60 pontos (à direita), e valores das médias por grupo comparando cada razão. Foi realizado teste não-

paramétrico Mann-Whitney. (R1 [acima]: U = 2,0; p = 0,11; R2[abaixo]: U = 6,0; p = 0,65).

Extraindo a razão dos valores absolutos de potência nas bandas de frequências analisadas no

mapa foi calculada a média dos grupos, o erro padrão e construído gráfico ao longo do tempo (Figura

22). Nossa análise não detectou diferença significativa entre os grupos tanto para R1 quanto para R2.

Entretanto, observamos que R1 dos animais VPA permanece abaixo dos valores para os controles ao

longo de todo o registro.

5.4 – IMPLEMENTAÇÃO DO APARATO PARA ESTIMULAÇÃO DE VIBRISSAS

5.4.1 – Indução sensorial de atividade neural no córtex barril de ratos adultos

Na expectativa de podermos avaliar além da atividade oscilatória espontânea no córtex

somatossensorial de ratos, como também a atividade oscilatória evocada, para que assim pudéssemos

34

fazer comparações, especialmente no nosso modelo animal de autismo, demos inicio a experimentos

e definição de padrões em um aparato experimental em nosso laboratório.

Inicialmente avaliamos a ocorrência de respostas evocadas através da estimulação por pulsos

de ar de uma vibrissa principal destacada, avaliando as respostas diretamente na região do córtex

barril. Definimos, de modo a não haver perda de informação, uma janela temporal no registro de

campo local com um intervalo de 200 ms antes da aplicação dos pulsos de ar, e 500 ms após para

trabalharmos com os dados coletados.

Figura 23: Padronização das respostas corticais evocadas por estimulação de vibrissas. À esquerda, média

de 100-estimulações (canal 16) no córtex barril após estimulação de vibrissas com duração crescente dos pulsos de ar (à

esquerda). Centro, Posicionamento anatômico da matriz de silicon probe no córtex após a injeção do traçador retrógrado

no tálamo (VPM). À direita, média das respostas evocadas (100-estimulações) e atividade multi-unitária, MUA (em

vermelho).

Aplicamos pulsos de ar com diferentes durações e conseguimos visualizar alteração no

comportamento oscilatório com aparecimento de resposta a partir de pulsos com duração de 15 ms.

Calculamos posteriormente a média de 100 estimulações em um canal definido, e conseguimos ainda

visualizar os efeitos na mudança de amplitude do sinal em pulsos que variaram desde 15 ms até 50

ms de duração (Figura 23). A partir disso, definimos como padrão para os próximos testes os pulsos

de 20 ms. Realizamos a análise de respostas em todos os canais da silicon probe, que pela

conformação linear nos permitiu definir respostas em diferentes profundidades nessa região do

córtex somatossensorial.

35

Conseguimos obter resposta em todos os canais, indicando uma boa padronização do local e

angulação na descida dos eletrodos. Além disso, conseguimos detectar atividade multi-unitária ao

longo dos 16 canais de registro sob estimulação de 20 ms de pulsos de ar (Figura 23).

5.4.2 – Respostas evocadas ao longo de 16 canais no córtex barril

Ao calcularmos a média de 100 estímulos simultâneos para cada canal construímos

um mapa de calor (ou heat-map; Figura 24), indicando a intensidade das respostas em cada canal, e

assim, visualizando o canal de menor latência para respostas, como também de maior ou menor

mudança de amplitude/intensidade de resposta. Parâmetros que podem ser usados para avaliação de

grupos.

Figura 24: Respostas corticais evocadas por pulsos de ar nas vibrissas. Média de 100-respostas (canais 1-16) no

córtex barril após estimulação de vibrissas (linha tracejada; duração do pulso = 20ms). Em azul, deflexão negativa; em

vermelho, deflexão positiva dos potenciais de campo evocados.

Através também da média das densidades de correntes em cada canal de registro (current

source density analysis; Figura suplementar 3), a análise do potencial elétrico extracelular registrado

em vários canais leva a uma estimativa do local de geração da corrente pela medida dos potenciais.

Com isso conseguimos delimitar, baseados também com a referência da profundidade de entrada dos

eletrodos no córtex, o canal de primeira entrada do estimulo. Importante para a padronização do local

de registro e escolha do canal/canais para análise ou comparação entre grupos.

36

6 DISCUSSÃO

Esse trabalho teve como objetivo caracterizar padrões oscilatórios no córtex somatossensorial

primário de um modelo de autismo validado, considerando o efeito da anestesia de uretano, e através

da avaliação de registros do potencial de campo local, além de, ao final indicar também um método

de avaliação de respostas evocadas nessa região cortical.

A região somatossensorial é uma área de grande interesse na caracterização do modelo e da

heterogeneidade dos transtornos do espectro autista, sua função exerce grande influência sobre os

aspectos comportamentais. Somado a isso, os distúrbios de percepção sensorial são os sintomas mais

prevalentes entre os indivíduos com TEA e podem ocasionar debilidades que levariam a prejuízos

físicos ou sociais.

Embora haja vários estudos comportamentais com o modelo que indiretamente envolve

aspectos sensoriais táteis, como respostas a estímulos aversivos e respostas que envolvem integração

sensorial e sensório-motora, ainda há uma lacuna a ser respondida sobre os aspectos

eletrofisiológicos dessa região nos animais.

Ao inspecionarmos o registro do córtex somatossensorial de todos os animais em busca de

alterações ou diferenças discrepantes entre grupos e com o intuito de retirar os interferentes no pré-

processamento, distinguimos nos animais tratados com VPA atividade espicular recorrente, que

caracteriza eventos paroxísticos.

Paroxismos epileptiformes são ondas cerebrais que se destacam por sua morfologia com

aspecto mais pontiagudo, com amplitude habitualmente mais elevada em relação à linha de base do

EEG.

Levando-se em consideração que os animais estavam completamente imóveis sob efeito de

anestesia de uretano durante o registro, e que crises subclínicas, sem correlato motor, podem ocorrer

na presença de atividade eletroencefalográfica epileptiforme (Scharfman etal., 2007), foi aceita a

possibilidade desses eventos serem evidências de atividade do tipo epiléptica cortical desses animais.

Encontrar esses indícios em um modelo de autismo não é algo pouco provável, lembrando-se

que, de acordo com a OMS, 0,8% da população sofre com a condição de epilepsia (Leonardi &

Ustun, 2012), mas essa prevalência cresce bruscamente para aproximadamente 30% dos indivíduos

que são portadores de algum transtorno autista (Gillberg e Billstedt, 2000).

A hiperexcitabilidade, característica na epilepsia, pode surgir através de um processo de

insulto tecidual denominado epileptogênese que de algum modo promove aumento de excitabilidade

neuronal e ocasionalmente resulta em descargas síncronas e recorrentes, que com o tempo geram

uma condição crônica de desequilíbrios excitatórios-inibitórios (Tatum et al., 2012). Enquanto que,

37

na caracterização do autismo e desse modelo experimental, já existem diversos correlatos de

alterações estruturais, com alterações na densidade de subtipos neurais e na neurotransmissão, e uma

das hipóteses mais abordadas para suas diversas disfunções é exatamente o desequilíbrio entre

excitação e inibição.

Por causa da importância da excitação e inibição para as funções sensoriais normais,

podemos associar mudanças nesse balanço a distúrbios sensoriais mesmo em pequenas proporções.

Esse balanço funciona construindo filtros críticos e moldam os fluxos sensoriais recebidos, além de

moldar as representações construídas desses fluxos em regiões corticais específicas (Foss-Feig et al.,

2013; Snijders et al., 2013).

Quando iniciamos a caracterização global da densidade oscilatória ao longo de todo o

registro, encontramos uma elevação na média das densidades de potência para frequências acima de

20 Hz (beta e gama), contudo, ao separarmos as médias por grupo e em bandas espectrais de delta,

teta, beta e gama (até os 100Hz) não encontramos diferenças estatísticas.

Em seguida, na tentativa de avaliar as dinâmicas através da comparação dos estados

oscilatórios ao longo do registro (~ 60 min) e sabendo que essa anestesia já foi proposta por

mimetizar um estado natural como o sono, com oscilações lentas e rápidas ocorrendo em ciclos,

definimos uma razão entre a potência de bandas espectrais delta (0,2 – 2 Hz), mais baixa, e teta (4 -

10 Hz), contudo não encontramos nada conclusivo.

Então utilizamos uma abordagem que tem como príncípio os estados comportamentais dos

ratos e suas transições descritas em um espaço ou “mapa” bidimensional que permite uma

examinação quantitativa e imparcial das dinâmicas dos estados de sono-vigília.

Figura 25: Ilustração dos potenciais de campo locais e estados comportamentais. Registro

simultâneo de LFP em quatro regiões do prosencéfalo - Córtex somatossensorial primário (Cx), o hipocampo

(Hi), o núcleo ventromedial posterior do tálamo (Th) e o núcleo caudado e putâmen (CP). Cinco estados

comportamentais foram codificados com base em comportamentos e inspeção visual de vestígios de LFP (Lin

& Gervasoni, 2008).

38

Animais acordados apresentam o LFP cortical de baixa amplitude e densidade de potência

elevada em teta (5-9 Hz) e gama (30-55 Hz). Os movimentos rítmicos de vibrissas se apresentam na

mesma freqüência de oscilações cortical-talâmicas subjacentes (7-12 Hz) (Fanselow e Nicolelis,

1999) enquanto que no sono de ondas lentas, se apresentam fusos de sono (10-14 Hz) sobrepostos a

ondas delta (1-4 Hz) e a medida o sono se aprofunda, as oscilações delta tornam-se predominantes.

Já no sono REM o animal apresenta pouca amplitude LFP cortical e potência teta e gama alta.

(Figura 26).

Com essas informações a abordagem do mapa foi proposta como um meio de avaliar os

efeitos da anestesia de uretano nos animais controle e nos animais VPA adultos, empregando a razão

de duas bandas de frequências, que englobam várias bandas espectrais, ao invés de uma única banda

de frequência e uma única razão.

Ao perceber a dispersão de pontos equivalentes aos valores do eixo de razão determinada

pelas faixas de frequência entre 0.5 – 20 Hz e 0.5 – 55 Hz avaliamos também essa razão ao longo de

todo o registro, mas não encontramos diferença significante entre os grupos.

Uma melhor caracterização de oscilações de alta frequência da banda gama (> 30 Hz)

parece ser necessária, pois são reconhecidas por desempenharem um papel fundamental na

codificação sensorial em redes locais e são fortemente moduladas em resposta à estimulação

sensorial. A potência basal de gama no giro temporal superior, uma área auditiva central, foi

recentemente demonstrada por estar cronicamente elevada em uma grande amostra de indivíduos

com TEA (Edgar et al., 2015).

No humano existem diferenças notáveis entre as investigações em indivíduos com TEA

baseadas em tarefas e em repouso dessa função oscilatória, a potência aumentada de gama em

repouso está em contraste com a diminuição de sua potência em períodos de tarefas sensoriais

(Cornew et al., 2012; Orekhova et al., 2007; Wang et al., 2013). Sendo necessário esclarecer melhor

os vínculos no fenótipo do autismo com as oscilações em repouso, as respostas oscilatórias aos

estímulos sensoriais e o acoplamento em toda a hierarquia oscilatória.

Nesse caso o que torna adaptações de avaliações com modelos animais importantes são além

de tudo os desafios metodológicos devido efeitos de filtragem do crânio em humanos que afetam

especificidade espacial e investigações de potências de maior frequência. Na perspectiva de uma

melhor análise, com maior número amostral e diferentes condições experimentais, ao final,

conseguimos implatar um aparato no laboratório para avaliar respostas no córtex somatossensorial de

roedores que irá auxiliar na comparação entre os grupos com a amplitude, latência, limiar de

respostas e localização do início do potencial evocado nessa região de interesse, além de analisá-las

conhecendo por base a atividade oscilatória espontânea.

39

7 REFERÊNCIAS

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Neurophysiol. 111, 1300–1307.

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Neurosciences, 31(3), 137–45. http://doi.org/10.1016/j.tins.2007.12.005

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50

8 ANEXOS

51

9 FIGURAS SUPLEMENTARES

Animal Idade

(PND)

Peso Sexo Registro

CTL5 7 19g Macho LFP CTL6 8 20g Fêmea LFP CTL7 8 21g Fêmea LFP CTL8 13 30g Macho LFP CTL9 13 35g Macho LFP CTL10 14 35g Macho LFP CTL11 20 55g Macho LFP CTL13 20 55g Fêmea LFP CTL14 20 50g Fêmea LFP e PE

CTL15 21 65g Fêmea LFP e PE

VPA5 14 20g Macho LFP

VPA6 15 25g Macho LFP VPA7 20 40g Fêmea LFP VPA8 20 40g Macho LFP

Tabela suplementar 1: Animais experimentais adicionais registrados. LFP = Potencial de campo local;

PE = Potencial evocado.

52

Figura suplementar 1: Potência normalizada de delta e gama ao longo dos registros dos animais. Na

coluna da esquerda animais controle, e na coluna da direita animais modelo VPA. Em vermelho a potência de

gama (30-100 Hz) e em azul delta (0,2-2 Hz).

53

Figura suplementar 2: Razão das potências espectrais delta e teta ao longo do tempo. Na coluna da

esquerda em (linha preta) apresentando os valores suavizados dos animais controles e na coluna da direita os

valores dos animais VPA no decorrer do registro. As linhas tracejadas verdes indicam os maiores e menores

valores obtidos. A linha tracejada vermelha (esquerda) e linha tracejada cinza (à direita) indicam os valores

correspondentes a 1, quando haveria equilíbrio da potência das comparação das duas bandas espectrais.

54

Figura suplementar 3: Análise do mapa de densidade de corrente após potencial evocado. Vias de

corrente (azul, min =-10000 uV/mm2) e fontes (vermelho, máx = 15000 uV/mm2). Respostas mais curtas

ocorrem ao redor da camada cortical IV à estimulação de sopro de ar (20 ms; Pressão: 1,45 psi).

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