PALESTRA – Pontos críticos na validação de métodos baseados ...

Pontos críticos na validação de métodos baseados em ICP-MS

Fabio F Silva

Química Analítica

A química analítica é uma ciência metrológica que busca desenvolver, otimizar e aplicar ferramentas analíticas para obter informações a respeito da composição química, bioquímica e da estrutura da matéria, visando a resolução de problemas científicos, técnicos, econômicos e sociais.

M. Valcárcel, Princípios de Química Analítica, Springer, 1999

Química Analítica

Química Analítica

Química

Bioquímica

Inorgânica

Orgânica

Físico-Química

Física

Astrofísica

Astronomia

Biofísica

Engenharia

Química

Civil

Elétrica

Mecânica

Medicina

Clínica

Farmácia

Toxicologia

Materiais

Metalurgia

Polímeros

CerâmicaCiências Sociais

Arqueologia

Antropologia

Forense

Agricultura

Agronomia

Veterinária

Praguicidas

Ambiental

Água

Solo

Ar

Biota

Geologia

Geofísica

Geoquímica

Paleontologia

Biologia

Botânica

Genética

Biomol

Química Analítica

• Qualitativa:– Fornece informações sobre a identidade de espécies (atômicas

ou moleculares)• Resposta: Sim ou Não

• Quantitativa– Fornece informações numéricas, tais como as quantidades

relativas de um ou mais componentes da amostra• Resposta: Quanto

MétodosClássicos e Instrumentais

Métodos Clássicos

Baseados na separação das espécies de interesse

• Reações seletivas (formação de precipitados/ espécies coloridas)

• Separações por propriedades físicas (p.f.; p.e.; etc)

– Qualitativa: cores, odores, solubilidade, p.f. etc– Quantitativa: medições titulométricas ou

gravimétricas

Métodos Instrumentais

Desenvolvimento da Eletrônica permitiu monitorar muitas propriedades físicas aplicadas no Desenvolvimento da Química Analítica Instrumental

Início: século XX• Medidas de propriedades físicas através de instrumentos:

– Condutividade, potencial do eletrodo, emissão e absorção de luz, razão massa carga e etc.

• Quantificação/identificação de compostos orgânicos, inorgânicos e bioquímicos

Base da Química Analítica Instrumental:• Fonte de Energia• Estímulo• Resposta• Medição da resposta

Aplicação da Química Analítica

A Sequência Analítica

1. Definição do problema analítico2. Escolha do método3. Amostragem4. Preparação da amostra5. Calibração e medidas6. Cálculo dos resultados7. Avaliação dos resultados8. Ação

Espectrometria de Massas com Plasma Indutivamente Acoplado

ICP-MS

Desenvolvimento Histórico

Robert Samuel Houk; Velmer A. Fassel e Alan L Gray

Anal. Chem., 1980, 52 (14), pp 2283–2289

ICP-MS: Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry

Características:• Baseado na relação Massa/Carga dos isótopos de cada

elemento.54Fe+

55Fe+

56Fe+

57Fe+

58Fe+

• Determinação Elementar (“Metais”);

• Técnica Muito Sensível (LD ~ 1 ppt);

• Grande Faixa Linear de Trabalho (0.001 ppb – 100.000.000 ppb);

• Multielementar;

• Cobre maioria dos elementos da tabela periódica.

Razão m/Z onde Z = 1

Análise por ICP-MS:O Instrumento

19831989

1989Yokogawa PMS100 1987

Análise por ICP-MS:O Instrumento

ICP-MS:Principais Componentes

• Sistema de Introdução de Amostras

• Fonte de Íons: Plasma de Argônio

• Interface

• Lentes Iônicas

• Analisadores de Massas: Quadrupolo

• Detectores

ICP-MS:Principais Componentes

Sistema de Introdução de AmostrasInjector

Plasma

gas (Ar)

Auxiliary

gas (Ar)

Torch

Spray chamber

Nebulizer

Drain

coil

Vaccuum

Sampler Skimmer

Plasma e Interface

Formação do Plasma de Ar:

Ar + e- Ar+ + e-

Ionização:

Ar+ + e- Ar + 2e-

15,8 eV

Quadrupolo e Detector

Análise por ICP-MS:O Processo

Validação de Metodologias Baseadas em ICP-MS

Validação

De acordo com a Norma NBR ISO/IEC 17025:2005 (Requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaios e calibração) no item 5451:

Validação é a confirmação por exame e fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinando

uso pretendido são atendidos.

Parâmetros de Validaçãode Métodos Baseados em ICP-MS1. Aplicabilidade2. Seletividade / Especificidade e Efeito Matriz3. Linearidade4. Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho5. Sensibilidade6. Limite de detecção (L.D.)7. Limite de quantificação (L.Q.)8. Exatidão e tendência (bias) 9. Precisão (repetitividade, precisão intermediária e

reprodutibilidade)10. Robustez – Robustez11. Incerteza de medição

Etapas Anteriores à Análisepor ICP-MS

Principais Fontes de Erro

• Contaminação e Perdas dos Analitos:– Amostragem

• Inadequada, sem representatividade homogeneidade

– Ambiente do laboratório, habilidade do analista e preparo de reagentes

– Preparo de amostras

Ambiente do Laboratório

• BEC (Background Equivalente Concentration)– Medida do sinal de fundo do ICP-MS

• O que contribui para o BEC:

10ppb

1ppb

100ppt

10ppt

1ppt

Elementos Tipicamente Afetados

ContaminaçãoAl Ca Fe K Pb Zn

Ar não Filtrado (ppm pó)

3000 2700 3200 8000 2150 1600

Ar Filtrado

(ppt)

<0,004 <0,006 <0,04 <0,04 <0,02

Cosméticos (ppm)

60000 1100 250 35000

Suor (ppm) 4 - 10 1 350 0,1 - 3 1

Pele (ppm) 1 - 2 250 10 3000 6 - 20

Cabelo (ppm) 4 - 30 3200 5 – 70 900 3 - 70 450

Tschöpel et al, Fresenius Z. Anal. Chem. 302, 1-14, 1980

Reagente Cdng mL-1

Cu ng mL-1

Feng mL-1

Alng mL-1

Pbng mL-1

Mgng mL-1

Znng mL-1

H2O ultra pura 0,01 0,04 0,32 <0,05 0,02 < 0,02 < 0,04

HCl 10 M Subdestilado

0,01 0,07 0,6 0,07 0,05 0,2 0,2

HCl 10 M Suprapuro

0,03 0,2 11 0,8 0,13 0,5 0,3

HCl 12 M p.a. 0,1 1,0 100 10 0,5 14 8

HNO3 15 M subdestilado

0,001 0,25 0,2 <0,005 <0,002 0,15 0,04

HNO3 15 M Suprapuro

0,06 3,0 14 18 0,7 1,5 5,0

HNO3 15 M p.a.

0,1 2,0 25 10 0,5 22 3,0

Tschöpel et al, Fresenius Z. Anal. Chem. 302, 1-14, 1980

O Desempenho do ICP-MS Depende da Estrutura do Lab

• Sistemas de controle de contaminação– Filtração de ar, insuflamento de ar limpo, controle

de acesso, capelas de fluxo laminar, etc;

• Boas práticas de laboratório– Equipe treinada e comprometida;

• Reagentes de qualidade– Água ultrapura

– Ácidos Subdestilados ou Suprapuros.

Preparo de Amostras

• Compatibilização da amostra com a técnica de análise (soluções aquosas para ICP-MS)

– Amostras Líquidas: • Soluções: leitura direta ou diluição (se necessário)

• Suspensões: filtração, centrifugação, etc.

• Presença de constituinte orgânico: combustão (atmosfera oxidante) ou destruição com reagentes químicos

– Amostras Sólidas:• Solubilização geralmente via digestão (Aquecimento + Ácidos +

Oxidantes): sistemas abertos ou fechados

Fontes de Erro no Preparo de Amostras para ICP-MS

• Perdas por Volatilização


• Perdas por Adsorção

É difícil estimar as perdas ou ganhos de elementos-traço como resultado de processos de adsorção ou dessorção, mas os fatores

mais importantes são:

• O analito, sua concentração e seu estado de oxidação;• Os elementos e os compostos orgânicos e inorgânicos

concomitantes na solução do analito;• As concentrações destes concomitantes, o estado de oxidação dos

concomitantes e o pH do meio;• A duração do contato e a temperatura.

��í�� ⟷ ��í��

�


• Contaminação de vidrarias (ng g-1) Elemento Carbono

VítreoPTFE Teflon® Quartzo

HeraluxQuartzo Suprasil

VideoBorossilicato

Co 2 2 1 1 100

Ni 500 - - - 2000

Cu 200 20 70 10 1000

Zn 300 10 50 100 3000

As 50 - 80 0,1 22000

Cd 10 - 10 - 1000

Hg 1 10 1 1 -Tolg e Tschöpel, Anal. Sci. 3(1987) 199-208

Estrutura laboratorial adequada, equipe treinada e comprometida, reagentes e vidraria de qualidade

apropriada, preparo de amostras em sistemas fechados

Contaminação e Perdas

Afetam:

• LD e LQ

• Precisão

• Exatidão

• Incerteza

Parâmetros da Validação: Aplicabilidade

• Conjunto de Analitos

Especificação detalhada p. ex: arsênio total;

• Faixa linear de trabalho;

• Matrizes cobertas

Leite – desnatado, integral, cru;

• Equipamento, reagentes, procedimento;

• A aplicação pretendida;

Definição Clara e Específica do Escopo do Método

Parâmetros da Validação: Seletividade/Especificidade• Um método pode ser seletivo ou específico. Então, o primeiro passo de

um processo de validação é verificar em qual situação o método se enquadra.

• Uma amostra, de maneira geral, consiste dos analitos a serem medidos, da matriz, e de outros componentes que podem ter algum efeito na medição, mas que não se quer quantificar. A especificidade e a seletividade estão relacionadas ao evento da detecção.

Um método que produz resposta para apenas um analito é chamado específico.

Um método que produz respostas para vários analitos, mas que pode distinguir a resposta de um analito da de outros, é chamado seletivo.

Interferências

• Em relação a outras técnicas, as técnicas de espectroscopia atômica não são afetadas severamente por interferências;

É a influência (positiva ou negativa) sobre os sinais relativos a um analito causada por constituintes outros da amostra

(Os Concomitantes).

Em ICP-MS as interferências são classificadas em 2 grupos:

Físicas ou de Matriz

--Características da solução da amostra que alteram a resposta do analito

Viscosidade, tensão superficial, pH, Teor de Sólidos Dissolvidos (TDS), etc.

Espectrais

-- Espécies com a mesma relação massa/carga que o analito de interesse:

Isóbaros – monoatômicos e poliatômicos

Interferências Físicas ou de Matriz

Nebulização

Taxa de aspiração Nebulizador

1% HNO3

5% H2SO4

Tamanhodas gotas

Viscosidade e a tensão superficial afetam a: • Taxa de aspiração• Tamanho das gotas• Sensibilidade

MIBK .................

Efeito do Corg na Ionização

• O Carbono Orgânico (Corg) pode aumentar o sinal do analitoentre 10-30%;

• Este efeito não ocorre uniformemente para todos os elementos – Os mais afetados são As e Se

A presença de Corg prejudica severamente a Exatidão devido aos efeitos na nebulização e ionização

Efeitos de Sais Dissolvidos (TDS)

• Interfere nos processos de nebulização:

– Mudanças de densidade e tensão superficial que alteram o processo de nebulização bem como transporte da amostra.

• Interfere nos processos de ionização:

– Altera a população de e- no plasma perturbando os processos de ionização.

• Interfere no transporte do feixe de íons

TSD < 100ppm “Matriz Leve”100 ppm < TDS < 1.000ppm (0,1 %) “Matriz Média”

0,1 % < TDS < 1 % “Matriz Pesada”TDS > 1% “Matriz Ultra Pesada”

Efeito de Sais DissolvidosElementos Facilmente Ionizáveis

• Os elementos alcalinos e alcalinos terrosos baixo potencial (energia) de ionização (PI):

– Easily Ionizable Elements (EIE)

• Altas concentrações destes elementos perturbam os processos de ionização

Na PI = 5,14 eV (Na

rapidamente libera seu elétron no

plasma)

Zn PI = 9,39 eV (Os cátions de

Zn podem se associam aos elétrons

do Na

Em um plasma com alta concentração de Na+, uma quantidade de íons Zn+ podem se associar aos e- do Na+ e retornarem ao estado de Zn neutro que não é

detectável pelo espectrômetro de massas resultando na redução do sinal de Zn+.

Efeito de Sais DissolvidosEfeito Espaço-Carga• Altas concentrações de íons “pesados” M+ (m > 40 uma) podem

perturbar a trajetória do feixe de íons:

– Repulsão entre cátions

– Mais severo para íons mais leves

Um feixe de íons difusos. Eles têm pequena interação uns com os outros e o campo eléctrico é dominado pelas lentes.

Alta densidade de íons “pesados”. Os íons sofrem ação dos campos das lentes bem como dos próprios íons gerando o efeito "espaço-carga" entre si. Os íons de massa mais leves terão maior probabilidade de ser desviados do feixe e perdidos.

Como Superara Efeitos de Alto TSD?• Otimização dos parâmetros instrumentais para aumentar a

robustez do plasma (CeO/Ce ≤ 1%):– Potência do Plasma

– Gás de Nebulização

– Distância entre o Cone e o Plasma

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

Sc-45 Cr-52 Fe-56 Zn-66 Mo-95 In -115

% R

eco

very

Elements

Signal Suppression in 0.3% NaCl

1% CeO/Ce

1.7 % CeO/Ce

Controle dos Efeitos das Interferências Físicas ou de Matriz: Conhecimento da amostra, definição do escopo

do método, preparo de amostra, otimização do ICP (plasma robusto), Padronização Interna, “Matrix

Matching”, adição de padrão.

Interferências Físicas ou de MatrizAfetam:

• LD e LQ

• Linearidade

• Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho

• Precisão

• Exatidão

• Vida útil do instrumento

Interferências Espectrais

A técnica de ICP-MS produz um espectro menos ruidoso

ICP-MS vs ICP OES

ICP-MS vs ICP OESElemento Isótopos Linhas de Emissão

Li 2 30

Cs 1 645

Mg 3 173

Ca 6 662

Cr 4 2277

Fe 4 4757

Ce 4 5755

A técnica de ICP-MS produz um espectro menos ruidoso

Interferências Espectrais (Isóbaros)• O que garante a especificidade de um analito no ICP-MS?

• Relação m/Z– Interferências Espectrais Monoatômicas

– Interferências Espectrais Poliatômicas

75As150Sm++

87Rb87Sr

32S16O16O

204Pb204Hg

75As35Cl40Ar

70Zn140Ce++

52Cr40Ar12C , 35Cl16O1H

56Fe40Ar16O, 40Ca16O

40Ca40Ar

AnalitoPotencial Interferente

As interferências Espectrais afetam a seletividade com FALSOS POSITIVOS

Interferências Espectrais: Isóbaros Poliatômicas• Condições químicas e/ou físicas do plasma/interface

podem resultar na formação de íons

moleculares/poliatômicos: OH, CO, ArH, etc

• O espectro de massa produzido por uma

Solução aquosa inclui massas do solvente e

qualquer associação com as impurezas presentes

na solução: SO, ArCl, OCl

Interferências poliatômicas mais comuns em ICP-MS:

ArX+ onde X=O, Cl, etc.

Óxidos: MoO+, TiO+, CaO+.

Dímeros: Ar2+, N2

+, O2+, S2

+

Hidretos: ArH+, BrH+

Hidróxidos: CaOH+, ArOH+

Estratégias de Correção de Interferências Espectrais de ICP-MS

• Subtrair o Branco

• Otimizar parâmetros do instrumento (Tune)

• Preparo de Amostras e Escolha dos Reagentes

• Separação da matriz (ex: usar HG ou NU)

• Usar ICP-MS com Tecnologia de Célula

A Estratégia Depende da Situação ...

Otimizar parâmetros da fonte/ICP e lente iônica

• Potência

• Fluxo de Nebulização

• Posição da Tocha

☺ Minimização de interferentes poliatômicos e de dupla carga

☺ Simples

� Limitado

Preparo de Amostras e Seleção de reagentes

• Diminuição de C residual

• Evitar a utilização de outros ácidos além do HNO3

☺Diminuição de espécies XC+ (40Ar12C+ interferente do 52Cr+) formadas no plasma

☺Diminuições de espécies como 40Ar35Cl+, 32S34S+, 31P16O2

1H+

�Restrito a poucas aplicações

Usar ICP-MS com Tecnologia de Célula

• Tecnologias mais difundidas baseado em Célula

– Discriminação por Energia Cinética (KED)

• Simples

• Multielementar

– Reações Seletivas

• Controle parcial das reações

• Controle de Interferências Poli e Monoatômica

Usar ICP-MS com Tecnologia de Célula

As Células podem operar em dois

diferentes Modos:

Colisão (KED)ou

Reação

Modo Colisão ou Kinetic Energy Discrimination (KED)

KED: Funcionamento

Célula de Colisão

Quadrupolo Pré-Filtro

HeSe+ArAr+

Os íons entram na cela com igual EC

Íons colidem com o He

σìon molecular> σ ion elementar

ArAr+ mais colisões que o Se+

ArAr+ perde mais EC que Se+

KED: Funcionamento

Distance

Ionkineticenergy

Voltagebarrier

AnalyzerQuadrupole

Pre-filter Collision cell

ArAr+

KED: Funcionamento

Distance

Ionkineticenergy

Voltagebarrier

AnalyzerQuadrupole

Pre-filter Collision cell

Se+

Redução da Intensidade dos Interferentes

Poliatômicos e Manutenção da

Intensidade dos Analitos

A) Amostra com matriz + analitos com a célula DESATIVADA

B) Amostra com matriz + analitos com a célula ATIVADA

A Interferência Espectral Afeta a Faixa Linear de Trabalho bem como os

LD/LQ

A) Amostra com matriz + analitos com a célula DESATIVADA

B) Amostra com matriz + analitos com a célula ATIVADA

A)

B)

Modo Reação

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

++

Modo Reação: Processos mais Comuns

• Transferência de Carga

ArO+ + NH3 → NH3+ + ArO

• Protonação

ArH+ + NH3→ NH4+ + Ar

• Transferência de Átomo de H

ArO+ + H2 → H2O+ + Ar

• Condensação

As+ + O2 → AsO+ + O

Modo Reação: Processos mais Comuns

• Transferência de Carga

ArO+ + NH3 → NH3+ + ArO

• Protonação

ArH+ + NH3→ NH4+ + Ar

• Transferência de Átomos de H

ArO+ + H2 → H2O+ + Ar

• Condensação

As+ + O2 → AsO+ + O

Modo Reção

+

+

+

+

+

+

+

+40Ar16O+

56Fe+

55Mn+

+

+

+

+

+

+

+

+

1H2

+ +

+

+

+

++

1H216O+

Transferência de carga

A+ + B+ + R → A+ + B + R+

PIA < PIR < PIB

A: AnalitoB: Íon interferenteR: Reagente (gás)

PIFe < PIH < PIAr

Fe+ + ArO+ + H2 → Fe+ + Ar + H2O+

Modo Reação H2

Controle dos Efeitos das Interferências Espectrais: Conhecimento da amostra, definição do escopo do método, preparo de amostra, otimização do ICP e

aplicação de célula (Colisão e Reação)

Interferências EspectraisAfetam:

• Seletividade

• LD e LQ

• Linearidade

• Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho

• Precisão

• Exatidão (falsos positivos)

Conclusão

• A Validação por ICP-MS é um processo trabalhoso e detalhado que depende:

– Estrutura do Laboratório

– Capacitação da equipe

– Definição clara do escopo do método

– Conhecimento da amostra

– Hardware e software adequados para a aplicação

– Controle contínuo

Agradecimentos

A Vocês pela Atenção !!!!

Muito Obrigado

Fabio F Silva

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