PAPEL DA VARIABILIDADE GENÉTICA NA DEPRESSÃO EM … · Agradecimentos ii Um especial...

Dissertação de Mestrado em Medicina Legal

PAPEL DA VARIABILIDADE GENÉTICA NA DEPRESSÃO

EM DOENTES COM PATOLOGIA AUTOIMUNE

ANA MARTA PRAÇA DÂMASO FERREIRA

M 2016

Ana Marta Praça Dâmaso Ferreira

PAPEL DA VARIABILIDADE GENÉTICA NA DEPRESSÃO EM

DOENTES COM PATOLOGIA AUTOIMUNE

Orientador – Professora Doutora Berta Martins da Silva

Categoria – Professora Associada

Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar

da Universidade do Porto

Coorientadores – Mestres Bárbara Guerra Leal e Andreia

Bettencourt

Categoria – MSc

Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar

da Universidade do Porto

Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Medicina Legal submetida ao

Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto

Agradecimentos

i

Agradecimentos

A finalização desta grande etapa não teria sido possível sem o apoio de várias

pessoas que, direta ou indiretamente, deixaram o seu contributo para que esta se

tornasse possível e às quais não posso deixar de prestar o meu agradecimento.

À Professora Doutora Berta Martins da Silva, pela oportunidade e por todo o

apoio prestado para a realização deste trabalho. Ainda por toda a compreensão,

ensinamentos e tempo disponibilizado. Esta etapa não teria sido possível sem a

presença de uma orientação tão rica em conhecimentos.

À Bárbara um especial agradecimento, devo-lhe tudo aquilo que aprendi ao

longo desta etapa. Quero agradecer não só por toda a ajuda prática e conhecimentos

científicos transmitidos mas também pela paciência e disponibilidade que nunca me

faltaram. Sem este forte apoio, seria impossível a realização deste trabalho.

À Mestre Andreia Bettencourt, pela ajuda prática, disponibilidade e partilha de

conhecimentos. Às Mestres Daniela Boleixa, Sandra Brás e Cláudia Carvalho um

grande obrigada por toda a ajuda prática, todas as dicas e o à vontade que sempre se

dispuseram a transmitir-me. E ainda, à Dona São e Mestre Dina Lopes por

proporcionarem o que diria ser um ambiente perfeito para o que se pretende numa

equipa científica.

À Comissão Científica do Mestrado em Medicina Legal, em especial à Professora

Doutora Maria José Pinto da Costa pela oportunidade em frequentar este ciclo de

estudos. Ainda um agradecimento generalizado a todos os professores que partilharam

uma pequena parte do seu vasto saber e iluminaram ainda mais os meus

conhecimentos.

Aos serviços de Neurologia e Unidade de Imunologia Clínica (UIC) do Hospital

de Santo António – Centro Hospitalar do Porto, por terem aceite participar no presente

estudo e no apoio a nível das amostras.

Às minhas amigas de sempre e para sempre, às minhas Anas, Margaridas e

Alexandras e à minha Inês, agradeço o apoio e a amizade única e insubstituível.

Obrigada por todos os fantásticos momentos que passamos desde a infância até ao

presente, fazendo com que tudo seja muito mais fácil e agradável de se viver.

Agradecimentos

ii

Um especial agradecimento ao Hugo, por ser o meu grande companheiro e o

meu porto de abrigo em todos os momentos, bons e menos bons. Obrigada por me

apresentares àquilo que penso ser o amor e me fazeres crescer tanto enquanto pessoa.

Aos meus irmãos, João e Teresa, que apesar de longe, sinto-os sempre perto,

quero agradecer por todo o apoio nos momentos mais críticos e de maior frustração.

Vocês são e serão sempre um dos maiores pilares da minha vida.

Aos meus pais, por me apoiarem e acreditarem em mim e nas minhas

capacidades incondicionalmente. Por fazerem de mim uma das maiores prioridades das

suas vidas e por me transmitirem os valores certos para que me tornasse tudo aquilo

que sou hoje!

A todos, o meu sincero OBRIGADA!

Resumo

iii

Resumo

As doenças autoimunes são patologias inflamatórias, crónicas, multifatoriais e

de sintomatologia complexa. A Esclerose Múltipla (EM) e a Doença de Behçet (DB) são

exemplos de doenças autoimunes. A depressão é um distúrbio frequente nestas

patologias. De facto, tanto os doentes com EM como com DB apresentam taxas de

prevalência de depressão significativamente mais elevadas, de 54% e 45,5%,

respetivamente, comparativamente à população em geral, 15%. A etiologia da

depressão continua por identificar mas sabe-se que fatores bioquímicos, genéticos e

sociais contribuem para o seu desenvolvimento. Nos últimos anos, diversos estudos têm

demonstrado que os indivíduos deprimidos têm alterações na resposta inflamatória. De

facto, tem sido descrito que estes indivíduos apresentam níveis mais elevados de

citocinas pro-inflamatórias. Sabe-se que estas podem interferir com o funcionamento do

SNC, nomeadamente ao nível da neurotransmissão serotoninérgica, do sistema HPA e

da neurogénese do hipocampo, mecanismos estes envolvidos na patofisiologia da

depressão.

Este estudo visa a contribuir para uma melhor compreensão dos estados

depressivos em doentes com patologia autoimune. Com esse propósito, foi estudado o

papel da variabilidade de moléculas do sistema serotoninérgico (rs6295, 5-HTR1A;

rs6296, 5-HTR1B; rs6313 e rs6314, 5-HTR2A) e de citocinas pro-inflamatórias

(rs1800629, TNFα; rs16944, IL-1β) em doentes com EM e DB. Para isso, foram

estudados 205 doentes com patologia autoimune (158 EM e 47 DB) da Unidade de

Imunologia Clínica do Hospital de Santo António – Centro Hospitalar do Porto. A esta

população foi aplicado o inquérito de saúde Hospital Anxiety and Depression Scale

(HADS) para rastreio da depressão e ansiedade. Cinquenta e cinco doentes com

autoimunidade (41 EM e 14 DB) foram diagnosticados com depressão (HADS≥8). Os

polimorfismos foram genotipados através de diferentes técnicas de Biologia Molecular

(tecnologia Taqman, PCR-RFP e PCR com análise do fragmento), consoante o

apropriado. Como controlo para os estudos genéticos, foi estudado um grupo de 255

indivíduos saudáveis do norte de Portugal.

No grupo de doentes de Behçet observou-se que a frequência do genótipo

rs6295GC apresenta-se diminuída em relação à população controlo [40,4% vs 51,7%,

p=0,027, OR (IC=95%)=0,453 (0,224-0,914)]. A frequência genotípica do rs16944TT

está aumentada nos doentes deprimidos comparativamente aos não deprimidos [16,4%

vs 5,4%, p=0,019, OR (IC 95%)=3,562 (1,238-10,254)]. De facto, a frequência

Resumo

iv

genotípica do rs16944TT está aumentada nos doentes deprimidos com EM assim como

nos DB, mas apenas se observaram resultados estatisticamente significativos em

doentes com EM [17.1% deprimidos vs 5.2% não deprimidos, p=0.039, OR

(CI=95%)=3.561 (1.065-11.910)]. Para os restantes polimorfismos não foram

observadas associações significativas, quer para as doenças autoimunes como para a

depressão.

A nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a propor uma associação entre

o gene HTR1A e a DB. O facto de a serotonina ser uma amina imunomodeladora poderá

ser um ponto de partida para investigações futuras. Este estudo também sugere que os

doentes com autoimunidade, particularmente os doentes com EM, portadores do

genótipo rs16944TT possuem maior predisposição para a depressão. Este genótipo

está associado a uma maior expressão da IL-1β levando não só a uma exacerbação de

reações inflamatórias mas também a défices no SNC, particularmente no funcionamento

do sistema serotoninérgico. Estas observações estão de acordo com estudos anteriores

e são de especial relevância em indivíduos com patologias autoimunes. Por essa razão,

estudos em coortes mais alargadas são necessários.

Estes estudos podem ter importância em aspetos médico-legais, nomeadamente

na prevenção do suicídio. Estima-se que 60% das mortes por suicídio ocorre em

consequência de distúrbios depressivos.

Palavras-chave: Depressão; Autoimunidade; Inflamação; Citocinas; Serotonina;

Polimorfismos.

Abstract

v

Abstract

Autoimmune diseases are multifactorial, chronic and inflammatory pathologies

with a complex symptomatology. Multiple Sclerosis (MS) and Behçet’s Disease (BD) are

examples of autoimmune diseases. Depression is a frequent condition in these

pathologies. Indeed, both patients affected by MS as BD have significantly higher

prevalence rates of depression, 54% and 45,5%, respectively, when compared to the

general population, 15%. Depression is of unknown ethiology but biochemical, genetic

and social factors are known to contribute to its development. In recent years, several

studies have demonstrated that depressed individuals have changes in the inflammatory

response. Indeed, it has been reported that these individuals present higher levels of

pro-inflammatory cytokines. It is known that these may interfere with SNC functioning,

particularly regarding to serotonergic neurotransmission, HPA system and hippocampal

neurogenesis, the mechanisms are involved in the pathophysiology of depression.

The study aims to contribute to better understanding of depressive states

in patients with autoimmunity. With that purpose the role of genetic variability in

serotonergic system molecules (rs6295, 5-HTR1A; rs6296, 5-HTR1B; rs6313 and

rs6314, 5-HTR2A) and in pro-inflammatory cytokines (rs1800629, TNFA; rs16944, IL-

1B) was studied in patients with Multiple Sclerosis (MS) and Behçet Disease (BD). For

that, 205 patients with an autoimmune pathology (158 MS and 47 BD) from the outpatient

clinic of Clinical Immunology Unit of Hospital de Santo António – Centro Hospitalar do

Porto, were studied. The health survey Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS)

was applied for screening of depression and anxiety. Fifty five patients with autoimmunity

(41 MS and 14 BD) were diagnosed with depression (HADS≥8). The polymorphisms

were genotyped by different Molecular Biology techniques (Taqman assay, PCR-RFLP

and PCR product Sizing), as appropriated. A group of 255 healthy individuals from the

north of Portugal were studied as control for genetic studies.

It was observed that, the frequency of rs6295GC genotype is lower in the

Behçet’s patients comparing to controls [40,4% vs 51,7%, p=0,027, OR (CI=95%)=0,453

(0,224-0,914)]. The genotypic frequency of rs16944TT is increased in depressed

patients comparing to those non-depressed [16,4% vs 5,4%, p=0,019, OR

(CI=95%)=3,562 (1,238-10,254)]. In fact, the rs16944TT frequency is higher in both MS

and DB depressed patients, but statistically significant results are only observed for MS

[17,1% depressed vs 5,2% non-depressed, p=0,039, OR (CI=95%)=3,561 (1,065-

Abstract

vi

11,910)]. Neither in autoimmune diseases or in depression, significant associations with

the other polymorphisms studied were observed.

To the best of our knowledge, this is the first study suggesting an association

between HTR1A gene and BD. The fact that serotonin is an immunomodulatory amine

may be a starting point for further researches. This study also suggests that patients with

autoimmunity, particularly MS patients, carrying the rs16944TT genotype have higher

predisposition to depression. This genotype is associated with higher IL-1b levels leading

not only to exacerbation of inflammatory reactions but also to impairments in SNC,

particularly in serotonergic system functioning. These observations are in line with

previous studies and may be especially relevant in individuals with autoimmune

diseases. For that reason, studies in larger cohorts are warranted.

These studies may have relevance in medical-legal concerns, particularly in the

suicide’s prevention. It is estimated that 60% of suicide deaths occur as a result of

depressive disorders.

Keywords: Depression; Autoimmunity; Inflammation; Cytokines; Serotonin;

Polymorphisms.

Índice Geral

vii

Índice Geral

Agradecimentos ............................................................................................................. i

Resumo ........................................................................................................................ iii

Abstract ........................................................................................................................ v

Índice Geral ................................................................................................................. vii

Índice de Figuras ..........................................................................................................ix

Índice de Tabelas .........................................................................................................xi

Abreviaturas e símbolos ............................................................................................. xiii

INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1

1.1. Sistema Imune .................................................................................................. 2

1.2.Esclerose Múltipla ............................................................................................... 3

1.2.1. Etiologia ....................................................................................................... 4

1.2.1.1. Fatores genéticos .............................................................................. 6

1.2.1.2. Fatores ambientais ............................................................................. 7

1.2.2. Manifestações clínicas ................................................................................. 8

1.2.3. Formas de Esclerose Múltipla ...................................................................... 9

1.3.Doença de Behçet ............................................................................................... 9

1.3.1. Etiologia ..................................................................................................... 10

1.3.2.1. Fatores genéticos ............................................................................ 11

1.3.2.2. Fatores ambientais ........................................................................... 12

1.3.2. Manifestações clínicas ............................................................................... 12

1.4.Depressão e autoimunidade .............................................................................. 13

1.5.Depressão ......................................................................................................... 14

1.5.1. Etiologia ..................................................................................................... 16

1.5.1.1. Fatores bioquímicos .......................................................................... 16

1.5.1.1.1. Hipótese monoaminérgica ........................................................ 17

1.5.1.1.2. Hipótese das citocinas .............................................................. 19

1.5.1.1.3. Hipótese neurogénica ............................................................... 20

1.5.1.2. Stress ................................................................................................ 21

1.5.1.3. Fatores genéticos .............................................................................. 22

1.5.1.3.1. Genes recetores de serotonina ................................................. 23

1.5.1.3.1.1. Recetor de serotonina 1A, 5-HTR1A ................................ 23

1.5.1.3.1.2. Recetor de serotonina 1B, 5-HTR1B ............................... 24

Índice Geral

viii

1.5.1.3.1.3. Recetor de serotonina 2A, 5-HTR2A ................................ 25

1.5.1.3.2. Genes citocinas ........................................................................ 26

1.5.1.3.2.1. Fator de Necrose Tumoral alfa, TNF-α ............................. 26

1.5.1.3.2.2. Interleucina 1 beta, IL-1β ................................................. 27

1.5.1.4. Depressão e as doenças crónicas ..................................................... 28

OBJETIVOS ............................................................................................................... 32

MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 34

3.1.População em estudo ........................................................................................ 36

3.2.Métodos ............................................................................................................ 37

3.2.1. Amostras biológicas ............................................................................... 37

3.2.1.1. Extração do DNA .......................................................................... 37

3.2.1.2. Quantificação do DNA .................................................................. 38

3.2.2. Estudos genéticos ................................................................................. 39

3.2.2.1. Estudos de associação ................................................................. 39

3.2.2.2. Variações genéticas ...................................................................... 39

3.2.3. Técnicas aplicadas ................................................................................ 39

3.2.3.1. PCR-RFLP .................................................................................... 41

3.2.3.2. PCR em tempo real ...................................................................... 45

3.2.4. Análise estatística .................................................................................. 49

RESULTADOS ........................................................................................................... 50

4.1.Caraterísticas dos doentes autoimunes ............................................................. 52

4.2.Análise genética ................................................................................................ 53

4.2.1. Suscetibilidade para a doença autoimune ............................................. 53

4.2.2. Suscetibilidade para a depressão .......................................................... 56

DISCUSSÃO .............................................................................................................. 60

CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS ............................................................ 68

BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................... 72

Índice de Figuras

ix

Índice de Figuras

Figura 1: Tolerância central e tolerância periférica ........................................................ 2

Figura 2: Prevalência da Esclerose Múltipla em todo o mundo……………………………4

Figura 3: Patofisiologia da EM. ..................................................................................... 5

Figura 4: Prevalência da DB em todo o mundo, por 100 000 habitantes. .................... 10

Figura 5: Patofisiologia da DB. .................................................................................... 10

Figura 6: Sinapse química .......................................................................................... 16

Figura 7: Sinalização serotoninérgica ......................................................................... 18

Figura 8: Local de ação dos antidepressivos .............................................................. 19

Figura 9: Mecanismos envolvidos na exacerbação de citocinas pro-inflamatórias ...... 20

Figura 10: Passos da PCR.......................................................................................... 40

Figura 11: Procedimento da técnica PCR-RFLP. ........................................................ 41

Figura 12: (A) Genótipos do polimorfismo rs1800629 obtidos por PCR-RFLP com

utilização da enzima NcoI. (B) Genótipos do polimorfismo rs6313 obtidos por PCR-RFLP

com utilização da enzima MspI. .................................................................................. 45

Figura 13: Mecanismo da PCR em tempo real com a tecnologia Taqman para a

genotipagem.. ............................................................................................................. 46

Índice de Tabelas

xi

Índice de Tabelas

Tabela 1: Principais manifestações clínicas da esclerose ............................................. 8

Tabela 2: Principais manifestações clínicas da doença de Behçet.............................. 13

Tabela 3: Critérios de diagnóstico para a depressão, segundo o DSM-V, Diagnostic and

Statistical Manual of Mental Disorders, 5ª Edição. ...................................................... 14

Tabela 4: Sequências de primers utilizadas para a análise dos polimorfismos rs1800629

e do rs6313. ................................................................................................................ 42

Tabela 5: Protocolo PCR – Reagentes e respetivas concentrações utilizados para

amplificação do gene TNF-α. ...................................................................................... 42

Tabela 6: Protocolo PCR – Reagentes e respetivas concentrações utilizados para

amplificação do gene HTR2A. .................................................................................... 43

Tabela 7: Perfil térmico da PCR para amplificação do gene TNF-α. ........................... 43

Tabela 8: Perfil térmico da PCR para amplificação do gene HTR2A. .......................... 43

Tabela 9: Local de corte das enzimas de restrição NcoI e MspI, utilizadas na análise dos

polimorfismos rs1800629 e rs6313, respetivamente. .................................................. 44

Tabela 10: Protocolo digestão enzimática com a enzima NcoI. .................................. 44

Tabela 11: Protocolo digestão enzimática com a enzima MspI. .................................. 44

Tabela 12: Reagentes e respetivas concentrações utilizadas na PCR para análise dos

polimorfismos rs16944 e rs6314. ................................................................................ 47

Tabela 13: Perfil térmico utilizado para a análise do polimorfismo rs16944. ............... 47

Tabela 14: Perfil térmico utilizado para a análise do polimorfismo rs6314. ................. 47

Tabela 15: Reagentes e respetivas concentrações utilizadas na PCR para análise dos

polimorfismos rs6295 e rs6296. .................................................................................. 48

Tabela 16: Sequências de primers e sondas utilizadas para análise dos polimorfismos

rs6295 e rs6296. ......................................................................................................... 48



Tabela 19: Caraterísticas demográficas e clínicas das populações estudadas. .......... 52

Tabela 20: Frequências genotípicas dos polimorfismos nos genes recetores da

serotonina (HTR1A, HTR1B e HTR2A), na população controlo e na população de

doentes. ...................................................................................................................... 54


serotonina (HTR1A, HTR1B e HTR2A) na população controlo e na população de

doentes com esclerose múltipla. ................................................................................. 54

Índice de Tabelas

xii


serotonina (HTR1A, HTR1B e HTR2A) na população controlo e na população de

doentes com a doença de Behçet. .............................................................................. 55

Tabela 23: Frequências genotípicas dos polimorfismos nos genes citocina (TNF-α e IL-

1β), na população controlo e na população de doentes. ............................................. 55


1β) na população controlo e na população de doentes com esclerose múltipla. ......... 56


1β) na população controlo e na população de doentes com doença de Behçet. ......... 56


serotonina (HTR1A, HTR1B e HTR2A) na população de doentes com e sem depressão.

................................................................................................................................... 57


serotonina (HTR1A, HTR1B e HTR2A) na população de doentes com esclerose múltipla

deprimidos e não deprimidos. ..................................................................................... 57


serotonina (HTR1A, HTR1B e HTR2A) na população de doentes com doença de Behçet

deprimidos e não deprimidos. ..................................................................................... 58


1β) na população de doentes com e sem depressão. ................................................. 58


1β) na população de doentes com esclerose múltipla deprimidos e não deprimidos. . 59


1β) na população de doentes com doença de Behçet deprimidos e não deprimidos. . 59

xiii

Abreviaturas e símbolos

5-HT – 5-hydroxytryptamine

5-HTR – 5-hydroxytryptamine receptor

ºC – graus Celsius

≥ - maior ou igual

< - menor

µL – microlitros

µM – micromolar

α – alfa

β – beta

γδ – gama/delta

A – Absorvância

ACTH – Adrenocorticotropic hormone

BDNF – Brain-derived Neurotrophic

Factor

BHE – Barreira Hematoencefálica

CD4+ - Cluster of Differentiation 4

COMT – Catechol-O-methyltransferase

CRH – Corticotropin-releasing Hormone

CSF – Cerebrospinal Fluid

DB – doença de Behçet

ddH2O – água bidestilada

DNA – Deoxyribonucleic Acid

dNTPs – Deoxynucleoside

Triphosphates

DSM-V – Diagnostical Statistical Manual

of Mental Disorders, 5th edition

EBV – vírus Epstein-Barr

EDSS – Extanded Disability Status

Scale

EDTA – Ethylenediamine Tetraacetic

Acid

EM – Esclerose Múltipla

EMER – Esclerose Múltipla

Exacerbação Remissão

EMSP – Esclerose Múltipla

Secundariamente Progressiva

EMPP – Esclerose Múltipla

Primariamente Progressiva

G – Gramas

GR – Glicocorticoides Receptors

HADS – Hospital Anxiety and

Depression Scale

HCl – Hydrochloric acid

HFE – Human hemachromatosis

HLA – Human Leucocyte Antigen

HPA – Hypothalamic–Pituitary–Adrenal

IL – Interleukin

IDO – Indoleamine 2,3-dioxygenase IFN – Interferon

LES – Lúpus Eritemoso Sistémico

https://en.wikipedia.org/wiki/Indoleamine_2,3-dioxygenase

Abreviaturas e símbolos

xiv

LHPP – Phospholysine

Phosphohistidine Inorganic

Pyrophosphate Phosphatase

M – Molar

MAO-A – Monoamine Oxidase A

MgCl2 – Magnesium Chloride

MHC – Major Histocompability Complex

mL – Mililitros

mM – Milimolar

MMPs – Matrix Metalloproteinases

MR –mineralocorticoides receptors

NaCl – Sodium Chloride

ng – Nanograma

nm - Nanómetro

NURD – Nuclear DEAF-1-related

OR – Odds Ratio

OMS – Organização Mundial de Saúde

p – p value

pb – pares de base

PC – População Controlo

PCR – Polymerase Chain Reaction

PTPN22 – Protein Tyrosine

Phosphatase Non-receptor type 22

RCLB – Red Cell Lysis Buffer

RFLP – Restriction Fragment Lenght

Polymorphism

RNA – Ribonucleic Acid

SDS – Sodium Dodecyl Sulfate

SNC – Sistema Nervoso Central

SMP – Sistema Nervoso Periférico

SNP – Single Nucleotide Polymorphism

SPSS – Statistical Package for the

Social Sciences

STRs – Short Tandem Repeats

Taq – Thermus aquaticus

TE – Tris-EDTA

TE2 – Tris-EDTA 2

TDO – Tryptophan 2,3-dioxygenase

TNF – Tumour Necrosis Factor

TPH – Triptophan Hidroxilase

TRYCATs – Tryptophan Catabolites

U – Unidade

VNTR – Variable Number of Tandem

Repeats

vs - versus

https://en.wikipedia.org/wiki/Magnesium_chloride

Introdução

Introdução

2

I. INTRODUÇÃO

1.1. Sistema Imune

O sistema imune é um sistema complexo de defesa contra agentes patogénicos

e células alteradas (Kindt, Osborne, Goldsby, & Kuby, 2007), tendo por base o

reconhecimento de características estruturais que os distinguem das células saudáveis

do hospedeiro. A regulação da resposta imune tem um papel importante para que não

ocorram danos excessivos nos tecidos. Mas, tal como em todos os sistemas biológicos,

podem ocorrer desregulações que culminam no desenvolvimento de alergias ou de

doenças auto-imunes (Abbas et al., 2014).

A autotolerância representa um dos

mecanismos de regulação do sistema imune

e permite a prevenção de reações

inapropriadas contra autoantigénios. Ao

nível do timo, são deletadas células T com

elevada afinidade para autoantigénios num

processo denominado por tolerância central.

Algumas células T CD4+ com baixa afinidade

para os autoantigénios, escapam ao controlo

tímico para a circulação. Perante esta

situação a regulação é controlada pelo

mecanismo de tolerância periférica, em que

a supressão de linfócitos T autorreativos

está ao encargo das células T reguladoras

(figura 1) (Abbas et al., 2014).

A ocorrência de falhas nos mecanismos de controlo leva a que os linfócitos T

autorreativos possam ser ativados na periferia, na presença de antigénios

(nomeadamente virais) de composição semelhante às das proteínas humanas, levando

à resposta autoimune. É neste pressuposto que se baseia a teoria do mimetismo

molecular, que poderá justificar a patofisiologia de inúmeras doenças autoimunes,

nomeadamente da Esclerose Múltipla e da Doença de Behçet (Al-Omaishi, Bashir, &

Gendelman, 1999; Kindt et al., 2007; Verity, Marr, Ohno, Wallace, & Stanford, 1999).

Assim, a doença autoimune é a expressão das respostas imunes contra células

ou tecidos do próprio organismo. São patologias multifatoriais uma vez que a exposição

de indivíduos geneticamente suscetíveis a fatores ambientais de risco pode levar a uma

Figura 1: Tolerância central e tolerância periférica (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2014).

Introdução

3

exacerbação da atividade imunológica, desencadeando o início e a progressão da

doença autoimune (Cho & Feldman, 2015). As doenças autoimunes dividem-se em dois

grupos: (i) doenças específicas de órgãos, em que órgãos específicos são atacados

pelo sistema imunitário; (ii) doenças sistémicas, podendo estas afetar qualquer parte do

organismo e diversos sistemas em simultâneo (Abbas et al., 2014). A Esclerose Múltipla

e a Doença de Behçet, que vão ser abordadas neste trabalho, são exemplos de doenças

autoimunes.

1.2. Esclerose Múltipla

A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença inflamatória crónica, desmielinizante e

degenerativa, que afeta o sistema nervoso central (SNC). Tem como principal

caraterística o aparecimento de lesões de natureza inflamatória, consequentes da

destruição da mielina, na substância branca encefálica e medular. Dado que a mielina

tem a função de isolar as fibras nervosas, considera-se essencial na eficácia da

sinalização e transmissão neuronal. Assim, a sua destruição culmina em inúmeras

deficiências neurológicas.

A EM é uma das principais causas de incapacidade na população adulta jovem.

A EM incide principalmente em adultos jovens entre os 20 e os 40 anos (Hauser &

Oksenberg, 2006; Nielsen & Stenager, 2016), apresentando maior prevalência em

mulheres do que em homens (D. H. Miller, Fazekas, Montalban, Reingold, & Trojano,

2014). Estima-se que cerca de 2 300 000 de pessoas são afetadas pela doença em todo

o mundo. Em Portugal, um estudo realizado no distrito de Santarém reportou uma

prevalência de 46,3/100 000 habitantes, estimando que 5000 portugueses sejam

afetados pela EM (De Sa et al., 2006). A incidência e prevalência da EM tem vindo a

aumentar em todo o mundo. Facto este que poderá estar associado às alterações nos

critérios de diagnóstico, ao melhoramento da identificação de casos menos severos e

ao aumento da taxa de sobrevivência por parte destes doentes (Lund, Nakken, Edland,

& Celius, 2014).

Introdução

4

Estudos epidemiológicos descrevem que em determinadas zonas do mundo, o

risco de desenvolver EM é mais elevado do que em outras zonas: a Europa do Norte e

a América do Norte possuem maior risco do que a Europa do Sul, a Oceânia e a América

do Sul que, por sua vez, têm um maior risco do que a Ásia ou África, onde esta doença

é muito rara (figura 2). Estes dados sugerem que a prevalência da EM aumenta com a

latitude (Kingwell et al., 2013; Kurtzke, 2000; Leray, Moreau, Fromont, & Edan, 2016).

Os indivíduos afetados pela EM possuem uma probabilidade superior de

desenvolver comorbidades tais como fadiga, depressão, ansiedade, distúrbios

bipolares, epilepsia, fibromialgia, doença inflamatória do intestino, doença cardíaca

isquémica e doença pulmonar crónica (Marrie et al., 2016).

1.2.1. Etiologia

A transmissão de informação entre o SNC, sistema nervoso periférico (SNP) e

restantes estruturas dá-se através de impulsos elétricos ao longo dos neurónios. Os

axónios são revestidos pela mielina, composta por uma membrana de bicamada lipídica

e produzida por oligodendrócitos no SNC e por células de Schwann no SNP. A mielina

é assim essencial para a eficácia na sinalização e transmissão neuronal, aumentando a

velocidade de transmissão do impulso nervoso e evitando perdas energéticas

significativas. O desenvolvimento e progressão da esclerose múltipla envolve respostas

Figura 2: Prevalência da Esclerose Múltipla em todo o mundo, por 100 000 habitantes (Marrie, 2004).

Introdução

5

imunológicas contra as proteínas da mielina. Apesar de os eventos imunológicos por

detrás das manifestações clínicas desta patologia serem conhecidos, ainda não se sabe

o que leva ao despoletar dos mesmos.

Indivíduos afetados pela EM possuem linfócitos T autorreativos na periferia que,

após ativação, conseguem atravessar a barreira hemato-encefálica (BHE), penetrando

no SNC. Esta migração é mediada por quimiocinas e seus recetores, moléculas de

adesão e enzimas (Holmoy, 2007). Uma vez no SNC, os linfócitos T são reativados por

células de microglia, macrófagos e células B que expressam antigénios de mielina,

apresentados no contexto das moléculas HLA. Os linfócitos T CD4+ reativados libertam

citocinas e metaloproteinases de matriz (MMPs), que comprometem ainda mais a BHE.

Como consequência, ocorre o aumento da migração de linfócitos T helper ativados na

periferia. Simultaneamente, são libertadas citocinas pro-inflamatórias pelos linfócitos T,

responsáveis pela destruição da mielina (Lassmann, 2005) (figura 3). Embora a etiologia

da EM continue por desvendar, há um consenso entre a comunidade científica

considerando-a uma doença complexa que envolve fatores imunológicos, genéticos e

ambientais.

Figura 3: Patofisiologia da EM (Adaptada de: http://www.revitallebrasil.com.br/gerenciador/wp-

content/uploads/2011/06/Fisiopatologia-da-Esclerose-M%C3%BAltipla-Foco-nos-Linf%C3%B3citos.jpg; Acedida a: 30/05/2016).

Introdução

6

1.2.1.1. Fatores genéticos

Estudos de suscetibilidade familiar mostram que 15% dos doentes EM têm um

familiar afetado por esta doença (Al-Omaishi et al., 1999). Estudos de gémeos

monozigóticos e dizigóticos permitem observar que a taxa de concordância é de 20-30%

e de 5%, respetivamente. Estas observações sugerem que a componente hereditária é

um fator de risco importante para o desenvolvimento da EM (Compston & Coles, 2008).

Mais de 50 polimorfismos genéticos foram identificados como associados com a

doença (Sawcer et al., 2011). Os genes mais relevantes associados à EM encontram-

se no complexo principal de histocompatibilidade (MHC – Major Histocompatibility

Complex). A função das moléculas do MHC é ligar os fragmentos peptídicos derivados

do antigénio à superfície celular para reconhecimento através de células T. A

denominação para o MHC humano é o sistema antigénio leucocitário humano (HLA). O

fator genético mais fortemente associado ao risco de desenvolver EM é o locus HLA-

DRB1 localizado no cromossoma 6p21.3, na região da classe II do sistema HLA,

especificamente o alelo DRB1*1501 (Hauser & Oksenberg, 2006). Um estudo de

associação numa população portuguesa confirmou que o alelo HLA-DRB1*15 é o

principal marcador genético de suscetibilidade para a doença nesta população

(Bettencourt, Martins da Silva, Pinho, & Martins Silva, 2012). No mesmo estudo,

observou-se ainda que a presença dos alelos HLA-A*02 e -238A do gene TNF-α diminui

o risco de desenvolver EM, e que a presença da variante C282Y do gene HFE (High

Iron Fe, human hemachromatosis) parece conferir um pior prognóstico. Por outro lado,

o alelo HLA-DRB1*15 e o alelo 1858T do PTPN22 (Protein Tyrosine Phosphatase Non-

receptor type 22) estão associados, na população portuguesa, a um curso benigno da

doença (Bettencourt et al., 2012).

Outros polimorfismos localizados fora do sistema HLA estão associados à EM.

Entre eles, a associação que se revelou mais significativa foi em polimorfismos em

genes que codificam para as cadeias α do recetor da interleucina 2 (IL2Rα 10p15) e do

recetor da interleucina 7 (IL7Rα 5p13) (Hafler et al., 2007). A IL2Rα tem sido descrita

como implicada na patofisiologia de outras doenças autoimunes como a diabetes tipo 1

e a doença de Grave (Brand et al., 2007). Os polimorfismos rs12722489 e rs2104286

no intrão 1 do gene IL2Rα, que codifica a proteína CD25, estão em desequilíbrio de

ligação e foram associados à EM (Hafler et al., 2007). Está descrito que as células T

reguladoras, que expressam as proteínas CD4 e CD25, apresentam perda de função

em inúmeras doenças autoimunes, incluindo a EM (Viglietta, Baecher-Allan, Weiner, &

Hafler, 2004). O polimorfismo rs6897932, localizado no exão 6 do gene IL7Rα, que

Introdução

7

codifica a proteína CD127, também apresenta uma associação significativa com a EM

(Hafler et al., 2007). A IL-7 é importante para a homeostase das células T de memória

e na geração de células T autorreativas. A IL7R é também crítica no desenvolvimento

das células T γδ (gama/delta), que estão entre as primeiras células T observadas nas

lesões inflamatórias dos doentes com EM (Wucherpfennig et al., 1992). Apesar da

significância, o risco relativo é baixo para estas associações e nenhuma é tão

significativa como a associação com genes da região HLA.

1.2.1.2. Fatores ambientais

Os fatores ambientais de risco possuem um papel fundamental para o

desenvolvimento da EM. Ao longo dos anos, muitos foram os estudados e sugeridos,

nos quais se incluem os níveis de vitamina D, as infeções virais e o tabagismo (Watad

et al., 2016).

A deficiência nos níveis séricos de vitamina D foi previamente associada a

inúmeras doenças autoimunes, incluindo a EM (Ascherio, Munger, & Simon, 2010). A

vitamina D existente no corpo humano é predominantemente sintetizada através da

exposição à luz solar. Logo, o tempo de exposição solar poderá ser um fator ambiental

de risco para o desenvolvimento da EM (Hanwell & Banwell, 2011).

A exposição solar é particularmente relevante no período de gestação, na

infância e na adolescência. Existe uma maior frequência da doença em indivíduos

nascidos na primavera relativamente aos nascidos nos meses de outono, uma vez que

o período gestacional ocorre nos meses de inverno e de verão, respetivamente (Willer

et al., 2005). Verificou-se que populações que migram de áreas de alto risco para áreas

de baixo risco após a adolescência, mantêm o risco elevado para desenvolver esta

doença, enquanto indivíduos que migram antes e durante a adolescência, parecem ter

um risco de desenvolver EM associado à nova área de migração (Compston & Coles,

2008).

A associação entre a carência de vitamina D e o desenvolvimento de doenças

autoimunes é explicado pelo seu papel imunomodelador, conferindo ao sistema imune

um menor estado pro-inflamatório.

Tem também sido reportado que a infeção pelo vírus Epstein-Barr (EBV) em

adultos jovens aumenta em três vezes mais o risco de desenvolver EM (Levin et al.,

2005). O EBV tem tropismo para as células B alterando o seu metabolismo, a produção

de proteínas e o seu ciclo de vida celular, estabelecendo assim a life long latency no

Introdução

8

sistema imune. Existe um potencial mimetismo entre determinadas moléculas do EBV

e epítopos específicos da proteína de mielina. Assim, os linfócitos específicos para EBV

podem reconhecer antigénios da mielina, desencadeando a resposta autoimune

(Compston & Coles, 2008).

Vários estudos reportam que o tabagismo aumenta 1,5x o risco relativo de

desenvolver EM (Riise, Nortvedt, & Ascherio, 2003), sendo ainda considerado um fator

de risco para a progressão da doença (Hernan, Olek, & Ascherio, 2001). Isto deve-se

ao facto do fumo do cigarro possuir componentes, tais como a nicotina e o cianeto, que

provocam efeitos modulatórios no sistema imune e na permeabilidade da BHE bem

como outros efeitos tóxicos no SNC (Hernan et al., 2001).

1.2.2. Manifestações clínicas

As manifestações clínicas na EM resultam da interrupção do sinal e da

transmissão do fluxo nervoso, devido ao dano ou destruição da mielina (Hauser &

Oksenberg, 2006). Após a destruição da mielina, pode ocorrer um processo de

remielinização, parcial ou completo. Quando a remielinização é eficaz, o doente

consegue recuperar as suas funções. Não sendo este processo eficaz, cada um desses

processos deixa uma cicatriz, chamada de placa. Essas placas vão-se acumulando no

cérebro e causando incapacidade, consoante o sítio onde se localizam. Assim, apesar

das manifestações clínicas na EM variarem muito de indivíduo para indivíduo, alguns

sintomas podem ocorrer com frequência e outros raramente se manifestam (SPEM,

Sociedade Portuguesa de Esclerose Múltipla).

Tabela 1: Principais manifestações clínicas da esclerose (Compston & Coles, 2008; Hauser & Oksenberg, 2006).

Introdução

9

1.2.3. Formas de Esclerose Múltipla

O padrão de sintomas manifestado por cada doente leva a classificar a doença

em 3 subtipos: EM exacerbação remissão (surto/remissão) (EMER), EM secundária

progressiva (EMSP) e EM primária progressiva (EMPP). Os doentes EMER apresentam

surtos, nos quais aparecem novos sintomas ou se agravam os já existentes, com

subsequente remissão com recuperação total ou parcial. Os doentes EMSP evoluem da

forma EMER, mas desenvolvem défices neurológicos significativos que aumentam com

o curso da doença. Os doentes EMPP têm uma progressão lenta e contínua dos défices

neurológicos desde o início, sem surtos, remissão ou recuperação. Existe ainda uma

forma de EM benigna que se carateriza pela ocorrência de um ou dois surtos durante a

vida do indivíduo, com recuperação total da incapacidade provocada, até 10 a 15 anos

após a manifestação dos primeiros sintomas (Hafler et al., 2007).

1.3. Doença de Behçet

A Doença de Behçet (DB) é uma vasculite sistémica dos pequenos e grandes

vasos com capacidade de afetar ambas as circulações (venosa e arterial). Carateriza-

se principalmente por úlceras orais recorrentes, úlceras genitais e inflamação ocular,

mas pode também afetar as articulações, a pele, o trato gastrointestinal e, em casos

mais severos, o SNC (Marshall, 2004; Mat, Yurdakul, Sevim, Ozyazgan, & Tuzun, 2013).

Eventos patológicos como a trombofilia envolvendo pequenos e grandes vasos são

comuns nos doentes de Behçet (Hirohata & Kikuchi, 2003; Pickering & Haskard, 2000).

A prevalência da DB varia geograficamente, sendo mais frequente numa faixa

de países que se estende desde o Mediterrâneo até ao Extremo Oriente. É assim

designada como a “Doença da Rota da Seda”, por corresponder ao percurso desta rota

ancestral entre a Europa e a Ásia (Bonfioli & Orefice, 2005; Pickering & Haskard, 2000).

A maior taxa de incidência verifica-se na Turquia, onde a prevalência chega a

atingir, nas regiões mais a oriente, 421 casos por 100 000 habitantes. No resto da

Europa, as taxas de prevalência são variáveis: 0,64 para o Reino Unido, 1,2 para a

Suécia, 3,8 para a Itália e 5,6 a 7,5 por 100 000 habitantes para a Espanha (figura 4).

Em 1997, o grupo nacional para o estudo da DB reportou uma casuística nacional com

241 doentes tendo apresentado uma taxa de prevalência de 2,4/100 000 portugueses

(Oliveira, Horta, Serra, & Castro, 2001).

Introdução

10

A DB afeta igualmente ambos os sexos, exceto na Turquia em que a prevalência

nos homens pode atingir a razão de 7:1 (Saadoun et al., 2010), e o aparecimento

sintomático dá-se entre os 20 e os 40 anos. Há ainda estudos que revelam que a doença

se manifesta de forma mais severa em homens jovens adultos (Bonfioli & Orefice, 2005;

Saadoun & Wechsler, 2012).

1.3.1. Etiologia

Tal como noutras doenças autoimunes, os eventos imunológicos por detrás

desta patologia não são ainda totalmente conhecidos. Sabe-se que a DB carateriza-se

pela infiltração perivascular de

linfócitos, monócitos e neutrófilos

(Marshall, 2004). O aumento nos níveis

de citocinas pro-inflamatórias, de

proteínas C reativas e de

microglobulina B2 é observado nestes

doentes (Akoglu, Direskeneli, Yazici, &

Lawrence, 1990; Aygunduz et al., 2002;

Muftuoglu et al., 1986). Os níveis de

mieloperoxidase, produzidos por

neutrófilos ativos, apresentam-se

também aumentados (Accardo-

Figura 4: Prevalência da DB em todo o mundo, por 100 000 habitantes (Yurdakul & Yazıcı, 2010).

Figura 5: Patofisiologia da DB. Ag, antigen; APC,

antigen-presenting cells; HSP, heat shock protein; IFN, interferon; IL, interleukin; IPP, isoprenyl pyrophosphate; PPP, prenyl pyrophosphate; TCR, T-cell receptor; Th1, T helper cells type 1; TNF-α, tumor necrosis factor alfa (Hirohata & Kikuchi, 2003).

Introdução

11

Palumbo et al., 2000). A exposição a um agente de risco em indivíduos geneticamente

suscetíveis levam a uma exacerbação da atividade imunológica que conduz ao

despoletar da doença (Ambrose & Haskard, 2013).


Estudos de suscetibilidade familiar observaram que 12% dos doentes de Behçet

têm um familiar afetado pela doença (Kone-Paut et al., 1999). A importância dos fatores

genéticos é reforçada pela constatação em estudos realizados na Turquia, em que a

taxa de risco para a DB em gémeos monozigóticos se encontra entre os 11,4% e os

52,5% (Gul, Inanc, Ocal, Aral, & Konice, 2000). Tais observações sugerem um forte

envolvimento da componente hereditária na predisposição para a DB.

Tal como na maioria das doenças autoimunes, os genes do sistema HLA são os

que têm um maior contributo para a doença de Behçet. A suscetibilidade para

desenvolver a DB está associada ao alelo HLA-B*51 na região da classe I do sistema

HLA (Ambrose & Haskard, 2013; Hirohata & Kikuchi, 2003). No entanto, a presença do

alelo HLA-B*51 por si só não explica todos os sintomas presentes na DB. De acordo

com este facto, estudos recentes sugerem o envolvimento de outros genes. Vários

autores descreveram associações entre os alelos HLA-B*15, -B*27, -B*57 e -A*26 e a

suscetibilidade para doença em populações espanholas, turcas e japonesas (Meguro et

al., 2010; Montes-Cano et al., 2013; Ombrello et al., 2014). Também foram descritas

associações entre polimorfismos no gene da citocina pro-inflamatória IL-10 (rs1518111)

e no locus IL23R-IL12RB2 (rs924080) e o risco de desenvolver DB (Pickering &

Haskard, 2000; Remmers et al., 2010). No entanto, nenhuma destas associações é tão

significativa como a do HLA-B*51. Por outro lado, os alelos HLA-A*03 e -B*49 foram

associados como alelos protetores para a DB tanto em populações espanholas como

turcas (Montes-Cano et al., 2013; Ombrello et al., 2014).

Na população portuguesa, Bettencourt et al. demonstraram que, para além do

alelo HLA-B*51, a frequência do alelo HLA-Cw*16 está aumentada nos doentes de

Behçet (Bettencourt et al., 2008). Nesta população, também o alelo HLA-B*27 foi

associado como um fator de prognóstico para a doença, uma vez que a frequência deste

é mais elevada nos casos mais severos da DB (Bettencourt et al., 2008).

Introdução

12

1.3.1.2. Fatores ambientais

Estudos migratórios verificaram que indivíduos que migram de zonas de elevada

prevalência da DB para zonas de baixa prevalência, possuem um risco diminuído de

desenvolver a doença em relação aos indivíduos que permaneceram no país de origem

(Marshall, 2004; Mat et al., 2013). Facto este que sugere que a distribuição geográfica

é um fator de risco para o desenvolvimento da doença, embora a razão para esta

evidência ainda não seja clara.

A exposição a agentes infeciosos é o principal fator ambiental envolvido na

patogénese da DB. Tanto agentes virais (vírus da herpes, vírus da hepatite e parvovírus)

como agentes bacterianos (mycobacteria e Streptococcus sanguis) foram associados

ao desenvolvimento da DB (Bonfioli & Orefice, 2005; Marshall, 2004; Oliveira et al.,

2001; Verity et al., 1999).

O stress psicológico é considerado por alguns autores como um importante fator

tanto no desenvolvimento inicial bem como no relapso da DB. O stress induzido por

eventos ocorridos ao longo da vida pode ser considerado um fator de risco por

comprometer a homeostase, afetando diretamente o sistema imune (Karlidag et al.,

2003). É importante referir que não só o stress causa a doença, mas também a própria

doença causa stress no indivíduo.

1.3.2. Manifestações clínicas

O grau de severidade da doença de Behçet difere de indivíduo para indivíduo,

podendo apresentar-se de forma moderada a severa (Kokturk, 2012). A atividade desta

doença tende a diminuir com a idade e a frequência das manifestações parece depender

da distribuição geográfica (Ambrose & Haskard, 2013; Mat et al., 2013).

Introdução

13

1.4. Depressão e autoimunidade

Nas doenças autoimunes, sintomas psicológicos, tais como a fadiga, perda de

interesse nas atividades diárias e défices cognitivos, são comuns. Apesar de estes

sintomas serem muitas vezes conhecidos como sickness behaviour, estes também são

os principais sintomas para o diagnóstico da depressão. Esta observação levanta uma

série de questões e, talvez, a mais importante será a de saber se, o sickness behaviour

e a depressão são um e o mesmo problema? Ou terão diferentes patofisiologias e, por

isso, será mais apropriado considerá-los como situações clínicas diferentes?

É um facto que mais de 50% dos doentes autoimunes apresentam sintomas

depressivos (Pryce & Fontana, 2016). Relativamente aos doentes afetados pela

esclerose múltipla, estes apresentam maiores taxas de depressão em relação à

população em geral ou mesmo entre doentes afetados por outras doenças crónicas,

incluindo a epilepsia do lobo temporal e a esclerose amiotrófica lateral (Group, 2005;

Schiffer & Babigian, 1984). Este facto poderá estar relacionado com os danos cerebrais

causados pela EM (Gold & Irwin, 2009). A prevalência de depressão na EM varia de

15,7% a 54%, dependendo da amostra da população e dos critérios de diagnóstico

utilizados (da Silva et al., 2011; Patten, Beck, Williams, Barbui, & Metz, 2003; Skokou,

Soubasi, & Gourzis, 2012). Em relação aos doentes afetados pela doença de Behçet,

foi descrito que estes apresentam uma prevalência de depressão variável entre 17,8%

e 45,5% (Dursun, Uguz, Kaya, Savas Cilli, & Endogru, 2007; Taner et al., 2007),

significativamente elevada em comparação à população em geral. A relação entre o

grau de severidade da doença e a depressão também tem vindo a ser associada,

existindo estudos que confirmam esta relação tanto para a esclerose múltipla

Tabela 2: Principais manifestações clínicas da doença de Behçet (Marshall, 2004; Saadoun & Wechsler, 2012)

Introdução

14

(Chwastiak et al., 2002; da Silva et al., 2011; Zorzon et al., 2001) como para a doença

de Behçet (Koca et al., 2015; Melikoglu, 2010).

1.5. Depressão

A depressão é um distúrbio mental comum, afetando cerca de 350 milhões de

indivíduos em todo o mundo. Nos países desenvolvidos afeta mais de 15% da

população (Haase & Brown, 2015). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS),

a depressão carateriza-se por uma tristeza persistente, perda de interesse, sentimentos

de culpa, distúrbios no sono e no apetite e fadiga. Pensamentos e tentativas de suicídio

são recorrentes em doentes deprimidos. Também sintomas de ansiedade e irritabilidade

são comummente associados à depressão. O diagnóstico de depressão é estabelecido

se estiverem presentes cinco dos sintomas descritos na tabela 3 e se estes persistirem

durante, pelo menos, duas semanas e interferirem na vida social e ocupacional do

indivíduo. Este distúrbio afeta não só a vida diária dos doentes como também a dos

seus familiares e amigos próximos (Neto, Borges, Torres-Sanchez, Mico, & Berrocoso,

2011).

Critérios de Diagnóstico para a Depressão

Humor deprimido

Falta de energia, fadiga

Falta de interesse pelas atividades que normalmente dão prazer

Baixa auto-estima

Sentimentos de culpa ou inutilidade

Dificuldade na concentração e raciocínio

Alterações psicomotoras, retardação ou agitação

Distúrbios no sono: insónia ou hipersónia

Irritabilidade

Perda ou ganho de apetite e, em consequência, de peso

Pensamentos recorrentes de morte ou suicídio

Tabela 3: Critérios de diagnóstico para a depressão, segundo o DSM-V, Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 5ª Edição.

A OMS coloca este distúrbio como sendo a quarta causa de incapacidade funcional

em todo o mundo e prevê que, em 2030, seja a segunda maior causa (Mathers & Loncar,

2006). Mesmo quando o tratamento é eficaz, a remissão da doença não envolve a perda

Introdução

15

total dos sintomas depressivos, prevalecendo défices a nível funcional e cognitivo.

Factos estes que culminam na redução da qualidade de vida dos indivíduos (Lepine &

Briley, 2011). É ainda importante salientar que 60% das mortes por suicídio ocorre em

consequência de distúrbios de humor, inclusive a depressão (Y. K. Kim et al., 2008). A

nível global, em cada ano quase um milhão de indivíduos são vítimas do suicídio (WHO,

2012). Em Portugal, o Ministério da Saúde estima que a depressão esteja associada à

perda de mais de 1200 vidas por ano.

Os estudos epidemiológicos têm vindo a demonstrar que a prevalência da

depressão está a aumentar. Apesar de apresentarem resultados relativamente

uniformes, a sua prevalência varia substancialmente de país para país e até mesmo

entre regiões do mesmo país. Estas disparidades emergem da falta de uma metodologia

científica comum, resultado da dispersão teórica sobre o distúrbio, o que torna difícil a

comparação de dados entre os diferentes estudos (Kessler & Bromet, 2013).

Sabe-se que a depressão pode ocorrer em qualquer momento da vida, no

entanto o início e progressão do distúrbio é mais comum em adultos jovens (Kessler &

Bromet, 2013). Apesar deste distúrbio afetar ambos os sexos atinge cerca de duas

vezes mais mulheres do que homens, apresentando taxas de prevalência de 12,5% e

7,1%, respetivamente (Gater et al., 1998). É de facto considerada a principal causa de

incapacidade entre as mulheres. Esta diferença pode estar relacionada com alterações

nos níveis de hormonas sexuais, em particular no início da puberdade, na gravidez, no

período pós-parto e na menopausa (Kessler, 2003). A depressão nos homens é muitas

vezes não diagnosticada e por isso não tratada. Os homens ainda têm dificuldade em

assumir os sintomas depressivos, o que poderá estar relacionado com o medo de

estigmatização social. É de realçar que, embora este distúrbio afete mais mulheres do

que homens, a taxa de suicídio entre homens é quatro vezes superior,

comparativamente às mulheres, e associa-se a formas mais violentas de suicídio

(Porche, 2005). Segundo Tully et al., descendências com pais deprimidos apresentam

maior predisposição para desenvolver depressão (Tully, Iacono, & McGue, 2008).

Independentemente do sexo e da idade, a prevalência da depressão está

também associada a fatores sociais. A exposição aos chamados stressfull life events

aumentam o risco para desenvolver o distúrbio depressivo (Mazure, 1998). Está descrito

que indivíduos com menor nível de escolaridade (L. Andrade et al., 2003), que se

encontram desempregados ou recentemente divorciados (Weissman et al., 1996),

apresentam uma maior prevalência de depressão. Em indivíduos geriátricos, o

Introdução

16

desenvolvimento da mesma está associado à progressão de uma doença física crónica,

bem como à perda de um papel ativo na sociedade (Alexopoulos, 2005).

1.5.1. Etiologia

Os distúrbios psiquiátricos, nomeadamente a depressão, possuem uma etiologia

complexa e múltiplas causas influenciam o desenvolvimento da mesma. O facto de a

etiologia da depressão diferir de indivíduo para indivíduo, torna a sua compreensão

ainda mais difícil. No entanto, sabe-se que o distúrbio depressivo é o resultado da

expressão de um conjunto de fatores bioquímicos, genéticos, sociais e da exposição a

determinados acontecimentos de stress ocorridos ao longo da vida (Nestler, Pena,

Kundakovic, Mitchell, & Akbarian, 2016).

1.5.1.1. Fatores bioquímicos

O sistema nervoso é responsável pela maioria das funções de controlo do

organismo. As principais células que compõem este sistema são denominadas por

neurónios, responsáveis pela

transmissão e receção dos impulsos

nervosos. Os neurónios comunicam com

o neurónio seguinte por sinais elétricos

ou químicos num processo denominado

por sinapse. A estes sinais químicos,

sintetizados e libertados pelo neurónio

pós-sináptico, dá-se o nome de

neurotransmissores. Uma vez libertados

pelos neurónios pré-sinápticos, ligam-se

a recetores específicos no neurónio pós-

sináptico, ao fim de concluir o processo

da sinapse (figura 6). Embora existam vários tipos de neurotransmissores, os que irão

receber particular atenção serão as aminas biogénicas. Estas incluem as colinas, em

que a acetilcolina é o principal neurotransmissor, e as monoaminas, que incluem a

serotonina (5-HT), a histamina e as catecolaminas (Andrade et al., 2003).

Figura 6: Sinapse química. (Adaptada de:

http://comunicacaoentreneuronios.blogspot.pt/. Acedida a: 20/06/2016).

Introdução

17

1.5.1.1.1. Hipótese monoaminérgica

As monoaminas são neurotransmissores que possuem um grupo amina ligado a

um anel aromático. De acordo com o tipo de radical que as constituem, as monoaminas

são divididas em catecolaminas (radical catecol) de que são exemplo a dopamina,

norepinefrina e epinefrina, ou em indolaminas (radical indol) como a serotonina. As

monoaminas produzem o seu efeito induzindo alterações bioquímicas complexas nos

neurónios pós-sinápticos do sistema nervoso central (SNC), através da interação com

proteínas sinalizadoras (proteínas G) nas membranas celulares pós-sinápticas. Estas

proteínas G, ligadas a recetores, e após estimulação das monoaminas, produzem

alterações no modo como os neurónios pós-sinápticos respondem aos

neurotransmissores clássicos (glutamato e ácido aminobutírico) (Kalia, 2005).

Segundo a hipótese monoaminérgica, a depressão é causada pela deficiência

de serotonina, dopamina e norepinefrina na fenda sináptica (Haase & Brown, 2015).

Schildkraut formulou esta hipótese no fim dos anos 60 e, atualmente, o sistema

monoaminérgico é o principal sistema envolvido na neurobiologia da depressão

(Schildkraut, 1965). De facto, é nesta teoria que se baseia o mecanismo de ação da

maioria dos antidepressivos, dado que estes produzem efeitos farmacológicos que

aumentam os níveis de serotonina na fenda sináptica. Além disso, os níveis reduzidos

de serotonina e seus metabolitos no fluído cérebroespinal (CSF) em doentes deprimidos

e indivíduos suicidas vêm dar maior suporte a esta teoria (Murphy, 1978).

O sistema serotoninérgico possui um extensivo sistema de enervações na maior

parte das estruturas corticais e subcorticais e detém ainda 14 subtipos de recetores,

proporcionando-lhe uma diversidade de oportunidades de sinalização. Dadas estas

caraterísticas, o sistema serotoninérgico está implicado em inúmeros processos

fisiológicos que envolvem a função motora, sensorial, gastrointestinal, vascular e

endócrina, assim como em vários aspetos comportamentais associados ao humor,

agressividade, cognição e memória (Serretti, Calati, Mandelli, & De Ronchi, 2006).

A serotonina é sintetizada a partir do aminoácido triptofano pela enzima

triptofano hidroxilase (TPH1 e 2). É posteriormente armazenada em vesículas e

libertadas para a fenda sináptica, na presença de um estímulo no neurónio. A regulação

dos níveis de serotonina na fenda sináptica está dependente de: (1) recetores dos

neurónios pós-sinápticos que, ligando-se à serotonina, induzem a transmissão de sinais;

(2) recetores dos neurónios pré-sinápticos que, ligados à serotonina, induzem o

feedback que regula a plasticidade do neurónio pré-sináptico e (3) proteínas

transportadoras que recapturam a serotonina para o neurónio pré-sináptico, sendo esta

Introdução

18

reaproveitada ou degradada pela enzima monoamina oxidase (MAO) (figura 7). O

aumento da atividade dos elementos moleculares constituintes do sistema

serotoninérgico leva a uma diminuição dos níveis de serotonina na fenda sináptica,

implicando o défice na sua neurotransmissão e uma consequente perda da

funcionalidade deste neurotransmissor.

Atualmente, o efeito antidepressivo dos fármacos comummente utilizados passa

pela (1) inibição da monoamina oxidase A (MAO-A), (2) o bloqueio de recetores pós-

sinápticos e (3) a inibição de proteínas transportadoras (figura 8). Apesar do aumento

imediato dos níveis de serotonina na fenda sináptica, os efeitos clínicos são visíveis

após semanas e a remissão da doença ocorre em apenas um terço dos doentes

deprimidos (Haase & Brown, 2015). Ruhe et al. demonstrou ainda que uma deficiência

aguda de monoaminas não altera o humor em indivíduos saudáveis, apenas em

indivíduos que apresentam história familiar de depressão (Ruhe, Mason, & Schene,

2007). Estas observações sugerem que a patofisiologia da depressão não é explicada

exclusivamente pela teoria monoaminérgica. No entanto, esta hipótese auxilia a

compreensão da vulnerabilidade para desenvolver este distúrbio.

Figura 7: Sinalização serotoninérgica (aan het Rot, Mathew, & Charney, 2009).

Introdução

19

1.5.1.1.2. Hipótese das citocinas

Esta teoria, formulada por Smith em 1991, sugere que a depressão é causada

pela ação das citocinas, resultando da ativação crónica do sistema imune. Durante esta

ativação, um nível anormal de citocinas pro-inflamatórias são secretadas (Smith, 1991).

As citocinas são moléculas produzidas pelas células do sistema imune responsáveis

pela comunicação intercelular (Dunn, Swiergiel, & de Beaurepaire, 2005). Uma vez na

corrente sanguínea, as citocinas são capazes de alterar a função de todos os tecidos e

órgãos, inclusive o cérebro. Por isso, são capazes de induzir efeitos negativos no humor,

no pensamento e no comportamento (Smith, 1997).

A apoiar esta teoria vem o facto de a administração de citocinas pro-inflamatórias

induzir sintomas depressivos tanto em animais (Kent, Bluthe, Kelley, & Dantzer, 1992)

como em humanos (Capuron & Ravaud, 1999; Rosenstein, Lerner, & Cai, 1999). Vários

estudos têm demonstrado que doentes deprimidos apresentam níveis plasmáticos

elevados de citocinas pro-inflamatórias, tais como as interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-6),

interferão gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (Irwin & Miller, 2007; Y.

K. Kim et al., 2008; Levine et al., 1999; Raison, Capuron, & Miller, 2006). Estas citocinas

são capazes de produzir alterações nos neurotransmissores, nomeadamente ao nível

da serotonina. Níveis elevados de citocinas aumentam a atividade da indolamina-2,3-

dioxigenase (IDO). Esta enzima provoca o aumento da conversão do triptofano em

Figura 8: Local de ação dos antidepressivos. (Adaptada

de: http://slideplayer.com.br/slide/352993/. Acedida a: 20/06/2016).

Introdução

20

quinurenina, influenciando negativamente a síntese de serotonina e positivamente a

produção de catabolitos do triptofano (TRYCATs). Estes catabolitos, o ácido quinurénico

e o ácido quinolinico, são conhecidos por terem propriedades depressivas e

ansiogénicas (Rosenblat, McIntyre, Alves, Fountoulakis, & Carvalho, 2015; Young,

Bruno, & Pomara, 2014).

As citocinas pro-inflamatórias também estimulam a ativação do sistema

hipotálamo-pitituária-adrenal (HPA), o que leva à hipercortisolemia e ao aumento da

atividade da triptofano-2,3-dioxigenase (TDO). Os elevados níveis de cortisol bem como

a atividade da enzima TDO (que degrada o triptofano em TRYCATs) são capazes de

provocar sintomas depressivos (Cowen, 2010). A capacidade das citocinas modularem

a neurogénese no hipocampo também tem vindo a ser reportada (Raison et al., 2006;

Rosenblat et al., 2015). Com base nestas observações, podemos compreender a

importância do papel das citocinas na ativação de inúmeros mecanismos e que a

interação entre eles está envolvida na patofisiologia da depressão (figura 9).

1.5.1.1.3. Hipótese neurogénica

Alterações estruturais e celulares ao nível do hipocampo têm vindo a ser

associadas à depressão. Isto deve-se ao facto do hipocampo ser uma das poucas

regiões cerebrais que produzem novos neurónios durante a vida adulta. A este processo

dá-se o nome de neurogénese (Haase & Brown, 2015). O hipocampo está assim

Figura 9: Mecanismos envolvidos na exacerbação de citocinas pro-inflamatórias (Han & Yu, 2014).

Introdução

21

envolvido na aprendizagem e memória, na função cognitiva, na regulação do humor e

na resposta ao stress (Lau, 2013). Esta teoria propõe que défices na neurogénese no

hipocampo podem ter um papel importante na patofisiologia da depressão.

A hipótese neurogénica tem por base várias observações clínicas e fisiológicas.

Campbell et al. reportaram que doentes deprimidos apresentam uma diminuição entre

10 a 15% no volume do hipocampo, comparativamente a indivíduos saudáveis

(Campbell, Marriott, Nahmias, & MacQueen, 2004). Esta atrofia é influenciada por

fatores neurotróficos, em particular o fator neurotrófico derivado do cérebro, BDNF

(Brain-derivated Neurotrophic Factor). O BDNF tem funções importantes na modulação

da plasticidade, na inibição de cascatas de morte celular e no aumento dos níveis de

metabolitos proteicos responsáveis pela proliferação dos neurónios no SNC (Neto et al.,

2011). Um défice na funcionalidade deste fator neurotrófico é responsável pela redução

do volume do hipocampo, evidenciado em doentes deprimidos, provocando défices na

aprendizagem e memória do indivíduo (Sheline, Sanghavi, Mintun, & Gado, 1999). De

facto, em doentes deprimidos, foi observada uma diminuição nos níveis de BDNF no

hipocampo (Karege et al., 2002). Verificou-se ainda, em estudos animais, que o

tratamento com antidepressivos leva ao aumento do volume do hipocampo, bem como

ao aumento dos níveis de BDNF (Neto et al., 2011). Com base nesta última observação,

consegue-se relacionar o défice na neurogénese no hipocampo com a diminuição da

neurotransmissão monoaminérgica.

1.5.1.2. Stress

O stress é comummente definido como uma ameaça à homeostase.

Determinados acontecimentos de vida podem provocar alterações no bem-estar do

indivíduo que, consequentemente conduzem à depressão (Smith & Vale, 2006). Este

tipo de acontecimentos, tais como a perda de um ente querido, traumas sexuais ou de

guerra, o divórcio ou o desemprego, funcionam como um fator de risco para este

distúrbio. Considera-se um fator de risco uma vez que nem todos os indivíduos expostos

ao mesmo acontecimento de vida desenvolvem depressão.

A resposta ao stress está associada à ativação de um sistema neuroendócrino

específico denominado por hipotálamo-pitituária-adrenal (HPA) (de Kloet, Joels, &

Holsboer, 2005). O stress estimula o hipotálamo que leva à secreção da hormona

libertadora de corticotrofina (CRH). Esta hormona atua sobre a pitituária induzindo a

libertação da hormona adrenocorticotrofina (ACTH) para a corrente sanguínea. Esta,

por sua vez, atua sobre o córtex adrenal estimulando a libertação de glucocorticoides

Introdução

22

(em humanos, o cortisol). O cortisol interage com os seus recetores: recetores

mineralocorticóides (MR) e recetores glucocorticoides (GR). E, através da ativação

desta última classe de recetores, o cortisol atua sobre o hipotálamo e a pitituária,

suprimindo a produção de CRH e ACTH, exibindo assim um efeito de feedback negativo

(Smith & Vale, 2006). Young et al. reportaram que doentes deprimidos apresentam uma

disfunção do sistema HPA durante situações de stress que resultam em

hipercolesteremia (Young, Lopez, Murphy-Weinberg, Watson, & Akil, 2000). Este

aumento dos níveis de cortisol na corrente sanguínea pode levar a uma redução da

síntese de serotonina, à diminuição da neurogénese no hipocampo (Krishnan & Nestler,

2008; Lupien et al., 1998), à indução da morte neuronal (S. Yu, Holsboer, & Almeida,

2008) bem como à retração das dendrites apicais no hipocampo (McLaughlin, Gomez,

Baran, & Conrad, 2007).


A importância dos fatores genéticos é demonstrada a partir de estudos

realizados em gémeos monozigóticos, que apresentam uma tendência familiar para a

depressão em cerca de 40 a 50% dos casos (Kiyohara & Yoshimasu, 2009). Também

foi reportado que indivíduos com familiares em primeiro grau que sofrem de depressão

têm um risco aumentado em 2 a 3 vezes mais de vir a sofrer deste distúrbio (Hamet &

Tremblay, 2005). A identificação de genes associados à depressão tem-se revelado

extremamente difícil, uma vez que múltiplos genes estão envolvidos na patofisiologia da

mesma. Os genes que codificam para os neurotransmissores, nomeadamente os da

serotonina, são os que têm recebido maior atenção por parte dos investigadores. Entre

eles estão os polimorfismos dos genes recetores e transportador da serotonina. Para

além destes, os genes que codificam para as enzimas de degradação de serotonina: a

monoamina oxidase A (MAO-A) e a catecol O-metiltransferase (COMT), também têm

sido alvo de um especial destaque. Com a crescente relação entre a inflamação e os

distúrbios depressivos, os genes que codificam para citocinas pro-inflamatórias têm

vindo a ser relacionados com a depressão (Clerici et al., 2009). No presente trabalho,

irão ser descritos os genes recetores de serotonina 1A, 1B e 2A, bem como os genes

das citocinas, TNF-α e IL-1β.

Introdução

23

1.5.1.3.1. Genes recetores da serotonina

Disfunções nos recetores da serotonina têm um papel crucial para o

desenvolvimento da depressão. Por isso, o estudo de genes implicados na regulação

destes recetores têm sido extremamente explorado e vários são os polimorfismos

descritos como implicados no início e progressão deste distúrbio. Entre os 14 subtipos

de recetores de serotonina identificados até ao momento, os que mais têm vindo a ser

associados a distúrbios psiquiátricos são os recetores de serotonina 1A (5-HTR1A, 5-

hydroxytryptamine receptor 1A), 1B (5-HTR1B) e 2A (5-HTR2A) (Fakhoury, 2016).

1.5.1.3.1.1. Recetor da serotonina 1A, 5-HTR1A

O recetor da serotonina 1A (5-HTR1A) é codificado pelo gene HTR1A localizado

no cromossoma 5 (5q11.2-13). Este recetor, que atua como um auto-recetor e um

hetero-recetor, é um importante mediador da sinalização serotoninérgica no cérebro,

regulando a ansiedade, o humor, a memória e a cognição. É alvo de vários

antidepressivos, que atuam na dessensibilização deste recetor de modo a que leve ao

aumento dos níveis de transmissão de serotonina (Fakhoury, 2016).

O polimorfismo rs6295 (-1019 G>C) tem sido associado à depressão, a

tentativas de suicídio e à resposta aos antidepressivos (Kishi et al., 2013; Lemonde et

al., 2003; Strobel et al., 2003). Este polimorfismo é responsável pela transcrição do

HTR1A. A presença do alelo rs6295G suprime o NURD, fator transcripcional que atua

como um repressor na expressão deste recetor. Assim, o alelo rs6295G está associado

à sobreexpressão do recetor HTR1A nas membranas pré-sinápticas. Subsequente ao

aumento da expressão do HTR1A, está a diminuição da neurotransmissão

serotoninérgica (Lemonde et al., 2003). Lemonde et al. reportaram um aumento na

frequência do genótipo rs6295GG em doentes deprimidos bem como na frequência do

alelo rs6295G em indivíduos suicidas. Todos os outros estudos que associam este

polimorfismo com a depressão encontraram interações com o polimorfismo rs6265 no

gene BDNF (Anttila et al., 2007) e com os polimorfismos rs10794134 e ss680746624 no

gene LHPP (Phospholysine Phosphohistidine Inorganic Pyrophosphate Phosphatase)

(Neff et al., 2009), em populações finlandesas e norte-americanas, respetivamente.

Também foi reportada uma interação com o polimorfismo 5-HTTLPR e negative life

events numa coorte chinesa (K. Zhang et al., 2009). Mais recentemente, Mekli et al.

reportaram que indivíduos portadores dos alelos rs6295G e rs878567T do gene HTR1A,

quando expostos a situações recentes de stress, possuem um maior risco de

desenvolver depressão. Até à data não existem estudos que reportem o papel funcional

Introdução

24

do polimorfismo rs878567 mas sabe-se que este está localizado na região funcional 3’

-UTR e não produz qualquer alteração ao nível do aminoácido. (Mekli et al., 2011).

Também a resposta aos antidepressivos parece diminuída em indivíduos portadores do

alelo rs6295G (Hong, Chen, Yu, & Tsai, 2006; Lemonde et al., 2003; Parsey et al., 2006).

Por outro lado, estudos em populações finlandesas (Illi et al., 2009) e espanholas (Arias

et al., 2002) não encontraram associações significativas entre este polimorfismo e a

depressão.

1.5.1.3.1.2. Recetor da serotonina 1B, 5-HTR1B

O recetor 5-HT1B atua tanto na membrana pré como pós-sináptica. Foi

observado em modelos animais que este recetor tem uma importante função na

cognição e no humor, bem como nos comportamentos agressivos e no abuso de

substâncias (Rocha, Ator, Emmett-Oglesby, & Hen, 1997; Saudou et al., 1994). Este

recetor é codificado pelo gene HTR1B localizado no cromossoma 6 (6q13) (New et al.,

2001).

Até à data, poucos são os estudos realizados para este gene. Apenas o

polimorfismo rs6296 (-861 G>C) foi associado à depressão. Neste estudo, verificou-se

que indivíduos com a presença do alelo rs6296C apresentam maior predisposição para

o abuso de substâncias e para o desenvolvimento da depressão (Huang et al., 2003).

Mais recentemente, um grupo de investigadores reportou que esta variante em interação

com situações recentes de stress predispunha o desenvolvimento da depressão, numa

população britânica (Mekli et al., 2011). Anteriormente, um estudo numa coorte

finlandesa reportou que o alelo rs6296C está associado ao alcoolismo antissocial

(Lappalainen et al., 1998). Ao contrário do observado por Fehr et al., numa população

alemã, que por sua vez associou o alelo rs6296G ao alcoolismo (Fehr et al., 2000). Este

polimorfismo embora se localize numa região codificante do gene, não altera a

sequência de aminoácidos do HTR1B. Logo, ainda continua por desvendar o papel

funcional deste polimorfismo. A associação entre este SNP e os distúrbios psiquiátricos

poderá estar relacionada com um outro polimorfismo localizado próximo da sequência

codificante deste gene. Este, por sua vez, poderá alterar a expressão do recetor HTR1B

e, subsequentemente, levar à diminuição dos níveis de serotonina na fenda sináptica.

Assim, as associações observadas poderão ser causadas por um desequilíbrio de

ligação entre este polimorfismo e outro gene (Lappalainen et al., 1998).

Introdução

25

1.5.1.3.1.3. Recetor da serotonina 2A, 5-HTR2A

Foi descrito que doentes deprimidos apresentam níveis elevados do recetor 5-

HT 2A (Fakhoury, 2016). Este recetor é codificado pelo gene HTR2A, localizado no

cromossoma 13 (13q14q21) e é composto por 3 exões. Variações neste gene podem

desempenhar um papel importante na patofisiologia, progressão e na resposta ao

tratamento de distúrbios psiquiátricos. Apesar dos inúmeros SNPs descritos com

potencial associação a várias doenças neuropsiquiátricas, o foco tem incidido mais em

três polimorfismos, rs6311 (-1438 A>G), rs6313 (102 T>C) e rs6314 (His452Tyr ou 1354

C>T) (Serretti, Drago, & De Ronchi, 2007). Spurlock et al. demonstraram que os dois

primeiros polimorfismos (rs6313 e rs6311) estão em desequilíbrio de ligação, podendo

ser considerados em conjunto (Spurlock et al., 1998). O rs6313 é um SNP silencioso

(não altera a sequência de aminoácido do recetor), localizado no exão 1, perto da região

promotora. Devido à sua localização pode influenciar a estrutura secundária do

transcrito, afetando na estabilidade e atividade translacional. A metilação do nucleótido

C tem vindo a ser associada como um mecanismo de redução da expressão do gene

(Clifford & Nunez, 1996). O rs6311, localizado próximo da região promotora, e o rs6314,

localizado na região C-terminal do recetor da serotonina 2A, podem ter também

influência nos níveis de expressão deste recetor (Serretti et al., 2007).

Relativamente ao polimorfismo rs6313, Petit et al. demonstraram que o alelo

rs6313C está aumentado em doentes deprimidos franceses assim como o associaram

a um maior grau de gravidade de depressão (Petit et al., 2014). Outros estudos, em

populações espanholas e canadenses, também associaram o alelo rs6313C com

comportamentos suicidas em doentes deprimidos (Arias et al., 2001; Du, Bakish,

Lapierre, Ravindran, & Hrdina, 2000). Os fatores envolvidos no desenvolvimento da

depressão poderão diferir em indivíduos sem outras patologias adjacentes e em

indivíduos afetados por outras patologias clínicas graves. Estudos de 2011 e 2015,

realizados numa coorte portuguesa de doentes com lúpus eritemoso sistémico (LES),

reportaram associações entre o alelo rs6313T e o genótipo rs6313TT e uma maior

suscetibilidade para a depressão (Ferreira, 2015; Leal et al., 2011). Por outro lado,

existem estudos, em populações europeias e asiáticas, que não reportaram qualquer

associação entre este polimorfismo, a depressão (Illi et al., 2009; Kishi et al., 2009; Tsai

et al., 1999) e comportamentos suicidas em doentes deprimidos (Wang et al., 2009;

Zhang et al., 2008). Quanto ao polimorfismo rs6311, populações dinamarquesas,

suecas e japonesas apresentaram associações entre a presença do alelo rs6311A e a

depressão (Christiansen et al., 2007; Jansson et al., 2003; Kamata et al., 2011).

Enquanto numa população coreana, Choi et al. observaram uma maior frequência do

Introdução

26

alelo rs6311G em doentes deprimidos (Choi et al., 2004). Por outro lado, existem

estudos que não encontraram qualquer associação entre este polimorfismo e a

depressão (Illi et al., 2009; Kishi et al., 2009; Tencomnao, Thongrakard, Phuchana,

Sritharathikhun, & Suttirat, 2010).

Embora o rs6314 seja o SNP menos estudado, também este foi associado com

os distúrbios psiquiátricos. Ozaki et al. reportaram que o alelo rs6314T está relacionado

com a diminuição da sinalização intracelular mediada pelo 5-HTR2A (Ozaki et al., 1997).

Um estudo incidido numa população francesa sugeriu que o alelo rs6314T está

associado a um maior grau de severidade da depressão, evidenciando que os doentes

com sintomas depressivos mais severos apresentavam o raro genótipo rs6314TT (Petit

et al., 2014). Ao contrário desta evidência, um estudo desenvolvido numa coorte de

crianças autistas não evidenciou qualquer associação entre este polimorfismo e o grau

de gravidade dos sintomas depressivos (Gadow, Smith, & Pinsonneault, 2014).

Também o comportamento antissocial, característico da depressão, foi associado ao

alelo rs6314T numa coorte norte-americana (Rubin et al., 2013), assim como à

diminuição do volume do hipocampo, numa população italiana (Filippini et al., 2006). Em

outros estudos não foi evidenciado qualquer relação entre o rs6314, a depressão (Minov

et al., 2001) e comportamentos suicidas em doentes deprimidos (Du et al., 1999).

1.5.1.3.2. Genes citocinas

Estudos revelando a importância do papel das citocinas na ativação de inúmeros

sistemas relacionados com a patofisiologia da depressão têm emergido ao longo dos

últimos anos. Os genes que codificam citocinas são altamente polimórficos e vários

SNPs, associados ao aumento e redução da produção de citocinas, têm vindo a ser

descritos na literatura científica e associados a distúrbios depressivos (Clerici et al.,

2009).

1.5.1.3.2.1. Fator de Necrose Tumoral alfa, TNF-α

O TNF-α tem a capacidade de induzir alterações a nível estrutural e funcional no

cérebro, levando ao desenvolvimento de sintomas depressivos (Krishnadas &

Cavanagh, 2012). Esta citocina é codificada pelo gene TNF-α, localizado no

cromossoma 6p21.3, na região III do sistema HLA. O polimorfismo rs1800629 (-308

G>A) está localizado na região promotora do gene TNF-α, influenciando a sua

transcrição e, consequentemente, a produção de TNF-α. Os resultados descritos na

Introdução

27

literatura científica acerca deste polimorfismo têm sido um tanto inconsistentes. O alelo

rs1800629A tem sido reportado como associado a uma produção excessiva desta

citocina (Wilson, Symons, McDowell, McDevitt, & Duff, 1997). Embora noutros estudos

não tenha sido encontrada qualquer diferença nos níveis de transcrição entre o alelo

rs1800629A e o alelo rs1800629G, mesmo em situações de stress (Galinanes, James,

Codd, Baxi, & Hadjinikolaou, 2008).

Até à data, poucos investigadores relacionaram o polimorfismo rs1800629 com

a depressão e, mais uma vez, as evidências têm-se revelado contraditórias. Jun et al.

reportaram associação entre o alelo rs1800629A e a depressão numa população

coreana (Jun et al., 2003). Mais recentemente, demonstraram uma associação entre o

genótipo rs1800629GG e a depressão em indivíduos geriátricos italianos (Cerri et al.,

2010). E por último, existem estudos que não encontraram qualquer associação entre

este polimorfismo e a depressão, em populações italianas e húngaras (Clerici et al.,

2009; Misener et al., 2008).

1.5.1.3.2.2. Interleucina 1 beta, IL-1β

Elevados níveis de IL-1β no sangue e no fluido cérebroespinal têm sido

observados em doentes deprimidos (Levine et al., 1999; Owen, Eccleston, Ferrier, &

Young, 2001). Para além disso, Levine et al. ainda correlacionou os níveis elevados

desta citocina no fluído cérebroespinal com um maior grau de gravidade da depressão.

O gene que codifica a IL-1β está localizado no cromossoma 2 (2q13-2q21) (Webb et al.,

1986). Foi reportado que o polimorfismo rs16944 (-511 C>T), localizado na região

promotora deste gene, tem influência na secreção desta citocina. De facto, o alelo

rs16944T deste polimorfismo aumenta a transcrição e tradução do gene IL-1β e

indivíduos portadores deste alelo têm maior suscetibilidade para a produção da IL-1β

(Hall et al., 2004).

Poucos são os estudos realizados para relacionar o polimorfismo rs16944 (-511

C>T) e a depressão. A presença do alelo rs16944T foi associado a uma maior

suscetibilidade para a depressão em indivíduos esquizofrénicos espanhóis (Rosa et al.,

2004), em doentes britânicos afetados por Alzheimer (McCulley, Day, & Holmes, 2004)

e em doentes oncológicos coreanos (Kim et al., 2013). No entanto, Borkowska et al.,

numa coorte polaca, observaram que o alelo rs16944T possui um efeito protetor para a

recorrência da depressão (Borkowska et al., 2011). Dois outros estudos relataram ainda

que doentes portadores do genótipo rs16944TT possuíam melhor resposta ao

tratamento com antidepressivos, em populações alemãs e tailandesas (Baune et al.,

Introdução

28

2010; Yu, Chen, Hong, Chen, & Tsai, 2003). É de realçar que os três estudos que

relacionam o alelo rs16944T à suscetibilidade de desenvolver depressão são

conduzidos em indivíduos que sofrem de outras patologias clínicas severas.

1.5.1.4. Depressão e doenças crónicas

As doenças crónicas, tais como o cancro, diabetes tipo II, doenças autoimunes

ou distúrbios neurodegenerativos, foram associadas a sintomas depressivos ao longo

das últimas décadas. Os sintomas depressivos têm vindo a ser descritos como resultado

de efeitos patofisiológicos específicos da doença, nomeadamente daquelas que afetam

o sistema nervoso central, de que são exemplos a esclerose múltipla, a doença de

Parkinson ou a epilepsia. Outros casos levam a crer que a depressão resulta de uma

reação secundária da doença crónica, pelo facto de esta ser uma condição progressiva,

debilitante e de prognóstico imprevisível (Sperner-Unterweger, Kohl, & Fuchs, 2014).

Para além destes efeitos, é importante referir que a inflamação é a condição

base das doenças somáticas crónicas. A elevada prevalência da depressão em

indivíduos afetados por doenças inflamatórias representa uma forte evidência do efeito

das citocinas na depressão. A reforçar esta ideia, observações clínicas reportaram que

doentes submetidos a uma terapia mediada por citocinas pro-inflamatórias podem

desenvolver sintomas depressivos como efeito secundário (Jacobs et al., 2000; Raison

et al., 2006; Siegert & Abernethy, 2005).

A depressão entre os doentes crónicos não pode ser subestimada, dado as

elevadas taxas de prevalência, os possíveis efeitos adversos da depressão na

progressão da doença crónica (Dursun et al., 2007; Mohr, Goodkin, Islar, Hauser, &

Genain, 2001; Taner et al., 2007), no funcionamento cognitivo (Cavaco et al., 2009;

Messinis, Kosmidis, Lyros, & Papathanasopoulos, 2010), na resposta ao tratamento

(Koca et al., 2015; Mohr et al., 1997), nas consequências delatórias na qualidade de

vida (Uguz, Dursun, Kaya, & Cilli, 2007) e no aumento para o risco de suicídio (Saygin,

Uzunaslan, Hatemi, & Hamuryudan, 2015; Stenager et al., 1992). Assim, o

melhoramento dos métodos de diagnóstico de depressão, bem como o tratamento

adequado da mesma, nos doentes com patologia autoimune é de extrema importância

tanto para o controlo da qualidade de vida do indivíduo e da progressão da doença

autoimune bem como para a prevenção de comportamentos suicidas.

Objetivos

Objetivos

32

II. OBJETIVOS

Tanto a esclerose múltipla como a doença de Behçet são patologias que podem

trazer incapacidades físicas aos doentes afetados por estas assim como levar ao

desgaste psicológico e emocional dos mesmos. É um facto que tanto doentes com EM

como os com DB apresentam taxas de depressão mais elevadas (15,7% a 54% e 17,8%

a 45,5%, respetivamente) comparativamente à população em geral. A presença de um

quadro depressivo nestes doentes pode ser o reflexo do atingimento do SNC ou, por

outro lado, ser a expressão de um conjunto de caraterísticas incapacitantes inerentes à

própria doença. O diagnóstico da depressão nestes doentes é de extrema importância

uma vez que esta poderá afetar negativamente o prognóstico da doença autoimune.

Sendo a depressão uma patologia tratável, não pode ser subestimada e deve ser um

dos focos entre os clínicos tanto para melhorar a qualidade de vida destes doentes como

prevenir consequências fatais, como o suicídio.

Assim, é relevante a identificação dos mecanismos biológicos que possam explicar

as diferenças individuais dos doentes com patologia autoimune. O estudo dos fatores

de suscetibilidade genética para a depressão nestes doentes poderá ajudar tanto na

melhoria do curso como no tratamento da doença autoimune. A aplicação de estratégias

de prevenção para o desenvolvimento da depressão e a melhoria da qualidade de vida

dos doentes são os principais objetivos destes estudos.

O presente estudo tem os seguintes objetivos:

Analisar o papel da variabilidade genética de moléculas do sistema

serotoninérgico na depressão em doenças autoimunes, nomeadamente na

esclerose múltipla e na doença de Behçet. Para isso, polimorfismos nos

genes HTR1A (rs6295), HTR1B (rs6296) e HTR2A (rs6313 e rs6314) serão

analisados.

Analisar o papel da variabilidade genética de citocinas pro-inflamatórias na

depressão em doentes com patologia autoimune, estudando polimorfismos

dos genes citocina TNF-α (rs1800629) e IL-1β (rs16944)

Material e Métodos

Material e Métodos

36

III. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. População em estudo

No presente trabalho, para análise dos SNPs em estudo, foram investigados 205

doentes com patologia autoimune, dos quais 158 sofrem de esclerose múltipla e 47 de

doença de Behçet. Os doentes foram recrutados da consulta de Neuroimunologia e da

Unidade de Imunologia Clínica do Hospital de Santo António, Centro Hospitalar do

Porto. Desta coorte de doentes, foram recolhidos dados clínicos e algumas informações

demográficas, nomeadamente, sexo, idade ao diagnóstico e duração da doença e, ainda

valores de EDSS (Expanded Disability Status Scale - que permite quantificar o grau de

incapacidade de oito sistemas funcionais) e a forma para os doentes com EM bem como

o grau de severidade para os doentes com DB. Como população controlo, para

verificação das frequências genotípicas dos polimorfismos em estudo dos genes

citocina (TNF-α e IL-1β) e dos genes recetores de serotonina (HTR1A, HTR1B e

HTR2A), foram utilizados dois conjuntos de 218 e de 255 indivíduos saudáveis,

respetivamente, recrutados da Região Norte de Portugal.

Todos os doentes foram submetidos a um rastreio de depressão e ansiedade,

aplicando a Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). A HADS foi desenhada de

forma a possibilitar aos clínicos uma avaliação do estado emocional do doente (Zigmond

& Snaith, 1983). A HADS consiste num conjunto de 2 subescalas, cada uma com sete

questões, e para as quais existe 4 possibilidades de resposta, pontuadas de 0 a 3. As

pontuações finais de depressão e ansiedade são obtidas separadamente e podem variar

entre 0 e 21. Neste estudo, e tal como em estudos anteriores, foi considerado um “cut-

off” de 8 como indicador de um doente com sintomas depressivos.

Uma vez caraterizada, os doentes foram divididos em dois grupos: (1) doentes

autoimunes com depressão (HADS ≥ 8) e (2) doentes autoimunes sem depressão

(HADS < 8).

Material e Métodos

37

3.2. Métodos

3.2.1. Amostras biológicas

A todos os indivíduos foi colhido sangue periférico por punção venosa em tubos

com 5% de EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid – anti-coagulante) e pH 7,3.

3.2.1.1. Extração de DNA

O DNA (ácido desoxirribonucleico) foi extraído utilizando uma modificação do

método clássico de Salting-out (Miller, Dykes, & Polesky, 1988). Este método baseia-se

na baixa solubilidade das proteínas na presença de elevadas concentrações de sais,

permitindo a extração de uma grande quantidade de DNA.

A 1ª fase envolveu a centrifugação de cada tubo de amostra durante 10 minutos

a 490g (Hettich Universal 30F Zentrifugen). Como resultado, obteve-se uma fase celular

- eritrócitos e buffy coat, anel de leucócitos -, e uma fase líquida - plasma.

Posteriormente e recorrendo à pipeta de Pasteur, foi recolhido o plasma e o buffy coat,

com alguns eritrócitos à mistura, para um tubo de Falcon de 50mL. Adicionou-se RCLB

(Red Cells Lysis Buffer – tampão de lise de eritrócitos que possui 1M de Tris-HCl a

pH7,2, 5M de NaCl e 1 M de MgCl2) até perfazer o volume de 50mL. Homogeneizou-se

por inversão e incubou-se a solução à temperatura ambiente e em agitação lenta num

oscilador (Stuart Scientific – Platform Shaker STR6), durante 5 minutos. Seguidamente,

procedeu-se a uma centrifugação a 828g durante 10 minutos a 4ºC (Heraeus Megafuge

16R). O sobrenadante foi descartado e o processo repetido até se obter um pellet limpo

de eritrócitos. De seguida, adicionou-se ao pellet 3,5mL de TE2 (Tris-EDTA 2x – tampão

com 1M de Tris-HCl a pH7,2, 5M de NaCl e 0,5M de EDTA) que proporcionou as

condições ótimas para o processo de lise e 200µL de SDS 10% (Sodium Dodecyl

Sulfate) – detergente responsável pela degradação da membrana fosfolipídica. Após

agitação vigorosa no vórtex, procedeu-se à adição de 10µL de proteinase K (50mg/mL),

responsável pela degradação das proteínas. A solução foi incubada de um dia para o

outro a 42ºC, promovendo a ação digestora da enzima sobre as células lisadas.

Uma vez digerida, transferiu-se a solução para um tubo de Falcon de 15mL e

adicionou-se 1mL de NaCl 6M, este tampão salino precipita as proteínas, rebentando

as membranas dos leucócitos e libertando desta forma o DNA para o meio. Depois de

agitada a solução no vórtex até obter um aspeto leitoso, incubou-se em agitação máxima

no oscilador magnético (Stuart Scientific – Platform Shaker STR6), durante 10 minutos.

Material e Métodos

38

Seguidamente, centrifugou-se a solução a 1923g, durante 30 minutos, à temperatura

ambiente (23ºC) (Heraeus Megafuge 16R), permitindo separar o sobredanante que

continha o DNA, do precipitado de proteínas. Depois de transferir o sobrenadante para

um tubo de Falcon de 50mL e de descartar o conteúdo proteico, promoveu-se finalmente

a precipitação do DNA, adicionando-se 20mL de etanol absoluto frio (a -20ºC). O etanol

proporciona a desidratação e posterior precipitação do DNA, invertendo-se lentamente

o tubo até surgir um novelo concentrado de DNA. Depois de descartado o etanol

absoluto, o novelo de DNA foi lavado com 5mL de etanol a 70% frio para eliminação das

impurezas (resíduos de sais orgânicos e proteínas). Numa última fase, o novelo de DNA

foi ressuspendido em 500µL de Tris-EDTA (tampão com 10mM de Tris HCl a ph7,2 e

1mM de EDTA), num eppendorf de 1,5ml. As amostras foram colocadas num agitador

rotativo (Stuart Scientific – Blood Tube Rotator SB1) durante algumas horas de modo a

que o DNA entre em solução.

3.2.1.2. Quantificação do DNA

A quantificação do DNA permitiu tanto determinar a concentração de DNA como

avaliar o seu grau de pureza, através da leitura das absorvâncias a 230nm, 260nm e

280nm, com recurso a um espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific – Nanodrop

1000) e utilizando 1,5µL de DNA da solução stock.

A absorvância a 260nm corresponde ao pico da absorvância dos ácidos

nucleicos – DNA e RNA -, e a leitura a 260nm indica a concentração de DNA na solução

stock. O valor da medição das absorvâncias a 280nm e 230nm indica-nos uma

estimativa de contaminação por proteínas e por sais orgânicos, respetivamente. O grau

de pureza é dado pelas razões A260/A230 e A260/A280, cujos valores devem estar

compreendidos entre 1,5 e 2, para que a amostra não seja considerada contaminada.

As soluções de trabalho foram preparadas para uma concentração de 50ng/µl e

um volume total de 200µl.

Material e Métodos

39

3.2.2. Estudos genéticos

3.2.2.1. Estudos de associação

Com o objetivo de identificar genes candidatos, estes estudos são realizados

para associar a doença com as variações genéticas. Para isso, comparam-se dois

grupos distintos (doentes autoimunes vs população controlo, doentes autoimunes

deprimidos vs doentes autoimunes não deprimidos). Supõe-se que os alelos que

predispõem à doença sejam mais frequentes em doentes, quando comparados com a

população controlo. Da mesma forma que os genótipos que possam oferecer proteção

contra o desenvolvimento da doença sejam mais frequentes na população controlo.

3.2.2.2. Variações genéticas

A uma variação na sequência de DNA que ocorra na população com uma

frequência igual ou superior a 1% dá-se o nome de polimorfismo (Karki, Pandya, Elston,

& Ferlini, 2015). A variação mais frequente que ocorre no genoma humano são os

chamados SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms. Estas variações são caraterizadas

pela alteração de um único nucleótido e podem ocorrer em qualquer região do genoma

humano. Além dos SNPs, os STRs (Short Tandem Repeats), os VNTRs (Variable

Number of Tandem Repeats) e os polimorfismos de inserção ou deleção estão

presentes ao longo de todo o genoma. Os STRs são nucleótidos alinhados, em curtas

repetições (2 a 4 pb), organizados em sequência. Os VNTRs são arranjos lineares de

múltiplas cópias de sequências repetidas de DNA que variam no tamanho (10 a 15 pb)

e são altamente polimórficas. Os polimorfismos de inserção ou deleção são um tipo de

variação genética na qual um nucleótido específico está presente (inserção) ou ausente

(deleção).

3.2.3. Técnicas aplicadas

Para genotipagem dos SNPs foram utilizadas técnicas baseadas na reação em

cadeia da polimerase (PCR).

A PCR foi introduzida em meados dos anos 80 e consiste na amplificação, de

forma exponencial, de uma sequência específica de DNA a partir de um reduzido

número de moléculas de DNA (Mullis et al., 1986). Baseada no processo de replicação

que ocorre in vivo, o princípio da PCR envolve a amplificação enzimática de um

Material e Métodos

40

fragmento de DNA molde flanqueado por dois primers. Para que a reação possa ocorrer

convenientemente são necessários os seguintes componentes:

DNA molde, que possui a sequência a amplificar;

Primers, oligonucleótidos que flanqueiam a região de DNA a amplificar;

dNTPs (nucleótidos trifosfato), necessários para a síntese da nova

cadeia;

DNA polimerase, enzima que cataliza a reação de adição dos dNTPs;

MgCl2, co-fator da enzima;

Solução buffer NH4+, que permite a manutenção das condições ótimas de

reação.

Esta reação envolve três passos distintos: (1) desnaturação do DNA, (2)

annealing dos primers específicos e (3) extensão da cadeia de DNA. Em conjunto, estes

passos caraterizam-se como um ciclo e são repetidos por um determinado número de

vezes (figura 10).

A desnaturação ocorre a altas temperaturas (92ºC-95ºC) permitindo a separação

das duas cadeias de DNA de forma a que, na fase seguinte e a temperaturas

específicas, os primers se possam ligar, por complementaridade, às cadeias de DNA

simples. A temperatura de annealing baixa até valores entre 55ºC e 65ºC, dependendo

das propriedades de melting dos primers. Por último, a fase de extensão ocorre a 72ºC

e a enzima DNA polimerase sintetiza a nova cadeia de DNA. A DNA polimerase utilizada

foi a Taq polimerase, isolada a partir da bactéria Thermus aquaticus, cuja principal

caraterística é ser estável a temperaturas elevadas.

Figura 10: Passos da PCR. (Adaptada de: http://jdcdn.wabisabiinvestme.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2014/08/PCR.png. Acedida a: 20-04-2016).

Material e Métodos

41

3.2.3.1. PCR-RFLP

A técnica de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) tem por base a

deteção de fragmentos de diferentes tamanhos após a digestão de amostras de DNA

com endonucleases de restrição (Williams, 1989). Estas reconhecem sequências

específicas do DNA (4-6pb) promovendo o seu corte, o que resulta na obtenção de

fragmentos de diferentes tamanhos. Para obter o padrão de restrição específico, os

fragmentos de DNA são separados de acordo com o tamanho permitindo assim a

identificação das variantes alélicas. Na PCR-RFLP, o produto de PCR digerido é

separado através da eletroforese em gel (agarose ou poliacrilamida) (figura 11).

Este foi o método aplicado para o estudo dos polimorfismos rs1800629 (-308

G>A) no gene que codifica a citocina pro-inflamatória TNF-α e rs6313 (102 T>C) no

gene que codifica o recetor da serotonina 2A (5-HTR2A). A PCR amplificou as

sequências específicas e o padrão de restrição específico foi obtido através eletroforese

em gel de agarose a 4% e 3%, após digestão com a enzima NcoI e MspI,

respetivamente.

Figura 11: Procedimento da técnica PCR-RFLP. (Adaptada de: http://path.upmc.edu/cases/case490.html. Acedida a: 22/06/2016).

Material e Métodos

42

As sequências dos primers utilizadas estão descritas na tabela 4. A mastermix

foi preparada para um volume total de reação de 10µl contendo os reagentes descritos

na tabela 5, para amplificação do gene TNF -308. Uma vez preparada e homogeneizada

a solução, foram adicionados 9µl da solução em cada tubo de reação que já continha

1µl de DNA (50ng/µl). Enquanto para a amplificação do gene HTR2A, a mastermix foi

preparada para um volume total de reação de 20µl (tabela 6) e foram adicionados 19µl

da solução em cada tubo de reação contendo 1µl de DNA (50ng/µl). Em cada protocolo

foram utilizadas três amostras de controlo positivo com genótipo conhecido e um

controlo negativo (água bidestilada estéril Braun). Os tubos de reação foram colocados

no termociclador Applied Biosystem 2720 (tabelas 7 e 8).

Tabela 4: Sequências de primers utilizadas para a análise dos polimorfismos rs1800629 e do rs6313.

Tabela 5: Protocolo PCR – Reagentes e respetivas concentrações utilizados para amplificação do gene

TNF-α.

Gene Polimorfismo Sequência dos primers

TNF-α rs1800629 Forward 5’-AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT-3’

Reverse 5’-CAG CGG AAA ACT TCC TTG GT-3’

HTR2A rs6313 Forward 5’-CAC GTC CTC GGT CAC CTC TAT-3’

Reverse 5’-CAT GAG TTT CTT CTT TTC CAG CAG-3’

Reagentes Concentração stock Concentração na reação

Tampão NH4+ 10x 1,0 x

dNTP’s mix 25 mM 0,4 mM

Primer Forward 10 mM 0,50 mM

Primer Reverse 10 mM 0,25 mM

GoTaq G2 Flexi DNA

polymerase

5U/µL 1 U/10µL

MgCl2 50 mM 3,00 mM

ddH2O -

Material e Métodos

43

Tabela 6: Protocolo PCR – Reagentes e respetivas concentrações utilizados para amplificação do gene

HTR2A.

Tabela 7: Perfil térmico da PCR para amplificação do gene TNF-α.

Tabela 8: Perfil térmico da PCR para amplificação do gene HTR2A.


Tampão NH4+ 10x 1,0 x

dNTP’s mix 25 mM 0,2 mM

Primer Forward 10 mM 1,00 mM

Primer Reverse 10 mM 1,00 mM

GoTaq G2 Flexi DNA

polymerase

5U/µL 1 U/20µL

MgCl2 50 mM 2,00 mM

ddH2O -

Desnaturação inicial 95ºC – 2 minutos

Desnaturação 95ºC – 15 segundos

Hibridação 58ºC – 1 minuto 45x

Extensão 72ºC – 30 segundos

Extensão final 72ºC – 2 minutos

Desnaturação inicial 94ºC – 3 minutos


Hibridação 58ºC – 30 segundos 35x

Extensão 72ºC – 1 minuto

Extensão final 72ºC – 3 minutos

Material e Métodos

44

Após amplificação das sequências que contêm os polimorfismos, as amostras

de DNA amplificadas foram submetidas ao processo de digestão pela enzima Thermo

Scientific FastDigest NcoI para análise do rs1800629 e pela enzima Thermo Scientific

FastDigest MspI para análise do rs6313 (tabela 9). Para a digestão com a enzima NcoI,

a mix foi preparada para um volume total de 15,5µl (tabela 10). Depois de

homogeneizada, foi distribuído 10,5µl de solução por cada tubo de reação que já

continha 5µl de produto da PCR. Enquanto para a digestão com a enzima MspI, a mix

foi preparada para um volume total de 31µl (tabela 11) e foi adicionado 21µl de solução

a cada tubo de reação contendo 10µl de produto da PCR.

Tabela 9: Local de corte das enzimas de restrição NcoI e MspI, utilizadas na análise dos polimorfismos

rs1800629 e rs6313, respetivamente.

Tabela 10: Protocolo digestão enzimática com a enzima NcoI.

Tabela 11: Protocolo digestão enzimática com a enzima MspI.

Após a incubação overnight a 37ºC, os fragmentos de DNA foram separados

recorrendo à eletroforese em gel. A migração dos fragmentos de DNA ocorreu num gel

de agarose a 4% e 3% (rs1800629 e rs6313, respetivamente) corado com brometo de

etídeo. Após a separação, os fragmentos de DNA foram visualizados sob luz ultravioleta

(figuras 12).

Enzima de restrição NcoI

5’…C↓CATGG…3’

3’…GGTAC↓C…5’

Enzima de restrição MspI

5’…C↓CGG…3’

3’…GGC↓C…5’

Reagente Concentração stock Concentração na reação

NcoI 500U/µL 500U/15,5µL

10x tango Buffer 10x 0,65x

ddH2O -

Reagente Concentração stock Concentração na reação

NcoI 10U/µL 10U/31µL

10x tango Buffer 10x 0,65x

ddH2O -

Material e Métodos

45

3.2.3.2. PCR em tempo real

A PCR em tempo real foi descrita pela primeira vez em 1993 por Higuchi e seus

colaboradores e é uma variante da técnica da PCR convencional (Higuchi, Fockler,

Dollinger, & Watson, 1993). Esta técnica permite monitorizar a amplificação de um

pequeno fragmento de DNA, que possua o sítio específico do polimorfismo, e a sua

deteção em tempo real, utilizando uma tecnologia de fluorescência. É possível detetar

a fluorescência após a amplificação utilizando um corante intercalante (brometo de

etídeo) ou durante a amplificação utilizando sondas fluorescentes de sequências

específicas, das quais são exemplo as sondas Taqman.

Tecnologia Taqman

A atividade exonucleotídica da enzima Taq polimerase é fundamental nesta

tecnologia de forma a aumentar a sensibilidade e especificidade de deteção da PCR

(Holland, Abramson, Watson, & Gelfand, 1991). A sonda Taqman é uma sequência

oligonucleotídica que se liga a uma sequência específica de DNA, que possua o

polimorfismo, permitindo a deteção e quantificação da fluorescência. Para a

genotipagem, utiliza-se duas sondas Taqman que diferem na sequência de DNA apenas

no local do SNP. Uma das sondas é complementar ao alelo wild-type e a outra é

complementar ao alelo mutante. Ambas apresentam diferentes cores de fluorescência

de modo a permitir a sua distinção. Estas sondas apresentam na extremidade 3’ uma

264 pb 244 pb

GG AA GA

CC TC TT

105 pb

68 pb

37 pb

Figura 12: (A) Genótipos do polimorfismo rs1800629 obtidos por PCR-RFLP com utilização da enzima NcoI. (B) Genótipos do polimorfismo rs6313 obtidos por PCR-RFLP com utilização da enzima MspI.

(A) (B)

Material e Métodos

46

molécula que aceita a energia da molécula reporter e a dissipa na forma de calor,

designada por quencher e na extremidade 5’ um fluorocromo reporter. A proximidade

física entre a molécula reporter e do quencher no princípio da análise suprime a deteção

da fluorescência do primeiro.

Na fase de annealing da PCR, as sondas Taqman ligam-se ao local específico

do SNP. Durante a fase de extensão das cadeias de DNA, as sondas são detetadas

pela enzima Taq polimerase que as hidrolisam através da sua atividade exonucleotídica.

Este processo conduz à separação do quencher do reporter, resultando num aumento

exponencial da intensidade de fluorescência até um ponto onde pode ser detetada.

Quando a sonda permanece intacta, a fluorescência é suprimida devido à molécula

quencher estar próxima da molécula de fluorescência reporter. A deteção só é possível

se a sonda estiver completamente hibridizada, uma vez que a Taq polimerase não

reconhece a sonda que possua uma base não complementar. O aumento da

fluorescência é detetado através de um equipamento de PCR que possua um

fluorímetro, permitindo a medição do sinal de fluorescência das duas moléculas reporter

(figura 13).

Esta técnica foi aplicada para o estudo dos seguintes SNPs: o rs16944 (-511

C>T) no gene que codifica para a interleucina 1β, o rs6295 (-1019 G>C) no gene que

codifica para o recetor de serotonina 1A (5-HTR1A), o rs6296 (-861 G>C) no gene que

Figura 13: Mecanismo da PCR em tempo real com a tecnologia

Taqman para a genotipagem. (Adaptada de: http://labforum.foroactivo.com/t13-experimentos-de-genotipado-con-sondas-taqman. Acedida a: 15/07/2016).

Material e Métodos

47

codifica para o recetor de serotonina 1B (5-HTR1B) e também para o rs6314 (1345 C>T)

no gene que codifica para o recetor de serotonina 2A (5-HTR2A).

Para a genotipagem dos polimorfismos rs16944 e do rs6314, foi preparada uma

solução que perfazia um volume total de 8µl que continha 12,5ng de DNA, água

bidestilada estéril Braun, 1x Taqman® Gene SNP Assay kit (C_1839943_10 para o

rs16944 e C_11696920_20 para o rs6314, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

e 1x Taqman® Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

A Taqman® Gene SNP Assay inclui as sondas e os primers e a Taqman® Universal

PCR MasterMix contém a DNA polimerase, dNTPs, Mg2+ e solução tampão (tabela 12).

Em cada protocolo foram utilizadas três amostras de controlo positivo com genótipo

conhecido e um controlo negativo (água bidestilada estéril Braun). As amostras foram

introduzidas no termociclador Rotor-GeneTM 6000 (Rcorbertt) (tabelas 13 e 14).

Tabela 12: Reagentes e respetivas concentrações utilizadas na PCR para análise dos polimorfismos

rs16944 e rs6314.

Tabela 13: Perfil térmico utilizado para a análise do polimorfismo rs16944.



Taqman® Universal PCR MasterMix 2x 1x

Taqman® Gene SNP Assay 40x 1x

ddH2O (Braun) -

Holding time 95ºC – 10 minutos








Material e Métodos

48

Para genotipagem dos polimorfismos rs6295 e rs6296, foi preparada uma

solução que perfazia um volume total de 10µl que continha 12,5ng de DNA, 0,9µM de

primers forward e reverse, 0,25µM de sondas Taqman® e 1x Taqman® Universal PCR

MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) (tabela 15). Para cada SNP

foram utilizados os primers e as sondas Taqman® específicas, de modo a permitir a

deteção do local específico da variação presente em cada um dos genes (tabela 16).

Também foram utilizadas três amostras de controlo positivo com genótipo conhecido e

um controlo negativo (água bidestilada estéril Braun). As amostras foram introduzidas

no termociclador Rotor-GeneTM 6000 (Rcorbertt) (tabelas 17 e 18).

Tabela 15: Reagentes e respetivas concentrações utilizadas na PCR para análise dos polimorfismos rs6295

e rs6296.

Tabela 16: Sequências de primers e sondas utilizadas para análise dos polimorfismos rs6295 e rs6296.



Taqman® Universal PCR MasterMix 2x 1x

Primers 50µM 0,9µM

Sondas Taqman® 10µM 0,25µM

ddH2O (Braun) -

Gene Polimorfismo Sequência dos primers e sondas

HTR1A rs6295

Primer F – 5’-AGGCTGGAGCAATGGC-3’

Primer A – 5’-CCAATTATTGCTAATTGATGGGAGAAG-3’

Sonda wt – FAM – AAAAAGGAAGACACTCGGTCTT-BBQ

Sonda mt – YAK – AAAAACGAAGACACACTCGGTCT-BBQ

HTR1B rs6296

Primer F – 5’CACGTCCTCGGTCACCTCTAT-3’

Primer A – 5’-GTCGGAGACTCGCACTTG-3’

Sonda wt – FAM – CTTGGTTCACATACACAGGAGATC-BBQ

Sonda mt – YAK – CTTGGTTGACATACACAGGAGATC-BBQ





Material e Métodos

49


3.2.4. Análise estatística

A análise das variáveis categóricas foi feita recorrendo ao teste de Qui-quadrado

ou ao Teste Exato de Fisher (quando o n<5, sendo n o número de indivíduos). Para o

estudo das frequências genotípicas calculou-se o valor de p e o valor de Odds Ratio

(OR), indicativo do risco relativo para determinado acontecimento, através de

Regressão Logística Binária. Considerou-se como estatisticamente significativo, valores

de p inferiores a 0,05. A análise estatística foi realizada com o auxílio do software

estatístico Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), versão 21.0.





RESULTADOS

Resultados

52

IV. RESULTADOS

4.1. Caraterísticas dos doentes autoimunes

Foram estudados 205 doentes com patologia autoimune sendo que 158 foram

diagnosticados com esclerose múltipla e 47 com doença de Behçet. As caraterísticas

demográficas e clínicas dos doentes estão descritas na tabela 19.

Tabela 19: Caraterísticas demográficas e clínicas das populações estudadas.

EDSS – Expanded Disability Status Scale | ER – Exacerbação Remissão | PP – Progressiva Primária | PS – Progressiva Secundária | HADS – Hospital Anxiety and Depression Scale

Esclerose Múltipla

n=158

Doença de Behçet

n=47

Sexo

Feminino, n (%) Masculino, n (%)

103 (65,2) 55 (34,8)

34 (72,3) 13 (27,7)

Idade ao diagnóstico (anos)

mediana (min – max)

29 (10 – 59) 35,5 (13 – 59)

Duração (anos)


5 (1 – 39) 16 (5 – 34)

EDSS


2 (0 – 8,5) -

Forma

ER, n (%) PP, n (%) PS, n (%)

132 (83,5) 17 (10,8) 9 (5,7)

-

Severidade

Moderada, n (%) Severa, n (%)

-

18 (60,9) 28 (39,1)

HADS


4,5 (0 – 21) 4 (0 – 15)

HADS ≥ 8, n (%)

41 (25,9) 14 (29,8)

Resultados

53

Ambas as populações de doentes com esclerose múltipla como de doença de

Behçet são constituídas predominantemente por mulheres (65.2% e 72,3%,

respetivamente) e apresentam idades médias ao diagnóstico de 29 e 35,5 anos,

respetivamente. Quanto às caraterísticas clínicas e começando pela análise dos

doentes com esclerose múltipla, a mediana da duração da doença é de 5 anos e a

mediana de EDSS apresenta o valor de 2,0. Entre os 158 doentes, 83,5% apresentam

a forma exacerbação remissão (surto/remissão), 10,8% a forma progressiva primária e

5,7% a forma progressiva secundária. Verificou-se que o valor médio de HADS é de 4,5

e nesta coorte (n=158), 25,9% dos doentes apresentam um quadro depressivo.

Relativamente aos doentes com doença de Behçet, observou-se que a mediana de

duração da doença é de 16,8 anos e que 60,9% dos doentes apresentam um grau de

gravidade moderado enquanto nos restantes 39,1% a doença manifesta-se de forma

grave. Verificou-se que o valor médio da HADS é de 4 e nesta coorte (n=47), 29,8% dos

doentes sofrem de depressão.

4.2. Análise genética

Para melhor descrever os resultados obtidos, optou-se por dividir a análise em

duas partes: correlacionar os SNPs com a doença autoimune e com a depressão

(HADS≥8) em doentes com patologia autoimune. Em cada uma destas análises foi

considerado um grupo com autoimunidade e ainda uma análise para cada uma das

doenças.

4.2.1. Suscetibilidade para a doença autoimune

As frequências genotípicas dos polimorfismos dos genes em estudo foram

comparadas entre as populações de doentes e a população controlo.

Relativamente aos polimorfismos rs6295, rs6296, rs6313 e rs6314 dos genes

recetores serotoninérgicos não se observaram diferenças estatisticamente significativas

entre a população de doentes e a população controlo (tabela 20).

Resultados

54

Tabela 20: Frequências genotípicas dos polimorfismos nos genes recetores da serotonina (HTR1A, HTR1B

e HTR2A), na população controlo e na população de doentes.

PC – População Controlo | OR – Odds Ratio

De modo a estudar a existência de uma associação específica de uma patologia,

dividiu-se o grupo de doentes de acordo com a patologia. Verificou-se que os doentes

com EM apresentam frequências genotípicas semelhantes à população controlo (tabela

21).


e HTR2A) na população controlo e na população de doentes com esclerose múltipla.


Polimorfismo Genótipos PC (n=265)

% (n)

Total Doentes (n=205)

% (n) OR (IC 95%) p

rs6295

HTR1A

GG GC CC

23,4 (62) 51,7 (137) 24,9 (66)

27,4 (55) 46,8 (94) 25,9 (52)

1 0,773 (0,494-1,211) 0,888 (0,531-1,485)

0,518

0,261 0,651

rs6296

HTR1B

GG GC CC

55,1 (146) 37,4 (99) 7,5 (20)

62,9 (129) 30,7 (63) 6,3 (13)

1 0,720 (0,485-1,069) 0,736 (0,352-1,538)

0,233

0,103 0,414

rs6313

HTR2A

CC CT TT

29,4 (78) 43,8 (116) 26,8 (71)

25,4 (51) 48,3 (97) 26,4 (53)

1 0,876 (0,531-1,446) 1,120 (0,717-1,751)

0,552

0,604 0,618

rs6314

HTR2A

CC CT TT

85,3 (226) 13,6 (36) 1,1 (3)

81,8 (166) 16,7 (34) 1,5 (3)

1 1,286 (0,772-2,141) 1,361 (0,271-6,830)

0,594

0,334 0,708

Polimorfismo

Genótipos

PC (n=265)

% (n)

Doentes EM (n=158)

% (n) OR (IC 95%) p

rs6295

HTR1A

GG GC CC

23,4 (62) 51,7 (137) 24,9 (66)

23,4 (36) 48,7 (75) 27,9 (43)

1 0,943 (0,573-1,551) 1,122 (0,639-1,969)

0,774

0,817 0,688

rs6296

HTR1B

GG GC CC

55,1 (146) 37,4 (99) 7,5 (20)

63,3 (100) 30,4 (48) 6,3 (10)

1 0,708 (0,461-1,086) 0,730 (0,328-1,626)

0,255

0,144 0,441

rs6313

HTR2A

CC CT TT

29,4 (78) 43,8 (116) 26,8 (71)

26,3 (41) 48,7 (76) 25,0 (39)

1 1,246 (0,774-2,006) 1,045 (0,607-1,800)

0,609

0,364 0,874

rs6314

HTR2A

CC CT TT

85,3 (226) 13,6 (36) 1,1 (3)

81,4 (127) 17,3 (27) 1,3 (2)

1 1,335 (0,774-2,300) 1,186 (0,196-7,194)

0,577

0,299 0,853

Resultados

55

Verificou-se que a frequência do génotipo rs6295GC (HTR1A) é inferior nos

doentes com Behçet comparativamente à população controlo [40,4% vs 51,7%,

p=0,027, OR (IC=95%) = 0,453 (0,224-0,914)] (tabela 22). Não foram encontradas

diferenças para os restantes polimorfismos estudados (tabela 22).


e HTR2A) na população controlo e na população de doentes com a doença de Behçet.


Considerando os polimorfismos rs1800629 e rs16944 dos genes citocinas pro-

inflamatórias TNF-α e IL-1β, verificou-se que não existem diferenças estatisticamente

significativas entre a população de doentes e a população controlo (tabela 23).

Tabela 23: Frequências genotípicas dos polimorfismos nos genes citocina (TNF-α e IL-1β), na população

controlo e na população de doentes.



% (n)

DB (n=47)

% (n) OR (IC 95%) p

rs6295

HTR1A

GG GC

CC

23,4 (62) 51,7 (137)

24,9 (66)

40,4 (19) 40,4 (19)

19,1 (9)

1 0,453 (0,224-0,914)

0,445 (0,187-1,057)

0,054

0,027

0,067

rs6296

HTR1B

GG GC CC

55,1 (146) 37,4 (99) 7,5 (20)

61,7 (29) 31,9 (15)

6,4 (3)

1 0,763 (0,389-1,496) 0,755 (0,211-2,709)

0,703

0,431 0,667

rs6313

HTR2A

CC CT TT

29,4 (78) 43,8 (116) 26,8 (71)

22,2 (10) 46,7 (21) 31,1 (14)

1 1,412 (0,631-3,161) 1,538 (0,643-3,682)

0,597

0,401 0,334

rs6314

HTR2A

CC CT TT

85,3 (226) 13,6 (36) 1,1 (3)

83 (39) 14,9 (7) 2,1 (1)

1 1,127 (0,468-2,711)

1,932 (0,196-19,047)

0,830

0,790 0,573


% (n)

Total Doentes (n=205)

% (n) OR (IC 95%) p

rs1800629

TNF -308

GG GA AA

71,0 (154) 25,8 (56) 3,2 (7)

78,9 (161) 20,6 (42) 0,5 (1)

1 0,717 (0,454-1,133) 0,137 (0,017-1,124)

0,074

0,154 0,064

rs16944

IL-1β

CC CT TT

43,8 (95) 48,4 (105)

7,8 (17)

49,3 (100) 42,4 (86) 8,4 (17)

1 0,778 (0,522-1,161) 0,950 (0,458-1,968)

0,504

0,247 0,884

Resultados

56

Dividindo o grupo geral de doentes autoimunes de acordo com a patologia,

verificou-se que os doentes com EM apresentam frequências genotípicas semelhantes

à população controlo (tabela 24). O mesmo se observou nos doentes com Behçet

(tabela 25).

Tabela 24: Frequências genotípicas dos polimorfismos nos genes citocina (TNF-α e IL-1β) na população

controlo e na população de doentes com esclerose múltipla.



controlo e na população de doentes com doença de Behçet.

-* Não calculável | PC – População Controlo | OR – Odds Ratio

4.2.2. Suscetibilidade para a depressão

Com o objetivo de verificar se algum dos polimorfismos descritos estariam

associados ao desenvolvimento da depressão na população de doentes, foram

analisadas as frequências genotípicas dos polimorfismos dos genes em estudo em

doentes com depressão e sem depressão.

Considerando os polimorfismos rs6295, rs6296, rs6313 e rs6314 nos genes dos

recetores de serotonina, verificou-se que não existem diferenças estatisticamente

significativas entre os doentes deprimidos e não deprimidos (tabela 26).


% (n)

EM (n=158)

% (n) OR (IC 95%) p

rs1800629

TNF -308

GG GA AA

71,0 (154) 25,8 (56) 3,2 (7)

78,5 (124) 20,9 (33)

0,6 (1)

1 0,754 (0,463-1,228) 0,177 (0,022-1,461)

0,158

0,256 0,108

rs16944

IL-1β

CC CT TT

43,8 (95) 48,4 (105)

7,8 (17)

49,4 (77) 42,3 (66) 8,3 (13)

1 0,776 (0,504-1,192) 0,943 (0,432-2,063)

0,504

0,247 0,884


% (n)

DB (n=47)

% (n) OR (IC 95%) p

rs1800629

TNF -308

GG GA AA

71,0 (154) 25,8 (56) 3,2 (7)

80,4 (37) 19,6 (9)

- -* -*

rs16944 IL-1β

CC CT TT

43,8 (95) 48,4 (23) 7,8 (7)

48,9 (23) 42,6 (20)

8,5 (4)

1 0,787 (0,406-1,523) 0,972 (0,298-3,165)

0,768

0,477 0,962

Resultados

57


e HTR2A) na população de doentes com e sem depressão.

HADS – Hospital Anxiety and Depression Scale | OR – Odds Ratio

Considerando separadamente o grupo de doentes com EM e com DB, verificou-se

que os doentes com EM deprimidos apresentam frequências genotípicas semelhantes

àqueles que não apresentam quadro depressivo (tabela 27).


e HTR2A) na população de doentes com esclerose múltipla deprimidos e não deprimidos.

-* Não calculável | HADS – Hospital Anxiety and Depression Scale | OR – Odds Ratio

Polimorfismo Genótipos HADS ≥ 8 (n=55)

% (n)

HADS < 8 (n=150)

% (n) OR (IC 95%) p

rs6295

HTR1A

GG GC CC

29,6 (16) 35,2 (19) 35,2 (19)

26,5 (39) 51,0 (75) 22,4 (33)

1 0,618 (0,286-1,333) 1,403 (0,624-3,157)

0,098

0,219 0,413

rs6296

HTR1B

GG GC CC

65,5 (36) 30,9 (17)

3,6 (2)

62,0 (93) 30,7 (46) 7,3 (11)

1 0,955 (0,485-1,878) 0,470 (0,099-2,224)

0,635

0,893 0,341

rs6313

HTR2A

CC CT TT

16,7 (9) 51,9 (28) 31,5 (17)

28,6 (42) 46,9 (69) 24,5 (36)

1 1,894 (0,815-4,401) 2,204 (0,876-5,543)

0,217

0,138 0,093

rs6314

HTR2A

CC CT TT

85,5 (47) 12,7 (7) 1,8 (1)

80,4 (119) 18,2 (27) 1,4 (2)

1 0,656 (2,268-1,610)

1,266 (0,112-14,295)

0,637

0,358 0,849


% (n)

HADS < 8 (n=117)

% (n) OR (IC 95%) p

rs6295

HTR1A

GG GC CC

25,0 (10) 32,5 (13) 42,5 (17)

22,8 (26) 54,4 (62) 22,8 (26)

1 0,545 (0,212-1,400) 1,700 (0,656-4,403)

0,033

0,207 0,274

rs6296

HTR1B

GG GC CC

63,4 (26) 31,7 (13)

4,9 (2)

63,2 (74) 29,9 (35) 6,8 (8)

1 1,057 (0,486-2,301) 0,712 (0,142-3,569)

0,898

0,889 0,679

rs6313

HTR2A

CC CT TT

17,1 (7) 53,7 (22) 29,3 (12)

29,6 (34) 47,0 (54)

23,5% (27)

1 1,979 (0,763-5,180) 2,159 (0,748-6,233)

0,299

0,160 0,155

rs6314

HTR2A

CC CT TT

85,4 (35) 14,6 (6)

-

80,0 (92) 18,3 (21) 1,7 (2)

-* -*

Resultados

58

Nos doentes com Behçet, as frequências genotípicas apresentam-se

semelhantes entre os doentes deprimidos e não deprimidos (tabela 28).


e HTR2A) na população de doentes com doença de Behçet deprimidos e não deprimidos.


Relativamente aos polimorfismos rs1800629 e rs16944 nos genes citocinas pro-

inflamatórias, verificou-se que a frequência do genótipo rs16944TT (IL-1β) é mais

elevada nos doentes deprimidos comparando com os doentes sem quadro depressivo

[16,4% vs 5,4%, p=0,019, OR (IC=95%) = 3,3562 (1,238-10,254)]. Não existem

associações estatisticamente significativas para o polimorfismo rs1800629 (tabela 29).


de doentes com e sem depressão.



% (n)

HADS < 8 (n=33)

% (n) OR (IC 95%) p

rs6295

HTR1A

GG GC CC

42,9 (6) 42,9 (6) 14,3 (2)

39,4 (13) 39,4 (13) 21,2 (7)

1 1 (0,255-3,928)

0,619 (0,098-3,919)

0,860

1,000 0,619

rs6296

HTR1B

GG GC CC

71,4 (10) 28,6 (4)

-

57,6 (19) 33,3 (11) 9,1 (3)

-* -*

rs6313

HTR2A

CC CT TT

15,4 (2) 46,2 (6) 38,5 (5)

25,0 (8) 46,9 (15) 28,1 (9)

1 1,60 (0,260-9,834)

2,22 (0,334-14,803)

0,708

0,612 0,409

rs6314

HTR2A

CC CT TT

85,7 (12) 7,1 (1) 7,1 (1)

81,8 (27) 18,2 (6)

- -* -*


% (n)

HADS < 8 (n=150)

% (n) OR (CI=95%) p

rs1800629

TNF -308

GG GA AA

80,0 (44) 20,0 (11)

-

78,5 (117) 20,8 (31) 0,7 (1)

-* -*

rs16944

IL-1β

CC CT TT

43,6 (24) 40,0 (22) 16,4 (9)

51,4 (76) 43,2 (64) 5,4 (8)

1 1,089 (0,559-2,121)

3,562 (1,238-10,254)

0,056

0,803 0,019

Resultados

59

Para verificar se esta associação é específica de uma patologia, dividiu-se mais

uma vez o grupo total de doentes de acordo com a patologia.

Verificou-se que a frequência do genótipo rs16944TT está aumentada tanto nos

doentes com EM como nos doentes com Behçet deprimidos, comparativamente àqueles

sem quadro depressivo (tabelas 30 e 31, respetivamente). No entanto, apenas os

doentes com EM deprimidos apresentam diferenças estatisticamente significativas em

comparação aos doentes com EM não deprimidos [17,1% vs 5,2%, OR (IC=95%) =

3,561 (1,065-11,910) (tabela 30).


de doentes com esclerose múltipla deprimidos e não deprimidos.



de doentes com doença de Behçet deprimidos e não deprimidos.



% (n)

HADS < 8 (n=117)

% (n) OR (IC 95%) p

rs1800629

TNF -308

GG GA AA

85,4 (35) 14,6 (6)

-

76,1 (89) 23,9 (28)

- 0,545 (0,208 – 1,430) 0,213

rs16944

IL-1β

CC CT TT

46,3 (19) 37,6 (15) 17,1 (7)

50,4 (58) 44,3 (51) 5,2 (6)

1 0,898 (0,414-1,948)

3,561 (1,065-11,910)

0,079

0,785 0,039


% (n)

HADS < 8 (n=33)

% (n) OR (IC 95%) p

rs1800629

TNF -308

GG GA AA

85,7 (12) 14,3 (2)

-

78,1 (25)

21,9 (7) -

0,595 (0,107 – 3,310) 0,701

rs16944

IL-1β

CC CT TT

35,7 (5) 50,0 (7) 14,3 (2)

54,8 (18) 39,4 (13)

6,1 (2)

1 1,938 (0,502-7,487)

3,600 (0,400-32,366)

0,430

0,337 0,253

DISCUSSÃO

Discussão

62

V. DISCUSSÃO

A depressão é um dos distúrbios psiquiátricos mais comuns nos países

desenvolvidos constituindo por isso um grave problema de saúde pública. Este distúrbio

está associado a um aumento do risco para o suicídio e a uma redução na capacidade

física, cognitiva e social levando a uma diminuição da qualidade de vida e,

consequentemente, a um aumento da morbidade e da mortalidade. Assim, o diagnóstico

da depressão bem como um tratamento adequado é de extrema importância.

Vários são os estudos que têm reportado a presença de sintomatologia

psicopatológica, nomeadamente a depressão e a ansiedade, tanto em doentes com

esclerose múltipla (da Silva et al., 2011; Patten et al., 2003; Skokou et al., 2012) como

com doença de Behçet (Dursun et al., 2007; Taner et al., 2007). Está bem documentado

que nestes doentes a prevalência de depressão é significativamente mais elevada em

comparação à população em geral, atingindo valores de 54% para os doentes com EM

e de 47,5% para os doentes com Behçet vs 15% para a população em geral (Skokou et

al., 2012; Taner et al., 2007). Manifestações clínicas tais como a fadiga e défices

cognitivos nos doentes com esclerose múltipla, e em casos mais graves de doença de

Behçet, constituem fatores que podem dificultar a sintomatologia depressiva e, portanto,

o diagnóstico de depressão.

Embora a etiologia da depressão ainda não esteja definida, a expressão de um

conjunto de fatores genéticos, bioquímicos, psicológicos e psicossociais pode estar

subjacente ao aparecimento deste distúrbio (Nestler et al., 2016). Relativamente à

depressão em doentes com patologia autoimune, surgem questões ainda mais

complexas. Será esta uma consequência do envolvimento da doença autoimune no

SNC? Ou estará a depressão associada a um conjunto de aspetos incapacitantes

inerentes à própria doença? Ou será a condição inflamatória, caraterística das doenças

autoimunes, a ligação entre estas e o desenvolvimento da depressão? Serão os

mecanismos biológicos, envolvidos na etiologia da depressão, semelhantes em doentes

com patologia autoimune e em indivíduos controlo?

O principal objetivo do presente estudo era analisar a existência de possíveis

associações entre vários polimorfismos de genes do sistema serotoninérgico e de genes

das citocinas e o desenvolvimento da depressão. Apresentamos a originalidade de

estudar uma coorte portuguesa de doentes com patologia autoimune, particularmente

aqueles com esclerose múltipla e com doença de Behçet. Para verificar se existe uma

associação entre as componentes genéticas avaliadas e a depressão, teve que ser

Discussão

63

analisada apriori a existência de uma associação com o desenvolvimento da doença

autoimune.

A serotonina, além de ser um importante neurotransmissor envolvido na regulação

de inúmeros processos ao nível do SNC, também está envolvida na regulação de uma

variedade de processos fisiológicos e apresenta efeitos imunomodulatórios. Várias

linhagens celulares hematopoiéticas como as plaquetas, monócitos e linfócitos

conseguem armazenar e libertar serotonina depois de estimuladas. De facto, tem vindo

a ser descrito que durante o processo inflamatório existe um aumento extracelular dos

níveis de serotonina (Mossner & Lesch, 1998). A ativação e proliferação de linfócitos T

e B, a modulação da libertação de citocinas e o recrutamento de neutrófilos para o local

da inflamação aguda são algumas das funções imunomodeladoras da serotonina e que

poderão ter influência nas doenças autoimunes (Mauler, Bode, & Duerschmied, 2016).

As funções imunológicas da serotonina são, por sua vez, mediadas pelos seus

recetores.

No nosso estudo e considerando a suscetibilidade para as doenças autoimunes

investigadas, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nos

polimorfismos rs6296, rs6313 e rs6314 (nos genes recetores de serotonina) entre os

doentes investigados e a população controlo. O polimorfismo rs6296, apesar de se

encontrar numa região codificante do gene HTR1B, não provoca nenhuma alteração a

nível da sequência de aminoácidos. A expressão deste gene poderá ser afetada devido

a um desequilíbrio de ligação entre este polimorfismo e um outro localizado próximo da

região codificante do gene HTR1B. Para este polimorfismo, não existem estudos que

reportem associações com as doenças autoimunes. Considerando os polimorfismos

rs6313 e rs6314, também estes podem influenciar a atividade do recetor 5-HT2A

provocando alterações ao nível da expressão do gene HTR2A. É conhecido que o

recetor de serotonina 2A tem efeitos na resposta imunitária, nomeadamente na

regulação da produção de citocinas pro-inflamatórias. Em 2008, um estudo sueco

observou associações entre a variabilidade genética do HTR2A, incluindo o rs6313 e

rs6314, e a artrite reumatoide (Kling et al., 2008).

Quanto ao polimorfismo rs6296, não se evidenciou a existência de qualquer

diferença nas frequências genotípicas na população geral de doentes autoimunes

(n=205) e no grupo de doentes com EM (n=158). No entanto, observou-se uma

diferença estatisticamente significativa na frequência do genótipo rs6295GC do gene

recetor da serotonina 1A no grupo de doentes com Behçet (n=47). A frequência do

genótipo rs6295GC apresenta-se diminuída nos doentes com Behçet comparativamente

Discussão

64

à população controlo. Este resultado sugere que o genótipo rs6295GC poderá ser

protetor para a doença de Behçet. Esta análise deve ser feita com precaução e são

necessários estudos com coortes mais alargadas para verificar se esta associação se

mantém. Até à data, não existem estudos que reportem uma associação entre o

polimorfismo rs6295 (-1019 G>C) e a proteção para a doença de Behçet. No entanto,

foi observada uma associação entre o alelo rs6295G e a suscetibilidade para o diabetes

mellitus tipo 1, numa coorte sueca (Asad et al., 2012). Está descrito que este recetor

desempenha um papel importante na regulação da proliferação de linfócitos T e B e na

atividade da adenilciclase. Baixos níveis de serotonina têm um efeito estimulatório,

enquanto elevados níveis possuem efeitos supressivos. Assim, uma sobreexpressão de

5-HTR1A poderá promover a proliferação de linfócitos T e B que poderá causar a reação

autoimune (Xu et al., 2011).

Os alelos HLA-DRB1*15 e HLA-B*51 estão associados à suscetibilidade para a EM

e DB, respetivamente, e é observada uma sobreexpressão de citocinas pro-

inflamatórias, como o TNF-α e IL-1β, nos doentes com estas patologias. Assim, é

conhecido que as doenças autoimunes têm uma forte associação com genes envolvidos

na resposta imune. Os polimorfismos nas regiões reguladoras dos genes citocinas

poderão influenciar a sua expressão e podem ser importantes preditores genéticos de

suscetibilidade à doença autoimune. O nosso estudo não encontrou diferenças

estatisticamente significativas nos polimorfismos rs1800629 e rs16944 dos genes

citocinas pro-inflamatórias TNF-α e IL-1β entre os doentes investigados e a população

controlo. Estes resultados estão de acordo com estudos realizados em doentes com EM

(Heidary et al., 2014; Mirowska-Guzel, Gromadzka, Mach, Czlonkowski, & Czlonkowska,

2011; Tolide-Ie, Tabatabaee, & Kamali-Sarvestani, 2014) assim como em doentes com

Behçet (Akman et al., 2008; Ates, Dalyan, Hatemi, Hamuryudan, & Topal-Sarikaya,

2010; Lee, Kim, Lee, Park, & Song, 2003).

No presente estudo verificamos que tanto doentes com esclerose múltipla como

aqueles com doença de Behçet apresentam taxas de prevalência de quadros

depressivos superiores, de 25,9% e 29,8%, respetivamente, às descritas na população

em geral, 15% (Haase & Brown, 2015). Atualmente, o sistema serotoninérgico é o

principal sistema envolvido na patofisiologia da depressão. Os polimorfismos dos genes

das moléculas envolvidas na sinalização serotoninérgica, nomeadamente dos recetores

de serotonina, poderão ser excelentes preditores genéticos de suscetibilidade para este

distúrbio. O polimorfismo rs6295 (-1019 C>G) está localizado na região promotora do

gene HTR1A (Anttila et al., 2007). Como já foi referido na parte introdutória deste

trabalho, é sugerido que a presença do alelo rs6295G altere o local de reconhecimento

Discussão

65

para a NURD. Esta alteração leva ao aumento da expressão deste recetor que poderá

afetar negativamente a disponibilidade de serotonina na fenda sináptica, observada em

doentes deprimidos. Um estudo realizado no Canadá com 129 doentes com depressão

reportou que os portadores do genótipo rs6295GG ou do alelo rs6295G possuem um

risco aumentado para o desenvolvimento da depressão (Lemonde et al., 2003). No

nosso estudo não se evidenciaram resultados estatisticamente significativos, o que está

de acordo com os resultados de um estudo finlandês que incluía 86 doentes deprimidos

(Illi et al., 2009).

Embora, até à data, existam poucas publicações que relacionem o polimorfismo

rs6296 (-861 G>C) no gene HTR1B e a depressão, Huang et al, num estudo norte-

americano que incluía 394 doentes psiquiátricos, evidenciaram que indivíduos

portadores do alelo rs6296C apresentavam maior suscetibilidade para o

desenvolvimento da depressão (Huang et al., 2003). Também foram reportadas

associações entre esta variante e a depressão em indivíduos expostos a situações

recentes de stress (Mekli et al., 2011) e ainda a uma maior predisposição para o

alcoolismo antissocial (Lappalainen et al., 1998). No presente estudo, não foram

observadas associações estatisticamente significativas entre este polimorfismo e a

suscetibilidade para a depressão.

Relativamente ao gene HTR2A, foi sugerido que variações neste gene podem

desempenhar um papel importante no desenvolvimento, progressão e na resposta ao

tratamento de distúrbios depressivos (Petit et al., 2014; Serretti et al., 2007). O rs6313

(102 T>C), apesar de silencioso, pode interferir na atividade do recetor dada a sua

localização na região promotora do gene. A maior parte dos estudos realizados para

este polimorfismo evidenciaram um aumento da frequência do alelo rs6313C em

doentes deprimidos (Arias et al., 2001; Du et al., 2000; Petit et al., 2014; Wrzosek et al.,

2011) comparativamente à população em geral. Os fatores envolvidos no

desenvolvimento da depressão poderão diferir em indivíduos sem outras patologias

adjacentes e em indivíduos com autoimunidade. Exemplo disso é observado em estudos

realizados em coortes portuguesas com LES, nos quais foram observadas associações

entre o alelo rs6313T e o genótipo rs6313TT e uma maior suscetibilidade para a

depressão (Ferreira, 2015; Leal et al., 2011). No presente estudo, também os doentes

com patologia autoimune deprimidos apresentam um aumento da frequência do

genótipo rs6313TT comparativamente ao genótipo rs6313CC (31,5% vs 16,7%,

respetivamente). No entanto, e tal como evidenciado noutros estudos, não existem

diferenças estatisticamente significativas nas frequências genotípicas deste

polimorfismo entre os grupos de doentes com autoimunidade deprimidos e não

Discussão

66

deprimidos. Relativamente ao polimorfismo rs6314 (1354 C>T), localizado na região C-

terminal do HTR2A, este também poderá ter influência nos níveis de expressão deste

recetor. Num estudo efetuado numa população francesa, o genótipo rs6314TT foi

associado a um maior grau de gravidade de depressão (Petit et al., 2014). No nosso

estudo, assim como descrito num estudo conduzido numa população alemã (Minov et

al., 2001), não foram observadas associações estatisticamente significativas entre este

polimorfismo e a suscetibilidade para a depressão.

A importância do papel das citocinas na ativação de sistemas relacionados com

a patofisiologia da depressão tem vindo a ser descrita. As citocinas pro-inflamatórias

influenciam negativamente a síntese de serotonina, estimulam a ativação do sistema

HPA, levando à hipercortisolemia, e modulam a neurogénese do hipocampo. Assim, tem

vindo a ser investigada uma possível relação entre os polimorfismos (SNPs) dos genes

citocinas e a suscetibilidade para a depressão. Nos doentes com patologia autoimune é

pertinente estudar os polimorfismos nos genes das citocinas na suscetibilidade para a

depressão, uma vez que existe uma elevada libertação de citocinas pro-inflamatórias

nestes doentes. Em relação ao polimorfismo rs1800629 (-308 G>A), Jun et al.

reportaram uma associação entre o alelo rs1800629A e a depressão numa população

coreana (Jun et al., 2003). Resultado este que contraria o evidenciado por Cerri et al.

num estudo conduzido numa coorte italiana que evidenciou que o genótipo

rs1800629GG está relacionado com o distúrbio depressivo em 50 doentes geriátricos

(Cerri et al., 2010). No nosso estudo não foram encontradas associações entre este

polimorfismo e a suscetibilidade para a depressão, tal como foi descrito em outras

publicações (Clerici et al., 2009; Misener et al., 2008).

A IL-1β tem vindo a ser sugerida como tendo um papel central na comunicação

entre o sistema imune e o SNC. Esta citocina pro-inflamatória é capaz de modular o

metabolismo do triptofano através do aumento da atividade da enzima IDO, o que leva

a uma redução da disponibilidade de triptofano para a síntese de serotonina; esta

enzima também ativa a via de quinurenina, que produz metabolitos neurotóxicos

(Dantzer, O'Connor, Lawson, & Kelley, 2011). Para além destes efeitos na transmissão

serotoninérgica, a IL-1β tem também um papel regulador na atividade do sistema HPA

(Maes, Bosmans, Meltzer, Scharpe, & Suy, 1993) bem como influencia negativamente

a plasticidade neuronal (Miller, Maletic, & Raison, 2009). O polimorfismo rs16944 (-511

C>T) pode alterar a expressão do gene IL-1β. Observamos uma associação

estatisticamente significativa entre o genótipo rs16944TT e a suscetibilidade para a

depressão, quando comparados doentes que apresentam quadro depressivo e aqueles

que não apresentam. Os nossos resultados seguem a mesma linha de outros estudos

Discussão

67

já publicados. O aumento do risco para a depressão foi observado em indivíduos

portadores do alelo rs16944T com esquizofrenia (Rosa et al., 2004), afetados pela

doença de Alzheimer (McCulley et al., 2004) e com cancro da mama (Kim et al., 2013)

e ainda em indivíduos portadores do genótipo rs16944TT expostos a situações de stress

durante a infância (Kovacs et al., 2016). Por outro lado, Borkowska et al., numa coorte

polaca, observaram um efeito protetor do alelo rs16944T contra a recorrência da

depressão (Borkowska et al., 2011). Dois outros estudos reportaram ainda que doentes

portadores do genótipo rs16944TT apresentavam melhor resposta ao tratamento com

antidepressivos (Baune et al., 2010; Yu et al., 2003). É de notar que no presente estudo,

bem como nos outros que relacionaram o alelo rs16944T à suscetibilidade para a

depressão, os grupos investigados são portadores de outras patologias clínicas severas

ou então expostos a situações de stress.

Tal como já foi referido ao longo do trabalho, a depressão é uma doença

complexa, que pode sofrer influência não só de múltiplos genes mas também de uma

série de fatores ambientais. Os estudos realizados incidem em diferentes populações e,

por isso, as frequências genotípicas são caraterísticas de cada população, podendo esta

ser uma das causas das discrepâncias observadas entre as diferentes publicações. O

poder estatístico também é reduzido dado que a maioria dos estudos apresentam uma

amostra populacional reduzida que condiciona a identificação de genes envolvidos na

suscetibilidade para a depressão. É também de referir que o nosso estudo foi conduzido

numa população afetada por uma condição clínica crónica e que a maior parte das

publicações existentes incidiram em indivíduos apenas afetados pela depressão e/ou

por distúrbios psiquiátricos.

CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS

Conclusões e Perspetivas Futuras

70

VI. CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS

Com o crescente aumento da prevalência de distúrbios psiquiátricos,

nomeadamente da depressão, em todo mundo, vários são os estudos que tentam

compreender a sua etiologia. A hipótese das monoaminas foi a primeira teoria a ser

explorada na tentativa de explicar a etiologia da depressão. Assim, a definição dos

genes candidatos para o estudo da suscetibilidade para a depressão tem sido baseada

no conhecimento de moléculas envolvidas nas vias de sinalização monoaminérgica e

no tratamento farmacológico. A associação de polimorfismos em genes envolvidos no

sistema serotoninérgico com as doenças psiquiátricas tem sido investigada por vários

grupos, mas os resultados têm-se revelado inconsistentes. O presente estudo

apresentou a singularidade de analisar o papel dos polimorfismos em genes de

moléculas do sistema serotoninérgico na depressão, numa coorte de doentes com

patologia autoimune.

Atualmente, outras teorias têm emergido na tentativa de uma melhor compreensão

acerca deste distúrbio. Uma das teorias mais testadas é a hipótese das citocinas. O

facto de as citocinas pro-inflamatórias induzirem uma síndrome comportamental,

conhecida como sickness behaviour, com sintomas semelhantes àqueles observados

na depressão, hipotetiza que uma desregulação da atividade inflamatória das citocinas

poderá ser um fator contributivo para os distúrbios depressivos. Esta teoria é suportada

por um grande número de evidências, tais como os efeitos provocados pelas citocinas

na neurotransmissão de serotonina, na atividade do sistema HPA e na neurogénese do

hipocampo. Todos estes eventos descritos como envolvidos na etiologia da depressão.

Para além destes efeitos, associações entre a elevada atividade inflamatória,

caraterística das doenças autoimunes, e a sintomatologia depressiva tem sido

documentada em inúmeros estudos. Por isso, os genes envolvidos na regulação da

atividade das citocinas são fortes candidatos para o envolvimento da suscetibilidade

genética na depressão.

No estudo apresentado, observou-se a existência de uma associação significativa

(p=0,019) para o genótipo rs16944TT do gene citocina IL-1β e que sugere que este

possa estar associado a uma maior suscetibilidade para a depressão nos doentes com

patologia autoimune. O nosso estudo é o primeiro a reportar esta associação em

doentes com autoimunidade, seguindo a mesma linha de outros estudos em doentes

portadores de outras patologias crónicas ou expostos a situações de stress. O efeito

protetor deste polimorfismo evidenciado noutros estudos incidiu em grupos de doentes

Conclusões e Perspetivas Futuras

71

deprimidos não expostos a fatores de stress. Estas evidências sugerem que uma

excessiva sobreexpressão da IL-1β, durante o curso de doenças crónicas ou em

eventos de stress ocorridos na vida, poderá interferir com o funcionamento neuronal

normal e, assim, despoletar o distúrbio depressivo.

A depressão é uma doença complexa causada por múltiplos genes de pequenos

efeitos e por condicionantes ambientais que surgem ao longo da vida. Logo, a

compreensão destas interações gene-gene e gene-ambiente permanece um importante

desafio. Assim, surge a necessidade de aumentar o número de amostras em estudo

bem como uma melhor caraterização das populações. A exposição a eventos de stress

ocorridos ao longo da vida, a avaliação da qualidade de vida dos doentes e a atividade

da doença inflamatória são aspetos que se devem ter em conta em estudos posteriores

da depressão em doentes com patologia autoimune.

O futuro passará pela implementação de uma medicina preventiva e personalizada.

O conhecimento dos fatores de suscetibilidade genética envolvidos na etiologia da

depressão em doentes com autoimunidade permitirá não só contribuir para o

desenvolvimento de novas terapêuticas mas também para um acompanhamento

médico personalizado, de modo a prevenir comportamentos depressivos e a melhorar

a qualidade de vida dos doentes. Relativamente aos aspetos médico legais, é de

especial interesse estudar os doentes com patologia autoimune devido à incapacidade

física, psicológica e social a que estes estão sujeitos e que poderá estar associada aos

distúrbios depressivos. Nos casos criminais, a condição mental do arguido é um

parâmetro que possui especial interesse, uma vez que poderá influenciar o veredito. É

um facto que os doentes deprimidos têm maior predisposição para cometer o suicídio.

Assim, medidas relativas à prevenção do suicídio em doentes deprimidos, incluindo o

internamento e uma terapia adequada, são de extrema importância médico-legal.

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