PARALISIA DO TREM POSTERIOR CAUSADA POR CROTAMINA - O...

CARINA TALARICO RIZZI

PARALISIA DO TREM POSTERIOR

CAUSADA POR CROTAMINA - O QUE HÁ

POR TRÁS DISSO?

São Paulo

2006

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CARINA TALARICO RIZZI

PARALISIA DO TREM POSTERIOR

CAUSADA POR CROTAMINA - O QUE HÁ

POR TRÁS DISSO?

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Mestre em Ciências, na Área de Fisiologia. Orientador: Prof. Dr. Lanfranco Ranieri Paolo Troncone

São Paulo

2006

i

Rizzi, Carina Talarico Paralisia do trem posterior causada por crotamina - o que há por trás disso? Número de páginas: 57 Dissertação (Mestrado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Fisiologia. 1. Palavra-Chave Principal: crotamina 2. Palavra-Chave Secundária: canal de sódio I. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Fisiologia.

Comissão Julgadora:

________________________ _______________________ Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

________________________ _______________________ Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

______________________ Prof(a). Dr.(a). Orientador(a)

ii

Para Clóvis

Cujo amor inspirou esta jornada

Para Plinio e Marilena, meus pais

Pelo amor, incentivo e dedicação

Para Pedro, meu querido filho

Por seu amor e seu doce sorriso

iii

Agradecimentos

Ao meu orientador pela confiança, devoção e paciência.

Ao Prof. Dr. José Carlos de Freitas pelo apoio quando da minha entrada no

mestrado e pela colaboração.

Ao Prof. Dr. Isaltino Marcelo Conceição por me acolher em seu laboratório e por

suas valiosas explicações.

Ao Prof. Dr. Enzo Wanke por possibilitar a obtenção de tão preciosos resultados.

Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola e seu aluno João Luiz de Souza pela

inestimável colaboração de última hora.

Aos meus dedicados e queridos amigos do laboratório, Marina Sorrentino e

Leandro de Magalhães que sempre tornaram tudo possível e melhor.

Ao Prof. Dr. Patrick Spencer, amigo de longa data, pela purificação da crotamina

e por relembrar bons e velhos tempos de festas e lasanha.

À Thalma de Freitas, Bianca Casasco e Ana Beatriz Oliveira pelo constante

apoio, sem falar no bom humor.

Ao pessoal de suporte Joana Padula, Wilson D’Ávila, Wanda Regina da Silva,

Maria Aparecida da Silva, Maria Zelma da Silva, Carlos Roberto Valério e Antônio

Fontes pelos cuidados cotidianos.

Às minhas queridas amigas Fábia Azevedo e Maria Fernanda Miranda pelo

amor, apoio e incentivo constantes.

À Silvia Helena Damiati por todo o apoio, confiança e alegria.

Aos amigos que acompanharam e incentivaram esta jornada: Alexandre

Azevedo, Ana Paola Cottini, Cláudia Pereira, Claudinei Pereira, Evanice Claudino,

Manuela Geronimo, Márcia Menezes (e sua família), Telma Silvério e Wilson Miranda.

Aos companheiros de laboratório Adriana, Aline, Ana Luiza, Camila, Celine,

Carlos, Cristiane, Cristina, Daiane, Elizângela, Gustavo, Geane, Leonardo, Mariana,

Marcela, Marlos, Milene, Neide, Rafaela, Raquel, Renata, Renato, Roseli, Sayuri,

Thaís, Vanessa e Vivian por partilharem as dores e alegrias.

iv

Índice:

Introdução ...........................................................................................................................................................1 Aspectos bioquímicos da crotamina ...................................................................................................1 Métodos de purificação ..............................................................................................................................5 Aspectos farmacológicos...........................................................................................................................7 Canais de sódio como alvos de toxinas...........................................................................................10

Material e Métodos...................................................................................................................................14 Purificação da crotamina .........................................................................................................................14 Ensaio comportamental ............................................................................................................................16 Sensibilidade de músculo rápido e lento à crotamina.............................................................16 Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro.............................................................18 Eletrofisiologia ..............................................................................................................................................19

Patch Clamp em células Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK) ...........................................................19 Patch Clamp em neurônios do gânglio da raiz dorsal em cultura primária .................................................22 Efeito da crotamina sobre as correntes de sódio dos canais de sódio voltagem-dependentes. ....................23

Resultados.........................................................................................................................................................24 Ensaio comportamental ............................................................................................................................24

Crotamina ..........................................................................................................................................................24 α-Pompilidotoxina e β-Pompilidotoxina..........................................................................................................25 µ-Conotoxina GIIIa ...........................................................................................................................................25 BcIII....................................................................................................................................................................26 Tetrodotoxina.....................................................................................................................................................26 Tx2-6 ...................................................................................................................................................................26

Sensibilidade de músculo rápido e lento à crotamina.............................................................27 Curva concentração versus resposta ................................................................................................................27 Dose única ..........................................................................................................................................................28

Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro.............................................................30 Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro.............................................................31 Eletrofisiologia ..............................................................................................................................................32

Patch Clamp em células Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK) ...........................................................32 Patch Clamp em neurônios do gânglio da raiz dorsal em cultura primária .................................................42

Discussão...........................................................................................................................................................44 Conclusões .......................................................................................................................................................52 Referências Bibliográficas .................................................................................................................53

v

Introdução

Aspectos bioquímicos da crotamina

As toxinas que atuam em canais de sódio têm características estruturais

simples, tais como o pequeno tamanho, a presença de pontes dissulfeto, de α hélices e

de folhas β (1). A crotamina apresenta tais características. É, portanto, um peptídeo

fortemente básico, de peso molecular 4887 Da. Compõe-se de 42 aminoácidos (Tabela

1), entre eles: 6 cisteínas , 9 lisinas, 2 argininas, uma tirosina na porção N-terminal e

uma glicina na C-terminal (2). Apresenta ainda, 7 resíduos de aminoácidos aromáticos:

1 tirosina, 2 histidinas, 2 triptofanos e 2 fenilalaninas (3). Dímeros podem ser formados

por pontes dissulfeto Cys4 - Cys37, Cys11 - Cys36 e Cys18 - Cys30 (4).

Tyr Lys Gln Cys His Lys Lys Gly Gly His

Cys Phe Pro Lys Glu Lys Ile Cys Leu Pro

Pro Ser Ser Asp Phe Gly Lys Met Asp Cys

Arg Trp Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys Gly

Ser Gly

Tabela 1 - Seqüência de aminoácidos da crotamina (adaptada de Beltran e col., 1990)

(5)

1

Beltran e col., 1985 (6) em estudos de small-angle x-ray scattering (SAXS)

propuseram um formato alongado ou achatado para a crotamina. Entretanto, os

próprios autores ressaltam a insuficiência desses dados para uma conclusão definitiva.

Curiosamente, em um estudo mais recente com a mesma metodologia, Beltran e col.,

1990 (7) propuseram um modelo bilobular, no qual o lobo maior, muito polar, e o lobo

menor, menos polar, ligam-se por uma ponte dissulfeto entre Cys18 e Cys30. Estes

autores sugerem ainda que, devido à sua menor polaridade, o lobo menor deve

interagir com a membrana celular. Essa assertiva, em verdade, abre inúmeras

possibilidades para a pesquisa das interações farmacológicas da crotamina e parece

constituir um dos principais avanços em relação ao trabalho dos mesmos autores

levado a cabo apenas cinco anos antes.

Duas isoformas da crotamina foram isoladas por Toyama e col., 2000 (8): F2 e

F3. Ambas possuem a mesma conformação tridimensional, ainda que possivelmente

difiram em dois ou três aminoácidos, e produzam os mesmos efeitos paralisantes em

ratos. O grupo observou que a F2 aumenta a liberação de insulina em ilhotas isoladas

de pâncreas de ratos. Estes autores mostraram ainda que as isoformas podem ser

encontradas tanto em estrutura dimérica bem como em monômeros estáveis. Segundo

Teno e col., 1990 (4), quando a crotamina apresenta-se como dímero, tem formato

próximo do esférico, o qual é mantido por pontes dissulfeto entre os monômeros.

Cameron e Tu (1978) (9) compararam a crotamina à miotoxina α, extraída da

cascavel das pradarias Crotalus viridis viridis, concluindo haver grande similaridade,

tanto química quanto no que se refere aos efeitos biológicos. Foram os primeiros a

reportar os danos causados à musculatura esquelética em preparações histológicas de

2

ratos previamente tratados com crotamina. Seus resultados demostraram a

constituição peptídica de ambas, sendo que a miotoxina-α teria duas pontes dissulfeto

e 39 resíduos de aminoácidos. As diferenças consistiriam em quatro mudanças de

aminoácidos entre a crotamina e a miotoxina-α (3): Lys16 por Glu, Leu19 por Ile, Phe25

por Leu, Arg33 por Lys. Entretanto, Teno e col., 1990 (4) demonstraram que a

miotoxina-α tem 42 aminoácidos, com apenas três diferenças; exclui-se então, a troca

de Lys16 por Glu. Mostraram ainda que as 3 pontes dissulfeto da miotoxina-α estão

entre Cys4 - Cys36, Cys11 - Cys37 e Cys18 - Cys30. Tal homologia (93%) sugeriria

estruturas terciárias conservadas entre as assim chamadas miotoxinas. Acreditava-se

que a miotoxina-α agisse em canais de sódio de músculo esquelético, causando

despolarização por aumento da permeabilidade ao sódio (10). Entretanto, a miotoxina-

α não age em canais iônicos da membrana plasmática, mas sim diretamente no

retículo sarcoplasmático de células musculares. Trabalhos mais antigos demonstravam

que ela se ligava a Ca2+-ATPase do retículo, desacoplando a bomba de cálcio (11)

(12). Mais recentemente Hirata e col., 1999 (13) propuseram que o sítio de ligação da

miotoxina-α seria a proteína de 30 Kda do complexo do receptor de rianodina, no qual

estão ainda: a calseqüestrina, a triadina, a juntina e a mitsugumina 29. Segundo

Katagiri e col., 1997 (14) existem sítios de ligação específicos para miotoxina-α no

cérebro e, quando injetada em concentrações nanomolares pela via

intracerebroventricular, causa um comportamento semelhante a convulsão. Nota-se,

entretanto, que não foram feitos registros eletroencefalográficos.

Estudos realizados com espectroscopia de próton NMR identificaram a estrutura

da crotamina em solução. Compreende as três pontes dissulfeto, uma α−hélice N-

3

terminal e uma pequena fita β tripla, conformação nunca antes vista em toxinas ativas

em canais iônicos (15). Recentemente Fadel e col., 2005 (16), usando um método

similar, descreveram uma estrutura diferente para a crotamina, com uma α−hélice com

os resíduos 1-7, uma fita β dupla anti-paralela com os resíduos 9-13 e 34-38 e três

pontes dissulfeto entre Cys4-Cys36, Cys11-Cys 30 e Cys18-Cys37. Ambos os grupos

destacam a similaridade de sua estrutura terciária com as β−defensinas humanas

(Tabela 2), mesmo com pouca homologia na seqüência de aminoácidos e tendo

atividades biológicas aparentemente distintas.

Crotamina – YKQCHKKGGHCFPK – EKICLPPSSDFGKMDCRWR - WKCCKKGSG

Miotoxina-a – YKQCHKKGGHCFPK – EKICI PPSSDLGKMDCRWK - WKCCKKGSG

β−Defensina– APLSCGRNGGVCIPIR - - - CPVPMR - - QIGTCFGRPVKCCRSW- -

Tabela 2 - Seqüência de aminoácidos da crotamina, miotoxina-α e β-defensina

Oguiura e col., 2005 (17) mapearam o gene da crotamina no final do braço longo

do cromossomo 2 e notaram haver um contraste na intensidade do sinal entre os dois

genes homólogos encontrados, o que sugere uma diferença no número de cópias do

gene que explicaria a variação na quantidade de crotamina presente na peçonha de

diferentes indivíduos. Tal gene tem 1,8 Kpb e está organizado em três exons, o

primeiro codifica 5´- UTR e os 19 aminoácidos do peptídeo sinal, o segundo codifica 42

aminoácidos, três pertencem ao peptídeo sinal e 39 à crotamina madura e finalmente o

exon 3, codifica os 3 últimos aminoácidos da crotamina, a lisina terminal e 3´-UTR .

4

Métodos de purificação

A crotamina foi descrita pela primeira vez por Gonçalves e Polson (1947) (18)

em um trabalho de purificação e análise eletroforética da peçonha da cascavel citada

como Crotalus terrificus e da jararacuçu, Bothrops jararacussu.

Laure, 1975 (2) utilizou para determinação da seqüência de aminoácidos e peso

molecular da crotamina, o seguinte método: filtração do veneno bruto em Sephadex-G-

75, seguida de outra em Sephadex-G-25, finalizando com uma em Sephadex-G-10,

todos acompanhados por espectrometria em 280nm para identificação do pico

correspondente à crotamina, que foi, então, dessalinizada e liofilizada. Beltran e col.,

1985 (6) fizeram uso desta mesma técnica de purificação para estudar sua estrutura e

conformação.

O grupo de Chang (19-21), que trabalhou com crotamina em Taipei na China,

descreve o seguinte método: primeiramente cromatografa-se o veneno em CM-

Sephadex C-25 eluída em acetato de amônia. A fração correspondente à crotamina foi

testada em músculo esquelético. Posteriormente foi feita nova filtração em Sephadex

G-75 e verificação por eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato. Os

trabalhos realizados por este grupo avaliaram a ação da crotamina em canais de sódio

em estudos eletrofisiológicos comparando-a à miotoxina α e sua interação com outras

toxinas.

Hampe e col., 1977 (22) utilizaram um método similar ao anteriormente citado.

Entretanto, o veneno foi filtrado em coluna de SP-Sephadex G-75 com posterior

filtragem em SP-Sephadex G-25, utilizando NaCl e formiato de amônia como tampão.

Seus estudos concentram-se na conformação e tipos de associação entre monômeros

5

da crotamina. Beltran e col., 1990 (7) seguiram estes mesmos passos e usaram o

mesmo tampão, com exceção do NaCl. Seus estudos focalizaram a conformação

tridimensional da molécula da crotamina.

Endo e col., 1989 (3) purificaram a crotamina a partir do veneno total, por gel

filtração em coluna Sephadex G-75 usando como tampão bicarbonato de amônia. A

última fração eluída continha a crotamina, que foi dessalinizada e liofilizada. Este grupo

estudou sua estrutura molecular em solução.

Teno e col., 1990 (4) filtraram o veneno bruto em coluna Sephadex G-75-120

com ácido fórmico e obtiveram quatro frações. Tais frações foram injetadas em

camundongos e, através da reação de paralisia das patas traseiras, a porção 4 foi

identificada como sendo crotamina. Em seguida, tal porção foi novamente filtrada, só

que dessa vez em coluna Sephadex G-25-50 com HCl. A amostra purificada foi usada

para demonstrar que a crotamina pode formar dímeros ou oligômeros, ligados por

pontes dissulfeto. Mancin e col., 1997 (23) fizeram uso do mesmo método de

purificação anterior, entretanto seus experimentos focalizam a liberação de histamina

causada pela crotamina e outras toxinas.

Mancin e col., 1998 (24) e Toyama e col., 2000 (8) obtiveram crotamina através

de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) de fase reversa em conjunto com

a análise em espectrômetro de massa. O primeiro grupo encontrou duas isoformas (F2

e F3) da crotamina que foram testadas quanto ao estímulo da secreção de insulina em

células pancreáticas de ratos e camundongos. Como controle usaram a toxina

purificada por filtração em Sephadex G-75. O grupo de Mancin verificou a atividade

analgésica da crotamina com experimentos realizados em camundongos.

6

Em seus estudos sobre a estrutura da crotamina em solução, Nicastro e col.,

2003 (15) utilizaram o mesmo método de purificação descrito por Mancin e col., 1998

(24) e confirmam a pureza e a identidade através de espectrometria de massa MALDI-

TOF.

Aos 600 gramas de veneno bruto seco a vácuo, Kerkis e col., 2004 (25)

adicionaram tampão formiato de amônio 0,25M, pH 3,5, para retirar a crotoxina que,

após centrifugação de baixa velocidade, precipita-se com adição de água gelada. Ao

sobrenadante adicionou-se Tris-base até pH 8,8 e em seguida aplicou-se em uma

coluna CM-Sepharose FF. Depois de lavada com uma solução de equilíbrio, a

crotamina foi recuperada passando-se uma solução diluente de NaCl, em seguida

dialisada, liofilizada e feita análise de aminoácidos, verificando-se pureza superior a

98%.

Aspectos farmacológicos

Quando injetada em ratos, a crotamina provoca uma contração, bastante

característica, da musculatura esquelética. Esse efeito é destacadamente mais

acentuado nos membros posteriores, causando sua hiperextensão (26). Tal fato deve-

se à despolarização da membrana das células musculares causada pelo influxo de

sódio (19;27).

Chang e Tseng (1978) (19), a partir de estudos eletrofisiológicos em junção

neuromuscular do nervo frênico e diafragma de ratos e camundongos, demonstraram

que a crotamina atua em canais de sódio, levando a uma despolarização da membrana

devido ao influxo de sódio nas células musculares. Esta despolarização foi prevenida

através da adição de tetrodotoxina, e pela diminuição da concentração de sódio no

7

meio externo, apontando para uma ação neste tipo de canal iônico. Notou-se ainda que

a despolarização foi irreversível, sugerindo que a toxina liga-se fortemente ao seu sítio.

O fato de que os potenciais miniatura de placa motora (PMPMs) não tenham sido

afetados indicaria uma seletividade da crotamina para canais de sódio em células

musculares.

Foram sugeridas duas explicações para o aumento da corrente de sódio

induzida pela crotamina. Usando o loose patch voltage clamp em musculatura de rã, os

resultados apontaram para um aumento do número de canais de sódio em

funcionamento ou para uma alteração na cinética do canal. A primeira hipótese foi

refutada, já que foi dado um pré-pulso hiperpolarizante de -132mV com duração de 100

ms para impedir a inativação lenta dos canais; o potencial foi mantido em

aproximadamente –93 mV para que houvesse apenas uma porcentagem mínima de

canais inativados; o experimento foi feito a temperatura de 12oC, para que novos

canais não fossem inseridos na membrana. Por fim, demonstraram que a segunda

hipótese seria mais provável: a crotamina forçaria os canais de sódio a permanecerem

abertos inibindo a transição direta do modo aberto para o modo inativado, que seria o

esperado fisiologicamente (28).

Um outro efeito atribuído à crotamina é o da mionecrose (9), caracterizada por

uma mudança na ultraestrutura das fibras musculares, levando a vacuolização. Tal fato

deve-se à dilatação do retículo sarcoplasmático, causado pelo desequilíbrio osmótico

decorrente do aumento da permeabilidade ao sódio (27). Desse modo, a aparência

ultraestrutural de células tratadas com crotamina assemelha-se àquela das células que

estão em choque osmótico (28).

8

Uma comparação adequada pode ser feita com a miotoxina-α, que guarda grande

similaridade estrutural com a crotamina. Os danos causados pela miotoxina-α às fibras

musculares esqueléticas são do mesmo tipo daqueles causados pela crotamina (9).

Um estudo farmacológico feito por Mancin e col., 1998 (24), sugeriu mais uma

atividade da crotamina: sua ação analgésica, possivelmente 30 vezes mais potente que

a da morfina. A dose de crotamina que causa analgesia (133,4 µg/kg) em

camundongos é bem menor que a de morfina (4 mg/kg) e parece não afetar os órgãos

nem a musculatura. Embora, estudos de antinocicepção com veneno total sugeriram

que o efeito periférico se deve a ativação de receptores opióides δ e κ, seguida da

estimulação do óxido nítrico e GMPc neuronais com subseqüente abertura de canais

de potássio sensíveis a ATP (29) e, recentemente, Fadel e col., 2005 (16) expuseram

que a atividade analgésica é devida a uma contaminação por crotoxina.

Quanto à interação entre toxinas, é tido que a crotamina potencializa a ação das

toxinas do grupo II (21). Entretanto, quando Chang e col., 1983 (20). empregaram

simultaneamente a crotamina e a toxina do escorpião Leiurus quinquestriatus (QTX),

observaram haver uma ação aditiva na despolarização da membrana das células de

diafragma de ratos e camundongos, mas não uma potencialização. Assim, as

preparações neuromusculares tratadas com QTX apresentaram uma despolarização de

aproximadamente 10 mV, porém, quando a preparação foi tratada com crotamina (0,1

µg/mL), apresentou despolarização de 3 mV e depois, com a adição de QTX, a

despolarização foi acrescida em aproximadamente 9 mV, com um certo retardo. Desta

forma, estes autores propuseram que o sítio de ligação da toxina deste escorpião

poderia se sobrepor em grande parcela ao da crotamina.

9

Kerkis e col. 2004 (25) demonstraram atividades da crotamina bastante diversas

daquelas até então descritas. Quais sejam: penetrar diferentes tipos celulares e

blastocistos de camundongo in vitro; marcar células da medula óssea, baço e líquido

peritoneal in vivo; adentrar ao núcleo tanto de células fixadas quanto não fixadas, ligar-

se aos cromossomos na fase S/G2 quando os centríolos começam a se dividir; ligar-se

aos centrossomos no citoplasma permitindo acompanhar todo o processo de

duplicação e separação do centríolo; marcar células em proliferação ativa; mostrando-

se não tóxica em concentrações micromolares. Todas estas ações pressupõem a

entrada da crotamina nas células.

Canais de sódio como alvos de toxinas

Os canais de sódio são alvos importantes para toxinas animais que têm função

de defesa ou predação. O fato de estes canais exercerem papel importante na biologia

celular e terem sua estrutura molecular bastante conservada no reino animal são

provavelmente as razões para esta preferência (30).

Segundo Catterall, 1980 (31), toxinas ativas em canais de sódio podem ser

classificadas em quatro grupos de acordo com os diferentes sítios de ligação ao canal

e ao modo de ação:

Grupo I - tetrodotoxina, saxitoxina, µ-conotoxina (peptídeo) - guanidinas

heterocíclicas que inibem o potencial de membrana dependente da condutância de

sódio, ou seja, bloqueiam o influxo deste íon. O sítio ao qual elas se ligam encontra-se

na face extracelular do canal iônico.

10

Grupo II - batracotoxina, graianotoxina, veratridina e aconitina - toxinas

lipossolúveis que alteram a voltagem de ativação e inativação ligando-se a um sítio na

porção transmembrânica do canal iônico, prolongando o potencial de ação e a

despolarização.

Grupo III - α−toxina de escorpião e toxinas de anêmona - peptídeos que inibem

a inativação dos canais de sódio ligando-se também a um sítio na face extracelular,

prolongando o potencial de ação e a despolarização celular.

Grupo IV - β-toxina de escorpião - peptídeo muito similar à α−toxina , liga-se com

pouca afinidade ao canal. Atua alterando a voltagem de ativação para valores mais

negativos fazendo com que o canal atinja seu limiar mais facilmente.

Toxinas ativas em canais de sódio foram encontradas em peçonha de aranhas,

escorpiões e serpentes, sem contar os compostos ativos derivados de vegetais.

Apenas para citar alguns exemplos: as toxinas de escorpiões possuem entre 60

e 70 resíduos de aminoácidos e quatro pontes dissulfeto (32). A α-toxina está presente

em escorpiões do Velho Mundo e pode ser considerada a responsável pela toxicidade

da peçonha (33). Já na peçonha do gastrópode marinho Conus geographus é

encontrada a µ-conotoxina, um peptídeo com 22 resíduos de aminoácidos sendo três

hidroxiprolinas, rico em cisteínas que formam três pontes dissulfeto e bloqueia os

canais de sódio voltagem-dependentes. Em seus estudos eletrofisiológicos Cruz e col.,

1985 (34) demonstraram ainda, que a µ-conotoxina não afeta as células nervosas e

sim as musculares, sendo portanto extremamente seletiva. Neste contexto, insere-se a

crotamina, toxina extraída da peçonha da cascavel sul-americana Crotalus durissus

terrificus que não compete pelos sítios de ligação da tetrodotoxina nem com os das

11

toxinas do grupo II. Entretanto, parece afetar alostericamente a ligação de tais toxinas,

aumentando a afinidade pelo sítio, mas não a atividade (21). Acredita-se que a

crotamina seja uma toxina do grupo III, atuando em canais de sódio de maneira

voltagem-dependente de células excitáveis, tais como células cardíacas, nervosas e

musculares (35).

Um dado curioso é que a intoxicação por crotamina causa paralisia espástica

preferencialmente dos membros posteriores, enquanto os anteriores mantêm sua

motilidade. Anatomicamente, os músculos rápidos e lentos apresentam uma

regionalização, ou seja, no trem posterior predominam músculos de contração rápida

com exceção do soleus, de contração lenta (36). Este último apresenta uma baixa

densidade de canais de sódio na placa motora, ao contrário dos músculos de contração

rápida, cuja densidade é bem maior (37). Este mesmo padrão ocorre na membrana

extra juncional, já que fibras de contração rápida requerem uma maior amplitude de

despolarização para iniciar a contração (38). Tal característica desses músculos

poderia estar relacionada à marcante síndrome crotamínica da paralisia dos membros

posteriores, descrita acima.

12

Objetivos

Como exposto acima, o intrigante efeito da crotamina de paralisar seletivamente

os membros posteriores não tem uma explicação adequada. Tendo em vista que a

musculatura destes membros é composta predominantemente por músculos rápidos e

que este tipo muscular apresenta maior densidade de canais de sódio voltagem-

dependente, levantamos a hipótese de que estes músculos seriam mais sensíveis à

crotamina e sofreriam paralisia primeiro que os demais músculos esqueléticos pois a

alta densidade de canais de sódio revela uma grande dependência de sua função.

Assim, para desafiar esta hipótese nos propusemos a:

Comparar os efeitos da crotamina em músculos de contração rápida (Extensor

Longo dos Dedos) e de contração lenta (Soleus).

Testar a ação da crotamina em um sistema heterólogo expressando as

subunidades α de canais de sódio, cardíacos, neuronais e musculares para verificar se

esta toxina tem preferência por algum sub-tipo de canal de sódio.

13

Material e Métodos

Purificação da crotamina

A crotamina utilizada foi purificada no Instituto de Pesquisas Energéticas e

Nucleares (IPEN) usando-se o método de cromatografia de exclusão molecular seguido

de troca iônica.

Em cada partida de purificação cerca de 150 mg de veneno total de Crotalus

durissus terrificus (fornecido pelo Instituto Butantan), na forma liofilizada, foram

dissolvidos em 2 mL de tampão formiato de amônio 100mM, pH 3. A solução foi

centrifugada por 10 minutos a 200 G, o sobrenadante foi aplicado a uma coluna de gel

filtração Superdex 75, equilibrada com o tampão de formiato de amônio 100mM pH 3 e

fluxo de 1 mL/minuto. As frações foram coletadas com um coletor automático do

sistema de Cromatografia Líquida Rápida de Proteína (Fast Protein Liquid

Cromatrography - FPLC) com determinação contínua da absorbância em comprimento

de onda de 280 nm (Figura 1). As frações que continham os picos principais foram

acondicionadas em frascos de vidro, congeladas e liofilizadas para posterior uso nas

análises.

A fração correspondente à crotamina semi-purificada, foi ressuspendida em

tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,8 e aplicada em uma resina do tipo Resource S

em sistema FPLC, estabilizada no mesmo tampão. Após a adsorção, a crotamina

ligada à resina foi retirada com a passagem de um gradiente linear salino de 0 a 2 M de

NaCl. A absorbância foi automaticamente lida em 280 nm (Figura 2) e as frações

contendo a crotamina foram agrupadas. Posteriormente a crotamina foi dialisada contra

14

água deionizada em membrana da SIGMA® - de capacidade entre 0 e 3000 Da -

congelada, liofilizada e mantida a -24ºC.

20 40 60 80 1000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D.O

. 280

nm

Frações (mL)

54

3

2 1

Figura 1 - Cromatograma do veneno total de Crotalus durissus terrificus em coluna de exclusão molecular Superdex 75.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 5 10 15 20 25

Fraçõe s (mL)

D.O

. 280

nm

Figura 2. Recromatografia de crotamina em resina Resource S.

15

Ensaio comportamental

Para avaliar os efeitos comportamentais causados pela crotamina, por toxinas

de canais de sódio do grupo I (tetrodotoxina e µ−conotoxina GIIIa) e do grupo III (α e β-

Pompilidotoxina de vespa, BcIII de anêmona e Tx2-6 da aranha armadeira) foram

usados camundongos Swiss machos pesando entre 25 e 35 g. Todas as toxinas foram

diluídas em solução salina fisiológica e injetadas intraperitonealmente (i.p.) nas doses

descritas em cada experimento. Os animais injetados foram acomodados em caixas de

biotério para observação por um tempo mínimo de duas horas. Quando os sintomas de

intoxicação eram evidentes, os animais eram colocados sobre a bancada e filmados e

fotografados a fim de documentar os principais sintomas da intoxicação. Foram

testadas além da crotamina N=10 (300 µg/kg), as toxinas α-Pompilidotoxina N=3, β-

Pompilidotoxina N=3 (até 300 µg/kg), BCIII N=3 ( 600 µg/kg), Tx2-6 N=10 (7 µg/kg), µ-

CgTxGIIIa N=3 (7 µg/kg) e Tetrodotoxina N=3 (10 µg/kg).

Sensibilidade de músculo rápido e lento à crotamina

Utilizaram-se os músculos extensor longo dos dedos (ELD) e Soleus, ambos dos

membros posteriores, de ratos Wistar machos pesando de 180 a 200 g.

Após a eutanásia por decapitação, os músculos foram dissecados e colocados

em uma placa de Petri contendo líquido nutritivo com a seguinte composição (mM):

NaCl 115, KCl 3,5, NaHCO3 25, NaH2PO4 1, MgCl2 6, glicose 12, gaseado com

carbogênio.

Foram usadas câmaras de vidro com parede dupla, cujas cubas internas têm 5

mL de capacidade e para as quais uma serpentina, que passa pela câmara externa,

16

fornece a solução nutritiva. Uma bomba de circulação envia água aquecida a 370C para

a câmara externa. Manteve-se um gaseamento constante com carbogênio. Dois

eletrodos ligados a um estimulador S88 Grass foram dispostos dentro das cubas.

O tendão distal de cada músculo foi amarrado com linha a uma haste de aço

inoxidável colocada no interior da cuba, enquanto o proximal foi amarrado a um

transdutor isométrico. O posicionamento do músculo foi feito de maneira a mantê-lo

eqüidistante dos eletrodos. As condições controle e experimental foram realizadas com

músculos retirados do mesmo animal. Foram usadas portanto, duas cubas

experimentais e duas cubas controles contendo respectivamente o Soleus e o ELD.

Inicialmente os músculos foram submetidos a uma tensão basal de 2g; após

estabilização, ligou-se o estimulador com os seguintes parâmetros: estimulação

contínua de 80 V, freqüência 0,2 Hz, duração 8 ms. Os sinais gerados pela contração

isométrica dos órgãos foram enviados a um amplificador, passando, a seguir, a uma

placa conversora analógica/digital acoplada a um microcomputador iMac. A aquisição

foi feita pelo programa Chart 4.2.

Foram empregadas duas abordagens para determinar os efeitos da crotamina

sobre estes músculos. Na primeira, realizou-se uma curva concentração versus

resposta com a crotamina sendo adicionada em lotes sucessivos ao banho nas

seguintes concentrações (µM): 0,001; 0,6; 2; 6,75; 20 e 60. Com a estimativa de

concentração obtida neste experimento elegeu-se a concentração de 6,75 µM para

fazer o bloqueio destes músculos em uma única administração. A concentração foi

escolhida em função de ser a que melhor distinguia a sensibilidade dos dois músculos.

17

Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro

Empregou-se o método de liberação de transmissores marcados como descrito

por Troncone e col., 1995 (39;39). Resumidamente, ratos machos Wistar foram

decapitados e seus estriados, dissecados e colocados em tampão Krebs-Ringer-

bicarbonato (KRB) gelado com a seguinte composição (mM): NaCl 118, NaHCO3 25,

KCl 4.8, CaCl2 1.3, KH2PO4 1.2, MgSO4, 1.2, glicose 10, pH 7.3, gaseada com

carbogênio. O tecido estriatal foi, então, cortado em prismas, com a utilização de um

McIlwain Tissue Chopper. Cortes de 250 µm foram dispersos com uma pipeta Pasteur

e lavados com 15 mL de KRB gelado, transferidos para um béquer contendo 3 mL de

KRB e incubados em banho a 37ºC por 5 minutos. Adicionou-se, em seguida, o agente

radioativo, 10 µL de [3H]-acetilcolina ([3H]Ach) (Amersham Bioscience®/ atividade

específica 2.96 TBq/mmol) e incubou-se novamente a 37ºC por 20 minutos. O tecido

foi, então, filtrado e lavado duas vezes com KRB gelado e distribuído em dez câmaras

de perfusão com volume interno de 0,25 mL. A perfusão ocorreu a uma taxa de 0,25

mL/min com uma bomba peristáltica de dez canais por 40 minutos, até obter-se uma

liberação basal estabilizada. Após esse tempo, foram coletadas quatro amostras da

liberação basal com um coletor desenvolvido no próprio laboratório, a intervalos de 3

minutos. Na quinta coleta as câmaras foram perfundidas com uma solução KRB de

estímulo com 20 mM de potássio (na qual se diminuiu a quantidade NaCl para manter a

osmolaridade) durante 2 minutos, após os quais retornou-se à perfusão com KRB

normal. A partir da oitava coleta perfundiu-se o tecido com as seguintes concentrações

de toxinas: crotamina 1 µM e 5 µM , Tx 2-6 0,1 µM, BCIII 0,1 µM e β-pompilidotoxina

18

0,1 µM; todas em KRB normal. Na décima segunda coleta verificou-se o efeito das

toxinas sobre a liberação estimulada pelo KRB com 20 mM de potássio.

Os cálculos da liberação fracional e as demais normalizações foram feitos a

partir do percentual do neurotransmissor liberado sobre o total do neurotransmissor

contido no tecido no momento da liberação (liberação fracional). Os efeitos das toxinas

foram avaliados pelo quociente (S2/S1) entre a liberação estimulada na presença da

toxina (S2) e a liberação estimulada controle (S1)(40). O efeito sobre a liberação basal

foi calculado pelo quociente (B2/B1) entre a liberação basal na presença da toxina (B2)

e a liberação basal controle (B1). A liberação (S) foi obtida subtraindo-se a liberação

basal do total liberado obtido sob estimulação.

Eletrofisiologia

Patch Clamp em células Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK)

Cultura de Células

Linhagens celulares Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK) expressando os

canais de sódio NaV1.1, 1.2, 1.3, 1.5 e 1.6; (cultivadas em meio Dulbecco modificado a

partir do meio Eagle suplementado com 10% de soro fetal bovino) foram obtidas por

transfecção a partir seus respectivos vetores de expressão pCIN5 (41) e

posteriormente selecionados por sua resistência a G418. Os vetores de pCIN5-hNaV1.3

e 1.6 foram gerados como descrito por Chen e col., 2000 (42) e Burbidge e col., 2002

(43). O vetor pCIN5-hNaV1.2 foi obtido a partir do clone de cADN hNaV descrito por Xie

e col., 2001 (44); o vetor pCIN5-hNaV1.1 foi gerado usando-se o cADN retirado de

clones parciais isolados de bibliotecas de cADN de cerebelo e medula de humanos

19

adultos e o vetor pCIN5-hNaV1.5 de clones parciais isolados de uma biblioteca de

cADN de coração humano. Células expressando NaV1.4 foram obtidas após

transfecção provisória de um plasmídeo contendo hNaV1.4 (cedido gentilmente pela

Profa Diana Conti-Camerino, Universidade de Bari).

Registros eletrofisiológicos

A toxina foi dissolvida na solução extracelular padrão, com a seguinte

composição (mM): NaCl 70, NMDG 67, CaCl2 2, MgCl2 2, HEPES-NaOH 10, pH = 7.4,

imediatamente antes dos experimentos. A solução usada para preenchimento da pipeta

tinha a seguinte composição: (mM) K+- aspartato 130, NaCl 10, MgCl2 2, EGTA-KOH

10, Hepes-KOH 10, pH = 7.3 com KOH.

Na presença de correntes de potássio contaminantes usou-se tetrodotoxina

(Sigma) 100 nM nas correntes de NaV1.1 a 1.4 e 1.6, os traços obtidos foram

subtraídos dos traços controle para obter as correntes sensíveis à tetrodotoxina. O

clone NaV1.5, que tem uma LD50 muito maior que 100 nM, não mostrou correntes de

potássio significativas em potenciais de teste. A solução foi aplicada empregando-se

um posicionador linear por controle remoto com nove posições que permitiu um tempo

médio de resposta entre 2 e 3 s colocado junto à célula em estudo.

Aquisição e análise dos dados

As correntes foram medidas em temperatura ambiente por MultiClamp 700A

(Axon Instruments) como descrito por Faravelli e col., 1996 (45) com uma pipeta de

resistência 1,5 a 2,2 MΩ. Os erros de capacitância e resistência em série da célula

foram cuidadosamente compensados em 85 a 90% antes de cada experimento de

fixação de voltagem para reduzir os erros de voltagem a 5% do pulso de protocolo.

20

Foi empregado rotineiramente o procedimento de P/N leak. A inativação

estacionária (steady-state de inativação) voltagem dependente foi determinada através

de um protocolo de pulso duplo, no qual o pulso condicionante foi aplicado de um

potencial fixado de –80 mV para uma série de potenciais de –110 a –10 mV com

incrementos de 10 ou 15 mV por 450 ms seguido imediatamente por um pulso teste

para –10 mV. As correntes de ativação estacionária (steady-state de ativação)

voltagem-dependentes foram desencadeadas por despolarizações graduais para testar

a abrangência dos potenciais de –60 a 0 mV a partir de um potencial imposto de –120

mV. As amplitudes do pico das correntes durante os testes foram normalizadas de

acordo com o primeiro pulso e projetadas contra o potencial do pulso condicionante. A

aquisição e a análise dos dados foram feitas pelos programas pClamp 8.2 (Axon

Instruments) e Origin 7 (Microcal Inc.).

Nos clones expressando NaV1.4 (canal de sódio muscular) foram feitas

perfusões intra e extracelulares com a toxina.

A toxina TX2-6 da aranha Phoneutria nigriventer, conhecida por agir em canais

de sódio retardando a inativação (46), foi utilizada como controle positivo nos clones

NaV1.4 e NaV1.1 (neuronal) com perfusão extracelular.

Todos os experimentos de eletrofisiologia envolvendo os canais de NaV1.1 a 1.6

foram realizados no laboratório do Dr Enzo Wanke, Universidade Milano-Bicocca, Itália

na forma de colaboração.

21

Patch Clamp em neurônios do gânglio da raiz dorsal em cultura primária

Cultura de células

Ratos com um dia de vida foram sacrificados por decapitação. Gânglios da raiz

dorsal de toda a extensão da espinha dorsal foram dissecados. Os gânglios foram

picotados, tratados com tripsina e dispersados mecanicamente. Após a dispersão as

células foram semeadas em recortes de lamínulas tratadas com poli-lisina e mantidas

em meio de cultura adicionado com soro fetal bovino e antibiótico. As células foram

utilizadas para os registros entre dois e três dias após a dispersão.

Registros eletrofisiológicos

Para os registros de correntes de sódio em canais de sódio voltagem-

dependentes, utilizou-se a técnica de patch clamp, configuração whole-cell. Durante o

experimento, as células foram observadas em microscópio invertido com um aumento

de 400x. As micropipetas utilizadas foram de vidro borossilicato estiradas em estirador

vertical e polidas em microforja. As micropipetas foram preenchidas com uma solução

com a seguinte composição, em mM: NaCl, 10; CsF, 150; TEACl, 10; MgCl2, 4,5;

EGTA, 9; Hepes, 10. Com o polimento, essas micropipetas apresentaram uma

resistência de ponta de 1,5 a 2,0 MOhms quando mergulhadas na solução de banho da

câmara de registros, que tinha a seguinte composição, em mM: NaCl, 50; cloreto de

colina, 82; MgCl2, 1,2; CaCl2, 1,8; CoCl2, 1; KCl, 4,0; Hepes, 10. Após a formação do

giga selo, a configuração whole cell pôde ser atingida pelo rompimento do patch

circunscrito pela ponta da micropipeta. O transiente de corrente capacitiva foi

cancelado em aproximadamente 90% e a resistência em série compensada em, no

mínimo, 80%.

22

Efeito da crotamina sobre as correntes de sódio dos canais de sódio voltagem-

dependentes.

A crotamina foi testada no pico das correntes de sódio e na curva de ativação e

inativação estacionária das correntes de sódio. Para o teste no pico das correntes,

utilizou-se um protocolo que consistia de uma série de vinte pulsos de 50 ms de

duração e de 0 mV, partindo de um potencial de membrana fixado em -110 mV.

Durante a série, alternou-se a condição controle e a condição teste (presença da

crotamina). Para o teste na ativação da condutância pela voltagem utilizou-se um

protocolo que consistia de uma série temporal de 30 pulsos despolarizantes partindo

sempre de um potencial de membrana de -110 mV. Durante a série, o pulso

despolarizante era adicionado de um delta de +5 mV a cada pulso, o que o fazia iniciar-

se em -65 mV e chegar a +80 mV no último pulso. Nesse teste, iniciou-se a perfusão

da célula em experimentação com crotamina um minuto antes do início da série. Para o

teste na curva de inativação estacionária, utilizou-se um protocolo de fixação de

voltagem que consistia de uma série temporal com 30 pulsos partindo sempre de um

potencial de membrana de -110 mV. Cada pulso consistia de um período de 50 ms que

variava de -145 a 0 mV com um delta de +5 mV a cada pulso, seguido de um período

de 10 ms em 0 mV comum a todos os pulsos da série. A crotamina também foi

apresentada 1 minuto antes do início do teste.

Os experimentos de eletrofisiologia com cultura de células do gânglio da raiz

dorsal foram realizados no laboratório do Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola, ICB-USP,

na forma de colaboração.

23

Resultados

Ensaio comportamental

Crotamina

De quinze a vinte minutos após a injeção de crotamina o animal começa a

apresentar os primeiros sinais da intoxicação. Altera-se o padrão de deambulação e

exploração de modo que o animal passa mais tempo parado que andando. Logo se

instala a paralisia dos membros posteriores (Fotografia 1), que parece envolver certa

hipertonia de alguns grupos musculares e hipotonia de outros. Os dedos permanecem

flácidos e sem reflexo de preensão, mas as pernas se apresentam distendidas

posteriormente. O animal responde a estímulos dolorosos aplicados aos membros

paralisados, sugerindo que apenas a motricidade está comprometida. No auge da crise

observa-se certa dificuldade respiratória ou mesmo uma parada dos movimentos

torácicos que retornam em seguida em aparente hiperventilação. Os membros

anteriores movem-se normalmente, levando a um deslocamento por arraste do corpo.

Este quadro dura de 2 a 4 minutos quando sobrevém uma aparente recuperação dos

movimentos mas nova crise tem lugar após 2 a 4 minutos, com a reinstalação dos

sintomas descritos. A intoxicação segue se aprofundando com crises mais freqüentes

até que em uma parada respiratória prolongada, o animal morre. A aplicação de doses

maiores de crotamina leva à morte mais rapidamente e não permite observar muitos

dos detalhes aqui descritos.

24

Fotografia 1 – Típica paralisia do trem posterior de camundongos causada pela injeção intraperitoneal de crotamina (300 µg/Kg)

α-Pompilidotoxina e β-Pompilidotoxina

Estas toxinas não eliciaram uma síndrome comportamental clara, mesmo

quando injetadas na dose de 600 µg/kg. O único comportamento apresentado pelos

animais foi uma corrida acompanhada de vocalização sugestiva de dor intensa,

imediatamente após a injeção das doses maiores. O comportamento cessou em

poucos segundos após a injeção e nenhum outro sinal de intoxicação foi observado. Os

animais sobreviveram por pelo menos 24 horas, quando, então, foram sacrificados.

µ-Conotoxina GIIIa

Os animais não conseguem sustentar o peso do corpo, nem sustentar a cabeça.

Apresentam intensa dificuldade respiratória, exoftalmia intensa e espasmos

25

respiratórios. A cauda permanece tensa e com movimentos em chicote contra o

substrato. O quadro evolui para morte em poucos minutos, com movimentos espásticos

de todos os membros, e possíveis espasmos inspiratórios.

BcIII

O comportamento de auto-limpeza repetitivo devido a cialorréia é o primeiro

sintoma a aparecer. Seguem-se reações hiper-reflexivas ao toque. O camundongo se

debate descoordenadamente quando tocado por um bastão de vidro em um dos

flancos. Após alguns minutos o animal posta-se com os membros anteriores estirados,

a cabeça elevada, abrindo e fechando a boca à semelhança de um cão latindo. A morte

sobrevém possivelmente por parada respiratória.

Tetrodotoxina

O animal se debate contra o substrato, tem fortes espasmos dos membros

posteriores (saltos), a cauda permanece tensa, chicoteando; poucos segundos após o

aparecimento dos sintomas, seus olhos tornam-se esbranquiçados. Apresenta

dificuldade respiratória, vindo a morrer em seguida.

Tx2-6

São observados os seguintes sintomas: ereção, salivação, tremor, piloereção e

morte. O quadro tem instalação lenta e pode levar mais de uma hora para o

aparecimento dos sintomas. A evolução é lenta e progressiva sendo a ereção peniana

um dos primeiros sintomas, seguido de cialorréia e piloereção. A cialorréia faz com que

o animal faça muita auto-limpeza e a ereção peniana pode ser parcial ou completa,

26

com exposição total da glande, o que impõe ao animal um caminhar alterado com

elevação do abdômen para evitar o contato do membro com o substrato. A morte

ocorre dentro de duas horas e raramente após este período. Só então a ereção

peniana cede. Os animais que sobrevivem à dose empregada não apresentam

seqüelas visíveis.

Sensibilidade de músculo rápido e lento à crotamina

Curva concentração versus resposta

A curva concentração versus resposta (Figura 3) mostra um padrão nitidamente

diferente entre o ELD e o Soleus. O primeiro apresenta acentuada diminuição da força

de contração com as primeiras doses de toxina, chegando a uma abolição completa

das contrações com 60 µM. Já o segundo mostra-se bastante resistente às primeiras

doses e suas contrações não são abolidas, mesmo com o dobro da concentração de

crotamina que paralisa o ELD, ou seja, 120 µM .

27

-6 -5 -4 -3 -2

0

50

100

ELDSoleus

Figura 3 - Curva concentração de crotamina versus resposta para os músculosELD e Soleus. A ação da crotamina na inibição das contrações muscularesevocadas eletricamente avaliada utilizando-se as seguintes concentrações datoxina ( µM): 0,001; 0,6; 2; 6,75; 20; 60 e 120.N= 9 para cada concentraçãotestada.

[Crotamina µM]

% d

a co

ntra

ção

inic

ial

Dose única

Logo após a administração da crotamina verificou-se um discreto aumento da

força de contração em ambos os músculos por poucos minutos (Figuras 4 e 5). Em

seguida observou-se uma diminuição na força das contrações tanto do ELD quanto do

Soleus que, decorridos 30 minutos da adição da toxina, decaiu 57% no primeiro e 14%

no último.

Verificou-se, nos controles do Soleus, uma perda espontânea da força de

contração durante o experimento de cerca de 30%, enquanto que o ELD não apresenta

perda. Portanto, os cálculos foram feitos descontando-se tal perda.

28

Fo

rça

da c

ontr

ação

4

3

2

40,2

Minutos

Forç

a da

con

traç

ão

8

6

4

2

0 33,231,430,028,2

41,4

Minutos

0 1

42,241,0

A

B

Figura 4 - Contrações estimuladas eletricamente do músculo Soleus. N=8. A - Condição controle. B - Ação da crotamina na concentração de 6,75 µM após período de estabilização.

29

Forç

a da

con

traç

ão

32,231,4 30,5

6

4

0

2

A

Minutos

Forç

a da

con

traç

ão B

Minutos

5

3

1

35,031,4 33,2

Figura 5 - Contrações estimuladas eletricamente do músculo ELD. N=8. A - Condição controle. B - Ação da crotamina na concentração de 6,75 µM após período de estabilização.

30

Liberação de acetilcolina por tecido nervoso in vitro

Dentre as toxinas testadas, apenas a Tx 2-6 modificou sensivelmente a liberação

de acetilcolina no corpo estriado de ratos (Figura 6). Sua ação aumentou a liberação de

acetilcolina na ordem de três vezes acima dos valores basais, atingindo um platô em

cerca de 9 minutos, após os quais o estímulo com potássio 20 mM teve um efeito

aditivo sobre a liberação. As toxinas BCIII e β-Pompilidotoxina, apesar de sua

conhecida ação nos canais de sódio, também foram inefetivas neste modelo de

liberação de acetilcolina.

Figura 6 - Liberação fracional de acetilcolinapor tecido nervosoestriatal estimulada por 20 mM de KCl na 5ª e 12ª . A concentração de 0,1 µM das seguintes toxinas Tx2-6, BcIII e β-Pompilidotoxina a partir da 8ª coleta. N=3 para todas as toxinas testadas

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Amostras

Libe

raçã

o fr

acio

nal (

%)

ControleTx 2-6 0,1 uMBCIII 0,1 uMPompilidotoxina 0,1 uM

31

A crotamina falhou em alterar a liberação desse neurotransmissor nas

concentrações de 1 e 5 µM, mesmo após 9 minutos de incubação (Figura 7).

Figura 7 - Liberação fracional de acetilcolina por tecido nervosoestriatal estimulada por 20 mM de KCl na 6ª e 12ª coletas. Acrotamina nas concentrações de 1µM e 5 µM foi adicionada apartir da 8ª coleta. N=3 para ambas as concentrações da toxina.

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Amostras

Libe

raçã

o fr

acio

nal (

%)

ControleCrotamina 1 uMCrotamina 5 uM

Eletrofisiologia

Patch Clamp em células Renais Embrionárias Humanas 293 (HEK)

Nos registros eletrofisiológicos de patch clamp as correntes de sódio dos canais

neuronais NaV1.1 (Figuras 8 e 9), NaV1.2 (Figuras 10 e 11), NaV1.3 (Figuras 12 e 13),

NaV1.6 (Figuras 20 e 21), muscular NaV1.4 (Figuras 14 e 15) e cardíaco NaV1.5

(Figuras 18 e 19) não foram alteradas pela crotamina. A perfusão intracelular de 3µM

da toxina no clone NaV1.4 por vinte minutos também não gerou mudanças na corrente,

32

nem no tempo de inativação (Figura 16). Tampouco se alteraram a ativação e a

inativação estacionárias dos clones NaV1.4 (Figura 17).

B A

Figura 8 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.1 N=3. A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um minuto de perfusão extracelular.

B A

Figura 9 - Registro eletrofisiológico de Inativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.1 N=3. A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um minuto de perfusão extracelular.

33

B A

B

Figura 10 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.2 N=3. A -Controle. B - Crotamina 1 µM após um minuto de perfusão extracelular.

B A


34


B A


35

B A

Figura 14 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.4 N=7. A - Controle. B - Crotamina 3 µM após oito minutos de perfusão extracelular.

B A

Figura 15 - Registro eletrofisiológico de Inativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.4 N=7. A -Controle. B - Crotamina 3 µM após oito minutos de perfusão extracelular.

36

B A

Figura 16 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.4 N=7. A - Controle. B - Crotamina 3 µM após vinte minutos de injeção intracelular.

controleaplicação de crotamina 3 µM extracelular por 8 minutos

controle aplicação de crotamina 3 µM extracelular por 8 minutos

Figura 17 - Curvas de Ativação e Inativação Estacionárias de células HEK expressando NaV1.4. Aplicação extracelular de crotamina a 3 µM por oito minutos a partir do início do experimento.

37

B A


B A


38

B A


B A

Figura 21 - Registro eletrofisiológico de Inativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.6 N=3. A - Controle. B - Crotamina 1 µM após um minuto de perfusão extrcelular.

39

Os experimentos com a toxina Tx2-6 registraram um claro aumento da corrente

de sódio aliado a um retardo na inativação dos canais nos clones NaV1.1(Figuras 22 e

23) e NaV1.4 (Figuras 24 e 25) com apenas um minuto de perfusão. Tais efeitos foram

mais pronunciados no clone NaV1.1.

B A

Figura 22 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.4 N=4. A - Controle. B - Tx2-6 1 µM após um minuto de aplicação extracelular.

B A

Figura 23 - Registro eletrofisiológico de Inativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.4 N=4. A - Controle. B - Tx2-6 1 µM após um minuto de perfusão extrcelular.

40

B A

Figura 24 - Registro eletrofisiológico de Ativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.1 N=4. A - Controle. B - Tx2-6 1 µM após um minuto de perfusão extrcelular.

B A

Figura 25 - Registro eletrofisiológico de Inativação Estacionária da corrente sódio em células HEK expressando NaV1.1 N=4. A - Controle. B - Tx2-6 1 µM após um minuto de perfusão extrcelular.

41

As toxinas foram empregadas em doses crescentes e os gráficos aqui

apresentados foram registrados com a maior concentração usada.

Patch Clamp em neurônios do gânglio da raiz dorsal em cultura primária

A crotamina não provocou mudanças na corrente de sódio em células de cultura

primária da raiz do gânglio dorsal (Figura 26). A ativação (Figura 27) e inativação

(Figura 28) estacionárias também não foram alteradas. N=3.

méd

ia I/

Imáx

crotamina

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Episódios

Figura 26 - Representação do valor da corrente/corrente máxima de sódio em células do gânglio da raiz dorsal. A crotamina 1 µM esteve presente do episódio 6 ao 15, conforme assinalado pela barra.

42

Legend

controlecrotamina

Ajuste controle

Ajuste crotamina

Vm (mV) -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 10 20 30

condutância relativa

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Figura 27 - Curvas de ativação estacionária de células do gânglio da raiz dorsal de ratos. Aplicação de crotamina na concentração de 1 µM.

Legend

controle

crotamina

Fitted controle

Fitted crotamina

Vm pré-pulso (mV)-160 -150 -140 -130 -120 -110 -100 -90 -80 -70 -60 -50 -40

0.2

0.4

0.6

0.8

1

cond

utân

cia

rela

tiva

Figura 28 - Curvas de inativação estacionária de células do gânglio da raiz dorsal de ratos. Aplicação de crotamina na concentração de 1 µM.

43

Discussão

Os resultados obtidos nos experimentos ora realizados com músculos isolados

demonstram que os músculos Soleus e ELD respondem de maneira diferente à

crotamina. Na curva concentração versus resposta a adição sucessiva de alíquotas da

crotamina ao banho permitiu o delineamento de curvas sigmóides típicas. Tendo em

vista que este tipo de experimento é demorado e a crotamina pode ter sua ação

modificada pela longa incubação, realizamos os testes com a administração de uma

única concentração de crotamina, escolhida com base nos efeitos observáveis nas

curvas sigmóides. Os resultados corresponderam em grande parte ao esperado,

descartando possíveis efeitos ligados à longa duração dos experimentos. Assim, esta

observação corrobora a hipótese inicial segundo a qual a crotamina bloquearia

inicialmente os músculos de contração rápida, levando ao quadro de paralisia dos

membros posteriores.

Por este raciocínio, os membros posteriores dos ratos são constituídos por

músculos que apresentam majoritariamente fibras de contração rápida, tais como o

ELD. A única exceção é o Soleus no qual 80% das fibras são de contração lenta (47)

(36). A maior susceptibilidade do ELD à crotamina observada seria, então, devida à

maior dependência dos canais de sódio apresentada por ele para contrair. Da mesma

forma, o Soleus necessita de menor amplitude de despolarização para contrair e a

crotamina não se mostra tão eficiente em bloquear sua contração. No entanto, como

passamos a discutir abaixo, as razões para estas diferenças são ainda desconhecidas.

Chang e Tseng (1978) (19) foram os primeiros a descrever a crotamina como

toxina que age em canais de sódio. Eles avaliaram o influxo de sódio radioativo em

44

preparações de diafragma isolado de camundongo e rato de ambos os sexos, pré-

tratados por 30 minutos com 10 µg/ml de crotamina a 37°C. Estes resultados revelaram

a presença de cinqüenta por cento ou mais de sódio marcado no músculo dos animais

controles, contra sessenta e sete por cento de sódio marcado nos grupos

experimentais. Os resultados mostraram que a quantidade de sódio no diafragma de

ratos foi discretamente aumentada pela presença da crotamina, mas não esclarecem

as questões intrínsecas relacionadas com este fenômeno.

Assumindo ainda como verdadeira a premissa de que a crotamina age em

canais de sódio, passamos a investigar se esta toxina apresenta alguma preferência

por canais musculares de modo a assim, explicar a síndrome crotamínica. No entanto,

os experimentos de fixação de voltagem em células, expressando clones de diferentes

tipos de subunidades α de canais de sódio, falharam redondamente em mostrar

qualquer efeito da crotamina sobre estes canais, como descrevemos abaixo.

Em experimentos eletrofisiológicos, empregando diafragmas isolados de

camundongos e ratos, Chang e col., 1983 (20) compararam a interação entre as ações

da crotamina, QTX e toxina II de anêmona. Para tanto, o tecido foi incubado com as

toxinas por mais de uma hora e, no caso da crotamina (0,2 µg/ml) especificamente,

foram requeridos 17 minutos de incubação para atingir cinqüenta por cento da

despolarização. Em nossos experimentos de fixação de voltagem, mesmo após 20

minutos da introdução da toxina (3µM), nenhuma alteração de corrente foi registrada.

Matavel e col., 1998 (28) observaram consideráveis aumentos na corrente de

sódio adquirida através de loose patch clamp em preparações de músculo

semitendíneo de rã. No entanto, a metodologia empregada na verificação da pureza da

45

toxina é questionável. Após os procedimentos cromatográficos, a pureza foi avaliada

por eletroforese, seguida de uma análise de aminoácidos e verificação por exclusão, ou

seja, ausência dos aminoácidos alanina, valina e treonina. Concluíram então, que não

havia contaminantes na preparação de crotamina. Tais perfis não excluem possíveis

contaminantes não protéicos ou outros peptídeos que não apresentem estes

aminoácidos. Há que se considerar ainda outra contradição, pois Chang e Tseng

(1978) (19) relataram que músculos esqueléticos de rãs não são sensíveis à crotamina.

As poucas publicações relacionadas com o mecanismo de ação da crotamina

(discutidas acima) apresentam apenas evidências indiretas da ligação desta toxina em

canais de sódio (19;20;28). Estes estudos baseiam-se no acúmulo de sódio no tecido

ou no aumento da corrente de sódio, mas, em nenhum momento os canais

propriamente ditos foram testados. A fim de elucidar esta questão, neste trabalho

realizamos experimentos eletrofisiológicos em células HEK, expressando as

subunidades α de canais de sódio cardíacos (NaV1.5), neuronais (NaV1.1, NaV1.2,

NaV1.3 e NaV1.6) e musculares (NaV1.4), nos quais foi possível uma medida direta da

atividade desta toxina. Surpreendentemente, não houve alteração da corrente nesses

canais. Para descartar a possibilidade de que a toxina testada estivesse degradada,

uma alíquota desta mesma amostra foi injetada em um camundongo e observou-se o

aparecimento da paralisia do trem posterior, o que confirmou sua atividade. Portanto,

ao contrário de toda a literatura pertinente ao assunto, evidenciou-se que ela não agiu

nas subunidades α dos canais de sódio testados. Ainda, como controle positivo, testou-

se uma toxina ativadora de canais de sódio do grupo III, a Tx2-6, em células com

NaV1.1 e NaV1.4. Desta feita ocorreu um aumento na corrente de sódio, bem como um

46

retardo na inativação dos canais, mais pronunciados nos clones neuronais que nos

musculares. Desta forma, não restam dúvidas sobre a integridade da toxina e a

validade do sistema para detecção de alterações na corrente de sódio. Curiosamente,

em experimentos eletrofisiológicos, Fletcher e col., 1996 (48) demonstraram uma

diminuição na corrente de sódio em cultura primária de células musculares humanas na

presença de 0,5 µM de crotamina extracelular. O grupo interpreta estes resultados

vislumbrando a possível necessidade de internalização da crotamina, mediada por uma

proteína que estaria ausente nas células da cultura estudada. Apenas com a

internalização seria possível obter-se o aumento da corrente de sódio observado em

outros estudos (20;28).

Apesar de Hong e Chang (1983) (21) considerarem improvável que a crotamina

penetrasse na célula, Kerkis e col., 2004 (25) demonstraram que ela penetra em

fibroblastos e linfoblastos humanos in vitro. Portanto, para verificar a possibilidade de a

crotamina alterar a corrente de sódio pelo lado interno da membrana, ela foi adicionada

à solução da pipeta nos estudos eletrofisiológicos, ficando em contato com o meio

intracelular de células HEK expressando canais de sódio musculares (NaV1.4). A

corrente foi registrada por 20 minutos, novamente sem alteração.

Considerando que as células HEK transfectadas como descrito expressam

apenas as subunidades α dos canais de sódio, testamos a crotamina em células do

gânglio da raiz dorsal em cultura primária cujos canais e toda a maquinaria celular

associada a eles está íntegra. Entretanto, ainda assim, não houve alteração da

corrente de sódio mensurada nessas células. Tendo em vista que algumas toxinas

47

apresentam seletividade entre canais, resta a possibilidade de que a ação da toxina

esteja ligada à subunidade β do canal de sódio muscular.

Nossos resultados de liberação de acetilcolina na presença de crotamina

contradizem os resultados obtidos por Camillo e col., 2001 (49). Utilizamos a mesma

metodologia descrita pelos autores e nem a concentração de 5 µM resultou em

alteração na cinética de liberação de acetilcolina pelo tecido estriatal. Tal discrepância

pode ser devida à presença de contaminantes na toxina utilizada nestes experimentos,

cuja pureza era de aproximadamente 80%. Para fins comparativos, testamos várias

toxinas ativas em canais de sódio neste mesmo modelo. A Tx2-6 (100 nM) levou a uma

liberação da ordem de três vezes acima dos valores basais, parecendo não alterar o

estímulo por KCl, enquanto que a β− pompilidotoxinas (0,1 µM), e a toxina de anêmona

BcIII (0,1µM.) nada fizeram. Diante dos conhecimentos atuais sobre a atuação dos

canais de sódio na despolarização da célula nervosa e o acoplamento deste processo

com a liberação de neurotransmissores, é difícil explicar os resultados obtidos. Muitos

estudos complementares seriam necessários para compreender a ação destas toxinas

neste modelo, mas esta tarefa foge muito da finalidade deste estudo.

Trabalhos recentes chamam atenção para a semelhança estrutural da crotamina

com as β-defensinas. Elas também são peptídeos catiônicos que apresentam três

pontes dissulfeto, no entanto possuem pouca homologia com a crotamina quanto à

seqüência de aminoácidos (25) (17) (16). Um estudo realizado por Lichtenstein e col.,

1988 (50) sugere que a citotoxicidade mediada pelas defensinas requer a ligação

destas moléculas a alvos extracelulares específicos, seguida por uma translocação ou

internalização deste complexo. Tal fato pode ser um indício da semelhança entre a

48

crotamina e as defensinas quanto ao mecanismo de ação. Outros estudos, utilizando

diferentes abordagens experimentais, serão necessários para esclarecer esta questão.

A ação mionecrótica da crotamina foi avaliada em um estudo realizado por

Cameron e Tu (1978) (9) no qual ela é comparada à miotoxina-α da serpente Crotalus

viridis viridis. Nesse estudo, ambas as toxinas foram injetadas por via intramuscular nos

membros posteriores de camundongos e amostras dos músculos foram analisadas em

microscopia óptica observando-se uma vacuolização qualitativamente similar.

Recentemente alguns autores demonstraram que a ação da miotoxina-α é intracelular,

atuando na homeostase do cálcio (11) (12) (13). Toyama e col., 2003 (51) testaram a

miotoxicidade das isoformas de crotamina, F22 e F32, em diafragma de camundongos

incubados com as toxinas. Ambas causaram padrões semelhantes de danos

morfológicos. Em vista desse panorama, no qual vemos que a crotamina causa danos

estruturais em fibras musculares, não age em canais de sódio e, frente às semelhanças

estruturais, poderia ser aventada a hipótese de que seu mecanismo de ação seja

semelhante ao da miotoxina-α, alterando a liberação ou mesmo a recaptação de cálcio

do retículo sarcoplasmático. De fato, Fletcher e col., 1996 (48) sugeriram que a

crotamina aumenta o cálcio intracelular pela via do receptor de rianodina em

preparações de retículo sarcoplasmático. Nessa mesma linha de raciocínio, há que se

pensar que se o alvo de uma toxina estiver localizado no interior da célula, as

respostas tendem a ser mais tardias, pois dependeriam de sua internalização e

posterior ligação ao receptor. Em vista disso, a demora na obtenção de despolarização

(19;20) sugere uma atuação intracelular, posto que toxinas de canais iônicos

localizados na membrana plasmática eliciam respostas geralmente imediatas. Neste

49

sentido, o aumento do cálcio citoplasmático, eventualmente causado pela crotamina,

poderia levar à ativação de enzimas que, por sua vez, alterariam os canais de sódio por

outros mecanismos.

A estrutura da crotamina vem sendo exaustivamente estudada desde a sua

purificação por Gonçalves e Polson (1947) (18). Seu peso molecular, localização das

pontes dissulfeto, fitas beta, dímeros e isoformas estão bem caracterizados. Entretanto,

trabalhos sobre farmacologia relacionados a esta toxina são relativamente raros; mais

escassos ainda aqueles tratando de sua ação em canais de sódio: são apenas três.

Todos os outros autores que se referem à crotamina como toxina de canais de sódio,

admitem que ela aja desta maneira baseados nestas poucas e antigas publicações (19-

21;28). Sua ação mionecrótica também foi pouco investigada (9), ao contrário da

miotoxina-α, para a qual existem mais trabalhos sobre mecanismo de ação e poucos

estudos sobre estrutura (11) (12) (14) (13).

Em nossos experimentos comportamentais, os efeitos observados após a

injeção das toxinas em camundongos foram bastante diversos. A tetrodotoxina e a µ-

conotoxina são toxinas do grupo I, bloqueadoras do canal de sódio (52); em

conseqüência, desencadearam quadros de intoxicação bastante semelhantes. Todas

as outras toxinas (BcIII, Tx2-6, α e β-Pompilidotoxina) são do grupo III, peptídeos que

prolongam o potencial de ação e a despolarização, retardando a inativação dos canais

de sódio. Isto posto, seria de se esperar que causassem síndromes comportamentais

semelhantes. Entretanto, não foi o que observamos. A Tx2-6 causou ereção peniana,

cialorréia, piloereção e morte; a BcIII, causou cialorréia e também hiper-reflexia e

estranhamente α e β Pompilidotoxina não causaram nenhuma intoxicação observável,

50

o que talvez indique uma ação espécie-específica. Como ponderado acima, a

explicação para estas diferenças tão grandes, foge ao escopo deste estudo.

Por fim, neste estudo observamos que muito há por ser feito em relação ao

estudo de toxinas ativas em canais de sódio e sobre as diversas funções destes.

Encontramos aqui um bom exemplo do papel fundamental das toxinas no estudo e

conhecimento da fisiologia da neurotransmissão e na função nervosa, com ênfase na

diversidade estrutural destes canais tanto intra quanto inter-específica.

51

Conclusões

Com base nos resultados obtidos neste estudo concluímos que:

1 - A paralisia seletiva dos membros posteriores pode, sim, ser atribuída a uma

sensibilidade maior dos músculos de contração rápida à crotamina, conforme proposto

em nossa hipótese de trabalho;

2 - A sensibilidade maior dos músculos rápidos à crotamina não está relacionada

à densidade de canais de sódio, como previsto em nossa hipótese, pois esta toxina não

tem ação em canais de sódio musculares ou neuronais, expressos em células

heterólogas ou em células neuronais em cultura primária;

3 - Tendo em vista que a crotamina pode penetrar a membrana celular, não se

pode descartar uma ação sobre sítios intracelulares ainda por descrever;

4 - O mecanismo de ação da crotamina permanece desconhecido, mas

observam-se claras semelhanças entre esta toxina e sua parente a miotoxina-α.

52

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PARALISIA DO TREM POSTERIOR CAUSADA POR CROTAMINA - O...

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