Participação dos neurônios noradrenérgicos da região A5 no ...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS ASSOCIAÇÃO AMPLA UFSCar/UNESP de Araraquara CAMILA LINHARES TAXINI PARTICIPAÇÃO DOS NEURÔNIOS NORADRENÉRGICOS DA REGIÃO A5 NO CONTROLE CARDIORRESPIRATÓRIO DURANTE A HIPERCAPNIA E HIPÓXIA EM RATOS Jaboticabal 2016

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Jlio de Mesquita Filho

PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FISIOLGICAS

ASSOCIAO AMPLA UFSCar/UNESP de Araraquara

CAMILA LINHARES TAXINI

PARTICIPAO DOS NEURNIOS NORADRENRGICOS DA REGIO A5 NO CONTROLE CARDIORRESPIRATRIO DURANTE A HIPERCAPNIA E HIPXIA

EM RATOS

Jaboticabal

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Jlio de Mesquita Filho

PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FISIOLGICAS

ASSOCIAO AMPLA UFSCar/UNESP de Araraquara

CAMILA LINHARES TAXINI

PARTICIPAO DOS NEURNIOS NORADRENRGICOS DA REGIO A5 NO

CONTROLE CARDIORRESPIRATRIO DURANTE A HIPERCAPNIA E HIPXIA

EM RATOS

Dissertao de Mestrado apresentada ao

Programa Interinstitucional de Ps

Graduao em Cincias Fisiolgicas com

associao ampla UFSCar/UNESP

Araraquara como parte dos requisitos para a

obteno do ttulo de Mestre em Cincia

Fisiolgicas.

Orientadora: Profa. Dra. Luciane Helena Gargaglioni Batalho

Co-Orientador: Prof. Dr. Thiago dos Santos

Moreira

Jaboticabal

2016

Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitria UFSCar Processamento Tcnico

com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Taxini, Camila Linhares

T235p Participao dos neurnios noradrenrgicos da regio

A5 no controle cardiorrespiratrio durante a

hipercapnia e hipxia em ratos / Camila Linhares

Taxini. -- So Carlos : UFSCar, 2016.

69 p.

Dissertao (Mestrado) -- Universidade Federal de

So Carlos, 2012.

1. Hipxia. 2. Hipercapnia. 3. Sistema nervoso

autnomo. 4. Neurnios noradrenrgicos. 5.

Quimiorrecepo. I. Ttulo.

DEDICATRIA

minha famlia e amigos que fizeram parte dessa etapa, me servindo de exemplo, me

ajudando nos momentos difceis e compartilhando felicidades, demonstrando todo

amor e afeto.

AGRADECIMENTOS

Hoje eu sei que a aprendizagem e a fora de vontade so essenciais, aprendi que o

esforo vale a pena sempre. Nada na vida conquistamos sozinhos, sempre precisamos de

outras pessoas para alcanar os nossos objetivos.

Este espao dedico queles que deram a sua contribuio para que este trabalho fosse

realizado. A todos deixo aqui o meu agradecimento sincero.

Agradeo primeiramente Deus por me amparar nos momentos difceis, me dar fora

interior para superar as dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e me suprir em

todas as minhas necessidades. Por ter me dado serenidade para aceitar as coisas que no posso

mudar, coragem para mudar aquilo que sou capaz e sabedoria para ver a diferena.

minha orientadora Profa Dr

a Luciane Helena Gargaglioni pela oportunidade

oferecida. Obrigada por acreditar no meu potencial, por me mostrar o caminho da cincia,

pela orientao, incentivo, me encorajar nas horas difceis e me aplaudir nos momentos de

glria, por me atender em qualquer dia e em qualquer horrio, por ter me dado suporte

emocional quando mais precisei, pelo bom convvio tanto no ambiente de trabalho como fora

dele, e principalmente por ser exemplo de profissional e de mulher que sempre seguirei.

Ao Profo Dr

o Thiago dos Santos Moreira pela co-orientao excelente, pois quando

precisei sempre estava presente para ajudar, tirar dvidas, orientar e discutir o andamento do

trabalho enriquecendo meu conhecimento cientfico e pessoal, por ter me recebido em seu

laboratrio e pela pacincia para me ensinar o que nunca imaginei aprender, tambm pela boa

convivncia e disponibilidade.

Profa Dr

a Knia Cardoso Bcego por dividir o ambiente de trabalho, experincias,

conhecimentos, por ajudar sempre que foi preciso e pela amizade.

Profa Dr

a Ana Carolina Thomaz Takakura que muito me ajudou no desenvolver do

trabalho, me acolheu em seu ambiente de trabalho me ensinando, ajudando e orientando em

tudo o que foi preciso, por sempre estar disposta a tirar dvidas, a discutir os resultados e pela

boa companhia.

Aos meus pais, Carlos e Jara que no me deram apenas a vida, mas principalmente a

alegria de viver, minha educao, condies de estudo e me ensinaram a fazer tudo da melhor

forma possvel com dignidade, confiando em mim e apoiando para que conseguisse realizar

meus sonhos.

minha irm Carla pela amizade, companheirismo, cumplicidade, compreenso,

conselhos, alegrias, por sempre torcer pelo meu sucesso e me ajudar no que foi preciso.

equipe do laboratrio, que sem dvida alguma merecem o louvor desse trabalho tanto

quanto eu, pois no conseguiria sem eles, foram eles que estavam sempre do meu lado quando

acontecia algum imprevisto e precisava de ajuda, quem passou horas sentados do meu lado

para ajudar ou mesmo para fazer companhia, fosse durante a semana ou nos finais de semana,

foram quem me ouviam reclamar da dificuldade em trabalhar com metodologias novas, com a

dificuldade em conseguir terminar meus protocolos, mas sempre estavam me apoiando, me

dando esperana e oferecendo ajuda que muitas vezes no tinha como darem, mas estavam ali.

s meninas de casa por me acolherem, por me deixarem fazer parte de suas vidas e

principalmente por me ajudarem a escrever uma parte da minha, e essa fase foi a que eu mais

cresci, mais aprendi, mais lutei, mais chorei, mais ri, que eu vivi de verdade e sem vocs tudo

isso no seria a mesma coisa. Vocs so minha segunda famlia, me ensinaram lidar com

diferenas e igualdades, me aconselharam, me deram broncas e me ajudaram em tudo.

Aos amigos que conquistei em So Paulo, que fizeram do pouco tempo que passei com

eles inesquecveis e uma amizade que ficou para sempre. repblica do 112D, que aceitaram

a amiga da agregada por terem um bom corao e foi essa, entre outras, qualidades que

fizeram de vocs o que hoje posso chamar, sem dvida alguma, de amigas. Foi por pouco

tempo, mas foi intenso e verdadeiro, obrigada pelos bons momentos na cidade grande.

Ao Euclides por sempre manter a ordem e o bem estar dos nossos animais e do nosso

ambiente de trabalho, por me auxiliar quando precisei e por todo seu trabalho essencial para o

desenvolvimento dos demais.

Ao Jaci Airton Castania, pela pacincia em me auxiliar nos procedimentos cirrgicos e

pela ajuda, pois sem ele no seria capaz de finalizar parte do trabalho, por passar horas

operando e ressuscitado os animais e por no ter desistido.

Ao Prof. Dr. Hlio Cesar Salgado pela colaborao e pela disponibilidade em ajudar no

desenvolvimento desse trabalho.

Ao secretrio Alexandre Prata Vieira Chiva por sanar todas as dvidas e ajudar em

todos os processos buricrticos do programa de ps graduao.

Aos amigos do mestrado pela boa convivncia durante as disciplinas, as expectativas e

pensamento positivo para que esse trabalho desse certo, pelas estadias fora de casa,

companhia e amizade dentro e fora do mbito acadmico, posso dizer que nada por acaso e

no foi diferente com a gente.

todos meus amigos, de perto ou de mais longe, os mais antigos, os mais novos, que

me apoiaram, acreditaram em mim, por entenderem a minha ausncia, e fizeram dessa etapa

uma fase de crescimento pessoal e muito feliz.

Aos animais os quais no foram apenas material de estudo, mas contriburam para o

desenvolvimento da pesquisa.

Finalmente, ao suporte financeiro da FAPESP, CNPq e INCT-Fis. Comp. para que

esse trabalho fosse realizado.

A persistncia o caminho do xito. (Charles Chaplin)

RESUMO

O grupamento noradrenrgico A5 representa um importante conjunto de neurnios

localizado na ponte ventrolateral e recebe projees de vrias reas do bulbo relacionadas

com a regulao cardiorrespiratria. A regio A5 contribui para a maturao do sistema

respiratrio antes do nascimento e em ratos adultos esses neurnios esto conectados com a

rede neural responsvel pela ritmognese respiratria. Os neurnios da regio A5 apresentam

um importante envolvimento no controle autonmico, pois envia e recebe projees de vrias

regies envolvidas no controle cardiovascular, alm de enviar projees diretamente para a

coluna intermdio lateral. Assim, testamos a hiptese de que os neurnios noradrenrgicos da

regio A5 participam das respostas cardiorrespiratrias produzidas pela hipercapnia ou

hipxia, em ratos anestesiados e no anestesiados. Em animais no anestesiados, sem e com

desnervao sino-artica, a leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 com anti-

dopamina -hidroxilase-saporina (anti-DH-SAP; 4,2 ng) promoveu uma reduo do volume

corrente da resposta ventilatria hipercapnia (7% CO, 30 minutos) e hipxia aguda (7% O, 30 minutos), mas no alterou a resposta cardiovascular. Em animais anestesiados, durante a hipercapnia aguda (5% a 10% CO, 5 minutos), a microinjeo bilateral de muscimol (agonista GABA-A; 2 mM) e a leso qumica com anti-DH-SAP na regio A5

reduziram o aumento da presso arterial mdia (PAM), atividade simptica esplncnica

(sSNA), frequncia e amplitude do nervo frnico produzidas por hipercapnia. Durante a

hipxia aguda (8-10% O2, 30 segundos) a microinjeo bilateral de muscimol na regio A5

atenuou o aumento da PAM e da sSNA promovido pela hipxia, sem afetar a atividade do

nervo frnico, porm a leso qumica da regio A5 no alterou as respostas promovidas pela

hipxia. Os resultados do presente trabalho demonstram que a participao da regio A5 na

resposta cardiorrespiratria depende do estado do animal, anestesiado ou no, bem como os

nveis de CO2 e O2. Em animais no anestesiados, os neurnios noradrenrgicos da regio A5

exercem uma modulao excitatria no controle do volume corrente em resposta

hipercapnia e hipxia. Enquanto em animais anestesiados, essa regio estimula a resposta

cardiorrespiratria hipercapnia, aumentando a amplitude e frequncia do nervo frnico, e

atividade simptica.

Palavras-chave: Sistema noradrenrgico. Quimiorrecepo. Sistema nervoso autnomo.

ABSTRACT

The noradrenergic A5 group is an important group of neurons located in the

ventrolateral pons and receives projections from several medullar areas related to

cardiorespiratory regulation. The A5 region contributes to the maturation of the respiratory

system before birth and in adult rats these neurons are connected with the neural network

responsible for respiratory rhythmogenesis. The A5 neurons have an important involvement in

autonomic control, these neurons send and receive projections from various regions involved

in cardiovascular control, and send projections directly to the intermidial column lateral.

Thus, we tested the hypothesis that noradrenergic neurons of A5 region participate in

cardiorespiratory responses produced by hypercapnia or hypoxia in anesthetized and

ananesthetized rats. In ananesthetized animals without and sino-aortic denervation, the lesion

of the noradrenergic neurons in the A5 region with anti-dopamine -hydroxylase-saporin

(anti-DH-SAP, 4.2 ng) promoted a decrease of tidal volume response to acute hypercapnia

(7% CO, 30 minutes) and acute hypoxia (7% O, 30 minutes), but did not alter the

cardiovascular response. In anesthetized animals during the acute hypercapnia (5% to 10%

CO, 5 minutes), the bilateral microinjection of muscimol (GABA-A agonist; 2 mM) and the

chemical injury with anti-DH-SAP on the A5 region reduced the increase of mean arterial

pressure (MAP), splanchnic sympathetic activity (sSNA), frequency and amplitude of phrenic

nerve produced by hypercapnia. During acute hypoxia (8-10% O2, 30 seconds) the bilateral

microinjection of muscimol in the A5 region attenuated the increase in MAP and sSNA

promoted by hypoxia without affecting the activity of the phrenic nerve, but the chemical

injury of A5 region not altered responses promoted by hypoxia. The results of this study show

that the participation of the A5 region in cardiorespiratory response depends on the animal's

condition, anesthetized or not, as well as CO2 and O2 levels. In animals ananesthetized, the

noradrenergic neurons of A5 region exert an excitatory modulation in control of tidal volume

in response to hypercapnia and hypoxia. While in anesthetized animals, this region stimulates

the cardiorespiratory response to hypercapnia, increasing the amplitude and frequency of the

phrenic nerve, and sympathetic activity. Key words: Noradrenergic system. Chemoreception. Autonomic nervous system.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Fotomicrografia de seces coronais do tronco enceflico mostrando os corpos

celulares de neurnios noradrenrgicos na regio A5 marcados com tirosina hidroxilase em

ratos no anestesiados 32

Figura 2 Mdia do nmero dos neurnios noradrenrgicos na regio A5 imunorreativos

para tirosina hidroxilase 33 Figura 3 Variao da resposta hipercapnia (7% CO2) nas variveis respiratrias em

animais no anestesiados 35 Figura 4 Variao da resposta hipercapnia (7% CO2) nas variveis cardiovasculares em

animais no anestesiados 37 Figura 5 Variao da resposta hipxia (7% O2) nas variveis respiratrias em animais no

anestesiados 39 Figura 6 Variao da resposta hipxia (7% O2) nas variveis cardiovasculares em animais

no anestesiados 41

Figura 7 Locais de injeo na ponte ventrolateral em ratos anestesiados 42

Figura 8 Efeitos cardiorrespiratrios produzidos pela ativao de quimiorreceptores

centrais em ratos anestesiados aps a microinjeo de muscimol 44

Figura 9 Efeitos cardiorrespiratrios produzidos pela ativao de quimiorreceptores

perifricos em ratos anestesiados aps a microinjeo de muscimol 46

Figura 10 Identificao imuno-histoqumica de neurnios noradrenrgicos da regio A5 em

ratos anestesiados 48

Figura 11 Ao seletiva de anti dopamina beta hidroxilase em neurnios positivos para

tirosina hidroxilase 49

Figura 12 Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 no sistema

cardiorrespiratrio aps ativao dos quimiorreceptores centrais em ratos anestesiados 50

Figura 13 Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 no sistema

cardiorrespiratrio aps ativao dos quimiorreceptores perifricos em ratos anestesiados 52

LISTA DE TABELAS Tabela 1 Mdia dos valores do pH e da presso parcial de CO2, O2 no sangue arterial

durantea normxia (0% CO2) e durante a hipercapnia (7% CO2) em ratos no anestesiados 36

Tabela 2 Mdia dos valores da presso parcial de CO2, O2 e pH no sangue arterial durante a

normxia (21% O2) e durante a hipxia (7% O2) em ratos no anestesiados 40

SUMRIO DEDICATRIA ...................................................................................................................2

AGRADECIMENTOS .........................................................................................................3

RESUMO ...............................................................................................................................6

ABSTRACT ..........................................................................................................................7

LISTA DE FIGURAS ...........................................................................................................8

LISTA DE TABELAS ..........................................................................................................8

1 INTRODUO ...............................................................................................................13

1.1 Quimiorrecepo central e integrao cardiorrespiratria durante ativao dos

quimiorreceptores centrais ............................................................................................13

1.2 Quimiorrecepo perifrica e integrao cardiorrespiratria durante ativao

dos quimiorreceptores perifricos .................................................................................15

1.3 Regio noradrenrgica A5 .......................................................................................16 2 OBJETIVOS ....................................................................................................................19

2.1 Animais no anestesiados .........................................................................................19

2.2 Animais anestesiados ................................................................................................19

3 MATERIAIS E MTODOS ...........................................................................................20

3.1 Animais no anestesiados .........................................................................................20

3.1.1 Procedimentos cirrgicos, anestesia e aquisio de dados ......................................20

3.1.1.1 Leses qumicas da regio A5 ..........................................................................20

3.1.1.2 Implante de cnulas arteriais e sensores de temperatura ..................................21

3.1.1.3 Desnervao sino-artica ..................................................................................21

3.1.1.4 Medidas da temperatura corporal .....................................................................22

3.1.1.5 Registro da presso arterial e frequncia cardaca ............................................22

3.1.1.6 Determinao dos gases sanguneos e pH ........................................................22

3.1.1.7 Determinao da Ventilao .............................................................................23

3.1.1.8 Mistura gasosas.................................................................................................23

3.1.1.9 Avaliao da localizao e efetividade da leso ...............................................24

3.1.1.10 Anlise dos Dados ..........................................................................................24 3.2 Animais anestesiados ................................................................................................25

3.2.1 Procedimentos cirrgicos, anestesia e aquisio de dados ......................................25

3.2.1.1 Leses qumicas da regio A5 ..........................................................................25

3.2.1.2 Procedimentos cirrgicos e anestesia ...............................................................26

3.2.1.3 Microinjees cerebrais de agonista GABA-A na regio A5 ...........................27

3.2.1.4 Registro da presso arterial e da frequncia cardaca .......................................27

3.2.1.5 Medida da atividade do nervo frnico e do nervo esplncnico ........................28

3.2.1.6 Testes do quimiorreflexo central e perifrico ...................................................29

3.2.1.7 Histologia cerebral para confirmao dos pontos de injeo central ...............29 3.2.1.8 Imunohistoqumica ...........................................................................................29

3.2.2 Anlise dos resultados .............................................................................................31 4 RESULTADOS ................................................................................................................32

4.1 Animais no anestesiados .........................................................................................32

4.1.1 Imunohistoqumica ..................................................................................................32 4.1.2 Desnervao sino-rtica ..........................................................................................33

4.1.3 Efeito da leso na regio A5 utilizando a toxina saporina conjugada com anti-

dopamina -hidroxilase sobre a ventilao, gases sanguneos e presso arterial durante a

hipercapnia em ratos no anestesiados intactos ou com desnervao sino-artica. .........34

4.1.4 Efeito da leso na regio A5 utilizando a toxina saporina conjugada com anti- dopamina -hidroxilase sobre a ventilao, gases sanguneos e presso arterial durante a

hipxia em ratos no anestesiados com desnervao sino-artica ou intactos. ................38

4.2 Animais anestesiados ................................................................................................42

4.2.1 A anlise histolgica ................................................................................................42 4.2.2 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo

central aps injeo bilateral de muscimol na regio A5 .................................................43

4.2.3 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo

perifrico aps injeo bilateral de muscimol na regio A5 ............................................44

4.2.4 Leso seletiva de neurnios TH da regio A5 com anti-DH-SAP ........................47

4.2.5 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo

central aps a inibio bilateral da regio A5 com anti-DH-SAP ..................................49

4.2.6 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo

perifrico aps a inibio bilateral da regio A5 com anti-DH-SAP .............................51 5 DISCUSSO ....................................................................................................................53

5.1 Efeito da desnervao sino-artica em ratos no anestesiados sobre os parmetros cardiorrespiratrios ...................................................................................53

5.2 Participao da regio A5 no controle respiratrio ..............................................54

5.3 Participao da regio A5 no controle cardiovascular .........................................56

5.4 Participao da regio A5 no controle da atividade simptica ............................58

CONCLUSES ...................................................................................................................59

REFERNCIAS..................................................................................................................60

APENDICE .........................................................................................................................69

13

1 INTRODUO

O sistema respiratrio responsvel por manter constante as presses parciais arteriais

de CO2 (PaCO2) e O2 (PaO2) frente a qualquer variao na demanda de O2 e na produo de

CO2 (HALDANE; PRIESTLEY, 1905). Em relao s respostas as variaes de CO2, os

quimiorreceptores sensveis ao CO2/pH podem ser classificados como perifricos (localizados

bilateralmente na bifurcao das artrias cartidas e nos corpos articos) e centrais

(localizados no sistema nervoso central - SNC). Esses sensores centrais apresentam papel

predominante na resposta ventilatria ao CO2 comparado aos quimiorreceptores perifricos,

estudos indicam que os corpos carotdeos so responsveis por cerca de 30% da resposta

ventilatria hipercapnia sistmica (DEMPSEY; FORSTER, 1982; FORSTER et al., 2008;

PAN et al., 1998), sendo o restante realizado pelos quimiorreceptores centrais (FORSTER et

al., 2008; FORSTER; SMITH, 2010). Estudo de Smith e colaboradores (2010) demonstrou

que as informaes provenientes dos quimiorreceptores perifricos tm um pronunciado efeito

sinrgico e hiperaditivo na sensibilidade dos quimiorreceptores centrais, demonstrando que

esses sensores interagem entre si, dessa forma a resposta ventilatria hipercapnia depende

dos quimiorreceptores perifricos e centrais.

Em relao queda da presso parcial do O2, o organismo quando exposto hipxia

apresenta um aumento da ventilao pulmonar mediado pela ativao dos quimiorreceptores

perifricos. A informao dos quimiorreceptores perifricos ascende para o tronco enceflico

(principalmente ncleos respiratrios bulbares), onde ocorre integrao das aferncias com

neurnios de reas especficas do bulbo, essas regies fazem parte do processamento deste

sinal e da modulao da resposta (LI; NATTIE, 2006; TAKAKURA et al., 2006), resultando

em um aumento da ventilao (GONZALEZ et al., 1995).

1.1 Quimiorrecepo central e integrao cardiorrespiratria durante ativao dos

quimiorreceptores centrais

A PaCO2 do encfalo detectada via mudanas no pH (LOESCHCKE, 1982).

Entretanto, como e onde o pH detectado e, ainda, como a acidificao do SNC pode alterar

as variveis cardiorrespiratrias (quimiorreflexo central) ainda motivo de vrias

controvrsias. Atualmente existem duas teorias a respeito de como e quais grupamentos

neuronais estariam envolvidos no controle da quimiorrecepo central.

14

Uma primeira teoria, chamada de teoria quimiorreceptora especializada (GUYENET;

STORNETTA; BAYLISS, 2008; MULKEY et al., 2004). Essa teoria postula que, em

situaes in vivo, os neurnios responsveis pelo ritmo respiratrio no so sensveis ao pH,

mas recebem projees de um grupamento especializado de neurnios excitatrios, localizados

na superfcie ventral do bulbo em um ncleo denominado ncleo retrotrapezide, que seria

considerado o principal local onde estariam localizados as clulas sensveis ao CO2/pH

(MULKEY et al., 2004; TAKAKURA et al., 2006).

Por outro lado, uma segunda teoria postula que a quimiorrecepo central est

distribuda em todo SNC (NATTIE; LI, 2009). Muitos so os neurnios candidatos

envolvidos, dentre os quais podem se incluir os grupamentos monoaminrgicos (adrenrgicos

e serotonrgicos), neurnios localizados na superfcie ventral, nos ncleos do trato solitrio

(NTS), neurnios da medula espinhal e do cerebelo, e neurnios orexinrgicos localizados no

hipotlamo e do cerebelo (ABBOTT et al., 2009; BIANCARDI et al., 2008; DEAN;

LAWING; MILLHORN, 1989; DENG et al., 2007; JOHNSON; HAXHIU; RICHERSON,

2008; LI; NATTIE, 2006; MULKEY et al., 2004; RICHERSON, 2004; STORNETTA et al.,

2006; TAKAKURA et al., 2007). Nesse caso, a quimiorrecepo central seria resultado de um

efeito cumulativo do pH nesses neurnios, resultando em uma resposta final (KAWAI;

ONIMARU; HOMMA, 2006; LI; NATTIE, 2006).

Do incio dos anos 60 at o incio dos anos 80, estudos mostravam a superfcie ventral

do bulbo como principal regio quimiossensvel no SNC (KONIG; SELLER, 1991;

LOESCHCKE, 1982). As evidncias celulares mostrando a participao da superfcie ventral

do bulbo na quimiossemsibilidade caminharam de maneira lenta at o incio da dcada de 80.

Posteriormente experimentos in vitro mostraram que vrios neurnios da superfcie ventral do

bulbo respondiam s variaes no pH do meio, e tambm eram responsveis mediante sua

excitao ou inibio qumica (BALLANTYNE; SCHEID, 2001; BAYLISS et al., 2001;

FELDMAN; MITCHELL; NATTIE, 2003; KAWAI et al., 1996; KAWAI; ONIMARU;

HOMMA, 2006; RICHERSON, 2004), sendo uma importante evidncia da distribuio dos

quimiorreceptores no SNC.

O aumento da presso parcial de CO2 promovido pela hipercapnia ocasiona o aumento

da presso arterial, da atividade simptica eferente e da atividade ventilatria, mesmo aps a

remoo dos barorreceptores e dos quimiorreceptores perifricos, indicando que os

quimiorreceptores centrais podem ser os principais responsveis pelos efeitos do CO2 no

sistema cardiorrespiratrio (MILLHORN, 1986; MOREIRA et al., 2006; OIKAWA et al.,

2005)

15

Em gatos e ratos vagotomizados e com os barorreceptores desnervados, o aumento da

presso parcial de CO2 ativa o componente fsico da atividade simptica cervical e

esplncnica, o qual sincronizado com o aumento da atividade respiratria (MILLHORN,

1986; MOREIRA et al., 2006). Esses resultados sugerem que, a ativao dos

quimiorreceptores centrais aumenta a atividade simptica via neurnios que fazem parte da

rede respiratria bulbar ou de neurnios que esto em sincronia com a rede respiratria bulbar.

A interao dos neurnios que controlam a ventilao com os quimiorreceptores centrais

influenciando a atividade simptica e cardiovascular muito pouco documentada. Entretanto

essa ideia no pode ser descartada, pois durante a hipercapnia (5-10% CO2) ratos com inibio

da rede respiratria apresentam um aumento ainda maior na atividade simptica (MOREIRA

et al., 2006; OIKAWA et al., 2005), e adicionalmente sabe-se que a hipercapnia, 5-10 e 10%

CO2 promove um aumento da presso arterial de gatos e bezerros, respectivamente (BLOOM;

EDWARDS; HARDY, 1977; TENNEY, 1956).

1.2 Quimiorrecepo perifrica e integrao cardiorrespiratria durante ativao dos

quimiorreceptores perifricos

Por muitos anos, acreditava-se que as alteraes na ventilao associada hipxia e

hipercapnia eram efeitos da estimulao direta, dos at ento chamados centros respiratrios,

no encfalo. Esse ponto de vista foi modificado aps as descobertas da ao dos

quimiorreceptores carotdeos e articos responsveis pelo aumento da ventilao em resposta

demanda de uma presso parcial de O2 menor (HEYMANS; BOUCKAERT, 1930).

Atualmente sabe-se que a hipxia estimula os quimiorreceptores dos corpos carotdeo e

artico, e a transmisso dessas alteraes ao tronco enceflico feitas por neurnios

sensoriais primrios, cujos axnios esto no nervo do seio carotdeo (FINLEY; POLAK;

KATZ, 1992), gerando mudana na taxa de sntese ou liberao de neurotransmissores no

encfalo (GUNER et al., 2008) a fim de promover respostas compensatrias.

Os quiorreceptores carotdeos so essenciais para o aumento imediato da ventilao e

da presso arterial durante a hipoxemia induzida por hipxia aguda, e tambm tem uma

importante contribuio para compensao respiratria para distrbios agudos do equilbrio

cido-base. Os quimiorreceptores carotdeos medeiam toda ou a maior parte da resposta

ventilatria hipxia aguda, e isso tem sido demonstrado em vrias espcies animais j

estudados (DAMASCENO; TAKAKURA; MOREIRA, 2014; FRANCHINI; KRIEGER,

16

1993; GOURINE, 2005; NATTIE; LI, 2009; OREGAN; MAJCHERCZYK, 1982;

WENKER et al., 2013; ZHANG et al., 2012).

Os quimiorreceptores perifricos tambm participam das respostas ventilatrias

compensatrias hipercapnia, principalmente os do corpo carotdeos (WHIPP;

WASSERMAN, 1980). Pelo fato da troca de H+ e HCO3

- atravs da barreira

hematoenceflica ser mais lenta, os quimiorreceptores carotdeos respondem mais

prontamente aos distrbios agudos do equilbrio cido-base, em contrapartida, em condies

crnicas sua contribuio menos proeminente (OREGAN; MAJCHERCZYK, 1982).

No controle cardiovascular os quimiorreceptores perifricos tm pouca influncia em

condies normais, porm so importantes para ajustar a presso arterial e redistribuir o fluxo

sanguneo durante alteraes acido-base metablicas (OREGAN; MAJCHERCZYK, 1982).

Estudos mostram que hipoxemia hipxia exerce influncias nas vias autonmicas reflexas, no

corao e nos vasos sanguneos atenuando os ajustes cardiovasculares mediados pelos

quimiorreceptores perifricos (HEISTAD; ABBOUD, 1980).

A estimulao dos quimiorreceptores perifricos provoca um aumento na presso

arterial devido ao aumento da resistncia perifrica total, porm h uma vasodilatao na

circulao coronariana a qual depende parcialmente da ativao de fibras vagais colinrgicas

vasodilatadoras (HEISTAD; ABBOUD, 1980; VATNER; RUTHERFORD, 1981). Contudo, a

vasoconstrio perifrica, durante estimulao dos quimiorreceptores carotdeos, pode ser

diminuda ou revertida por efeitos decorrentes de uma hiperpnia (OREGAN; MAJCHERCZYK, 1982). Assim, a integridade dos quimiorreceptores perifricos e suas vias

reflexas so importantes para respostas hiperpneica e hipertensiva durante episdios agudos

de hipxia (HEYMANS, 1958). Em humanos, assim como em outros animais, foi observado

que aps alguns meses ou anos da remoo dos corpos carotdeos h uma recuperao parcial

das respostas ventilatrias hipxia devido ao aumento da sensibilidade dos corpos articos

inativos (SMITH; MILLS, 1980).

1.3 Regio noradrenrgica A5

Os grupamentos noradrenrgicas localizados na regio pontinea so classificados em

quatro grupos: A4, A5, A6 e A7. Esses grupamentos noradrenrgicos esto envolvidos em

vrias funes neurovegetativas como o sono, termorregulao, controle cardiovascular e

respiratrio (GUYENET, 1991). Dentre essas regies, a regio A5 recebe influncia de vrias

17

reas bulbares envolvidas no controle cardiorrespiratrio (GUYENET et al., 1993;

GUYENET; STORNETTA; BAYLISS, 2010).

O grupamento noradrenrgico da regio A5 est localizado na ponte ventrolateral

entre a raiz do nervo facial e o ncleo olivar caudal superior, neurnios noradrenrgicos dessa

regio enviam projees diretas para a medula espinhal e tambm para reas bulbares

envolvidas com o controle cardiorrespiratrio (BYRUM; GUYENET, 1987; JANSEN;

WESSENDORF; LOEWY, 1995; MAIOROV; MALPAS; HEAD, 2000). Marcao

retrgrada e antergrada da regio A5 mostrou que essa regio recebe projees hipotalmicas

como da rea perifornical e ncleo paraventricular, como tambm do Klliker-Fuse,

Parabraquial dorsal, ncleo do trato solitrio (NTS) caudal e intermedirio, e de formaes

reticulares bulbar ventral como A1 e B1. Suas projees estendem-se para o ncleo central da

amdala, rea perifornical do hipotlamo, substncia cinzenta periaquedutal (PAG),

parabraquial, ncleo NTS, ncleo paraventricular do tlamo, leito dos ncleos das estrias

terminais, reas hipotalmicas dorsais, formao reticular ventrolateral do bulbo e para a

coluna intermdio lateral.

Virtualmente todas as reas conectadas com a regio A5 esto envolvidas no controle

cardiovascular, alm de receber projees do maior centro regulatrio cardiovascular

(BYRUM; GUYENET, 1987). Vrias evidncias na literatura tm mostrado a participao da

regio A5 no controle das variveis cardiorrespiratrias. A regio A5 constitui a principal

fonte de excitao noradrenrgica (aproximadamente 40%) dos neurnios pr-ganglionares

simpticos da coluna intermdio-lateral da medula espinhal, formando juntamente com o RVL

os dois grandes grupamentos neuronais responsveis pelo controle da atividade simptica

eferente (BYRUM; STORNETTA; GUYENET, 1984; LOEWY et al., 1979, 1986; STRACK

et al., 1989).

A participao dos neurnios noradrenrgicas da regio A5 no controle cardiovascular

ainda controversa. Estudo envolvendo a estimulao eltrica da regio A5 em coelhos

anestesiados promove o aumento da presso arterial (WOODRUFF; BAISDEN;

WHITTINGTON, 1986), enquanto a estimulao qumica da regio A5 em ratos anestesiados

diminui a presso arterial (NEIL; LOEWY, 1982; STANEK et al., 1984). Os neurnios

noradrenrgicos da regio A5 aumentam sua atividade mediante a ativao de reflexos

cardiovasculares como a ativao do quimiorreflexo perifrico, ou diminuem sua atividade

atravs da ativao do barorreflexo (ANDRADE; AGHAJANIAN, 1982; ERICKSON;

MILLHORN, 1994; GUYENET, 1984; GUYENET et al., 1993; HIROOKA et al., 1997;

HUANGFU; KOSHIYA; GUYENET, 1991).

18

A regio A5 tambm importante para a maturao do sistema respiratrio antes do

nascimento (HILAIRE et al., 2004), a integridade de regies noradrenrgicas pontineas

necessria para a maturao adequada do sistema respiratrio (VIEMARI et al., 2005), visto

que animais knock-out para o gene Ret (gene que codifica o receptor transmembrana de

tirosina hidroxilase) no so capazes de apresentar atividade rtmica do nervo frnico, in vitro. Estudos do final da dcada de 80 mostraram que aps a inibio do grupamento A5, em

neonatos, os neurnios responsveis pelo controle do ritmo respiratrio foram deprimidos

mediante um mecanismo dependente de receptores 2 adrenrgicos, alm do mais a ativao

desse mecanismo promoveu uma diminuio da frequncia respiratria (ERRCHIDI;

HILAIRE; MONTEAU, 2009; HERBERT; MOGA; SAPER, 1990; HILAIRE; MONTEAU;

ERRCHIDI, 1989). Adicionalmente, estudos in vitro e em ratos anestesiados mostram que a

regio A5 parece estar envolvida no controle do ritmo respiratrio, alm de se conectar,

reciprocamente, com o NTS e a regio ventrolateral do bulbo (RVL), regies envolvidas com

o controle da ventilao (HILAIRE; MONTEAU; ERRCHIDI, 1989; HERBERT; MOGA;

SAPER, 1990; HILAIRE et al., 2004; HUANGFU; GUYENET, 1997a, 1997b).

Os neurnios noradrenrgicos da regio A5 parecem estar envolvidos, no apenas em

condies basais, mas tambm na modulao da resposta s alteraes da PaCO2 e PaO2. A

hipercapnia aumenta a expresso da protena Fos nas clulas noradrenrgicas da regio A5,

indicando a ativao dessas clulas (HAXHIU et al., 1996; TEPPEMA et al., 1997). Leses

qumicas dos neurnios catecolaminrgicos do tronco enceflico atenuou a resposta

hipercapnia durante o sono e a viglia, sugerindo que os neurnios noradrenrgicos do tronco

enceflico participam da quimiorrecepo central, onde 78% dos neurnios noradrenrgicos

da regio A5 foram lesados (LI; NATTIE, 2006). Portanto, h evidncias de que os neurnios

noradrenrgicos da regio A5 podem contribuir nas alteraes cardiorrespiratrias

promovidas em uma situao de hipercapnia.

Segundo Guyenet e colaboradores (1993), os neurnios da regio A5 so responsivos

tambm hipxia. Os autores demonstraram que a seco do nervo do seio carotdeo diminui,

mas no elimina, a atividade dos neurnios A5 dando maior suporte hiptese de que esses

neurnios podem ser inerentemente sensveis hipxia. A utilizao da protena Fos como

indicador de ativao neuronal tambm sugere que os neurnios dessa regio so ativados em

resposta hipxia (ERICKSON; MILLHORN, 1994).

Desta forma, diante do que foi discutido, torna-se importante tambm averiguar e

estudar os mecanismos cardiovasculares e respiratrios promovidos pela hipercapnia e

hipxia aps leses seletivas dos neurnios noradrenrgicos do grupamento A5.

19

2 OBJETIVOS

Em vista das evidncias expostas, o presente estudo foi realizado em animais no

anestesiados e anestesiados e teve como principais objetivos:

2.1 Animais no anestesiados

2.1.1 Avaliar os parmetros cardiorrespiratrios basais; 2.1.2 Averiguar a participao dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 nas

respostas cardiorrespiratrias induzidas por hipercapnia, por meio de leso seletiva dos

neurnios noradrenrgicos com a toxina saporina conjugada com anti-dopamina -

hidroxilase (anti-DH-SAP);

2.1.3 Investigar a influncia dos quimiorreceptores perifricos na resposta

cardiorrespiratria induzidas por hipercapnia aps a leso seletiva dos neurnios

noradrenrgicos da regio A5 com a toxina anti-DH-SAP;

2.1.4 Avaliar a participao dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 nas respostas

cardiorrespiratrias induzidas por hipxia, por meio de leso seletiva dos neurnios

noradrenrgicos com a toxina saporina conjugada com anti-DH-SAP;

2.1.5 Investigar a influncia dos quimiorreceptores perifricos na resposta

cardiorrespiratria induzidas por hipxia aps a leso seletiva dos neurnios

noradrenrgicos da regio A5 com a toxina anti-DH-SAP.

2.2 Animais anestesiados

2.2.1 Investigar o efeito da microinjeo bilateral de muscimol na regio A5 sobre a

presso arterial mdia (PAM), atividade simptica esplncnica (sSNA); frequncia e

amplitudedo nervo frnico durante a hipercapnia;

2.2.2 Investigar o efeito da microinjeo bilateral de muscimol na regio A5 sobre a

PAM, sSNA, frequncia e amplitude do nervo frnico durante a hipxia;

2.2.3 Avaliar a participao dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 sobre a PAM,

sSNA, frequncia e amplitude do nervo frnico durante a hipercapnia, por meio de leso

seletiva dos neurnios noradrenrgicos com a toxina saporina conjugada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP);

2.2.4 Avaliar a participao dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 sobre a PAM,

sSNA, frequncia e amplitude do nervo frnico durante a hipxia, por meio de leso seletiva

dos neurnios noradrenrgicos com a toxina saporina conjugada com anti-dopamina -

hidroxilase (DH-SAP).

20

3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Animais no anestesiados

No total foram utilizados 70 ratos Wistar, adultos, com peso variando entre 290 e 360

gramas, procedentes do biotrio Central da UNESP de Botucatu. Aproximadamente 24%dos

animais tiveram a localizao correta da leso e sobreviveram at o final do experimento,

desta forma foram includos na anlise. Os animais receberam gua e rao ad libitum e foram

mantidos em cmara ventilada (ALESCO, Monte Mor, SP) com temperatura e umidade

controladas. O ciclo claro-escuro do biotrio foi mantido com 12 horas cada. Os protocolos

experimentais esto de acordo com os Princpios ticos de Experimentao Animal adotado

pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA) e foram aprovados pela

Comisso de tica em Experimentao Animal (CEEA) da FCA-UNESP em 10 de maro de

2010 (Protocolo n 004449/10).

3.1.1 Procedimentos cirrgicos, anestesia e aquisio de dados

3.1.1.1 Leses qumicas da regio A5

Em todos procedimentos cirrgicos foram utilizados mtodos asspticos para evitar os

riscos de infeces. Os animais foram, inicialmente, anestesiados intraperitonealmente (i.p)

com quetamina (80 mg/kg) e xilazina (7 mg/kg) e adaptados a um aparelho estereotxico Kopf

(Kopf Instruments, Kent, Inglaterra). Aps uma inciso longitudinal na pele e no tecido

subcutneo para a exposio da calota craniana, o lambda e o bregma foram utilizados como

referncia para nivelar as cabeas dos animais, bem como para localizao da regio A5, os

parmetros estereotaxicos foram de acordo com o atlas de Paxinos e Watson (PAXINOS;

WATSON, 1998). As injees foram realizadas 10,0 mm caudal ao bregma, 2,3 mm lateral a

linha mdia e 9,9 mm abaixo da superfcie do osso craniano. As injees bilaterais (volume de

100 nL) de saporina conjugada anti dopamina -hidroxilase (anti-DH-SAP, 4,2 ng -

Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) ou IgG-Saporina (controle - Advanced

Targeting Systems, San Diego, CA) (MADDEN; SVED, 2003; SCHREIHOFER; GUYENET,

2000) na regio A5 foram realizadas utilizando-se pipetas de vidro (dimetro interno 25-40

21

m, Sutter Instrument Co, CA) acopladas a uma seringa Hamilton (5 L). A microinjeo foi

feita utilizando-se uma bomba de microinjeo (modelo 310, Stoelting Co. Il, EUA) ao longo

de 2 minutos para minimizar a difuso da droga. Aps as injees da toxina, as cabeas dos

animais foram suturadas, os animais receberam uma dose profiltica subcutnea (sc) de

enrofloxacina (10mg/kg, Schering-Plough) e de flunixina meglumina (2,5mg/kg, Schering-

Plough). Aps a recuperao os animais foram acomodados e mantidos por 1 semana em

cmara ventilada (ALESCO, Monte Mor, SP) com temperatura e umidade controladas, com

ciclo claro-escuro do biotrio mantido em 12 horas cada. Os animais receberam gua e rao

ad libitum.

3.1.1.2 Implante de cnulas arteriais e sensores de temperatura

Um dia antes dos experimentos, para evitar infeces, os ratos foram anestesiados com

quetamina (80 mg/kg, i.p) e xilasina (7 mg/kg, i.p), e ento um transmissor de telemetria foi

implantado na cavidade abdominal e o cateter foi inserido na artria femoral direita para

aquisio da presso arterial pulstil e frequncia cardaca da aorta abdominal (MLE1022

Telemetry SNA and Pressure Transmitter (TR46SP), ADInstruments, Austrlia). Em alguns

animais, para coletar amostras sanguneas utilizadas na anlise de gases sanguneos, a

canulao da aorta abdominal foi feita inserindo um tubo de polietileno na artria femoral

direita (PE-10 conectado a um PE-50 - Clay Adams, Parsippany, NJ), o cateter foi

transpassado subcutaneamente e sua extremidade livre foi exteriorizada e fixada na rea inter-

escapular, dessa forma o animal estava consciente e livre para movimentar-se no interior da

cmara de pletismografia no dia seguinte. No mesmo dia, um sensor e registrador de

temperatura integrado (data-loggers - SubCue, Calgary, AT, CA) foi implantado na

cavidade abdominal.

3.1.1.3 Desnervao sino-artica

No dia anterior ao experimento, juntamente com a canulao da aorta abdominal

descrita anteriormente, um grupo de animais tiveram os barorreceptores articos e carotdeos

desnervados. Atravs de uma inciso mediana na regio cervical anterior do rato, os msculos

pr-traqueais, esterno-hiideo e esternocleidomastideo foram afastados e a bifurcao da

cartida foi visualizada. O nervo larngeo superior e o tronco simptico cervical foram

22

isolados da artria cartida comum e seccionados, ento o nervo carotdeo juntamente com o

corpsculo carotdeo foram removidos (KRIEGER, 1964). A desnervao sino-artica foi

realizada bilateralmente e sua eficcia foi avaliada aps os experimentos pela ausncia de

bradicardia em reposta administrao intravenosa (i.v.) de fenilefrina (5 g/kg).

3.1.1.4 Medidas da temperatura corporal

Um sensor e registrador de temperatura integrado (dataloggers - SubCue, Calgary, AT,

CA) foi conectado, via conexo ptica, a um computador para a programao da coleta de

dados ao longo do experimento com leituras de temperatura a cada 5 min, utilizando o

programa SubCue temperature data logger software. Os dados de temperatura foram

utilizados para o clculo do volume corrente.

3.1.1.5 Registro da presso arterial e frequncia cardaca

Os sinais fisiolgicos das variveis cardiovasculares foram transmitidos via wireless do

transmissor de telemetria para um receptor (MLE1162 SNA and Pressure Master Receiver

Controller (TR162), ADInstruments, Austrlia) que converte o sinal analgico em digital para

o sistema de aquisio de dados (Power Lab 16/30, ADIinstruments, Austrlia). O software

utilizado foi LabChart que acompanha o sistema da ADIntruments.

3.1.1.6 Determinao dos gases sanguneos e pH

Amostras de sangue arterial foram obtidas de ratos durante normocapnia, hipercapnia e

hipxia nos grupos de animais controle (IgG-Saporina) e no grupo dos animais com leso

seletiva (anti-DH-SAP), sem desnervao. Para tal, duas gotas de sangue foram colhidos em

um cartucho (EG7+) para anlise imediata do pH arterial (pHa), presso parcial de dixido de

carbono (PaCO2) e presso parcial de oxignio arterial (PaO2) atravs do analisador porttil de

gases sanguneos i-STAT (i-STAT Analyzer, Abbott Laboratories, EUA, NY).

23

3.1.1.7 Determinao da Ventilao

A ventilao foi medida por pletismografia de corpo inteiro em sistema fechado

(BARTLETT; TENNEY, 1970). Durante a realizao de cada medida de ventilao, o fluxo

de ar foi interrompido e a cmara do animal permaneceu totalmente vedada por curtos

perodos de tempo (~2 min). As oscilaes da temperatura do ar da cmara causadas pela

respirao foram medidas como oscilaes de presso, pelo fato do volume de ar corrente

inspirado ser aquecido da temperatura da cmara Tc e saturado com vapor de gua,

enquanto que o volume de ar corrente expirado ser novamente esfriado at a temperatura da

cmara. Sinais de um transdutor de presso, conectado cmara do animal e a uma cmara de

referncia so coletados por um espirmetro e enviados para o sistema de aquisio de dados

(Power Lab 16/30, ADIinstruments, Austrlia). O software utilizado foi LabChart. A

calibrao do volume foi obtida durante cada experimento, injetando um volume conhecido

de ar dentro da cmara do animal (1mL) com o uso de uma seringa graduada. Duas variveis

respiratrias sero medidas, a freqncia respiratria (fR) e o volume corrente (VT), o ltimo

calculado atravs da frmula: VT=PT/PK x VK x TA/Tamb x (PB-PA)/PB-TA/TC (PB-PC) VK: volume de ar injetado na cmara do animal para calibrao;

PT: deflexo de presso associada com cada volume de ar corrente; PK: deflexo de presso associada com cada volume de ar injetado para

calibrao, TC: temperatura corporal; Tamb: temperatura ambiente;

TA: temperatura do ar dentro da cmara;

PB: presso baromtrica; PC: presso de vapor dgua temperatura corporal;

PA: presso de vapor dgua temperatura da cmara.

A ventilao foi medida pelo produto de fR por VT. A ventilao e o VT foram

apresentados nas condies de presso baromtrica ambiente, Tc e saturados com vapor

dgua (BTPS).

3.1.1.8 Mistura gasosas

Na hipercapnia, os animais foram submetidos a uma mistura gasosa de 7% CO2,

balanceada com 21% O2 e N2 (White Martins, Jaboticabal, SP) durante 30 minutos. Os

24

parmetros cardiorrespiratrios foram analisados aos 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos aps o

incio da hipercapnia.

J para a hipxia, a mistura gasosa utilizada foi de 7% O2 balanceada N2 (White Martins,

Jaboticabal, SP), o protocolo foi o mesmo utilizado na hipercapnia.

3.1.1.9 Avaliao da localizao e efetividade da leso

Ao final dos experimentos, os animais foram anestesiados profundamente e perfundidos

atravs do corao (corte no trio direito) com tampo fosfato (PBS, 0,1 M com pH de 7,4),

seguido por paraformaldedo 4 % em PB. Os encfalos foram removidos da caixa craniana,

armazenados no mesmo fixador 4 C por 4 horas e posteriormente mantidos em soluo de

sacarose 30% dissolvida em tampo fosfato 0,1 M com pH 7,4 4 C por 48 horas. O tecido

ento foi submerso em 2-metilbutano (Sigma) congelado no gelo seco (1 min, -30C),

posteriormente o tecido foi embebido em Tissue Tek O.C.T., e ento cortado no criostato

(Leica CM 1850) 30m. Para verificar a localizao e a efetividade da leso foi utilizada

imunorreatividade para tirosina hidroxilase (TH), que um marcador de neurnios

catecolaminrgicos (XU et al., 2003) atravs do mtodo de imunohistoquimica free floating (KANG et al., 2007). Para este fim, os cortes foram incubados por 48 horas com anticorpo

policlonal de rato anti-TH (1:10000, Sigma Chemical CO. St. Luis, MO, EUA), passando a

seguir por 1 hora de incubao com anticorpo secundrio biotinilado de coelho (1:1000,

Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). O anticorpo biotinilado foi complexado com

avidina DH: peroxidase biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), e o

complexo foi revelado pela adio de cromognio di-hidrocloreto de diaminobenzidina (DAB)

para visualizar a marcao dos neurnios catecolaminrgicos.

3.1.1.10 Anlise dos Dados

Os valores so expressos como mdia erro padro da mdia. Alteraes na ventilao,

presso arterial e frequncia cardaca, gases sanguneos, temperatura, consumo de O2 e

produo de CO2 foram avaliadas por anlise de varincia (ANOVA) para medidas repetidas

seguida pelo teste de mltiplas comparaes de Tukey-Kramer. Valores de P

25

3.2 Animais anestesiados

Os experimentos com animais anestesiados foram realizados em 30 ratos Wistar (250-

280 g) proveninetes do biotrio da USP de So Paulo. Os animais receberam gua e rao ad

libitum e foram mantidos com temperatura e umidade controladas. O ciclo claro-escuro do

biotrio foi mantido com 12 horas cada. Os protocolos experimentais esto de acordo com os

Princpios ticos de Experimentao Animal adotado pelo Colgio Brasileiro de

Experimentao Animal (COBEA) e foram aprovados pela Comisso de tica em

Experimentao Animal do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo.

3.2.1 Procedimentos cirrgicos, anestesia e aquisio de dados

3.2.1.1 Leses qumicas da regio A5

Em todos procedimentos cirrgicos foram utilizados mtodos asspticos para evitar os

riscos de infeces. Os animais foram, inicialmente, anestesiados intraperitonealmente (i.p)

com quetamina (80 mg/kg, i.p) e xilasina (7 mg/kg, i.p) e adaptados a um aparelho

estereotxico Kopf (Modelo 1760). Aps uma inciso longitudinal na pele e no tecido

subcutneo, a calota craniana foi exposta e o lambda e o bregma foram utilizados como

referncia para nivelar a cabea do animal, bem como para a localizao da regio A5,

utilizando os parmetros estereotaxicos presentes no atlas de Paxinos e Watson (PAXINOS;

WATSON, 1998). Os animais tambm receberam uma inciso superficial na pele, na regio

da mandbula, para insero de um eletrodo de estimulao bipolar no ramo mandibular do

nervo facial (ANSELMO-FRANCI et al., 1998; TAKAKURA et al., 2006). As injees

bilaterais (volume de 100 nl) de saporina conjugada com anti dopamina -hidroxilase (anti-

DH-SAP, 4,2ng - Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) ou IgG-Saporina (controle -

Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) (MADDEN; SVED, 2003; SCHREIHOFER;

GUYENET, 2000) na regio A5 foram realizadas sob presso com nitrognio, utilizando-se

pipetas de vidro (dimetro interno 25-40 m, Sutter Instrument Co, CA) acopladas ao

aparelho PicoSpritzer II (General Valve Corporation, NJ). As pipetas de vidro permitiram o

registro do potencial antidrmico do ncleo facial, facilitando as injees corretas na regio

A5. Aps as injees da toxina, as cabeas dos animais foram suturadas, os animais

26

receberam uma profiltica dose subcutnea (sc) de enrofloxacina (10mg/kg, Schering-Plough)

e de flunixina meglumina (2,5mg/kg, Schering-Plough). Aps a recuperao os animais foram

acomodados e mantidos por 1 semana em salas com temperatura, umidade e luminosidade

controladas, com ciclo claro-escuro do biotrio mantido em 12 horas cada. Os animais

receberam gua e rao ad libitum.

3.2.1.2 Procedimentos cirrgicos e anestesia

Uma semana aps a injeo bilateral da toxina saporina conjugada com anti dopamina

-hidroxilase (anti-DH-SAP) ou do controle (IgG-SAP) na regio A5, os animais foram

anestesiados com a mistura de 5% halotano em 100% de oxignio. Os animais foram

inicialmente traqueostomizados e colocados em ventilao artificial com 1,4 - 1,5% de

halotano em 100% de oxignio para continuao dos procedimentos cirrgicos. Em todos

experimentos foram realizados os seguintes procedimentos cirrgicos:

A) Canulao da artria femoral para registro de presso arterial (PAM) e

frequncia cardaca (FC);

B) Canulao da veia femoral para administrao de drogas;

C) Acomodao do animal no aparelho estereotxico para localizao e exposio

do nervo frnico e do nervo esplncnico, via posio dorsolateral

(MOREIRA et al., 2006, 2007; TAKAKURA et al., 2006, 2007, 2008);

D) Vagotomizao bilateral de todos os animais, a fim de prevenir uma influncia

da ventilao na atividade do nervo frnico.

Alguns animais (n = 17) sofreram desnervao bilateral dos baro e quimiorreceptores,

o nervo larngeo superior e o tronco simptico cervical foram isolados da artria cartida

comum e seccionados, ento o nervo carotdeo juntamente com o corpsculo carotdeo foram

removidos (KRIEGER, 1964), a fim de se estudar apenas os efeitos da estimulao dos

quimiorreceptores centrais, ao final dos experimentos a efetividade da desnervao foi testada

atravs da administrao intravenosa (i.v) de fenilefrina (5 g/kg).

Aps a finalizao dos procedimentos cirrgicos, o anestsico halotano foi substitudo

pelo anestsico endovenoso uretano (1,2 g/kg).

Todos os animais foram ventilados com 100% de oxignio durante todo o perodo

experimental, sendo registrado

27

37C, utilizando-se um colcho com resistncia interna para aquecimento. O ndice de CO2-

expirado foi monitorado durante todo o experimento por meio de um capnmetro (Columbus

Instruments, Ohio, USA). O nvel da anestesia foi constantemente monitorado testando-se a

ausncia de efeitos no reflexo de retirada, ausncia de mudanas na presso arterial e na

atividade do nervo frnico aps o pinamento da pata do animal. Satisfeitos esses critrios, o

relaxante muscular (pancurnio) foi administrado endovenosamente com uma dose inicial de

1 mg/kg.

3.2.1.3 Microinjees cerebrais de agonista GABA-A na regio A5

A soluo de Muscimol (agonista GABA-A, 2 mM; Sigma, USA) continha 5% de

microesferas de ltex fluorescentes diludas, para averiguar o sitio de microinjeo aps o

experimento (Lumafluor, New City, NY, USA) (MOREIRA et al., 2007). As microinjees

na regio A5 foram realizadas sob presso com nitrognio, utilizando-se pipetas de vidro

(dimetro interno 25-30 m, Sutter Instrument Co, CA) acopladas ao aparelho PicoSpritzer III

(General Valve Corporation, NJ). O volume das injees foi de 50 nL em cada lado (injees

bilaterais para a regio A5). As coordenadas utilizadas para atingir a regio A5 foram

baseadas no potencial antidrmico do ncleo facial. As injees foram realizadas 200 m

rostral a poro anterior do ncleo facial, 2,0 mm lateral a linha mdia e 250 m ventral ao

limite ventral do potencial antidrmico do ncleo facial (KOSHIYA; GUYENET, 1994). Os

registros eletrofisiolgicos foram realizados em um lado e a segunda injeo foi realizada

simetricamente do outro lado baseado nas coordenadas estereotxicas da primeira injeo.

3.2.1.4 Registro da presso arterial e da frequncia cardaca

Para o registro das variveis cardiovasculares, os animais foram submetidos

canulao da artria femoral direita com tubo de polietileno (PE-10 conectado a um PE-50)

para aquisio da presso arterial pulstil, presso arterial mdia e frequncia cardaca da

aorta abdominal. A cnula da artria femoral foi conectada a um transdutor de presso

(Physiological Pressure Transducer mod. MLT844, ADInstruments) acoplado a um pr-

amplificador (Bridge Bio Amplifier mod. ML221, ADInstruments) e ao sistema de registro

computadorizado Cambridge Electronic Design (CED-1401) de 4 canais. Foram registradas,

simultaneamente, a presso arterial pulstil (PAP), PAM e FC. Os animais tambm tiveram a

28

veia femoral canulada com tubo de polietileno (PE-10 conectado a um PE-50) para a infuso

de drogas sistmicas (TAKAKURA et al., 2006, 2011).

3.2.1.5 Medida da atividade do nervo frnico e do nervo esplncnico

Por meio de uma abertura dorsolateral o nervo frnico esquerdo foi exposto e isolado

da diviso ventral do quinto plexo cervical, em seguida o nervo foi cortado distalmente e

colocado em um eletrodo bipolar em forma de gancho, a atividade do nervo frnico foi

filtrada de 30 a 300 Hz. Para obter acesso ao nervo esplncnico foi realizada uma abertura

retroperitoneal, o nervo esplncnico esquerdo foi exposto na sada do gnglio supra-renal, e

ento atividade simptica ps-ganglionar do nervo esplncnico foi registrada utilizando-se um

eletrodo bipolar em forma de gancho em configurao monopolar, a atividade simptica do

nervo esplncnico foi filtrada de 30 a 300 Hz. Os nervos frnico e esplncnico, assim como os

eletrodos de registro, foram cobertos com uma pasta de moldagem dental (Kwik-Cast Sealant,

WPI, USP) para isolar o nervo e eliminar a interferncia de rudos.

O eletrodo bipolar, em que os nervos foram colocados, foi conectado a um conversor

analgico-digital (modelo CED-140; Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) de 4

canais. Este aparelho possui filtro passa-baixo, ligao AC-DC (corrente direta-alternada),

filtro de corte, permite variao do ganho e possibilita correo da linha de base. A partir

deste aparelho o sinal foi copiado para um sistema de aquisio de dados verso 6 do Spike 2

software (Cambridge Electronic Design). Os resultados foram gravados em CD para posterior

anlise dos resultados.

A integral da atividade do nervo frnico e do nervo esplncnico foi obtida aps a

retificao (=0,015) e refinamento (2s) do sinal original. A amplitude e frequncia do nervo

frnico foram normalizados em cada experimento, atribuindo 100 a saturao do

quimiorreflexo (CO2 elevado) e 0 perodos de apneia. Para a normalizao da atividade do

nervo esplncnico foi atribudo 100 ao perodo de repouso da atividade do nervo e 0 ao valor

mnimo registrado durante a administrao de fenilefrina (5 mg/Kg, i.v.), a qual saturou o

barorreflexo, ou aps o bloqueio ganglionar com hexametnio (10 mg/Kg, i.v.).

29

3.2.1.6 Testes do quimiorreflexo central e perifrico

A hipercapnia foi produzida por adio de CO2 no ar fornecido pela ventilao artificial. Em

cada rato, a adio de CO2 foi monitorizado para atingir no mximo entre 9,5 e 10% de CO2

no final da expirao, a hipercapnia foi mantida durante 5 min e, em seguida, substituda por

O2 a 100%. Cada rato foi submetido a trs sesses de hipercapnia: a primeira foi 10 minutos

aps injees bilaterais de salina na regio A5, a segunda 10 minutos aps injees bilaterais

de salina ou muscimol na regio A5, e a terceira 120 minutos aps a injeo de salina ou

muscimol na regio A5. Da mesma forma, os animais que passaram pela microinjeo de

IgG-SAP ou anti-DH-SAP (4,2ng), na semana anterior, formam submetidos hipercapnia

por um perodo de 5min.

Hipxia foi obtida mudando a mistura de 100% de O2 para 8-10% O2 equilibrado com

N2 por 30 s. As medidas realizadas so iguais s supracitadas no protocolo de hipercapnia.

3.2.1.7 Histologia cerebral para confirmao dos pontos de injeo central

Ao trmino dos experimentos, os ratos foram anestesiados profundamente e perfundidos

atravs de injeo no corao com soluo salina tamponada (50 mL) seguida de soluo de

formalina a 10% (50 mL). Posteriormente, os encfalos foram retirados e fixados em

formalina 10% por dois dias. Cortes transversais (40 m de espessura) foram feitos nos

pontos de injeo com auxlio de um micrtomo vibratomo (Vibratome 1000S Plus, USA). Os

cortes histolgicos, montados em lmina foram corados com cresil violeta e analisados para

localizar os pontos das injees de acordo com o Atlas de Paxinos e Watson (1998).

3.2.1.8 Imunohistoqumica

Ao trmino dos experimentos de leses seletivas da regio A5, os animais foram anestesiados

profundamente e perfundidos atravs do corao com PBS (0,1 M, pH 7,4) seguido de

paraformaldedo (4% em PB 0,1 M, pH 7,4). Os encfalos foram removidos da caixa craniana

e guardados no mesmo fixador por 48 horas a 4C. Os encfalos foram cortados em criostato

numa espessura de 30 m e guardados em soluo crioprotetora anticongelante -20C (20%

de glicerol, 30% de etileno glicol em 50 mM de fosfato, pH 7.4) para preservar as qualidades

do tecido cerebral para posterior tratamento imunohistoqumico (SCHREIHOFER;

30

GUYENET, 1997). Para verificar a localizao e a efetividade da leso foi utilizada

imunorreatividade para tirosina hidroxilase (TH), que um marcador de neurnios

catecolaminrgicos (XU et al., 2003) atravs do mtodo free floating (KANG et al., 2007). Para este fim, os cortes foram incubados por 48 horas com anticorpo policlonal de

camundongo anti-TH (1:10,000, Chemicon, Temecula). Para detectar Phox2b foi utilizado

anticorpo de coelho (1:800, cedido por J.-F. Brunet, Ecole Normale Suprieure, Paris, France).

Os anticorpos primrios foram detectados com a incubao com anticorpo secundrio com

fluorescncia para revelar neurnios marcados com TH (goat anti-mouse, Alexa 488,

Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ou Phox2b (donkey anti-rabbit Cy3, Jackson, West Grove,

PA, USA), ou sem fluorescncia utilizando o anticorpo secundrio biotinilado (donkey anti-

mouse 1:1000, Jackson) complexado com avidina DH: peroxidase biotinilada (Vector

Laboratories, Burlingame, CA, USA), e o complexo foi revelado pela adio de cromognio di-

hidrocloreto de diaminobenzidina (DAB) para visualizar a marcao dos neurnios

catecolaminrgicos. Colina Acetiltransferase (ChAT) foi detectada com o anticorpo de cabra

anti-ChAT (1:50, Chemicon) e revelado com mtodo de fluorescncia (donkey anti-goat CY3,

1:200, Jackson) ou com anticorpo biotinilado (donkey anti-goat, 1:500, Jackson) seguido de

colorao com DAB (KANG et al., 2007; WANG; GERMANSON; GUYENET, 2002).

Um microscpio multifuncional Zeiss Axioskop 2 (campo claro, campo escuro e

epifluorescncia) foi usado para todas as observaes. Os locais de injeo (microesperas

fluorescentes) e os neurnios marcados com TH foram plotados usando uma tcnica descrita

anteriormente de mapeamento assistida por computador baseado no uso de uma fase de

microscpio motorizado controlada pelo software Neurolucida (STORNETTA; GUYENET,

1999). Os arquivos Neurolucida foram exportados para o software NeuroExplorer

(MicroBrightfield, Colchester, VT, USA) para contar os vrios tipos de perfis neuronais

dentro de uma rea definida do tronco enceflico. Quando necessrio, arquivos Neurolucida

selecionados tambm foram exportados para o programa de desenho Canvas 9 software (ACD

Systems of America, Miami, FL, EUA) para modificaes finais. As imagens foram tiradas

com uma cmera SensiCam QE 12 bits CCD cmera (resoluo 1376 1040 pixels,

CookeCorp., Auburn Hills, MI, EUA). A nomenclatura neuroanatmica foi baseada segundo

Paxinos e Watson (1998).

31

3.2.2 Anlise dos resultados

A anlise estatstica foi feita utilizando Sigma Stat verso 3.0 (Jandel Corporation, Point

Richmond, CA). Os dados foram apresentados como mdia erro padro da mdia. Foram

utilizados testes paramtricos, Teste-t pareado e ANOVA de uma via. Quando foi utilizada a

ANOVA, o teste post-hoc (Newman-Keuls mltiplas comparaes) foi usado para todas as

comparaes de pares. Significncia foi estabelecida com p

32

4 RESULTADOS

4.1 Animais no anestesiados

4.1.1 Imunohistoqumica

A figura 1 mostra as fotomicrografias representativas das seces coronais do tronco

enceflico na regio A5 de um animal representativo dos grupos, mostrando a marcao para

neurnios catecolaminrgicos. As figuras 1A e 1C mostram os corpos celulares dos neurnios

positivos para tirosina hidroxilase (TH) do grupo que recebeu leso fictcia com IgG-Saporina,

e as figuras 1B e 1D so representativas do grupo com leso qumica dos neurnios

noradrenrgicos com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (Anti-DH-SAP,

4,2 ng), mostrando a diminuio das clulas TH-positivas na regio A5 aps a leso qumica.

A

A5 A5

B

A5 A5

C

500m

100m

D

Figura 1 Fotomicrografia de seces coronais do tronco enceflico mostrando os corpos celulares de neurnios noradrenrgicos na regio A5 (crculos pontilhados em A e B) marcados com tirosina

hidroxilase. (A e C) Animal representativo do grupo com leso fictcia (IgG-Saporina) na regio A5. (B e D) Animal representativo com leso qumica na regio A5 com saporina congugada com anti-

dopamina -hidroxilase (Anti-DH-SAP, 4,2 ng). As setas apontam o ncleo de um dos neurnios marcados pela tirosina hidroxilase.

33

Os neurnios noradrenrgicos marcados para tirosina hidroxilase na regio A5 foram

agrupados usando o Bregma como referncia, e quantificados. A mdia dos valores est

representada na figura 2. Observa-se que houve uma diminuio de clulas noradrenrgicas em

todos os segmentos analisados (-9,68, -9,8, -10, 04, -10,30 e -10,52 mm caudal ao bregma),

com maior efetividade em -9,68 e menor efetividade (em torno de 70%) em -10,30 mm em

relao ao bregma. A mdia geral de reduo dos neurnios positivos para tirosina hidroxilase

na regio A5 foi de 80%.

IgG-Saporina (n=5)

Anti-DH-SAP (n=11)

IR

30

de

neu

rn

iosT

H-

re

a A

5 20

10

N

mer

o

0

-9,68 -9,8 -10,04 -10,30 -10,52

Milmitros em relao ao Bregma

Figura 2 Mdia do nmero dos neurnios noradrenrgicos na regio A5 imunorreativos para tirosina hidroxilase (TH-IR) no grupo com leso fictcia (IgG-Saporina) e lesado com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (Anti-DH-SAP, 4,2 ng) nas seces -9,68, -9,8, -10,04, -10,30 e -10,52

mm em relao ao Bregma.

4.1.2 Desnervao sino-rtica

A efetividade da desnervao sino-artica foi testada com injeo intravenosa de

fenilefrina (5 g/kg). A fenilefrina um vasoconstritor que gera como resposta um aumento

da presso arterial mdia, a ativao dos barorreceptores e quimiorreceptores perifricos pelo

aumento da presso arterial mdia gera uma bradicardia reflexa. Com a desnervao sino-

artica a bradicardia reflexa abolida, assim, a efetividade da desnervao sino-artica

observada quando aps a injeo intravenosa de fenilefrina (5 g/kg) provocou um aumento

34

da presso arterial mdia com ausncia da bradicardia reflexa ( PAM= +9,9 mmHg; FC= -

20,6 BPM).

4.1.3 Efeito da leso na regio A5 utilizando a toxina saporina conjugada com anti-

dopamina -hidroxilase sobre a ventilao, gases sanguneos e presso arterial durante a

hipercapnia em ratos no anestesiados intactos ou com desnervao sino-artica.

A figura 3 apresenta a variao () do volume corrente (VT), frequncia respiratria

(fR) e ventilao (VE), entre a normocapnia (0% CO2) e hipercapnia (7% CO2), do grupo anti-

DH-SAP (DH-SAP) e o grupo IgG-Saporina (IgG-SAP) dos animais sem desnervao sino-

artica (intactos) e animais sino-artico desnervados. A leso dos neurnios noradrenrgicos

da regio A5 no alterou a resposta basal das variveis respiratrias dos animais intactos (VE

= 377,4 19 vs IgG-SAP 444,4 32 mL.kg -1

.min-1

, P>0.05; VT = 4,4 0,2 vs IgG-SAP 5,1

0,3 mL.kg-1

, P>0.05; fR = 86,5 6,3 vs IgG-SAP 87,4 2,5 rpm, P>0.05) e dos animais

sino-artico desnervados (VE = 562,7 102 vs IgG-SAP 564 82 mL.kg -1

.min-1

, P>0.05; VT

= 7,0 1,0 vs IgG-SAP 7,8 1 mL.kg-1

, P>0.05; fR = 70,7 3 vs IgG-SAP 76,2 9 rpm, P>0.05). Durante a hipercapnia, a desnervao sino-artica causou

nos animais controles um aumento da ventilao (P0,05). Portanto, a leso dos

neurnios noradrenrgicos da regio A5 promoveu uma atenuao no aumento do VT

produzido pela hipercapnia, tanto nos animais intactos (Fig. 3B) quando nos animais sino-

articos desnervados (Fig. 3E).

35

A 1500

)

-1

mi

n

1000

-1

(mL

kg

500 E

V

0

B

15

)

-1

10

(mL

kg

T

5 V

0

C 80

(rp

m)

60

40

fR

20

0

Intactos

IgG-SAP DH-SAP

* IgG-SAP DH-SAP IgG-SAP DH-SAP

D 1500

)

- 1

mi

n

1000

-1

(mL

kg

500 E

V

0

E

15

)

-1

10

(mL

kg

T

5 V

0

F 80

(rp

m)

60

40

fR

20

0

Sino-artico

desnervados

IgG-SAP DH-SAP

*

IgG-SAP DH-SAP

IgG-SAP DH-SAP

Figura 3 Variao da resposta hipercapnia (7% CO2) nas variveis respiratrias em animais no

anestesiados. Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos na regio A5 com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP, 4,2 ng) ou da leso fictcia (IgG-SAP, 100 nL) sobre a

variao da ventilao (VE), do volume corrente (VT), e da frequncia respiratria (fR) em ratos intactos (A, B e C) que no passaram pela desnervao sino-artica, e (D, E e F) animais sino-artico

desnervados. * indica diferena significativa da variao entre os grupos DH-SAP e IgG-SAP (P

36

(IgG-SAP P=0,0002, DH-SAP P=0,0082) e na PaO2 (IgG-SAP P=0,0199, DH-SAP

P=0,0307). Nenhuma das condies experimentais teve efeito significativo no bicarbonato

plasmtico.

Tabela 1 Mdia dos valores do pH e da presso parcial de CO2, O2 no sangue arterial do grupo sem desnervao sino-artica (intacto) que sofreu leso fictcia com IgG-Saporina (IgG-SAP) ou leso dos neurnios noradrenrgicos com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP) na regio A5, durante a normxia (0% CO2) e durante a hipercapnia (7% CO2).

Intacto Intacto IgG-SAP DH-SAP

(n = 4) (n = 5 )

0% CO2 7% CO2 0% CO2 7% CO2

pHa 7,50,01 7,30,01###

7,40,04 7,20,06##

PaCO2 40,81,22 58,71,01###

34,11,17 54,45,29##

(mmHg)

PaO2 751,41 106,33,73

# 959,76 119,810,49

# (mmHg)

#Indica diferena significativa dos valores normocpnicos e hipercpnicos.

# P0,05) nem dos animais

sino-artico desnervados (PAM = 129 13,1 vs IgG-SAP 117,2 9,3 mmHg, P>0,05; FC =

410,5 25,7 vs IgG-SAP 376,9 6,7 bpm, P>0,05). A desnervao sino-artica causou um

aumento na frequncia cardaca basal dos animais com neurnios noradrenrgicos da regio

A5 ausentes, consequentemente um aumento na resposta hipercapnia P0,05) enquanto nos animais controle com desnervao sino-artica a

hipercapnia aumentou a PAM e diminuiu nos animais lesados com a desnervao sino-artica

37

(Fig. 4C) (PAM= -13,9 17,8 vs IgG-SAP +7,7 5,3 mmHg, P>0,05). A FC dos animais

intactos diminuiu frente ao estmulo hipercapnico (Fig. 4B) (FC= -19,4 40,8 vs IgG-SAP -

13,1 12,8 bpm, P>0,05), a mesma resposta foi observada nos animais lesados sino-artico

desnervados, enquanto nos animais controles houve um aumento da FC (Fig. 4D) (FC= -9,9 27,7 vs IgG-SAP 7,7 5,5 bpm, P>0,05).

P

AM

(m

mH

g)

Intactos Sino-artico

desnervados

20

20

10

(mm

Hg)

10

0

0

-10

PA

M

-10

-20 -20

-30 -30

-40

-40

-50

IgG-SAP DH-SAP

-50

IgG-SAP

DH-SAP

)

) 0

- 1

F C ( b a t i m e n t o s . m i n

F C ( b a t i m e n t o s . m i n

-1

-20

-40

-60 IgG-SAP DH-SAP

20

0

-20

-40

-60

IgG-SAP DH-SAP

Figura 4 Variao da resposta hipercapnia (7% CO2) nas variveis cardiovasculares em animais

no anestesiados. Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP, 4,2 ng) ou da leso fictcia com IgG-

Saporina (IgG-SAP, 100 nL) na regio A5, em animais intactos (A e B), sem desnervao sino-artica, e com desnervao sino-artica (C e D), sobre a presso arterial mdia (PAM) e a frequncia cardaca

(FC).

F

C (

ba

tim

ento

s.m

in-1

)

F

C (

ba

tim

ento

s.m

in-1

)

P

AM

(m

mH

g)

A

B

C

D

38

4.1.4 Efeito da leso na regio A5 utilizando a toxina saporina conjugada com anti-

dopamina -hidroxilase sobre a ventilao, gases sanguneos e presso arterial durante a

hipxia em ratos no anestesiados com desnervao sino-artica ou intactos.

A figura 5 apresenta a variao () da ventilao (VE), volume corrente (VT) e frequncia

respiratria (fR), entre a normocapnia (0% O2) e hipxia (7% O2), do grupo Anti-DH-SAP

(DH-SAP) e o grupo IgG-Saporina (IgG-SAP), dos animais sem desnervao sino-artica

(intactos) e animais sino-artico desnervados. A leso dos neurnios noradrenrgicos da regio

A5 no alterou a resposta basal das variveis respiratrias dos animais intactos (VE = 368,3

24,1vs IgG-SAP 467,6 50,1 mL.kg -1

.min-1

, P>0,05; VT = 4,5

0,2 vs IgG-SAP 5,2 0,5 mL.kg-1

, P>0,05; fR = 82,7 7,1 vs IgG-SAP 90,4 4,2 rpm,

P>0,05), e sino-artico desnervados (VE = 562,7 102,1vs IgG-SAP 518,5 88,4 mL.kg -

1.min

-1, P>0,05; VT = 7,0 1,1 vs IgG-SAP 7,2 1,5, P>0,05; fR = 79,4 9,7 vs IgG-SAP

76,4 11,6 rpm, P>0,05). Durante a hipxia, a desnervao sino-artica causou nos animais

controles um aumento da ventilao (P0,05; VT = +5,9 1,2 vs IgG-SAP

+5,5 0,8 mL.kg-1

, P>0,05; fR = +31,8 11,8 vs IgG-SAP +64,6,4 9,7 rpm, P>0,05).

Dessa forma, a leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 promoveu uma atenuao

no aumento do VT produzido pela hipxia, apenas nos animais intactos (Fig. 5B)

39

Intactos

A

) 2000

-1

mi

n 1500

-1

k g

1000

(m L

E

500

V

0

IgG-SAP

DH-SAP

D 2000

)

- 1

mi

n 1500

-1

kg

1000

(mL

500 E

V

0

Sino-artico

desnervados

IgG-SAP DH-SAP

B

)

8

6

- 1

k g

(m L 4

T

V

2 *

0

IgG-SAP DH-SAP

C

)

80

- 1

(bre

ath

s.m

in

60

40

f

R

20

0

IgG-SAP

DH-SAP

E 8

)

6

- 1

k g

( m L

4

T

V

2

0 IgG-SAP DH-SAP

F

80

)

- 1

(bre

aths

.mi

n 60

40

f

R

20

0 IgG-SAP DH-SAP

Figura 5 Efeito da leso dos neurnios noradrenergicos com saporina conjulgada com anti - dopamina -hidroxilase (DH-SAP, 4,2 ng) ou leso fictcia com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (IgG-SAP, 100 nL) na regio A5 sobre o volume corrente (VT), a frequncia

respiratria (fR) e a ventilao (VE), em ratos no anestesiados intactos e sino-articos desnervados durante a hipxia. * indica diferena significativa entre os grupos IgG-SAP e DH-SAP (* P

40

Tabela 2 Mdia dos valores da presso parcial de CO2, O2 e pH no sangue arterial do grupo sem desnervao sino-artica (intacto) que sofreu leso fictcia com IgG-Saporina (IgG-SAP) ou leso dos neurnios noradrenrgicos com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP) na regio A5, durante a normxia (21% O2) e durante a hipxia (7% O2).

Intacto Intacto IgG-Saporina Anti DH-SAP

(n =4 ) (n =5 )

21% O2 7% O2 21% O2 7% O2

pHa 7,50,01 7,60,03#

7,40,04 7,60,04#

PaCO2 40,81,22 19,61,60

### 34,11,17 13,51,47

## (mmHg)

PaO2 751,41 21,30,89

### 959,76 36,810,09

# (mmHg)

#Indica diferena significativa dos valores normocpnicos e hipxicos.

# P0,05) nem dos animais sino-artico desnervados (PAM = 129 13,1 vs

IgG-SAP 117,2 9,3 mmHg, P>0,05; FC = 410,5 25,7 vs IgG-SAP 376,9 6,7 bpm,

P>0,05). A desnervao sino-artica provocou uma queda na presso arterial mdia nos

animais controles durante a hipxia P0,05) quando do grupo

desnervado (PAM = -27,3 9,0 vs IgG-SAP 47,5 12,8 mmHg, P>0,05), e a frequncia

cardaca foi aumentada em ambos os grupos, (Fig. 6B e D) intactos (FC = +58,4 23,8 vs

IgG-SAP 33,4 19,8 bpm, P>0,05) e sino-articos desnervados (FC = +56,8 36,5 vs IgG-

SAP 48,3 26,9 bpm, P>0,05).

41

PA

M (

mm

Hg)

Intactos

0

-10

-20

-30

-40

-50

IgG-SAP DH-SAP

Sino-artico

desnervados 0

(mm

Hg

) -10

-20

P

AM

-30

-40

-50

IgG-SAP DH-SAP

F

C (

ba

tim

ento

s.m

in -

1)

150

100

50

0

IgG-SAP DH-SAP

150

100

50

0

IgG-SAP DH-SAP

Figura 6 Variao da resposta hipxia (7% O2) nas variveis cardiovasculares em animais no anestesiados. Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 com saporina conjulgada

com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP, 4,2 ng) ou da leso fictcia com IgG-Saporina (IgG-SAP, 100 nL) na regio A5, em animais intactos (A e B), sem desnervao sino-artica, e com desnervao

sino-artica (C e D), sobre a presso arterial mdia (PAM) e a frequncia cardaca (FC).

A

B

C

D

F

C (

ba

tim

ento

s.m

in-1

)

42

4.2 Animais anestesiados

4.2.1 A anlise histolgica

A Figura 7 mostra as injees realizadas regio A5. O centro de injees na regio A5

foi localizado 10,0 milmetros abaixo da superfcie dorsal do encfalo e 200 m rostral

extremidade rostral do ncleo motor facial. A figura 7A apresenta as microesferas localizadas

na regio correspondente localizao dos neurnios da regio A5. Injees Peri foram

consideradas quando localizadas na regio parapiramidal no mesmo plano da regio A5,

representadas na Figura 7B.

1mm

Grupo 1mm hipercapnia Grupo

hipxia

Grupo peri

Figura 7 Locais de injeo na ponte ventrolateral. (A) Fotomicrografia representativa de uma seco

coronal mostrando microinjees bilaterais na regio A5. (B) Esquema mostrando o centro dos locais de injeo revelado pela presena de microesferas fluorescentes. Abreviaes: LSO, oliva superior

lateral; py, pirmide; 7n, raiz do ncleo facial. A seta indica o local da injeo. Os pontos pretos e cinzas representam os locais de microinjees na regio A5 e os pontos vazios indicam os centros dos

locais de microinjees nas regies vizinhas (peri) da regio A5.

Gupo hipercapnia

Grupo hipxia

Grupo peri

43

4.2.2 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo

central aps injeo bilateral de muscimol na regio A5

As injees bilaterais de muscimol (2 mM - 50 nL) na regio A5 foram feitas em ratos

completamente desnervados. O muscimol na regio A5 no produziu nenhum efeito sobre a

presso arterial mdia (PAM= 121 3 mmHg vs salina 119 6 mmHg, P>0,05) e atividade

do nervo simptico (sSNAM= 96 11% do controle, P>0,05) em repouso.

Contudo, a injeo bilateral de muscimol na regio A5 atenuou o aumento da presso

arterial mdia (PAM= +19 3 mmHg vs salina +33 4 mmHg, P

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Figura 8 Microinjeo Muscimol (2 mM - 50 nL) na regio A5 atenuou os efeitos

cardiorrespiratrios produzidos pela ativao de quimiorreceptores centrais em ratos anestesiados com desnervao sino-artica. (A) Registro representativo que mostra o efeito da injeo de muscimol na

regio A5 nas alteraes na presso arterial (PA), na atividade simptica do nervo esplncnico (sSNA), e na atividade do nervo frnico (PNA) provocadas por um aumento de 5 a 10% de CO2 da expirao

final. As respostas foram registradas 10 min aps a injeo bilateral de soluo salina na regio A5, e 10 min aps a injeo bilateral de muscimol (2 mM, 50 nL de cada lado) na regio A5. (B) presso

arterial mdia (PAM), (C) sSNA ( sSNA), (D) frequncia PNA ( PNA freq) e (E) amplitude PNA ( ampl PNA) provocada pela expirao final de 5-10% de CO2 durante injees de salina ou

muscimol na regio A5. Diferenas expressas como percentagem da resposta provocada pelo CO2 durante a injeo de salina. * diferente da salina (P < 0,05), n = 8 ratos.

4.2.3 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo

perifrico aps injeo bilateral de muscimol na regio A5

A injeo bilateral de muscimol (2 mM - 50 nL) na regio A5, em 7 ratos

vagotomizados anestesiados com uretano e com os nervos do seio carotdeo intactos, no

alterou a presso arterial mdia (PAM= 125 7 mmHg vs salina 122 5 mmHg, P>0,05) e

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atividade do nervo simptico (sSNA= 98 4% do controle) no repouso. A injeo bilateral de

muscimol na regio A5 bloqueou o aumento da presso arterial mdia (PAM= 5 4 mmHg

vs salina +20 3 mmHg, P0,05) produzido por hipxia (Fig. 10A, D e E).

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Figura 9 Injeo Muscimol na regio A5 atenuou os efeitos cardiorrespiratrios produzidos pela

ativao de quimiorreceptores perifricos em ratos anestesiados intactos. (A) Registro representativo que mostra o efeito da injeo de muscimol na regio A5 nas mudanas na presso arterial (PA), a

atividade do nervo simptico esplncnico (sSNA), e da atividade do nervo frnico (PNA) provocada pela hipxia (8-10% O2, 30 s). As respostas foram registradas 10 min aps a injeo bilateral de salina

na A5, e 10 min aps a injeo bilateral de muscimol (2 mM, 50 nL de cada lado) na A5. Alteraes

na (B) presso arterial mdia (PAM), (C) sSNA ( sSNA), (D) frequncia da PNA ( PNA freq) e (E) amplitude da PNA ( PNA ampl) causada pela hipxia durante injeo de salina ou muscimol na regio A5. Diferenas expressas como uma porcentagem da resposta provocadas pelo O2 durante a injeo de soluo salina. * diferente de soluo salina (P

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4.2.4 Leso seletiva de neurnios TH da regio A5 com anti-DH-SAP

A toxina Anti-DH-SAP (injeo de 100 nL contendo 4,2 ng de toxina) foi

administrada bilateralmente na regio A5. Os neurnios imunorreativos Phox2b e TH foram

examinados na ponte ventrolateral em todos os animais que receberam injeo de anti-DH-

SAP, a fim de avaliar o efeito da toxina sobre os neurnios positivos para TH e neurnios

Phox2b prximos. Os neurnios positivos para TH, com ou sem Phox2b foram plotados e

contados em sete seces coronais por rato e cada seco foi separada por 180 uM. A Figura

10A uma foto representativa de um rato que recebeu 4,2 ng de anti-DH-SAP. Os neurnios

positivos para TH e negativos para Phox2b estavam ausentes na regio A5 em ratos

lesionados, mas o nmero de neurnios negativos para TH e positivos para Phox2b foi

aproximadamente o mesmo nos animais controles e lesionados (Fig.