PARTICULARIDADES DAS TÉCNICAS DE HEMATOLOGIA E … · Silva, Stéphanie Silva Almeida e Marina...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

PARTICULARIDADES DAS TÉCNICAS DE HEMATOLOGIA E

BIOQUÍMICA SÉRICA DE TARTARUGA-DA-AMAZÔNIA

(Podocnemis expansa, Schweigger, 1812) EM CATIVEIRO

Fabricio Romulo Cardoso de Camargo

Orientadora: Profª. Drª. Danieli Brolo Martins

GOIÂNIA

2018

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FABRICIO ROMULO CARDOSO DE CAMARGO

PARTICULARIDADES DAS TÉCNICAS DE HEMATOLOGIA E

BIOQUÍMICA SÉRICA DE TARTARUGA-DA-AMAZÔNIA

(Podocnemis expansa, Schweigger, 1812) EM CATIVEIRO

Dissertação apresentada como co-requisito para

a obtenção do título de Mestre em Ciência

Animal junto à Escola de Veterinária e

Zootecnia da Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração:

Cirurgia, Patologia Animal e Clínica Médica

Linha de pesquisa:

Clínica, diagnóstico por imagem e patologia

clínica na saúde de animais de companhia e

selvagens

Orientadora:

Profª.Drª. Danieli Brolo Martins – EVZ/UFG

Comitê de orientação:

Profa. Dra. Luciana Batalha de Miranda Araújo

(EVZ/UFG)

Profa. Dra. Naida Cristina Borges (EVZ/UFG)

GOIÂNIA

2018

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AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, gostaria de agradecer a meus pais, Zilmar Cardoso dos

Santos Camargo e Teirdes Romulo de Camargo, por todo o apoio e paciência e pela

presença constante nos momentos bons e ruins. Sem vocês, nada disso seria possível.

A minha orientadora, Professora Doutora Danieli Brolo Martins, por toda a

confiança depositada num residente, inicialmente, estranho à área de patologia clínica, e

por ter me recebido no LABCLINVET.

A minha co-orientadora, Luciana Batalha de Miranda Araújo, cuja ajuda

providencial foi importante pra conclusão desse trabalho.

As amigas da rotina do laboratório, as residentes Rayanne Henrique Santana da

Silva, Stéphanie Silva Almeida e Marina Santos da Silva, sempre juntas e prontas para

enfrentar qualquer perrengue.

Minhas colegas de mestrado, Luana Souza Ribeiro, Nadjanaira Abraão Costa e

Carolina Silva Petenusse que sabem o quão difícil é lidar com a pós-graduação e seus

altos e baixos. “Endure and shine” deveria ser nosso lema.

Aos funcionários do LABCLINVET e do Hospital Veterinário, Ízis, Maria

Francisca e Wesley, que fizeram parte dessa jornada, do início ao fim

E por fim, a Thawanne Delefrate Queiroz, que sempre teve a paciência e as

palavras certas para me ajudar a passar por todo o processo da forma mais serena

possível.

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“Sometimes you climb out of bed in the morning and you think, I’m not going to make

it, but you laugh inside – remembering all the times you’ve felt that way.”

Charles Bukowski

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SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS ............................................................. 1

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 2

2.1 Tartaruga-da-amazônia ............................................................................................... 2

2.2. Análises Bioquímicas ................................................................................................ 3

2.2.1. Aspartato amininotrasferase (AST) ........................................................................ 3

2.2.2. Creatinofosfoquinase .............................................................................................. 4

2.2.3. Fosfatase alcalina (FA) ........................................................................................... 4

2.2.4. γ-glutamil transferase (GGT).................................................................................. 4

2.2.5. Ferro ....................................................................................................................... 5

2.2.6. Cálcio e fósforo ...................................................................................................... 5

2.2.6. Colesterol ................................................................................................................ 5

2.2.7. Ureia ....................................................................................................................... 6

2.2.8. Proteínas séricas totais (PST) e albumina............................................................... 6

2.3 Hematologia e hemograma de répteis ........................................................................ 7

2.3.1 Eritrograma .............................................................................................................. 7

2.3.2 Leucograma ............................................................................................................. 8

2.3.1 Trombograma ........................................................................................................ 11

2.4. Técnicas hematológicas de contagem...................................................................... 11

2.4.1. Contagem de eritrócitos ........................................................................................ 12

2.4.1. Contagem de leucócitos ........................................................................................ 12

2.4.2. Contagem de trombócitos ..................................................................................... 13

REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 16

CAPÍTULO 2 - Bioquímicas séricas de tartaruga-da-amazônia (Podocnemis

expansa): estabilidade de analitos em diferentes tempos de armazenamento ................ 22

INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 23

MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 24

RESULTADOS .............................................................................................................. 25

DISCUSSÃO .................................................................................................................. 25

CONCLUSÃO ................................................................................................................ 27

REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 27

CAPÍTULO 3 - Comparação de diferentes técnicas de contagem de leucócitos e

trombócitos em tartaruga-da-amazônia (Podocnemis expansa) ..................................... 33

INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 34

MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 37

RESULTADOS .............................................................................................................. 39

DISCUSSÃO .................................................................................................................. 40

CONCLUSÃO ................................................................................................................ 43

REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 43

CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................... 49

ANEXOS ........................................................................................................................ 50

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Tartaruga-da-amazônia (Podocnemis expansa). ................................... 2

FIGURA 2 – Células sanguíneas de tartaruga-da-amazônia (Podocnemis expansa).

A) Heterófilo. B) Eosinófilo. C) Basófilo. D) Linfócito. E)

Monócitos. F) Trombócitos. ................................................................... 9

FIGURA 3 – Técnicas de contagem hematológica para hemácias. leucócitos e

trombócitos. As estrelas vermelhas indicam quais quadrados do

quadrante central devem ser contados. Os números indicam quais

quadrantes do hemocitômetro devem ser contados. A área em

vermelho indica que todo o quadrante central deve ser contado. ....... 14

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Métodos para estimativa de leucócitos totais e trombócitos em lâmina de

esfregaço de tartarugas-da-amazônia (Podocnemis expansa) de acordo

com diferentes autores. ELT = Estimativa de leucócitos totais; ETT =

Estimativa de trombócitos totais; CGA = Campo de grande aumento. ........... 15

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LISTA DE TABELAS

Capítulo 2

TABELA 1. Efeitos do congelamento (-20°C) em analitos séricos de tartarugas-da-

amazônia em diferentes momentos: T0 (dia 0), T1 (4 dias), T2 (Dia 8),

T3(Dia 16), T4(Dia 32). EP = erro padrão; CV = Coeficiente de

variação; AST = Aspartato aminotransferase; ALT = Alanina

aminotransferase; CK = creatinofosfoquinase; Col. T. = Colesterol

total; FA = Fosfatase alcalina; GGT = gama-glutamiltransferase; PST =

Proteínas séricas totais. Médias seguidas pelas mesmas (a, b e c) letras

são idênticas estatisticamente pelo teste de Scott-Knott (p>0,05). ........... 31

Capítulo 3

TABELA 1. Métodos para estimativa de leucócitos totais e trombócitos em lâmina

de esfregaço de tartarugas-da-amazônia (Podocnemis expansa). ............ 38

TABELA 2. Valores médios, desvio padrão (DP), amplitude, coeficiente de variação

(CV), coeficiente de correlação (r) e probabilidade de significância (p)

para a contagem total de leucócitos (CLT) em tartarugas-da-amazônia

(Podocnemis expansa) obtidos por diferentes métodos (N=20). ............. 39

TABELA 3. Valores médios, desvio padrão (DP), amplitude, coeficiente de variação

(CV), coeficiente de correlação (r) e probabilidade de significância (p)

para a contagem de trombócitos totais (CTT) em tartarugas-da-

amazônia (P. expansa) obtidos por diferentes métodos (N=20). ............. 40

xiii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AST - Aspartato aminotransferase

CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais

CGA - Campo de grande aumento

CHCM - Concentração de hemoglobina corpuscular média

CK - Creatinofosfoquinase

CT - Colesterol Total

CTH - Contagem total de hemácias

CTL - Contagem total de leucócitos

CTT - Contagem total de trombócitos

CV - Coeficiente de Variação

ELT - Estimativa de leucócitos totais

ETT - Estimativa de trombócitos totais

FA - Fosfatase alcalina

GGT - γ-glutamil transferase

HTC - Hematócrito

NH - Técnica de Natt & Herrick

PST - Proteínas Séricas Totais

VCM - Volume Corpuscular Médio

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RESUMO

A Amazônia brasileira abriga 17 diferentes tipos de quelônios, entre eles a espécie

Podocnemis expansa, também conhecida como tartarua-da-amazônia e considerada o

maior quelônio de água doce da América do sul. Historicamente, era encontrada em

seu habitat com facilidade e utilizada como importante fonte de proteínas para

populações ribeirinhas e urbanas de vários países, o que permitiu a sobre-exploração

e declínio de seus números, com consequente normatização governamental e

estabelecimento de criatórios comerciais. A realização de hemograma e bioquímicas

séricas são maneiras eficazes de se obter informações sobre o status geral de um

réptil, sobre doenças que alteram o status normal e como indicador prognóstico.

Assim, dada a importância econômica da espécie, o objetivo geral desse trabalho é

adicionar informações à literatura referente a analitos da bioquímica sérica

armazenados em diferentes tempos de estocagem e verificar a correlação entre

diferentes técnicas hematológicas utilizadas na realização do hemograma em P.

expansa. Para isso, foram utilizados 20 animais de cativeiro, que foram contidos

fisicamente e anestesiados. O sangue foi colhido do seio cervical, lâminas de sangue

sem anticoagulante foram preparadas no momento e parte do sangue foi armazenado

em tubos de heparina, a partir dos quais as contagens hematológicas em

hemocitômetro (eritrócitos, leucócitos e trombócitos totais) foram realizadas, sempre

dentro do período de 15 minutos após a colheita. O restante foi armazenado em

tubos de soro, centrifugado e separado em alíquotas, das quais uma foi utilizada para

obtenção dos valores basais (T0). Foram analisados os seguintes analitos: albumina,

aspartato aminotransferase (AST), cálcio, creatinofosfoquinase (CK), colesterol,

fosfatase alcalina (FA), ferro sérico, fósforo, gama glutamiltransferase (GGT),

proteínas séricas totais (PST) e ureia. Dosagens posteriores foram repetidas com

quatro (T4), oito (T8), 16 (T16) e 32 (T32) dias após T0 e os valores resultantes

foram analisados por meio de análise de variância (ANOVA) com ajuda do software

R. Na parte da bioquímica sérica, verificou-se variações estatisticamente

significativas na albumina, que aumentou entre T16 e T32; AST, que diminui em

T16 e T32; CK, GGT e fósforo apresentaram diminuição entre T0 e T4 e entre T4 e

T8; FA, com diminuição apenas em T16; PST, que se elevou em T32; Ureia, com

aumento apenas em T4. Cálcio e colesterol total se mostraram estáveis em todos os

tempos. Para análise das lâminas de esfregaço e comparação de técnicas de

estimativa, três métodos foram utilizados para leucócitos e três para trombócitos. As

médias obtidas com cada um foram comparados pelo teste T com dados pareados e a

correlação entre as técnicas foi determinada pelo método de Pearson, com equações

de regressão linear formuladas para estimar os demais métodos em função da

contagem direta em hemocitômetro. Para a parte de técnicas hematológicas,

observou-se que os métodos não possuem correlação com a contagem em

hemocitômetro. Os dados obtidos são de grande importância para o aperfeiçoamento

diagnóstico em tartarugas-da-amazônia, pois ajudam a esclarecer qual o período de

viabilidade para alguns analitos séricos e qual técnica hematológica oferece melhores

resultados para a obtenção da contagem total de leucócitos e trombócitos e a

aprimorar os procedimentos laboratoriais adotados para esta espécie.

Palavras-chave: Quelônios, bioquímica sérica, hemograma, estimativa, estabilidade

xv

ABSTRACT

Amazon is home to 17 distinct types of chelonians, among them the Podocnemis

expansa, also known as Arrau-turtle, the largest freshwater turtle in South America.

Historically, it was easily found in its habitat and was an important source of protein

for Ribeirinho people and urban communities in several south-american countries,

which allowed intensive exploration and decline of their numbers, and those are

followed by governmental regulation and the emergence of commercial breeders. A

complete blood count (CBC) and serum biochemistry are simple and very efficient

means to get information about the general status of a reptile, diseases that alter

normal status and can be used as prognostic indicator. Thus, given the economic

importance of this species, the general objective of this work is to add information

regarding serum biochemical analytes storage in different time periods and to verify

if there is any correlation between different hematological techniques used to obtain

the value of the total leukocytes and thrombocytes count in P. expansa. Thereunto,

20 captive arrau-turtles were used, which were physically restrained and

anesthetized. Blood was withdrawn from the cervical sinus, blood films without

anticoagulant were prepared at the time and part of the blood was stored in heparin

tubes, from which are used for the hematological procedures - erythrocytes,

leukocytes and total thrombocytes counts in a hemocytometer - were performed,

always within the period 15 minutes after collection. The remainder of blood was

stored in serum tubes, centrifuged and separated into aliquots, from which a sample

was used to obtain the baseline values (T0). The following analytes were assayed:

albumin, aspartate aminotransferase (AST), calcium, creatino phosphokinase (CPK),

cholesterol, alkaline phosphatase (ALP), serum iron, phosphorus, gamma-

glutamyltransferase (GGT), total serum protein (TSP) and urea. Posterior assays

were repeated with four (T4), eight (T8), 16 (T16) and 32 (T32) days after T0 and

the resulting values were analyzed by means of analysis of variance (ANOVA) with

help of R software. As results of the serum analysis there were statistically

significant variations in albumin, which increased between T16 and T32; AST,

which decreased in T16 and T32; CPK, GGT and phosphorus presented a decrease

between T0 and T4 and between T4 and T8; ALP, with decreased only in T16; TSP,

which increased in T32; Urea, with increase only in T4. Calcium and cholesterol

were stability in all storage periods. Regarding the blood smears and estimation

techniques comparison, three methods for leukocytes and three for thrombocytes

count, were used. The obtained averages were compared by the T-test with paired

samples and a correlation between the techniques was obtained via Pearson’s

correlation coefficient. Linear regression equations were modelled to estimate the

relationship between the methods used and the direct hemocytometer counting. In the

blood smear estimation count it was observed that the methods do not correlate with

a hemocytometer count. The data obtained are of foremost importance for the

diagnostic improvement in arrau-turtles, since they help clarify the viability period

for some serum analytes and the suitability of hematological technique to obtain total

count of leukocytes and thrombocytes and to improve laboratory procedures for this

species.

Key words: Testudinata, serum biochemistry, blood count, estimation methods,

long-term stability

1

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS

1. INTRODUÇÃO

A Amazônia brasileira abriga 17 diferentes espécies de quelônios1,

distribuídas em 5 famílias distintas. Dessas, três pertencem à subordem Cryptodira e

duas à subordem Pleurodira. Entre estas últimas, encontram-se a família

Podocnemididae e a espécie Podocnemis expansa, também conhecida como tartaruga-

da-amazônia1 e considerada o maior quelônio de água doce da América do Sul, podendo

atingir 80cm de comprimento, 60 cm de largura de carapaça e peso de até 60kg2. Assim,

a obtenção de dados sobre tartarugas-da-amazônia (P. expansa), que abranjam os

diferentes tipos de aclimatação a que esses animais estão submetidos, são fundamentais

para os esforços de conservação e preservação voltados para essa espécie3.

Quelônios em geral, são espécies oportunistas, que se aproveitam da

disponibilidade local de alimentos4. Contudo, há uma mudança de preferência alimentar

entre as diferentes idades, onde animais mais jovens consomem alimentos com maior

quantidade de proteína e animais mais velhos tendem a consumir maior quantidade de

matéria vegetal5,6. Para a medicina veterinária, a ampliação de criações comerciais e o

aumento da casuística clínica de espécies selvagens em instituições veterinárias é um

desafio, pois a realização de exames laboratoriais encontra-se prejudicada devido à

dificuldade de colheita, transporte e processamento de amostras, ausência de

padronização para técnicas espécie-específicas e pela grande influência de fatores

externos nos valores de parâmetros hematológicos e bioquímicos dentro da mesma

espécie7,8. No entanto, as informações obtidas podem ser úteis no diagnóstico de

doenças, no estabelecimento do prognóstico e para monitorar a resposta dos animais a

terapias estabelecidas9.

A realização do hemograma e de análises de bioquímicas séricas são

maneiras eficazes de se obter informações sobre o status geral de um réptil, sua resposta

a estresse ou mesmo a contaminantes ambientais. A técnica é minimamente invasiva e

com poucos efeitos colaterais10,11. Em tartarugas-da-amazônia, o hemograma é uma

ótima forma de se avaliar e monitorar a resposta a doenças, bem como, sua saúde

nutricional e o desempenho desses animais, seja em seu ambiente natural ou em

criatórios comerciais10,12.

2

Assim, o objetivo dessa dissertação é adicionar informações para a literatura

referente a tartaruga-da-amazônia, principalmente a respeito dos valores de analitos da

bioquímica sérica (estocados em diferentes tempos de armazenamento) e verificar se

existe correlação entre as diferentes técnicas hematológicas utilizadas na realização do

hemograma. Esses dados auxiliarão nas metodologias laboratoriais aplicadas à esta

espécie e, consequentemente, no diagnóstico de doenças e na avaliação das condições

fisiológicas e de adaptação da P. expansa.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Tartaruga-da-amazônia

Geograficamente, esta espécie é amplamente distribuída pelos afluentes dos

rios Orinoco (Colômbia e Venezuela) e Essequibo (Guiana e Venezuela), além das área

de drenagem do rio Amazonas na Colômbia, Venezuela, Guianas, nordeste do Peru,

leste do Equador, e região norte da Bolívia e do Brasil2,13. Entre os estados brasileiros,

encontra-se distribuída pelo Amazonas, Acre, Roraima Amapá, Pará, Rondônia,

Tocantins, Mato Grosso e Goiás13.

FIGURA 1 – Tartaruga-da-amazônia (Podocnemis expansa).

Fonte: ICMBIO13

Historicamente, estas tartarugas eram facilmente encontradas em seu hábitat

e serviram como importante fonte de proteínas para populações tradicionais ribeirinhas

3

e urbanas dos países sul-americanos14. Seus ovos e carne ainda são vastamente

apreciados, o que levou a intensa exploração dessas populações ao longo dos anos13,

culminando com sua inclusão na lista de espécies ameaçadas de extinção15.

Apesar de seu status conservatório ser menos preocupante que outras

espécies de quelônios15, sua conservação depende do estabelecimento programas

governamentais e leis que proíbam a caça desses animais. Com o estabelecimento da

Lei de proteção à Fauna, nº 5.197 de 1967, o comércio de animais da fauna silvestre foi

proibido. Contudo, houve a previsão para a construção de criadouros comerciais para

fins econômicos e industriais16, que foram normatizados pelas portarias 142-N, de 30 de

dezembro de 1992 e 70 de 23 de agosto de 1996. Contudo, a despeito desses esforços,

acredita-se que a população de tartarugas-da-amazônia sofreu um acentuado declínio

nos últimos 90 anos, devido a intensificação do comércio ilegal e a superexploração

para o consumo não convencional1,13.

2.2. Análises Bioquímicas

A análise bioquímica de analitos encontrados no plasma e no soro é uma

ferramenta amplamente utilizada nas mais variadas espécies animais para se avaliar o

funcionamento e o estado de saúde dos diversos órgãos e tecidos do organismo47.

Apesar da falta de estudos para validação, esses testes também são rotineiramente

aplicados em répteis e a interpretação das alterações é feita de forma similar aos

mamíferos, mas levando-se em consideração particularidades da fisiologia das diversas

espécies48.

Existem valores de referência publicados para algumas espécies de répteis,

mas estes devem ser utilizados apenas como parâmetros do que pode ser encontrado,

pois a grande maioria foi obtido com um número muito pequeno de animais. Outros

fatores como temperatura, área geográfica, hábitos ecológicos, estado nutricional,

gênero e idade também podem interferir nos analitos sanguíneos49.

2.2.1. Aspartato amininotrasferase (AST)

A AST se localiza no citosol e nas mitocôndrias das células e possui meia

vida variável entre as espécies50. Suas maiores concentrações se encontram no fígado e

nos músculos, não sendo específica para nenhum dos dois locais. Desse modo,

aumentos na atividade sérica AST são melhores interpretados quando analisados em

4

conjunto com enzimas que possuem maior especificidade, como a creatinofosfoquinase

(CK). Elevações da atividade sérica de AST, sem alterações nas concentrações de CK,

provavelmente são de origem hepatobiliar51. Processos como toxemia e septicemia

também podem provocar o aumento de ambas enzimas. 50,52.

2.2.2. Creatinofosfoquinase

A CK é encontrada em grande quantidade nos músculos e no coração,

seguidos do diafragma e dos músculos lisos. Possui meia vida curta em todas as

espécies, variando de 2 a 8 horas. É bastante utilizada como marcador de traumas e

danos recentes50. Aumentos da atividade de CK, junto com elevações discretas a

moderadas de AST, indicam lesões musculares. Entretanto, por ser bem específica,

aumentos na atividade enzimática nem sempre indicam dano muscular visível e podem

estar associados a esforços musculares53.

2.2.3. Fosfatase alcalina (FA)

A FA é uma enzima presente no soro em sua forma solúvel, mas que

também está distribuída na membrana celular de tecidos por todo o organismo e sua

meia vida pode variar de 6 a 70 horas, a depender da espécie54. Nos ossos, ela atua em

uma das fases do processo de mineralização, possuindo assim uma maior atividade em

filhotes ou em alterações que interfiram nesse processo50. Não é considerada específica

para nenhum órgão em répteis e elevações de suas concentrações podem estar

associadas a com atividade osteoblástica aumentada e hiporatireoidismo52,54.

2.2.4. γ-glutamil transferase (GGT)

A GGT é outra enzima ligada a membranas celulares, com maior presença

tecidual nas células dos canalículos biliares, hepatócitos e em células do epitélio

pancreático e dos túbulos renais. Sua atividade sérica e tecidual varia entre as espécies,

sendo quase ausente em algumas51 e mais elevada em outras55. Mesmo nas espécies

com menores níveis, o sítio com maior atividade é o tecido renal. Entretanto, na

ocorrência de doença renal, elevações dos níveis dessa enzima no soro não são

esperados, já que ela se localiza principalmente nas células epiteliais tubulares e sua

eliminação ocorre pela urina50,51,56. Desse modo, elevações séricas da GGT precisam ser

5

avaliadas com cuidado, pois seu significado clínico ainda não é completamente

entendido.

2.2.5. Ferro

O ferro é um íon inorgânico essencial para inúmeros processos metabólicos

como constituinte de inúmeras proteínas importantes para o organismo. É absorvido no

intestino e no plasma, devido a sua grande capacidade oxidativa, é transportado ligado

uma proteína transportadora, a transferrina. Uma vez absorvido pelas células, quase

nenhum ferro é perdido, a menos que uma hemorragia ocorra57,58. A deficiência de ferro

geralmente é causada por doenças que provoquem a perda ou diminuição da produção

de proteínas plasmáticas, parasitismo, hemorragias, nutrição inadequada, problemas

intestinais ou sequestro devido a condições inflamatórias24.

2.2.6. Cálcio e fósforo

Em répteis, os íons cálcio e fósforo têm seus níveis regulados pelo

paratormônio, pela calcitonina e pela vitamina D ativada. As concentrações de cálcio,

na maioria dos répteis, se encontram entre 8 a 11 mg/dL e podem variar devido a

espécies, particularidades fisiológicas e gênero, com fêmeas apresentando maiores

concentrações. Deficiências de cálcio geralmente possuem fundo nutricional, são

relacionados a deficiências de vitamina D, aumento da ingestão de fósforo,

hipoalbuminemia ou hipoparatireoidismo52.

Os níveis de fósforo geralmente se situam entre 1 e 5 mg/dL e diferenças de

gênero também foram demonstradas, com machos apresentando concentrações menores.

Diminuições nos níveis séricos podem ser causados por problemas nutricionais, já

aumentos estão associados a aumento da ingestão, hipervitaminose D, doença renal e

hemólise52. Juntos esses dois íons são um indicador confiável de doença renal, sendo

comumente o primeiro indicador bioquímico de seu aparecimento59.

2.2.6. Colesterol

O colesterol é uma molécula sintetizada no fígado, encontrada apenas em

animais, que é precursora de hormônios, da vitamina D e dos ácidos biliares, compondo

também membranas celulares e micelas biliares60. A presença de colesterol no plasma

varia de acordo com a dieta do réptil, com herbívoros apresentando menores

6

concentrações quando comparados com onívoros e carnívoros e sua análise pode ser útil

no diagnóstico de doenças hepáticas52. Além de estados fisiológicos, como a nidação,

período pós-prandial, pré-hibernação e durante a vitelogênese, também pode estar

aumentado devido a lipidose hepática ou hipervitaminose D55,61. Apesar de não muito

estudado, a falência hepática grave pode causar hipocolesterolemia devido a diminuição

de síntese.

2.2.7. Ureia

Répteis são animais uricotélicos em sua maioria, excretando principalmente

ácido úrico. Entretanto, répteis que passam a maior parte de sua vida em ambientes

aquáticos excretam ureia e entres estes, apenas quelônios e animais da família

Sphenodontia promovem a excreção em níveis consistentes62. Na maioria dos répteis a

ureia é considerada um indicador ruim para doença renal devido a sua baixa produção.

Em quelônios, aumentos e diminuições relacionados a ingestão, respectivamente, de

dietas com alto e baixo teor de proteína foram relatados, tornando-a um possível

indicador de estado alimentar63.

2.2.8. Proteínas séricas totais (PST) e albumina

As proteínas séricas totais (PST) correspondem a diferentes compostos

nitrogenados que constituem o maior grupo de constituintes sanguíneos. Em répteis

saudáveis, é esperado uma concentração entre 3 e 7 mg/dL, com fêmeas demonstrando

aumentos em algumas fases do ciclo reprodutivo52. Sua análise é importante tendo em

vista que suas frações se modificam em resposta a infecções e doenças ajudando a

diagnosticar o estágio de inflamações e infecções, a origem nutricional ou neoplásica de

disproteinemias e a existência de doenças metabólicas52,64. Hiperproteinemia pode

ocorrer em fêmeas em nidação, animais desidratados ou em hiperglobulinemia

associada a doenças inflamatórias crônicas50.

Entre as PST, a que apresenta maior concentração é a albumina,

contribuindo com até 50% de todas as proteínas totais. É sintetizada pelos hepatócitos e

sua taxa de síntese é controlada pela pressão coloidosmótica, apesar de sofrer

influências hormonais64, e algumas espécies apresentam maior concentração de

albumina que outras55. A diminuição das concentrações séricas podem ocorrer devido a

doenças glomerulares severas que causem a perda proteica, resposta de fase aguda a

7

inflamações ou mesmo devido a contaminação por linfa durante a colheita da

amostra59,65. As PST e a albumina podem ser usadas como bons indicadores de estado

nutricional, apenas se alterando se acontecer uma intensa diminuição do consumo de

proteína bruta11.

2.3 Hematologia e hemograma de répteis

Hematologia se refere ao estudo dos aspectos normais e patológicos do

sangue, um tecido de consistência líquida, composto por plasma e células, cuja função

primária é o transporte de gases e nutrientes entre os diversos tecidos de um

organismo17,18. Por meio da análise do hemograma, geralmente subdividido em

eritrograma, leucograma e plaquetograma, é possível obter informações a respeito de

várias doenças que alteram os constituintes sanguíneos normais, sobre o estado de saúde

geral do animal e também como indicador prognóstico19,20. Diferente de mamíferos,

onde a análise da amostra de sangue é rotineiramente feita de forma automatizada há

décadas, a contagem de células em répteis ainda é feita por meio de métodos manuais,

que são mais propensos a erros analíticos que os automáticos21.

Apesar das características gerais serem parecidas, o hemograma varia

bastante entre as diferentes espécies de répteis ou mesmo entre indivíduos da mesma

espécie, com a resposta celular sendo menos previsível do que o encontrado em

mamíferos e aves22,23. Além disso, fatores como as condições ambientais, variações

estacionais, localização geográfica, local de venopunção, contenção, métodos

laboratoriais utilizados, dieta, gênero e idade também interferem7,8, tornando mais

difícil o estabelecimento de valores de referência e a interpretação dos resultados

obtidos7,23.

2.3.1 Eritrograma

No eritrograma avalia-se o número total de hemácias, o hematócrito, a

dosagem de hemoglobina, os índices eritrocitários e a morfologia destas células24. Em

répteis saudáveis os hemácias maduros são nucleados, de formato arredondado a

elipsoidal, podendo apresentar bordas irregulares, com núcleo centralizado,

apresentando cromatina densa, de coloração roxo escuro, e citoplasma que se cora

fracamente de rosa, dependendo da coloração utilizada19,23,25.

8

Sua função é semelhante à dos mamíferos e possuem vida média estimada

na circulação de 600 a 800 dias, podendo ser maior em animais que hibernam8,25.

Morfologicamente, dentro de um mesmo esfregaço, as hemácias maduras costumam

possuir formato, cor e tamanhos homogêneos. Também é comum encontrar uma

pequena porcentagem (< 2%) de hemácias imaturas que são células maiores e mais

arredondadas, com citoplasma mais basofílico, maior relação núcleo:citoplasma e

cromatina menos densa que os eritrócitos maduros7,25.

O hematócrito (HTC) e a concentração de hemoglobina de animais

saudáveis geralmente é menor do que o encontrado em mamíferos e aves, situando-se

entre 20 e 40% e 5,5 a 12g/dL, respectivamente24. Os índices eritrocitários podem ser

calculados de forma semelhante as outras classes8. O volume corpuscular médio (VCM)

costuma ser maior quando comparado com mamíferos, o que se traduz em contagens

totais de hemácias menores, devido a relação inversa que existe entre VCM e número de

eritrócitos26. Apesar do maior volume indicar uma maior concentração de hemoglobina

por eritrócito, os répteis possuem uma concentração de hemoglobina corpuscular média

(CHCM) menor que as outras classes, provavelmente devido ao espaço ocupado pelo

núcleo. Contudo esses valores, a depender da espécie, podem apresentar uma grande

variação17,26. As informações obtidas no eritrograma são utilizadas para classificar as

anemias, que possuem etiologia similar a encontrada em aves e mamíferos27, indicar a

presença de inclusões parasitárias ou virais7 e ajudar a estabelecer uma lista de

diagnósticos diferenciais24.

2.3.2 Leucograma

O conjunto de dados numéricos, absolutos e relativos, do perfil leucocitário

associado com qualquer anormalidade morfológica observada, cuja interpretação

fornece informações cruciais sobre o desenvolvimento de processos inflamatórios, é

chamado de leucograma28. Os leucócitos de répteis podem ser divididos em dois grupos:

granulócitos e células mononucleares, com o primeiro grupo se subdividindo em

acidófilos e basófilos, e o segundo em linfócitos e monócitos8,27.

Cinco tipos de leucócitos diferentes costumam ser identificados no

esfregaço sanguíneo (Figura 2): heterófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e

monócitos29. Um sexto tipo, os azurófilos, são encontrados em ordens como Squamata e

9

Crocodilya, mas raramente aparecem nos Testudinatas30. Todavia, já foram descritos

em três espécies do gênero Podocnemis31.

FIGURA 2 – Células sanguíneas de tartaruga-da-amazônia (Podocnemis expansa). A) Heterófilo. B)

Eosinófilo. C) Basófilo. D) Linfócito. E) Monócitos. F) Trombócitos.

Os heterófilos são análogos aos neutrófilos encontrados em mamíferos e

desempenham um papel importante na fagocitose e na resposta da imunidade inata a

estímulos inflamatórios9,24. Em geral são células grandes, podendo apresentar

pseudopodia, com citoplasma de cor clara, com grânulos rosa-alaranjados, um núcleo

excêntrico e que costuma ser redondo7,9. Contudo, em algumas espécies este pode ser

bilobado9,27. Alterações morfológicas dos heterófilos, notadamente o aumento da

basofilia citoplasmática, degranulação, vacuolização e granulação citoplasmática

anormal, estão intimamente ligadas a resposta a infecções, processos inflamatórios e

necrose24 e são utilizadas como marcador prognóstico.

Em répteis, os eosinófilos ainda não tiveram sua função bem esclarecida,

mas eosinofilia já foi associada a parasitismo e outras estimulações antigênicas24.

Costumam ser células grandes e arredondadas, com tamanho variável, e citoplasma

transparente a azul-claro e com grânulos geralmente esféricos e eosinofílicos - que

podem se corar azul-esverdeado em algumas espécies de lagartos8,32 - núcleo

arredondado ou lenticular, raramente lobado e excêntrico, com cromatina

densa8,17,23,25,32. Compõem entre 7 a 20% dos leucócitos em répteis saudáveis, com as

maiores porcentagens encontradas com maior frequência em lagartos e as menores em

10

quelônios24,33. Anormalidades morfológicas em eosinófilos são raras e a degranulação

pode ser um artefato de preparação das lâminas ou de coloração inadequada25,33.

Os basófilos são células arredondadas de tamanho médio e que costumam

ser menores que heterófilos e eosinófilos, de núcleo redondo, centralizado e com

cromatina densa. Seus grânulos se coram intensamente, chegando a impedir a

visualização do núcleo, entretanto é comum que não se corem quando utilizados

corantes do tipo Romanowsky a base de água32,33. Sua função ainda não é

completamente conhecida, mas já se observou que seu número aumenta em alguns tipos

de infecções virais e em hemoparasitismo24. É possível encontrar uma grande variação

na porcentagem de basófilos circulantes, com algumas espécies apresentando 0,8% e

outras até 63% em média24,34.

Os linfócitos são morfologicamente semelhantes aos de mamíferos e aves,

possuindo tamanho variável e são o tipo celular predominante na circulação da maioria

das espécies de répteis, podendo atingir até 80% dos leucócitos circulantes24. Quando

maduros, se apresentam como células de citoplasma fracamente basofílico,

normalmente sem grânulos, alta relação núcleo:citoplasma, com um núcleo

cromatofílico preenchendo quase toda a célula25. Grandes linfócitos podem aparecer em

casos de estimulação antigênica e tendem a possuir citoplasma mais abundante,

basofílico, com vacuolizações e núcleo excêntrico22,33. A linfocitose pode ocorrer

fisiologicamente, durante a ecdise, ou estar relacionada a doenças infecciosas,

inflamatórias e ferimentos em resolução, indicando um processo crônico23. A linfopenia

está associada a condições que causam estresse e imunossupressão e também com má-

nutrição23.

Os monócitos, a depender do estímulo enfrentado pelo organismo, variam

muito em tamanho e formato, mas costumam ser as maiores células encontradas na

circulação27. Possuem citoplasma abundante, de cor azul-acinzentada, com bordas bem

definidas, que pode se apresentar vacuolizado, e núcleo de forma ameboide,

arredondado ou reniforme23,24. A despeito da pouca informação sobre seu papel na

regulação da resposta inflamatória, sabe-se que os monócitos são constituintes

importantes e a formação de granulomas e de células gigantes multinucleadas é

comum35.

Alguns autores fazem distinção de um outro tipo celular, os azurófilos, que

combinam características de heterófilos e monócitos. São ligeiramente menores que os

monócitos, com citoplasma mais basofílico, finamente granular e vacuolizado2736.

11

Também apresentam atividade fagocíticas e podem estar associados com estágios

precoces de inflamações e infecções bacterianas, principalmente em cobras24,33.

Todavia, em lagartos e quelônios, essas células possuem propriedades citoquímicas

semelhantes aos de monócitos, não sendo diferenciadas destes durante a realização da

contagem diferencial23,25,33.

2.3.1 Trombograma

O trombograma fornece informações numéricas sobre a concentração de

trombócitos por µL de sangue. Sua determinação é complicada, pois os estas células

tendem a se aglomerar in vitro, principalmente quando expostos a heparina, o

anticoagulante mais utilizado na hematologia de répteis, podendo levar a uma

interpretação errônea dos resultados23,25. Os trombócitos possuem funções correlatas às

plaquetas em mamíferos, exercendo papel central nas etapas de formação do trombo e,

do mesmo modo que suas contrapartes, apresentam mudanças conformacionais,

degranulação e agregação quando ativados23,33.

Em répteis, no geral, trombócitos são pequenas células nucleadas, de

formato elíptico a redondo, núcleo central e com cromatina densa. O citoplasma se

apresenta tipicamente claro a azul-pálido, com ocasional granulação azurofílica.23,33,37.

Podem ser facilmente confundidos com pequenos linfócitos na maioria das espécies,

devido a suas semelhanças morfológicas7,25. Diferente das plaquetas, os trombócitos

ainda possuem capacidades fagocíticas, que individualmente, são comparáveis a dos

macrófagos, sugerindo que estas células também desempenham importante papel na

resposta imune inata. Entretanto, a extensão dessa contribuição é desconhecida37.

2.4. Técnicas hematológicas de contagem

Nas últimas décadas, a utilização de técnicas automatizadas para a contagem

dos tipos celulares sanguíneos avançou de forma constante em mamíferos e aumentou

muito a precisão das análises obtidas. Contudo, estes avançados não ecoaram na rotina

laboratorial de répteis e outros vertebrados inferiores, em parte, graças a presença de

eritrócitos e trombócitos nucleados21. Apesar de ser possível a realização da contagem

automatizada de eritrócitos em alguns aparelhos, não há ainda validação desse método

para répteis38, de modo que para a realização do hemograma ainda são utilizados

métodos manuais (Figura 3)21.

12

2.4.1. Contagem de eritrócitos

A contagem de eritrócitos é realizada de maneira direta, com o auxílio de

um hemocitômetro e de um diluente33. O método mais comum na prática laboratorial

utiliza o diluente proposto por Natt & Herrick39, que cora os núcleos das hemácias de

uma cor violeta escura, e diluição de 1:200. Após a mistura, o sangue diluído é colocado

no hemocitômetro e deixado em repouso por 5 minutos dentro de uma câmara úmida,

para permitir a sedimentação das hemácias e evitar a evaporação do líquido. Após esse

tempo, os eritrócitos são contados em cinco quadrados do quadrante central, nos dois

lados da câmara de contagem, e o número resultante é multiplicado por 10.00040 (Figura

3). Uma diferença superior a 10% na contagem obtida em cada lado da câmara indica

que houve um erro de procedimento e todo o processo precisa ser repetido8. Mesmo

com esses cuidados, esse método ainda possui um erro inerente de 10-20% atribuído a

pipetagem e diluição38,40,41.

2.4.1. Contagem de leucócitos

Para leucócitos a contagem direta é meio mais comum na rotina e o

procedimento, que também faz uso de um hemocitômetro, é semelhante ao usado para a

contagem de eritrócitos, com a utilização dos mesmos diluentes e proporções de

diluição8,32,40. Os leucócitos se coram de cor azul-escura ou roxo-escuro e principal

diferença é que a contagem das células é realizada em todos os 9 quadrantes

hemocitômetro, com o valor obtido multiplicado por 20040 (Figura 3).

Ainda é possível realizar uma avaliação semiquantitativa dos leucócitos

totais através de métodos de estimativa em lâmina de esfregaço, principalmente se o

volume de sangue disponível for muito pequeno33. Existem várias técnicas para a

obtenção desses valores estimados, seja em relação a contagem total de hemácias42,43 ou

por um fator determinado pela objetiva utilizada33,44 (Quadro 1). A maior desvantagem

dessas técnicas é que um esfregaço tecnicamente imperfeito pode causar ruptura,

aglomeração e má-distribuição de células, com impactos diretos sobre os resultados44.

13

2.4.2. Contagem de trombócitos

A contagem de trombócitos também pode ser valer das mesmas técnicas

para eritrócitos e leucócitos, com a contagem no hemocitômetro realizada no quadrado

central dos dois lados da câmara e o resultado multiplicado por 5009 (Figura 3).

Entretanto, o número real é difícil de ser estimado, pois a dificuldade de se diferenciar

pequenos linfócitos e trombócitos, durante o procedimento da contagem, e a grande

capacidade que essas células possuem de formar agregados aumentam a imprecisão

dessa técnica40,41. Aumentar o tempo de contato da amostra com o diluente de Natt &

Herrick melhora a capacidade de diferenciação entre linfócitos e trombócitos41,45. Outra

alternativa é contar trombócitos junto com os leucócitos totais e realizar uma contagem

diferencial de 200 células que os inclua38.

Do mesmo modo que os leucócitos, é possível realizar uma estimativa da

concentração de trombócitos no sangue de répteis. A avaliação pode ser feita em relação

ao número total de hemácias contadas42,43 ou ao de leucócitos presentes no sangue33,40

(Quadro 1). Para isso também é preciso utilizar um esfregaço que possua boa

distribuição de células e que não contenha agregados trombocitários, já que a ocorrência

desses fatores contribui para a menor acurácia dessas estimativas33,40.

14

FIGURA 3 – Técnicas de contagem hematológica para hemácias. leucócitos e trombócitos. As

estrelas vermelhas indicam quais quadrados do quadrante central devem ser

contados. Os números indicam em quais quadrantes do hemocitômetro a contagem

deve ser realizada. A área em vermelho indica que todo o quadrante central deve ser

contado. Adaptado de: Campbell, T. Hematologic Techniques in Lower Vertebrates.

In: Campbell, T, editor. Exotic Animal Hematology and Cytology; 2015 p.199-205.

15

Quadro 1. Métodos para estimativa de leucócitos totais e trombócitos em lâmina de esfregaço de

tartarugas-da-amazônia (Podocnemis expansa) de acordo com diferentes autores. ELT =

Estimativa de leucócitos totais; ETT = Estimativa de trombócitos totais; CGA = Campo de

grande aumento.

Tipo celular Técnicas de estimativa hematológica

Leucócitos

ELT (µL) = (leucócitos em 1000 hemácias) x (n° total de hemácias) 43

1000

ELT (µL) = (leucócitos em 2000 hemácias) x (n° total de hemácias) 42

2000

ELT (µL) = leucócitos em 20 CGA(40x) X 1500 44

20

Trombócitos

ETT (µL) = (trombócitos em 1000 hemácias) x (n° total de hemácias) 43

1000

ETT (µL) = (trombócitos em 2000 hemácias) x (n° total de hemácias) 42

2000

ETT (µL) = (trombócitos em 200 leucócitos) x (n° total de leucócitos) 46

200

42 - Ishikawa et al., 2008; 43 – Tavares-Dias et al., 2008; Fulano et al., 2000; 44 – Latimer & Bienzle, 2010; 46

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CAPÍTULO 2 - Bioquímicas séricas de tartaruga-da-amazônia (Podocnemis

expansa): estabilidade de analitos em diferentes tempos de armazenamento

Fabricio Camargo2, Nadjanaira Barbosa Abrão2, Carolina Silva Petenusse2, Thawanne Delefrate Queiroz3, Emmanuel Arhnold4, Luciana Batalha de Miranda

Araújo5, Danieli Brolo Martins5*

Camargo, F., Abrão, N.B., Petenusse, C.S., Queiroz, T.D., Arnhold, E., Araújo, L.B.M., & Martins, D.B. 2017 [Arrau-turtle's (Podocnemis expansa) sera biochemistry: Frozen analytes stability and long-term storage in various times]. Bioquímica sérica de tartaruga-da-Amazônia (Podocnemis expansa): estabilidade de analitos congelados em diferentes tempos de armazenamento., Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Laboratório Clínico Veterinário, Hospital Veterinário, Departamento de Medicina Veterinária, Escola de Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Goiás, Rodovia Goiânia, km 8, s/n – Campus Samambaia, Goiânia, GO, 74001-970, Brasil. E-mail: [email protected] Abstract – Turtles plays a vital role as primary protein source for riverside populations in Brazil. The encouragement of the commercial breeding of these animals meets the conservationist efforts, as it is important to know how they behave in captive conditions. Sera biochemical tests are ancillary diagnostic tools and the storage conditions of this samples are one of the main problems faced, since there are not always clinical laboratories near to these species. Thus, the aim of this study was to provide information about the stability of albumin, aspartate aminotransferase (AST), calcium, creatine kinase (CK), total cholesterol (TC), alkaline phosphatase (ALP), iron, phosphorus, γ-glutamyl transferase (GGT), total serum proteins (PST) and urea at different storage times. Seventeen Amazonian turtles were used, and the serum obtained was separated into aliquots and analyzed at separate times: T0, T4, T8, T16 and T32 days at -20ºC. After evaluation of the results it was found that albumin, AST, CK, GGT, inorganic phosphorus, FA, urea, iron and PST suffer interference due to long storage time. Analytes such as calcium, TC, ALP and urea can be evaluated up to one month after freezing. AST, albumin and PST can be analyzed up to one week after freezing and CK, GGT, inorganic phosphorous and iron are best evaluated on fresh samples. INDEX TERMS: Chelonian, Frozen sample, Reptile, Long-term stability. 1 Recebido em........................

Aceito para publicação em ...................................

Parte da dissertação de mestrado do primeiro autor. 2 Programa de Pós-graduação em Ciência Animal (PPGCA), área de concentração em Cirurgia, Patologia Animal

e Clínica Médica (CiPAC). Escola de Veterinária e Zootecnica da Universidade Federal de Goiás (EVZ/UFG).

Goiânia, GO, Brasil. 3Graduanda em Medicina Veterinária, EVZ/UFG, Goiânia, GO, Brasil. 4 Departamento de Zootecnia, EVZ/UFG. Goiânia, GO, Brasil. 5 Departamento de Medicina Veterinária, EVZ/UFG. Goiânia, GO, Brasil. *Autor para correspondência:

[email protected]

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Resumo - Tartarugas cumprem um importante papel como fonte de proteínas para populações ribeirinhas no Brasil. O incentivo a criatórios comerciais para essa espécie vai ao encontro dos esforços conservacionistas, pois é importante conhecer como esses animais se comportam em condições de cativeiro. Exames bioquímicos séricos são ferramentas auxiliares de diagnóstico e um dos problemas enfrentados se encontra justamente nas condições de armazenamento de amostras, uma vez que nem sempre há laboratórios clínicos próximos a esses animais. Assim, esse trabalho objetivou fornecer informações sobre a estabilidade da albumina, aspartato aminotransferase (AST), cálcio, creatinofosfoquinase (CK), colesterol total (CT), fosfatase alcalina (FA), ferro, fósforo, γ-glutamil transferase (GGT), proteínas séricas totais (PST) e ureia em diferentes tempos de armazenamento. Foram utilizadas 17 tartarugas-da-amazônia e o soro obtido separado em alíquotas avaliadas em diferentes tempos: T0 (análise imediata), T4, T8, T16 e T32 sendo quatro, oito, 16 e 32 dias, respectivamente, a -20ºC. Verificou-se que albumina, AST, CK, GGT, fósforo, FA, ureia, ferro e PST sofreram interferências ao longo dos tempos de armazenamento. Analitos como cálcio, CT, FA e ureia podem ser avaliadas até um mês após o congelamento, enquanto que AST, albumina e PST até uma semana após o congelamento. CK, GGT, fósforo e ferro são melhores avaliados em amostras frescas. TERMOS DE INDEXAÇÃO: Conservação de amostras, Efeito de congelamento, Répteis, Quelônios.

INTRODUÇÃO

Os exames bioquímicos séricos são importantes ferramentas auxiliares de diagnóstico na prática médico-veterinária, constituindo uma maneira prática e eficaz de se conseguir informações sobre o estado geral de um animal. Contudo, para que se obtenha valores confiáveis, é necessário que o manejo e o processamento das amostras seja realizado de maneira adequada (Ehsani et al. 2008; Kaneko et al. 2008). Após a colheita e a etapa de centrifugação e separação do soro ou plasma, o tempo e a temperatura de armazenamento são importantes causas de variação dos resultados analíticos (Cray et al. 2009; Ehsani et al. 2008).

A estabilidade dos parâmetros bioquímicos no soro é a capacidade que estas amostras possuem de manter suas propriedades originais dado um período conhecido de tempo (Singh et al. 2015). Quando se tem em mente que um dos problemas mais comuns, enfrentados por veterinários de campo, principalmente os que atendem animais silvestres, é o devido acondicionamento de amostras para envio e processamento, conhecer o comportamento dos analitos e sua estabilidade ao longo do tempo quando congelados é essencial.

Enquanto na medicina encontra-se com facilidade inúmeros estudos, nem sempre concordantes (Devanapalli et al. 2002), que detalham os efeitos das diferentes condições de armazenamento das amostras a serem analisadas (Heins et al. 1995; Kift et al. 2015; Verma & Dahiya 2015; Kachhawa et al. 2017; Marjani 2008), em medicina veterinária a quantidade de trabalhos é restrita. É possível encontrar um maior número de trabalhos que avaliam o comportamento do soro em diferentes condições em cães (Thoresen et al. 1992; Divya & Jayavardhanan 2012), ratos (Singh et al. 2015; Spinelli et al. 2012) e equinos (Ada et al. 2017; Oliveira et al. 2016; Alberghina et al. 2013). Já em outras espécies, como felinos (Christopher & O’Neill 2000), bovinos (Tóthova et al. 2010; Ehsani et al. 2008),

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cordeiros (Oliveira et al. 2011) e aves (Hoppes et al. 2015; Hawkins et al. 2006) as informações ainda são escassas, tornando-se praticamente impossível encontrar literatura que descreva a estabilidade de analitos em répteis.

Assim, o objetivo desse trabalho foi fornecer informações sobre a estabilidade e mudanças nas concentrações observadas de albumina, aspartato aminotransferase (AST), cálcio, creatinofosfoquinase (CK), colesterol total (CT), fosfatase alcalina (FA), ferro, fósforo, γ-glutamil transferase (GGT), proteínas séricas totais (PST) e ureia, encontrados no soro congelado de tartarugas-da-Amazônia (Podocnemis expansa) e mensurados em diferentes tempos.

MATERIAL E MÉTODOS

Para a realização desse trabalho, foram utilizadas 17 tartarugas-da-Amazônia (Podocnemis expansa) cultivadas no Setor de Piscicultura da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (latitude 16°35'44.9"S e longitude 49°16'54.6"W), com 10 anos de idade, alimentadas com ração para peixes de fabricação própria. O projeto foi autorizado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFG), sob nº 62/2014, e pelo SISBIO/IBAMA nº 47924-1. Os animais foram capturados, contidos fisicamente e anestesiados com uma mistura de cetamina (Vetnil®, 10%, 20mg/Kg) e midazolan (Dormonid®, Roche, 5mg/mL, 2mg/Kg). Em seguida, o sangue foi colhido a partir do seio cervical (Owens & Ruiz 1980), utilizando-se seringas de 10ml e agulhas 0,7x25 mm, e transferido para tubos plásticos de 5mL sem anticoagulante e com gel separador. Para a formação do coágulo, os tubos foram mantidos em temperatura ambiente (25°C) por 30 minutos e depois centrifugados por 10 minutos a 3800 rotações por minuto.

O soro foi separado em cinco alíquotas, sendo a primeira utilizada para análise imediata afim de se obter os valores basais (T0) de cada animal e as quatro amostras restantes envoltas em papel alumínio e congeladas a -20°C (em freezer do tipo “frost free”) para avaliação em diferentes tempos, que foram estabelecidos da seguinte forma: T4, T8, T16 e T32, ou seja, quatro, oito, 16 e 32 dias após a colheita, respectivamente. Para o descongelamento, as amostras foram retiradas do freezer e colocadas em temperatura ambiente por 30 minutos, e após, foram homogeneizadas por um minuto.

A determinação dos valores de albumina (verde de bromocresol), aspartato aminotransferase (AST) (método cinético UV – IFCC), cálcio (método CPC), creatinofosfoquinase (CK) (método IFCC), colesterol total (método enzimático – Trinder), fosfatase alcalina (Bowers e Mc Comb modificado), ferro sérico (Goodwin modificado), fósforo (método do fósforo-molibdato), gama-glutamiltransferase (GGT) (Szasz modificado), proteínas séricas totais (método do biureto) e ureia (método enzimático UV) foram realizados utilizando-se reagentes comerciais (Labtest Diagnóstica®, Lagoa Santa, Minas Gerais) de acordo com as instruções do fabricante e analisador bioquímico automático (CM-250, Wiener Lab®, Rosário, Argentina).

Os valores obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias resultantes comparadas a 5% de probabilidade por meio do teste de Scott-Knott, utilizando-se, para isso, o software R (R Core Team 2011).

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RESULTADOS

Neste estudo, verificou-se que vários constituintes séricos armazenados a -20 °C sofreram interferências ao longo do tempo de armazenamento. Os resultados estão dispostos na Tabela 1.

É possível notar que a albumina demonstrou inicialmente uma pequena tendência a diminuição, de maneira não significativa (p>0,05), seguida de um aumento significativo (p<0,05) em seu valor em T16 e em T32. Por sua vez, a atividade da AST apresentou uma diminuição continuada entre os diferentes tempos, acentuando-se após T8 e tornando-se estatisticamente representativa (p<0,05) em T16 e T32.

CK, GGT e fósforo apresentaram diminuições significativas (p<0,05) entre T0 e T4 e entre T4 e T8. O ferro também apresentou redução em suas concentrações, com mudanças significativas (p<0,05) entre os momentos T0 e T4, mantendo-se estável nos outros tempos. Cálcio e CT se mostraram estáveis ao longo de todo o período de análises (p>0,05).

A atividade da FA foi significativamente menor (p<0,05) que a média em T16, mas nos demais tempos, verificou-se um comportamento estável (p>0,05). A ureia também sofreu uma alteração estatisticamente significante (p<0,05) em T4, mantendo a estabilidade (p>0,05) nos demais tempos. As PST apresentaram comportamento de estabilidade durante entre T0 e T16 com uma elevação significativa (p<0,05) em T32.

DISCUSSÃO

Sabe-se que as variáveis encontradas na fase pré-analítica exercem forte influência sobre os resultados de parâmetros sanguíneos e bioquímicos (Forsyth et al. 2006). Entre essas variáveis, o armazenamento é certamente uma das frequentes fontes de discordância entre autores (Thoresen et al. 1995; Devanapalli et al. 2002). Deste modo, esse trabalho acrescenta dados a esse debate, bem como lança luz sobre o comportamento de analitos bioquímicos em uma espécie importante e com poucas informações na área até então.

Neste estudo, o comportamento da albumina foi semelhante ao reportado por outros pesquisadores em tempos e temperaturas comparáveis (Kachhawa et al. 2017) e também em períodos menores de congelamento, de apenas 2 dias (Alberghina et al. 2013; Boyanton & Blick 2002). Outro trabalho apontou um comportamento variável, quando analisada em soro congelado por mais de 15 dias (Oliveira et al. 2011). Entretanto, os autores julgaram que essas variações não eram importantes, pois não foram consideradas clinicamente significativas (Kachhawa et al. 2017; Boyanton & Blick 2002). Contudo, a escassa quantidade de trabalhos publicados (Tavares-dias et al. 2009; Oliveira-Júnior et al. 2009; Mundim et al. 2004) e a ausência de valores de referência para a espécie, aumentam a dificuldade em julgar o que é uma alteração clinicamente significativa.

A AST, em trabalhos com soro equino (Oliveira et al. 2016), canino (Divya & Jayavardhanan 2012), murino (Singh et al. 2015) e humano (Kachhawa et al. 2017) apresentou a mesma perda de atividade ao longo do tempo, sem que essa diminuição fosse importante estatisticamente. Outro trabalho, com ratos Sprague-Dawley (Cray et al. 2009), apontou a estabilidade da AST até 30 dias de armazenamento a -20°C. Essa perda de atividade pode estar ligada a proteólise

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por proteinases séricas, agregação proteica e a pequenas alterações de pH sofridas por essa enzima (Herrmann et al. 2001).

Uma diminuição da atividade da CK, semelhante a encontrada, foi demonstrada em diferentes tempos, por vários autores (Forsyth et al. 2006; Gislefoss et al. 2015; Thoresen et al. 1995; Cho & Meltzer 1979). É importante lembrar que a atividade total da CK é a soma de várias isoenzimas (Crother et al. 1999) e que cada uma de suas isoformas podem apresentar comportamentos diferentes quando submetidas as mesmas condições de armazenamento (Cho & Meltzer 1979). Além disso, a CK é uma enzima sabidamente lábil, que é melhor conservada quando armazenada com diferentes compostos tiólicos (Gislefoss et al. 2015; Cho & Meltzer 1979), e podem existir diferenças interespecíficas importantes na expressão e no formato dessas isoenzimas, que podem contribuir para a diminuição de sua atividade (Crother et al. 1999).

A diminuição da GGT, como encontrada nesse trabalho, ainda não havia sido reportada. Contudo, alguns pesquisadores reportaram que a GGT é estável por até 30 dias a -20°C em soro de ratos Wistar (Singh et al. 2015) e em soro humano (Cuhadar et al. 2013). Contudo, informações discrepantes são fornecidas a respeito do soro bovino, desde sua estabilidade por até 4 semanas (Muller et al. 1997) até aumentos na atividade enzimática a partir de 8 dias (Divya & Jayavardhanan 2014). Quando armazenada em temperatura de refrigeração, é esperado que exista uma diminuição de atividade após 24 horas (Eisenhawer et al. 2008).

O comportamento do fósforo e do ferro foi inesperado, já que a literatura aponta que ambos possuem grande estabilidade ao longo de diferentes tempos e condições de armazenamento (Singh et al. 2015; Oliveira et al. 2011; Kachhawa et al. 2017; Oddoze et al. 2012; Gislefoss et al. 2008). Assim, mais pesquisas são necessárias para esclarecer o comportamento desses analitos em tartarugas-da-Amazônia ou se estes resultados se repetem em répteis em geral.

A estabilidade do cálcio, como observada no presente trabalho, já foi documentada em publicações com soro humano, onde alguns pesquisadores demonstraram que as concentrações de cálcio permaneceram as mesmas por períodos extensos de tempo, quando o soro foi mantido congelado a -25°C (Gislefoss et al. 2008). Em ratos Wistar, este mineral é instável quando mantido em temperatura de refrigeração por até 6 horas, mas ao ser congelado manteve-se inalterado por até 4 semanas (Singh et al. 2015). Outro experimento, com ratos Sprague-Dawley, houve aumento do cálcio após 360 dias de armazenamento a -20°C (Cray et al. 2009).

Quanto ao CT, a ausência de alterações no soro de ratos foi reportada quando armazenado congelado por até 120 dias (Spinelli et al. 2012; Singh et al. 2015) e o mesmo parece ocorrer em cordeiros (Oliveira et al. 2011). Em humanos, é relatada estabilidade por até 1 ano (Jansen 2014), bem como, diferenças significativas entre variados tempos de armazenamento, mas sem que isso apresentasse implicações clínicas (Kachhawa et al. 2017). Todavia, ainda é necessário descobrir se esse comportamento se estende as demais frações do colesterol.

O comportamento estável da FA é correlato ao encontrado em soro equino (Oliveira et al. 2016) e de ratos (Singh et al. 2015), mas diferente da redução gradual descrita em amostras humanas (Thoresen et al. 1995) e caninas (Divya & Jayavardhanan 2012) armazenadas por período comparável. A queda observada em T16, pode estar relacionada, tal qual a CK, as diferentes isoformas que

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compõem a fração total da FA mensurada (Fernandez & Kidney 2007). Assim, o comportamento específico de cada isoforma em diferentes condições e temperaturas de armazenamento deve ser melhor investigado.

O aumento significativo da ureia em T4 pode ter ocorrido devido a contaminação da amostra e crescimento bacteriano (Kachhawa et al. 2017), apesar de não ter sido notado nenhuma intercorrência ou alteração sugestiva de proliferação de bactérias durante a realização das análises. Nos demais tempos (T0, T8, T16 e T32) a ureia apresentou-se estável, de maneira semelhante ao encontrado em cordeiros (Oliveira et al. 2011), equinos (Oliveira et al. 2016), ratos (Cray et al. 2009) e em humanos (Kachhawa et al. 2017). Entretanto, um estudo relatou elevações variáveis dos níveis de ureia em amostras humanas quando estas foram congeladas a -20°C (Cuhadar et al. 2013).

As PST também apresentaram comportamento de estabilidade durante a maior parte do período avaliado, apesar da diminuição notada em T3 não ter significância estatística. Em T4, o aumento foi estatisticamente significativo, o que se assemelhou ao encontrado em estudos conduzidos com soro de cabras (Nagyová et al. 2016) congelado por até uma semana, soro de cordeiros (Oliveira et al. 2011) congelado por até 28 dias e também em soro congelado de equinos por 48 horas (Alberghina et al. 2013). Essas alterações podem estar relacionadas com o processo de descongelamento das amostras (Cuhadar et al. 2013) e com efeitos físico-químicos inerentes as propriedades constituintes do soro (Nagyová et al. 2016), de modo que seriam necessários a realização de novos estudos para esclarecer essa questão.

É importante ressaltar que muitas dessas alterações podem ocorrer devido a diferenças individuais e inter-específicas (Cray et al. 2009; Crother et al. 1999; Cho & Meltzer 1979) . Citam-se como exemplos possíveis parâmetros relacionados aos animais utilizados na presente pesquisa, a erros sistemáticos que tenham ocorrido em alguns dias (Kachhawa et al. 2017), às diferenças no processamento, às condições de armazenamento e metodologias de teste (Cray et al. 2009) ou mesmo ao pequeno número de amostras colhidas. Assim, estas alterações devem ser vistas como parte de um estudo preliminar sobre a estabilidade sérica de analitos do soro de tartarugas-da-Amazônia.

CONCLUSÃO

Em tartarugas-da-Amazônia, os analitos cálcio, colesterol total, fosfatase alcalina e a ureia são determinados, sem prejuízos para a interpretação dos dados, em até um mês após o congelamento a -20ºC. AST, albumina e PST apresentam resultados fidedignos se mensurados até uma semana após o congelamento a -20ºC. Já as enzimas CK e GGT, bem como os minerais ferro e fósforo, devem ser avaliados em amostras frescas, não congeladas.

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31

LEGENDA DA TABELA

Tabela 1. Efeitos do congelamento (-20°C) em analitos séricos de tartarugas-da-amazônia

(Podocnemis expansa) em diferentes momentos: T0 (dia 0), T1 (4 dias), T2 (Dia 8), T3(Dia

16), T4(Dia 32). EP = erro padrão; CV = Coeficiente de variação; AST = Aspartato

aminotransferase; ALT = Alanina aminotransferase; CK = creatinofosfoquinase; Col. T. =

Colesterol total; FA = Fosfatase alcalina; GGT = gama-glutamiltransferase; PST = Proteínas

séricas totais. Médias seguidas pelas mesmas (a, b e c) letras são idênticas estatisticamente

pelo teste de Scott-Knott (p>0,05).

32

T0 T4 T8 T16 T32

Analito CV (%) Médias + EP

Albumina (g/dl) 10,3 2,51a ± 0,07 2,28a ± 0,07 2,37 a ± 0,07 2,67 b ± 0,07 2,75b ± 0,07

AST (U/L) 13,2 264a ± 8 256a ± 8 236a ± 8 227b ± 8 224b ± 8

CK (U/L) 7,1 18373a ± 285 16650b ± 285 15919c ± 285 15572c ± 285 15341c ± 285

Cálcio (mg/dL) 8,6 10,69a ± 0,22 10,78a ± 0,22 10,71a ± 0,22 10,74a ± 0,22 10,20a ± 0,22

Col. T. (mg/dL) 9,4 90a ± 2 94a ± 2 91a ± 2 93a ± 2 90a ± 2

FA (UI/L) 16,4 101a ± 4 103a ± 4 97a ± 4 87b ± 4 108a ± 4

Ferro (µg/dL) 36 195a ± 12 113b ± 12 112b ± 12 103b ± 12 125b ± 12

Fósforo (mg/dL) 12,9 6,35a ± 0,16 5,53b ± 0,16 4,9c ± 0,16 4,66c ± 0,16 4,34c ± 0,16

GGT (UI/L) 19,9 14,7a ± 0,53 11,2b ± 0,53 9,8c ± 0,53 9,3c ± 0,53 9,2c ± 0,53

PST (g/dL) 7,1 4,67a ± 0,08 4,78a ± 0,08 4,81a ± 0,08 4,18a ± 0,08 5,2b ± 0,08

Ureia (mg/dL) 22,6 91,8b ± 5,5 120a ± 5,5 94,8b ± 5,5 100,5b ± 5,5 95,7b ± 5,5

33

CAPÍTULO 3 - Comparação de diferentes técnicas de contagem de leucócitos e 1

trombócitos em tartaruga-da-amazônia (Podocnemis expansa) 2

Different techniques comparison for leukocytes and thrombocytes count in Arrau-3

turtle (Podocnemis expansa) 4

5

RESUMO 6

Em répteis, há falta padronização das técnicas hematológicas e a contagem dos tipos 7

celulares ainda é realizada manualmente, por meio de técnicas diretas, principalmente a 8

técnica de Natt-Herrick, ou ainda, por estimativas obtidas do esfregaço sanguíneo. 9

Assim, este trabalho objetivou realizar a comparação entre diferentes métodos 10

estimativos com a técnica de contagem manual, para a obtenção dos valores para 11

leucócitos e trombócitos em tartaruga-da-amazônia (Podocnemis expansa). Para isso, 12

foram utilizados 20 animais, cujo sangue foi colhido por punção do seio cervical e 13

esfregaços de sangue não heparinizados foram preparados imediatamente após a 14

colheita. As contagens totais de leucócitos (CTL) e de trombócitos (CTT), foram feitas 15

pelo método direto segundo Natt-Herrick, deixando as amostras em contato com o 16

sangue por 30 minutos antes da realização da contagem. As estimativas de leucócitos e 17

trombócitos totais (ELT e ETT) foram realizadas avaliando-se o esfregaço sanguíneo. 18

Ficou demonstrado que os métodos apresentaram médias estatisticamente distintas, 19

além de não possuírem nenhuma correlação com o método de contagem direta. Pode 20

concluir que as estimativas e as técnicas de contagem direta de leucócitos e trombócitos 21

em tartarugas-da-amazônia não são equivalentes entre si, mas as informações obtidas 22

podem ser úteis na realização de hemogramas nesta espécie. 23

PALAVRA-CHAVE: Esfregaço sanguíneo, leucograma, trombograma, répteis, 24

quelônios 25

34

ABSTRACT 1

In reptiles, hematological techniques are not well established, and the counting of 2

different cell types is still performed manually, using direct techniques such as Natt-3

Herrick's, or through estimation techniques. The aim of this study was to compare blood 4

smear estimation methods with the manual technique to obtain the values for leukocytes 5

and thrombocytes. For this, 20 Arrau turtles (Podocnemis expansa) were used, whose 6

blood was collected by cervical sinus puncture and non-heparinized blood smears were 7

prepared immediately after harvest. The total count of leukocytes (TLC) and 8

thrombocytes (TTC) were done by the direct Natt-Herrick method, leaving the samples 9

in contact with blood for 30 minutes before counting. The total estimates of leukocytes 10

and thrombocytes (TLE and TTE) were performed by evaluating the blood smear and 11

this demonstrated that the methods presented different statistical average, besides 12

having no correlation with the direct counting method. It was concluded that estimates 13

and direct techniques are not equivalent to each other, but the information obtained can 14

be useful in the accomplishment of blood cell count in this species. 15

Keywords: Chelonian, Reptiles, Blood Smear 16

17

INTRODUÇÃO 18

A análise do hemograma é uma ferramenta útil e muito difundida, que auxilia no 19

diagnóstico e no acompanhamento de diversos estágios da saúde dos animais (CHUNG 20

et al., 2009). Diferente de mamíferos, onde a determinação do número de células 21

sanguíneas é realizada de forma rotineira por métodos automatizados há várias décadas, 22

a contagem de células em répteis ainda é majoritariamente realizada por meio de 23

35

métodos manuais ou estimativas, que são menos precisos que o resultado de aparelhos 1

automáticos (SHELDON et al., 2016). 2

Em tartarugas, a contagem total de leucócitos (CTL) pode fornecer informações 3

críticas sobre a resposta do organismo do réptil a doenças. Já a contagem total de 4

trombócitos (CTT) pode demonstrar o estado do sistema hemostático do animal, pois 5

estas células estão diretamente envolvidas no processo de formação do trombo e na 6

secreção de tromboplastina, que possui papel na formação do coágulo (NARDINI et al., 7

2013). 8

A CTL pode ser realizada a partir de dois métodos. O primeiro é conhecido 9

como método da Floxina B e é uma forma indireta de se obter a CTL (SHELDON et al., 10

2016). A segunda forma é utilização da técnica de Natt-Herrick, uma metodologia 11

direta, que foi desenvolvida para o cômputo de células sanguíneas em aves, mas que é 12

amplamente utilizada em répteis e anfíbios. 13

Este método também é bastante utilizado para a determinação de trombócitos na 14

rotina (ROBERTSON & MAXWELL, 1990; SYKES & KLAPHAKE, 2008). Contudo, 15

existem poucas pesquisas em répteis que façam uso deste método direto (CHUNG et al., 16

2009; TROIANO et al., 2008; TSAI et al., 2014), devido à grande margem de erro 17

apresentada pela técnica (TSAI et al., 2014). Essas células podem ser confundidas com 18

pequenos linfócitos e, ainda, tem a capacidade de formar agregados com facilidade, o 19

que dificulta sua identificação na área de contagem (ARIKAN & ÇIÇEK, 2014; 20

CAMPBELL, 1994). Contudo, o tempo de coloração e a quantidade de corante 21

utilizados podem influenciar positivamente na precisão deste procedimento 22

(ROBERTSON & MAXWELL, 1990; TSAI et al., 2014). 23

Muitos dos métodos de estimativa de leucócitos totais (ELT) e de trombócitos 24

(ETT) (TAVARES-DIAS & OLIVEIRA-JÚNIOR; MARCON, 2008), necessitam 25

36

também da contagem total de hemácias do animal (CTH), que pode ser obtida de 1

maneira direta por diferentes formas (CAMPBELL, 2015; JENKINS-PEREZ, 2012; 2

NARDINI et al., 2013; SAMOUR, 2016; SYKES & KLAPHAKE, 2008). Na rotina, os 3

métodos estimativos são normalmente utilizados para confirmar contagens manuais, 4

bem como, detectar erros laboratoriais, quando diferenças muito grandes são 5

encontradas (SHELDON et al., 2016). Entretanto, a facilidade de realização e o pouco 6

tempo que tomam, junto com a dificuldade em se conseguir amostras de sangue de 7

répteis em quantidades adequadas, faz com que muitos patologistas clínicos recorram 8

cada vez mais a essas técnicas estimativas ao realizar hemogramas dessas espécies 9

(SAMOUR, 2016). 10

Alguns autores defendem que essas técnicas devem ser utilizadas apenas quando 11

não for possível a realização da contagem direta e deveriam ser empregadas apenas para 12

obter uma avalição qualitativa (baixo, normal e alto) do número dessas células nos 13

animais, não sendo ainda recomendadas para o uso clínico ou para o estabelecimento de 14

valores de referência para uma espécie (CAMPBELL, 2015; JENKINS-PEREZ, 2012). 15

A despeito dessa controvérsia, para a determinação dos valores estimados de 16

CTL e CTT, recomenda-se o uso de um esfregaço tecnicamente perfeito, que contenha 17

uma área de monocamada com células bem distribuídas (ALLISON & MEINKOTH, 18

2007; SAMOUR, 2016). O ideal é que este seja feito no momento da colheita de 19

sangue, sem anticoagulante, e seja fixado o quanto antes, podendo ser corado até alguns 20

dias após a sua realização (ALLISON & MEINKOTH, 2007). Assim, o objetivo desse 21

trabalho foi comparar os valores obtidos na contagem de leucócitos e trombócitos por 22

meio de diferentes métodos de estimativa em esfregaço sanguíneo, com os encontrados 23

por meio do método direto de Natt-Herrick, em tartarugas-da-amazônia (P. expansa). 24

25

37

MATERIAL E MÉTODOS 1

Foram utilizadas 20 tartarugas-da-amazônia, com peso médio de 6,1 quilos, 10 2

anos de idade, mantidas em cativeiro no Setor de Piscicultura da Escola de Veterinária e 3

Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (latitude 16°35'44.9"S e longitude 4

49°16'54.6"W). O projeto foi autorizado pelo CEUA, sob o registro 62/2014 e pelo 5

SISBIO, sob o protocolo 47924-1. 6

Os animais foram capturados, contidos fisicamente e anestesiados com uma 7

mistura de cetamina (20mg/Kg) e midazolam (2mg/Kg). O sangue foi colhido por 8

punção do seio cervical (OWENS & RUIZ, 1980) e armazenado em tubos plásticos 9

pediátricos contendo heparina sódica (Labor Import®, Osasco, São Paulo). Uma gota de 10

sangue não heparinizado foi utilizada para a confecção imediata de esfregaços 11

sanguíneos que foram secados e corados com corante de rotina para hematologia do tipo 12

panótico rápido Instant Prov® (New Prov, Pinhais, Paraná). 13

As duas primeiras técnicas utilizadas para a ETL são semelhantes e consistem da 14

contagem de leucócitos em 1000 (Método 01) ou 2000 (Método 02) eritrócitos no 15

esfregaço sanguíneo. O valor obtido é recalculado para µL por meio da seguinte 16

fórmula: ETT ou ELT/ µL = número de células encontradas em 1000 ou 2000 hemácias 17

multiplicado pelo número total de eritrócitos, dividido por 1000 ou 2000 (ISHIKAWA 18

et al., 2008; TAVARES-DIAS & MORAES, 2006). 19

A terceira técnica utilizada para a estimativa da ELT consiste na contagem das 20

células encontradas em vinte campos (40x) e em seguida o número resultante é 21

multiplicado por 1500 e o resultado expresso em µL de sangue (Método 03) (JENKINS-22

PEREZ, 2012; SYKES & KLAPHAKE, 2015). Para a ETT, foram realizados 23

procedimentos idênticos as duas primeiras técnicas utilizadas para a contagem de 24

38

leucócitos (Método 04, contagem dos trombócitos em 1000, e método 05, em 2000 1

hemácias). 2

A última técnica (método 06) é realizada ao contar-se o número de trombócitos 3

encontrados em duzentos leucócitos e multiplicando-o pelo valor de leucócitos totais 4

obtidos pelo método direto, com o resultado sendo dividido por 200 e expresso em µL 5

(WOJTASZEK, 1991). A tabela 1 apresenta um resumo das técnicas utilizadas para a 6

contagem de leucócitos e trombócitos. 7

Tabela 1. Métodos para estimativa de leucócitos totais e trombócitos em lâmina de esfregaço de 8 tartarugas-da-amazônia (Podocnemis expansa). 9

Células Método Fórmula

Leucócitos

1 ELT (µL) = (leucócitos em 1000 hemácias) x (n° total de hemácias) a

1000

2 ELT (µL) = (leucócitos em 2000 hemácias) x (n° total de hemácias) b

2000

3 ELT (µL) = leucócitos em 20 CGA(40x) X 1500 c

20

Trombócitos

4 ETT (µL) = (trombócitos em 1000 hemácias) x (n° total de hemácias) a

1000

5 ETT (µL) = (trombócitos em 2000 hemácias) x (n° total de hemácias) b

2000

6 ETT (µL) = (trombócitos em 200 leucócitos) x (n° total de leucócitos) d

200

CGA = Campo de grande aumento; ELT = Estimativa de leucócitos totais; ETT = Estimativa de 10 trombócitos totais. A) (TAVARES-DIAS et al., 2008); B) (ISHIKAWA et al., 2008) C)(LATIMER & 11 BIENZLE, 2010); D) (WOJTASZEK, 1991). 12

13

O valor total de eritrócitos, leucócitos e trombócitos foi obtido por contagem em 14

duplicata realizada em câmara de Neubauer improved, pelo método de Natt-Herrick 15

(NH), deixando a amostra em contato com o corante por 30 minutos antes do 16

procedimento (método direto) (ROBERTSON & MAXWELL, 1990). Já as estimativas 17

dos valores de leucócitos e trombócitos foram obtidas utilizando-se as lâminas de 18

39

esfregaço examinadas no aumento de 40x e de 100x, a depender do método e depois 1

comparadas entre si. 2

Por meio do software R (R CORE TEAM, 2011), os resultados de cada técnica 3

foram comparados e suas médias avaliadas pelo teste do T para dados pareados. 4

Também foi obtida a correlação entre as técnicas, pelo método de Pearson, e equações 5

de regressão linear foram formuladas para estimar os demais métodos em função de 6

NH. 7

8

RESULTADOS 9

Ao se comparar os valores obtidos pelo método direto com as diferentes 10

estimativas para o número de leucócitos, demonstrou-se que todos os métodos 11

apresentaram médias estatisticamente distintas (p<0,05). Também ficou demonstrado 12

que os diferentes métodos de estimativa não possuem correlação com a contagem em 13

câmara (Tabela 2). Para a ETT, os resultados foram semelhantes ao da ELT, ou seja, as 14

médias obtidas com cada técnica foram estatisticamente distintas (p < 0,05) e nenhuma 15

das técnicas utilizadas apresentou correlação com o método direto (Tabela 3). 16

Tabela 2. Valores médios, desvio padrão (DP), amplitude, coeficiente de variação (CV), coeficiente de 17 correlação (r) e probabilidade de significância (p) para a contagem total de leucócitos (CLT) em 18 tartarugas-da-amazônia (Podocnemis expansa) obtidos por diferentes métodos (N=20). 19

Método CLT (µl)

Média ± DP Amplitude

CV

(%) Equação da regressão linear r p

NH 4381±2001a 1375-10000 45,6 NH = -421,55+0,43*Método1 0,34 <0,01

1 10740±2868b 6900-19250 25,6 Método1 =

269,6+0,71*Método2 0,79 <0,01

2 11928±3614c 6150-23100 30,3 NH = -276,2 + 0,39*Método2 0,47 <0,01

3 7396±2008d 4125-12112 27,1 NH = -159,5 + 0,61*Método3 0,34 <0,01

NH = Método direto de Natt-Herrick; Método 1 = {ELT (µL) = [Leucócitos em 1000 hemácias * Número 20 total de hemácias (µL)] / 1000 (TAVARES-DIAS et al., 2008)}; Método 2 = {ELT (µL) = [Leucócitos 21 em 2000 hemácias * Número total de hemácias (µL)] / 2000 (ISHIKAWA et al., 2008)}; Método 3 = 22 {ELT (µL) = [Leucócitos em 20 CGA(40x) / 20] * 1500 (LATIMER & BIENZLE, 2010)}. Letras 23 diferentes indicam diferenças entre as médias pelo teste T para dados pareados (p<0,05). 24

40

1

Tabela 3. Valores médios, desvio padrão (DP), amplitude, coeficiente de variação (CV), coeficiente de 2 correlação (r) e probabilidade de significância (p) para a contagem de trombócitos totais (CTT) em 3 tartarugas-da-amazônia (Podocnemis expansa) obtidos por diferentes métodos (N=20). 4

Método CLT (µl)

Média ± DP Amplitude

CV

(%) Equação da regressão linear r p

NH 10243±2505a 5375-14875 24,4 NH = 10450-0,026*Método4 -0,05 <0,01

4 7982±2832b 3355-15050 35,4 Método4 = 3774 +

0,591*Método5 0,72 <0,01

5 11230±3252c 5700-18100 28,9 NH = 11595,9-0,12*Método5 -0,03 <0,01

6 12604±4731d 5400-24435 37,5 NH = 10910 - 0,052*Método6 -0,04 <0,01

NH = Método direto de Natt-Herrick; ; Método 4 = {ETT (µL) = [Trombócitos em 1000 hemácias * 5 Número total de hemácias (µL)] / 1000 (TAVARES-DIAS et al., 2008)}; Método 5 = {ETT (µL) = 6 [Trombócitos em 2000 hemácias * Número total de hemácias (µL)] / 2000 (ISHIKAWA et al., 2008)}; 7 Método 6 = {ETT (µL) = (Trombócitos em 200 leucócitos * Contagem total de leucócitos) / 200 8 (WOJTASZEK, 1991)}. Letras diferentes indicam diferenças entre as médias pelo teste T para dados 9 pareados (p<0,05). 10

11

DISCUSSÃO 12

Frequentemente, os métodos de estimativa em esfregaço sanguíneo são 13

utilizados para confirmar uma contagem realizada por métodos diretos em 14

hemocitômetro ou até mesmo em substituição a este (SHELDON et al., 2016; STRIK et 15

al., 2007). Em P. expansa (TAVARES-DIAS et al., 2008), bem como em outros répteis 16

(SHELDON et al., 2016), já foram encontradas discrepâncias entre as técnicas diretas e 17

indiretas de contagem de leucócitos e trombócitos. Entretanto, esses trabalhos não 18

consideraram um maior tempo de contato das amostras com o corante de Natt-Herrick, a 19

contagem direta de trombócitos e nem técnicas de estimativa em lâmina que utilizem 20

objetivas de menor aumento (40x). 21

No presente estudo, observou-se que os métodos de estimativa testados não 22

apresentaram correlação com a metodologia de contagem direta utilizada - tanto para 23

leucócitos, quanto para trombócitos - e isso demonstra que, apesar de muito difundidas 24

na rotina prática, para P. expansa, os resultados obtidos a partir do esfregaço sanguíneo 25

41

devem ser vistos e avaliados com cautela e poderão ser melhores interpretados de forma 1

semiquantitativa (CAMPBELL, 2015; JENKINS-PEREZ, 2012), confirmando apenas 2

se há a presença de leucocitose ou leucopenia. A existência de discordâncias entre as 3

técnicas não deve ser automaticamente estendida a outras espécies, pois em cobras-4

d’água-de-colar (Natrix natrix) essas diferenças não foram encontradas 5

(WOJTASZEK, 1991), e em tartarugas-marinhas (Caretta caretta) já se reportou 6

equivalência das técnicas (KELLER et al., 2004) ao mesmo tempo em que animais 7

submetidos a diferentes condições ambientais apresentaram variação significativa entre 8

a contagem manual e as técnicas de estimativa (DEEM et al., 2009), indicando que a 9

execução de um processo de verificação espécie-específico, ou mesmo de condições 10

específicas, é necessário. 11

O coeficiente de variação (CV) diz respeito a variabilidade dos dados em relação 12

à média e é útil porque é indiferente as unidades de medidas utilizadas para o que se 13

está avaliando, permitindo a imediata comparação entre diferentes métodos e analitos 14

(REED et al., 2002). Quanto ao CV relatado no presente estudo para o método direto, 15

45,6%, apesar de não existirem referenciais que identifiquem faixas de classificação 16

quanto ao grau de precisão para essa técnica em répteis, este está próximo ao reportado 17

em pesquisas outros répteis, que apresentaram valores entre 34,3 a 53,2% 18

(ADAMOVICZ et al., 2015; DEEM et al., 2015; MUÑOZ et al., 2013), bem como do 19

encontrado para trabalhos que utilizaram P. expansa e que obtiveram CVs entre 30,4 a 20

46,8% (MARTÍNEZ et al., 2007; MORSELLI et al., 2016; ROSSINI et al., 2012; 21

TAVARES-DIAS et al., 2008). As técnicas estimativas apresentaram um CV (método 1 22

= 25,6%; método 2 = 30,3%; método 3 = 27,1%) próximo ao reportado na literatura 23

para a mesma espécie (TAVARES-DIAS et al., 2008) ou para espécies diferentes 24

42

(DEEM et al., 2009; SHELDON et al., 2016) – Chelonoids spp. e Caretta caretta - que 1

variou entre 23 a 61,7% . 2

Para os trombócitos, o método direto apresentou menor variação do CV (24,4%) 3

quando comparado a outros répteis, cujos CVs encontrados variaram entre 25,1 a 4

106,8% (CHANSUE et al., 2011; CHUNG et al., 2009; ÐIKIĆ et al., 2011; PIRES et 5

al., 2009; SANTOS et al., 2009; SILVA et al., 2009), não existindo, até onde se saiba, 6

trabalhos que tenham aplicado o método direto em P. expansa. Não é possível dizer se a 7

menor variação encontrada no CV do método direto está associada com o aumento do 8

tempo de contato das células com o corante, apesar dessa possibilidade já ter sido 9

aventada (TSAI et al., 2014). Para mais esclarecimentos, torna-se necessário que mais 10

pesquisas sobre esse tema específico sejam realizadas. As estimativas (método 1 = 11

35,4%; método 2 = 28,9 %; método 3 = 37,5%) apresentaram CV dentro do 12

anteriormente relatado em outras espécies, que reportaram valores de 10,1 e 41,6% 13

(DISSANAYAKE et al., 2017; WOJTASZEK, 1991), mas menores do que o 14

encontrado para P. expansa em outros estudos (OLIVEIRA-JÚNIOR., et al, 2009; 15

ROSSINI et al., 2012; TAVARES-DIAS et al., 2009; TAVARES-DIAS., et al, 2008). 16

Ademais, mesmo com todos os cuidados tomados durante a realização da 17

contagem direta e na confecção e na leitura dos esfregaços, as diferenças encontradas 18

neste estudo podem ser resultado fatores intrínsecos e extrínsecos (REED et al., 2002), 19

que não foram observados durante o desenvolvimento dessa pesquisa. Dentre estes 20

podem-se citar: a diferença de leucócitos no sangue, diferentes tendências de agregação 21

entre as espécies, erros de pipetagem e/ou contagem, ou mesmo de identificação de 22

células, aglutinação celular não observada no hemocitômetro, nos tubos, na microscopia 23

e no esfregaço sanguíneo, distribuição desigual das células e rompimento de células 24

43

durante a confecção da lâmina, (NARDINI et al., 2013; SYKES & KLAPHAKE, 2015; 1

TAVARES-DIAS et al., 2008; WOJTASZEK, 1991). 2

3

CONCLUSÃO 4

As técnicas de estimativa em lâmina de esfregaço sanguíneo para contagem de 5

leucócitos e trombócitos em tartaruga-da-amazônia não apresentam correlação com o 6

método de contagem direto. Apesar disso, as técnicas de estimativa investigadas podem 7

ser úteis para a obtenção de informações durante a avaliação de esfregaços sanguíneos 8

nesta espécie. 9

10

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49

CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os dados obtidos durante o desenvolvimento dessa dissertação são de

grande importância para o aprimoramento do diagnóstico em tartarugas-da-amazônia, já

que ajudam a esclarecer sobre o período de viabilidade de amostras séricas desses

animais, ainda mais quando muitos dos cativeiros licenciados pelo Ibama encontram-se

distantes de laboratórios que possuem a infraestrutura adequada para a correta análise e

manipulação das amostras. Também servem para providenciar mais dados sobre como

empregar melhor as técnicas de contagem durante a realização do hemograma – em

hemocitômetro ou por estimativa em esfregaço sanguíneo - para a obtenção dos valores

totais de leucócitos e trombócitos, evitando erros e melhorando os procedimentos

laboratoriais adotados para a essa espécie.

Devido ao reduzido, porém crescente, número de proprietários de répteis e

de médicos veterinários com experiência que possuem contato com esses animais,

realizar um trabalho como esse enfrenta desafios singulares, seja no manejo e

contenção, na falta de padronização e execução dos exames laboratoriais ou na logística

para transporte dos animais e/ou amostras, dificuldades a muito superadas, ou

minimizadas, em mamíferos acabam por tomar dimensões maiores.

A realização deste projeto possibilitou grande imersão no tema e

demonstrou a preocupante ausência de trabalhos com répteis, evidenciando a

necessidade de novas pesquisas, principalmente estudos que busquem padronizar e

melhorar a qualidade dos exames laboratoriais realizados. Este trabalho também trouxe

novos questionamentos com o potencial de gerar mais conhecimento na área de

Patologia Clínica Veterinária.

50

ANEXOS

Anexo A – Aprovação do projeto no CEUA

51

Anexo B – Normas da revista Pesquisa Veterinária Brasileira

55

Anexo C – Normas da revista Pesquisa Veterinária Brasileira

57

Anexo D – Normas da revista Ciência Rural

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