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PATRICIA BATISTA BARRA MEDEIROS BARBOSA ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE EXTRATOS SALINOS DE SEMENTES DE PLANTAS DA CAATINGA CONTRA Aedes aegypti E INVESTIGAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE PROTEÍNAS BIOATIVAS NATAL/RN 2014.1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
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PATRICIA BATISTA BARRA MEDEIROS BARBOSA
ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE EXTRATOS SALINOS DE
SEMENTES DE PLANTAS DA CAATINGA CONTRA Aedes aegypti
E INVESTIGAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE PROTEÍNAS
BIOATIVAS
NATAL/RN
2014.1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
PATRICIA BATISTA BARRA MEDEIROS BARBOSA
ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE EXTRATOS SALINOS DE
SEMENTES DE PLANTAS DA CAATINGA CONTRA Aedes aegypti
E INVESTIGAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE PROTEÍNAS
BIOATIVAS
Natal/RN
2014.1
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Bioquímica do Centro de
Biociências da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito
parcial para obtenção do título de Doutor
em Bioquímica
Orientadora: Profa. Dra. Maria de Fátima
Freire de Melo Ximenes
Co-0rientadora: Adriana Ferreira Uchôa
UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede
Catalogação da Publicação na Fonte
Barbosa, Patricia Batista Barra Medeiros.
Atividades biológica de estratos salinos de sementes de plantas da caatinga contra Aedes aegypty e
investigação da participação de proteínas bioativas / Patricia Batista Barra Medeiros Barbosa. – Natal,
RN, 2014. 159 f. : il.
Orientadora: Profª. Drª. Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa
de Pós-Graduação em Bioquímica.
1. Larvicidas – Tese. 2. Pupicidas – Tese. 3. Adulticidas – Tese. 4. Índice de repelência efetiva –
Tese. 5. Homogenato intestinal – Tese. 6. Inibidores enzimáticos – Tese. 7. Lectinas – Tese. 8. Vicilinas
– Tese. I. Ximenes, Maria de Fátima Freire de Melo. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 661.16.034.7
PATRICIA BATISTA BARRA MEDEIROS BARBOSA
ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE EXTRATOS SALINOS DE
SEMENTES DE PLANTAS DA CAATINGA CONTRA Aedes aegypti
E INVESTIGAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE PROTEÍNAS
BIOATIVAS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica do Centro de Biociências da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial
para obtenção do título de Doutor em Bioquímica
Aprovada em 09/06/2014
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes,
Orientadora
Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
Prof. Dra Patrícia Maria Guedes Paiva
Departamento de Bioquímica - UFPE
Prof. Dr. Iron Macedo Dantas
Departamento de Ciências Biológicas - UERN
Prof. Dra. Caroline Addison Carvalho Xavier de Medeiros
Departamento de Farmacologia - UFRN
Prof. Dr.Hugo Alexandre de Oliveira Rocha
Departamento de Bioquímica - UFRN
Aos meus filhos Davi Marcelo Barra Barbosa e Sarah Letícia Barra Barbosa a quem amo
de forma mais profunda e sincera;
Aos professores Maurício Pereira Sales- UFRN (in memória) e
André Newton –UFRN/UERN (in memória)
Dedico esse trabalho
Agradecimentos
À Deus, pela companhia constante nessa caminhada e pela força nos muitos momentos
de desânimo. Sua luz guia meus passos e nela tento seguir Seu caminho;
À professora Maria de Fátima de Melo Freire Ximenes pela orientação, auxílio
fundamental na preparação dos artigos, mas sobretudo, pela confiança, amizade e
incentivos que me fizeram acreditar que no final tudo daria certo;
À Universidade do Estado do Rio Grande do Norte, na pessoa do prof. Almir, chefe do
Setor de Capacitação, por ter concedido meu afastamento total das atividades docentes,
sem o qual não teria sido possível realizar esses trabalho;
Aos professores Adriana Ferreira Uchoa e Elizeu Viana Antunes pela permissão para
utilizar o LQFPB e orientação nos experimentos bioquímicos;
Ao Programa de Pós Graduação em Bioquímica, na pessoa de seu coordenador, prof.
Dr. Hugo Alexandre, pela oportunidade;
Aos professores da banca defesa pela disponibilidade e auxílio;
Aos professores da banca de qualificação: Paula Vivianne Souza de Queiroz Moreira
(UERN), Herbet Tadeu de Almeida Andrade (UFRN) e Suely Ferreira Chavante
(UFRN) pelas valiosas sugestões;
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Bioquímica pelas excelentes
disciplinas ministradas
À Patrícia Macedo e Claudio Pinto coordenadores da Floresta Nacional (Flona) de
Nísia Floresta (ICMC/MMA) pela doação das sementes e identificação das espécies
vegetais;
As queridíssimas Roberta Luciana do Nascimento Godone e Joycellane Alline do
Nascimento Campos Ribeiro pela ajuda nos ensaios bioquímicos, pela amizade e pelos
momentos agradabilíssimos que compartilhamos;
As poderosas Julliete Medeiros de Oliveira (Ju) e Juliana Macêdo Chagas (Ju2) pela
ajuda nos ensaios biológicos com A. aegypti e momentos divertidíssimos
compartilhados (sentirei saudades de nossos lanches regados com gostosas risadas);
Aos alunos de Iniciação científica, fieis companheiros. Cada um fundamental em seu
momento: Lucas Leonardo, Jessica Jales, Vanessa, Brena e Douglas
Aos colegas do LABENT, Cássio, Hilário, Marcos, Maria e Macel pelas ajudas e
experiências trocadas;
Ao funcionário da SAFE que exerce suas atividades no LABENT, Ayrton Lima, cuja
criatividade foi indispensável no planejamento e desenvolvimento dos ensaios
biológicos;
Ao Prof. Dr. Guilherme Fulgêncio de Medeiros (Seu Guila) do Departamento de
Oceanografia e Limnologia, por ter aberto as portas e me acolhido de forma tão gentil
no Laboratório de Ecotoxicologia Aquática (DOL/NUPPRAR/UFRN), onde foram
realizados os ensaios de ecotoxicidade;
Aos amigos do Laboratório de Ecotoxicologia Aquática, Aline, Thiago e Vanessa que
me receberam tão cordialmente e tornaram os cansativos ensaios de ecotoxicidade
divertidos e animados;
Á professora Raquel Brant Giodani do Departamento de Farmácia do Centro de
Ciências da Saúde da UFRN que abriu seu laboratório para a realização dos ensaios de
detecção de metabolitos secundários;
A mestranda do Departamento de Farmácia do Centro de Ciências da Saúde Barbara
Cabral, que me acompanhou nos ensaios de detecção de metabolitos secundários;
À Virgínia, Ticiane, Celina, Sergio e todos os demais colegas com quem tive o prazer
de cursar disciplinas;
Aos colegas do LQFPB, Anderson, Ticiane, Jonalson, Vanessa, Adeliana, Rafael Russi,
Richelli, Noberto, Rafael Serquiz e a todos os outros pela preciosíssima ajuda nos
ensaios bioquímicos e por me ajudarem a achar as coisas dentro do laboratório;
À aluna Luciana Maria Araújo Rabelo pela realização dos ensaios celulares com
fibroblastos e à Delano Anibal da Silva pela realização da cromatografia de exclusão
molecular;
À Margarita A. Mayromatis, ex- secretaria do Programa de Pós Graduação em
Bioquímica pelo auxílio nas “questões burocráticas”;
A Márcio Bastos, secretário do Programa de Pós Graduação em Bioquímica pelas
orientações na preparação da qualificação e da defesa
Aos funcionários da SAFE lotados no Departamento de Bioquímica Ângela e Jonas por
tornarem o ambiente de trabalho “mais saudável”;
Aos meus filhos Davi e Sarah de quem “roubei” tempo para dedicar-me a esse trabalho.
Também por me acompanharem nos finais de semana, feriados e finais de dias para
cuidar da colônia ou encerrar algum experimento;
Ao meu marido pelo seu amor e sua paciência com minhas ausências. Minhas
conquistas serão sempre suas conquistas, pois sem sua ajuda sei que não teria como
obtê-las. Obrigada por, principalmente, acreditar que a razão de todo esse sacrifício
passou pela certeza de compartilharmos, juntos, um futuro melhor.
À minha família, meus pais, irmãos e minha avó, pelo apoio incondicional.
“Sei que os que confiam no Senhor
Revigoram suas forças, suas forças se renovam
Posso até cair ou vacilar, mas consigo levantar
Pois recebo d'Ele asas
E como águia, me preparo pra voar
Eu posso ir muito além de onde estou
Vou nas asas do Senhor
O Teu amor é o que me conduz.
Posso voar e subir sem me cansar
Ir pra frente sem me fatigar.
Vou com asas, como águia
Pois confio no Senhor!
Que me dá forças pra ser um vencedor
Nas asas do Senhor
Vou voar! Voar!
Celina Borges
“Posso todas as coisas Naquele que me fortalece”
Filipenses 4:13
“Tudo é do Pai. Toda honra e toda gloria,
é Dele a vitória, alcançada em minha vida”
Pe. Fabio
Resumo
A dengue é a mais importante arbovirose da atualidade. A ausência de uma
vacina profilática torna o controle da dengue pautado principalmente no controle do
inseto vetor, o Aedes aegypti, mas os crescentes relatos de resistência aos inseticidas
químicos têm tornado urgente à busca por produtos alternativos. Nesse contexto foram
preparados, testados e caracterizados 21 extratos brutos (EB) de sementes de plantas da
Caatinga, utilizando o fosfato de sódio 50 mM pH 8 como extrator. Todos os EB
apresentaram atividade larvicida e repelente para a postura das fêmeas grávidas de A.
aegytpti. Os EB de D. grandiflora, E. contortisiliquum, A. cearenses, C. ferrea e C.
retusa foram capazes de atrair as fêmeas para a posturas quando em baixas
concentrações, sendo que nessas concentrações os EB de E. contortisiliquum e A.
cearenses foram capaz de levar a óbito 52% e 100% das larvas, respectivamente. Os
extratos de A. cearenses, P. viridiflora, E. velutina, M. urundeuva e S. brasiliensis
tiveram atividade pupicida, enquanto que os extratos de P. viridiflora, E. velutina, E.
contortisiliquum, A. cearenses, A. colubrina, D. grandiflora, B. cheilantha, S.
spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli e G. americana tiveram ação adulticidas. Todos
os extratos apresentaram toxicidade para C. dubia e os EB de E. velutina e E.
contortisiliquum não interferiram na viabilidade dos fibroblastos. Em todos os extratos
foram identificadas pelo menos duas proteínas com potencial inseticida, tais como
inibidores enzimáticos, lectinas e proteínas ligantes à quitina e componentes do
metabolismo secundário. Considerando todos os ensaios biológicos, os extratos de A.
cearenses, P. viridiflora, E. contortisiliquum, S. brasiliensis, E. velutina e M. urundeuva
foram considerados os mais promissores e o EB de E. contortisiliquum foi selecionado
para ser fracionando, já que foi o único não apresentou atividade pupicida, indicando
uma ação inseticida dependente da ingestão de compostos ativos. Como observado para
o EB, as frações proteicas de E. contortisiliquum, também apresentaram atividade
larvicida, com destaque para F2 que apresentou maior atividade larvicida e menor
toxicidade ambiental do que o EB de origem. A redução na atividade proteolítica das
larvas alimentadas com o EB e as frações de E. contortisiliquum sugeriu que inibidores
de tripsina seriam os responsável pela atividade larvicida. Embora o aumento na
purificação de um inibidor de tripsina de E. contortisiliquum (ITEc) tenha resultado na
perda da atividade larvicida, foi constatado que sua ausência reduziu a eficácia das
frações, indicando que o ITEc contribui, mas não é suficiente para a atividade larvicida
do EB de E. contortisiliquum. Também não foi verificada atividade inseticida na fração
rica em vicilina, e nem evidências da contribuição dessa molécula para a atividade
inseticida do EB. Os resultados mostram o potencial dos extratos salinos de sementes de
planta da Caatinga e, em especial do EB e da F2 de E. contortisiliquum, para o controle
da população de A. aegypti e indicam que a eficácia desses extratos deve resultar da
ação conjunta de diferentes compostos ativos, que atuando em diferentes mecanismos
são capazes de comprometer a viabilidade dos insetos.
Palavras chaves: larvicida, pupicida, adulticida, índice de repelência efetiva,
homogenato intestinal, inibidores enzimáticos, lectinas, vicilinas.
Abstract
Dengue fever, currently the most important arbovirus, is transmitted by the
bite of the Aedes aegypti mosquito. Given the absence of a prophylactic vaccine, the
disease can only be controlled by combating the vector insect. However, increasing
reports of resistance and environmental damage caused by insecticides have led to the
urgent search for new safer alternatives. Twenty-um plant seed extracts from the
Caatinga were prepared, tested and characterized. Sodium phosphate (50 mM pH 8.0)
was used as extractor. All extracts showed larvicidal and ovipositional deterrence
activity. Extracts of D. grandiflora, E. contortisiliquum, A. cearenses, C. ferrea and C.
retusa were able to attract females for posture when in low concentration. In the
attractive concentrations, the CE of E. contortisiliquum and A. cearenses were able to
kill 52% and 100% of the larvae respectively. The extracts of A. cearenses, P.
viridiflora, E. velutina, M. urundeuva and S. brasiliensis were also pupicides, while
extracts of P. viridiflora, E. velutina, E. contortisiliquum, A. cearenses, A. colubrina, D.
grandiflora, B. cheilantha, S. spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli e G. americana
displayed adulticidal activity. All extracts were toxic to C. dubia zooplankton. The EB
of E. velutina and E. contortisiliquum did not affect the viability of fibroblasts. In all
extracts were identified at least two potential insecticidal proteins such as enzyme
inhibitors, lectins and chitin-binding proteins and components of secondary metabolism.
Considering all bioassays, the extracts from A. cearenses, P. viridiflora, E.
contortisiliquum, S. brasiliensis, E. velutina and M. urundeuva were considered the
most promising. The E. contortisiliquum extracts was the only one who did not show
pupicida activity, indicating that its mechanism of action larvicide and adulticidal is
related only to the ingestion of toxic compounds by insect, so it was selected to be
fragmenting. As observed for the CE, the protein fractions of E. contortisiliquum also
showed larvicidal activity, highlighting that F2 showed higher larvicidal activity and
lower environmental toxicity than the CE source. The reduction in the proteolytic
activity of larvae fed with crude extract and fractions of E. contortisiliquum suggested
that the trypsin inhibitors (ITEc) would be responsible for larvicidal activity. However
the increase in the purification of this inhibitor resulted in loss of larvicidal activity, but
the absence of trypsin inhibitor reduced the effectiveness of the fractions, indicating that
the ITEC contributes to the larvicidal activity of this extract. Not been observed
larvicidal activity and adulticide in rich fraction vicilin, nor evidence of the contribution
of this molecule for the larvicidal activity of the extract. The results show the potential
of seeds from plant extracts of Caatinga as a source of active molecules against insects
A. aegypti at different stages of its development cycle, since they are composed of
different active compounds, including protein nature, which act on different
mechanisms should result in the death of insects.
Keywords: larvicide, pupicide, adulticide, ovipositional deterrence activity, gut
homogenate, enzyme inhibitors, lectins, vicilins.
LISTA DE FIGURAS
Pag.
Figura 1 Esquema do ciclo biológico do Aedes aegytpi....................................... 22
Figura 2 Colônia de A. aegypti. A. Gaiolas de procriação; B. Bandejas de
eclosão das larvas; C. Gaiolas para emergências dos
adultos....................................................................................................
44
Figura 3 Etapas para retiradas dos intestinos das larvas L4 de A. aegypti. A.
Transferência das larvas para placas resfriadas; B. Imobilização das
larvas; C. Retiradas dos apêndices terminais; D. Retirada da cabeça;
E. Retirada do intestino; F. Intestino e corpo separados.......................
48
Figura 4 Adulto de A. aegypti imobilizado para obtenção do homogenato dos
adultos (H). As retas indicam as partes que foram removidas: cabeça
(azul), patas (verde) e asas (vermelho)..................................................
48
Figura 5 Sementes de plantas da Caatinga utilizadas no presente estudo........... 51
Figura 6 Farinha das sementes de plantas da Caatinga utilizadas no presente
estudo ....................................................................................................
49
Figura 7 Ensaios larvicida. A. Ensaio larvicida com L1 em placa de células
com 96 poços contendo 20 larvas e volume final de 200 µL; B.
Ensaio larvicida com L4 em recipientes plásticos de 50 ml contendo
20 larvas lume final de 20 mL...............................................................
54
Figura 8 Ensaio pupicida. Recipientes de vidro de 25 mL contendo 10 pupas e
volume final de 20 mL..........................................................................
54
Figura 9 Esquema de realização dos ensaios de atratibilidade/repelência. Vista
frontal (A) e superior (B) e uma gaiola mostrando a disposição das
ovitrampas na base................................................................................
54
Figura 10 Ensaios adulticida e de interferência na postura das fêmêas. A.
Gaiolas utilizadas nos ensaios. B. Detalhe de uma gaiola para
visualização dos adultos. C. Tratamento oferecido para alimentação
dos insetos adultos.................................................................................
56
Figura 11 Ensaios de ecotoxicidade com C. dubia. A. Cultivo de C. dubia.
Ensaios com filhotes de 1 dia; C. Exemplar de C. dubia.....................
56
Figura 12 Atividade proteolítica do HIL de A. aegypti em diferentes pHs (A) e
temperaturas (B).....................................................................................
68
Figura 13 Atividade proteolítica do HIL de A. aegypti após previa incubação
com inibidores de proteases serínicas (PMSF, TLCK, SBTI, TPCK),
cisteínicas (E-64 e IA) e metaloproteases (IA e FENA)........................
69
Figura 14 Mortalidade das pupas de A. aegypti incubadas por 24 h com EB de
sementes de plantas da Caatinga. Diferentes letras indicam diferenças
entre os tratamentos...............................................................................
73
Figura 15 Índice de repelência efetiva (IRE) dos extratos brutos de sementes de
plantas da Caatinga com efeito duplo (atrativo e repelente) para as
fêmeas grávidas de A. aegypti...............................................................
75
Figura 16 Mortalidade das larvas L1 de A. aegypti incubadas com EB de
sementes de plantas da Caatinga com atividade atrativa para a postura
das fêmeas. Em destaque as concentrações capazes de atrair as
fêmeas para a posturas dos ovo.........................................................
76
Figura 17 Mortalidade dos adultos de A. aegypti alimentados com extrato bruto
de sementes de plantas da Caatinga. Diferentes letras indicam
diferenças entre os tratamentos.............................................................
78
Figura 18 Número de ovos/ fêmea ingurgitada de A. aegypti alimentada com
extrato bruto de sementes de plantas da caatinga. Diferentes letras
indicam diferenças entre os tratamentos................................................
79
Figura 19 Viabilidade celular dos fibroblastos de camundongos 3T3 após
incubação com extratos brutos de sementes de plantas da Caatinga
nas concentrações referentes a CL50 e CL90 das larvas L4 de A.
aegypti....................................................................................................
82
Figura 20 SDS-PAGE (12%) dos EB das sementes de plantas da caatinga.......... 86
Figura 21 SDS-PAGE (12%) do extrato bruto (EB) e das frações proteicas de E.
contortisiliquum.....................................................................................
86
Figura 22 Atividade proteolítica do HIL de A. aegypti alimentados com a CL50
de EB e das frações proteicas (F1, F2 e F3) de E. contortisiliquum
em diferentes tempos. Diferentes letras indicam diferenças entre os
tratamentos............................................................................................
91
Figura 23 Perfil de eluição de F2 (20mg de proteína) da semente de E.
contortisiliquum em cromatografia de afinidade de Tripsina-
Sepharose...............................................................................................
93
Figura 24 Atividade proteolitica do HIL de A. aegypti alimentadas com
quantidades crescentes do retido de tripsina de E. contortisiliquum
(RTEc). (A) Atividade proteolítica do HIL pós 24h. Diferentes letras
entre colunas indicam diferenças significativas. (B) Zimograma do
HIL das larvas alimentadas com diferentes concentrações de RTEc (5
µL), utilizando azocaseina 2,5% como substrato.................................
89
Figura 25 Perfil de eluição do RTF2 (1mg de proteína) em cromatografia de
exclusão molecular Superdex 75 Tricorn em sistema FPLC/AKTA. O
pico com atividade inibitória foi denominado de inibidor de tripsina
de E. contortisiliquum (ITEc)...............................................................
94
Figura 26 Curva de inibição e concentração de inibição 50% (IC50) do HIL de
A. aegypti incubado com o inibidor de E. contortisiliquum utilizando
BApNa 1,25 mM (A) e azocaseina 1% (B) como
substratos................................................................................................
95
Figura 27 Constante de Inibição (Ki) do ITEc sobre o HIL de A. aegypti
utilizando BApNa (A) e azocaseina (B) como substratos.....................
95
Figura 28 Obtenção do retido de quitina da fração F3 (RQF3). (A) Perfil de
eluição da fração F3 da semente de E. contortisiliquum em
cromatografia de afinidade de quitina. (B) SDS-PAGE (12%) do EB,
F3 e fração retida na quitina (RQ) de semente de E. contortisiliquum
96
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Pag.
Tabela 1. Família, nomes científicos e nomes vulgares das plantas cujas
sementes foram utilizadas nesse estudo...............................................
49
Tabela 2. Atividade larvicida dos extratos brutos de sementes de plantas da
Caatinga contra A. aegypti...................................................................
71
Tabela 3. Pontuação dos extratos brutos (EB) de semente de plantas da
Caatinga nos ensaios biológicos...........................................................
72
Tabela 4. Índice de repelência efetiva (IRE) para à posturas das fêmeas de A.
aegypti EB de sementes de plantas da Caatinga..............................
74
Tabela 5 Ecotoxicidade para C. dubia dos EB de sementes de plantas da
Caatinga.......................................................................................
80
Tabela 6. Caracterização parcial dos extratos de sementes de plantas da
Caatinga................................................................................................
85
Tabela 7. Atividade inibitória (AI) dos extratos brutos de sementes de plantas
da Caatinga...........................................................................................
87
Tabela 8. Atividade larvicida das frações proteicas de E. contortisiliquum....... 89
Tabela 9. Caracterização parcial das frações protéicas de E. contortisiliquum... 90
Tabela 10. Atividade inibitória das frações protéicas de E. contortisiliquum....... 90
Tabela 11 Atividade larvicida das frações proteicas que não ficaram retidas na
cromatografia de afinidadede E. contortisiliquum............................
93
Tabela 12 Atividade larvicida da fração proteica de E. contortisiliquum não
retida na cromatografia de afinidade de quitina.................................
96
LISTA DE ABRAVIAÇÃO
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
ABS Absorbância
AH Atividade hameglutinante
BApNA Nα-benzoyl-DL-arginine4-nitroanilide hydrochloride
Bórax Borato de sódio ou Tetraborato de sódio
CaCl2 Cloreto de cálcio
CCD Cromatografia de camada delgada
CL50 Concentração letal 50
CL90 Concentração letal 90
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DNS Ácido 3,5-dinitro salicílico
E-64 L-trans-epoxisulfonilfluoreto
EB Extrato bruto
EDTA Etilenodiaminotetracético
FENA 1,10-fenantrolina
HA Homogenato dos adultos
HCl Ácido clorídrico
HIL Homogenato intestinal das larvas
IA Iodoacetamina
IC50 Concentração capaz de inibir 50% da atividade da enzima
IRE Índice de repelência efetiva
ITEc Inibidor de tripsina de E. contortisiliquum
Ki Constante de Inibição
L1 Larvas de primeiro estádio de A. aegypti
L4 Larvas de quarto estádio de A. aegypti
mA Mili ampere
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiliazol-2- il)-2,5-difeniltetrazólio
NaOH Hidróxido de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
pH Potencial hidrogeniônico
PMSF Fenilmetilsulfonilfluoreto
SBTI Inibidor de tripsina de soja (Glycine max)
SDS Dodecil sulfato de sódio
TCA Ácido tricloroacético
TEMED N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine
TLCK N-p-tosil-lisina clorometilcetona
TMOF Aea-Trypsin Modulating Oostatic Factor
TPCK Tosil-L-fenilalanina clorofenilcetona
Tris Trisaminometano (2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol)
UH Unidade de hemaglutinação
UI Unidade de inibição
UV Luz ultra-violeta
SUMARIO
Pag.
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 21
1.1 O Aedes aegypti............................................................................................... 21
1.2 Viroses transmitidas pelo A. aegypti............................................................... 22
1.2.1 Febre amarela.......................,,....................................................... 22
1.2.2 Febre do chikungunya................................................................... 23
1.2.3 Dengue.......................................................................................... 24
1.3 O controle da dengue....................................................................................... 25
1.4 Plantas no controle de insetos ........................................................................ 28
1.5 Proteinas como moléculas de defesa de plantas.............................................. 30
1.5.1 Inibidores de enzimas digestivas.................................................. 31
1.5.1.1 Proteases........................................................................ 31
1.5.1.1.1 Proteases digestivas de A. aegypti............... 32
1.5.1.2 Amilases ....................................................................... 35
1.5.1.3 Inibidores proteicos....................................................... 35
1.5.2 Proteínas ligantes à quitina........................................................... 37
1.5.2.1 Lectinas......................................................................... 38
1.5.2.2 Vicilinas........................................................................ 39
1.6 Estudos toxicológicos de plantas inseticidas................................................... 39
1.7 Nordeste brasileiro como fonte de plantas para o controle de A. aegypti....... 40
2 OBJETIVOS............................................................................................................. 43
2.1 Objetivos gerais............................................................................................... 43
2.2 Objetivos específicos....................................................................................... 43
3 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................... 44
3.1 Os insetos........................................................................................................ 44
3.1.1 A colônia de A. aegypti................................................................. 44
3.1.2 Dissecação dos intestinos das larvas de A. aegypti....................... 45
3.1.3 Obtenção do homogenato intestinal das larvas (HIL) de A
aegypti...........................................................................................
46
3.1.3.1 Caracterização do HIL de A. aegypti......................... 46
3.1.4 Detecção da quitina no intestino das larvas de A. aegypti........... 47
3.1.5 Obtenção do homogenato dos adultos de A. aegypti.................... 47
3.2 Os extratos de plantas...................................................................................... 49
3.2.1 As sementes ................................................................................. 49
3.2.2 Obtenção dos extratos brutos........................................................ 51
3.3 Ensaios biológicos com Aedes aegypti........................................................... 52
3.3.1 Ensaios larvicida.......................................................................... 52
3.3.2 Ensaio pupicidas........................................................................... 53
3.3.3 Ensaios de repelência/atratibilidade de postura............................ 53
3.3.4 Ensaios adulticida......................................................................... 55
3.3.5 Ensaios de interferência de postura.............................................. 55
3.4 Ensaios de toxicidade...................................................................................... 55
3.4.1 Ensaios de ecotoxicidade aguda com Ceriodaphinia dubia........ 55
3.4.2 Ensaios de toxicidade celular........................................................ 56
3.5 Caracterização parcial dos extratos de sementes de plantas da Caatinga...... 58
3.5.1 Determinação do peso seco........................................................... 58
3.5.2 Dosagem de proteína.................................................................... 58
3.5.3 Dosagem de carboidratos totais.................................................... 58
3.5.4 Dosagem de compostos fenólicos totais....................................... 58
3.5.5 Detecção e dosagem de proteínas ligante a quitina...................... 58
3.5.6 Detecção de componentes do metabolismo secundário................ 59
3.5.7 Perfil eletroforético....................................................................... 59
3.5.8 Detecção de lectinas...................................................................... 59
3.5.9 Detecção de lectinas ligantes à quitina......................................... 60
3.5.10 Detecção de inibidores de proteases serínicas.............................. 60
3.5.10.1 Ensaios de inibição de tripsina.................................. 60
3.5.10.2 Ensaios de inibição de quimotripsina........................ 61
3.5.10.3 Ensaios de inibição das proteases do HIL................. 61
3.5.11 Detecção de inibidores de amilases.............................................. 61
3.5.11.1 Ensaios de inibição das amilases............................... 62
3.6 Frações protéicas de E. contortisiliquum........................................................ 62
3.6.1 Obtenção das frações proteicas de E. contortisiliquum................ 62
3.6.2 Ensaios larvicida e pupicida com as frações proteicas de E.
contortisiliquum............................................................................
62
3.6.3 Caracterização das frações proteicas de E. contortisiliquum........ 62
3.6.4 Detecção in vivo da inibição das proteases digestivas das larvas
de A. aegypti alimentadas com EB e as frações proteicas de E.
contortisiliquum............................................................................
63
3.6.5 Obtenção das frações de E. contortisiliquum com e sem inibidor
de tripsina......................................................................................
63
3.6.6 Obtenção do inibidor de tripsina de E. contortisiliquum (ITEc) 64
3.6.6.1 Constatação in vitro e in vivo da atividade do
inibidor de tripsina de E. contortisiliquum sobre as
larvas de A. aegypti....................................................
65
3.6.6.1.1 Curva e constante de inibição do ITEc 65
3.6.6.1.2 Zimograma.............................................. 65
3.6.7 Obtenção das frações com e sem vicilina..................................... 66
3.7 Análise dos dados............................................................................................ 66
4 RESULTADOS........................................................................................................ 68
4.1 Caracterização do homogenato intestinal e detecção de quitina nas larvas
de A. aegypti....................................................................................................
68
4.2 Atividade biológica dos EB de sementes de plantas da Caatinga contra A.
aegypti.............................................................................................................
69
4.2.1 Atividade larvicida....................................................................... 69
4.2.2 Atividade pupicida....................................................................... 73
4.2.3 Atratibilidade/repelência para a postura das fêmeas de A.
aegypti.......................................................................................... 74
4.2.4 Atividade adulticida..................................................................... 77
4.2.5 Interferência na postura das fêmeas............................................. 78
4.3 Toxicidades dos EB de sementes de plantas da Caatinga.............................. 79
4.3.1 Toxicidade para C. dubia............................................................. 79
4.3.2 Toxicidade para fibroblastos de camundongos 3T3..................... 80
4.4 Ranque dos EB de sementes de plantas da Caatinga....................................... 81
4.5 Composição química parcial dos EB de sementes de plantas da
Caatinga.................................................................................................
83
4.5.1 Detecção de atividades inibitórias................................................ 83
4.6 Seleção e fracionamento do extrato de E. contortisiliquum............................ 88
4.6.1 Atividade larvicida das frações proteicas de E. contortisiliquum 88
4.6.2 Caracterização parcial das frações proteicas de E.
contortisiliquum............................................................................
89
4.6.3 Atividade inibitória in vivo do extrato e frações proteicas de E.
contortisiliquum............................................................................
90
4.6.4 Contribuição dos inibidores de tripsina na atividade larvicida
do extrato e das frações de E. contortisiliquum............................
91
4.6.4.1 Ensaios in vitro com o inibidor de tripsina de E.
contortisiliquum (ITEc) .................................................
94
4.6.5 Contribuição das vicilinas na atividade larvicida de E.
contortisiliquum ..........................................................................
95
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 97
6 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 111
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 113
8 ANEXOS................................................................................................................... 130
Anexo 1 Ensaios larvicida com L4 e diferentes tampões.................................. 130
Anexo 2 Ranking parcial dos ensaios biológicos.............................................. 131
Anexo 3 Tipos sanguíneos nos quais foram identificadas a presença de
letinas por meio de ensaios de hamglutinação ....................................
132
Anexo 4 Obtenção da fração rica em vicilina de A. colubrina........................... 133
Anexo 5 Obtenção da fração rica em vicilina de Vigna ungliculata.................. 133
Anexo 6 Obtenção da fração rica em vicilina de E. velutina............................. 134
Anexos 7 Artigo aprovado para publicação no periódico Parasitology
Research...............................................................................................
135
Anexos 8 Artigo submetido para publicação....................................................... 162
1 INTRODUÇÃO
1.1 O Aedes aegypti
O mosquito Aedes aegypti Linnaeus, 1762 (filo Arthropoda, classe
Hexapoda, ordem Diptera, família Culicidae) é o vetor dos agentes etiológicos da febre
amarela, febre do chikungunya e dengue (Chhabra et al., 2008), embora também insetos
do gênero Aedes possam estar envolvido na transmissão de outras importantes
enfermidades como encefalite equina do leste, febre do vale Rift e filariose (Rozendaal,
1997; Wan-Norafikah et al., 2010).
Originário do continente africano, onde seu ancestral ainda vive nas
florestas subsaarianas, o A. aegypti chegou às Américas durante a colonização
(Donalisio & Glasser, 2002; Powell & Tabachnick, 2013). De hábitos diurnos esse
mosquito se adaptou aos ambientes domésticos e peridomésticos, passando a utilizar
recipientes artificias, como potes, barris, pneumáticos usados, latas, garrafas e vasos de
plantas para a deposição de seus ovos (Claro et al., 2004; Câmara et al., 2007;
Rodriguez et al., 2007; Luz et al., 2008,).
Os ovos de A. aegypti (0,4 mm) são depositados principalmente nas paredes
de recipientes contendo água. Como possuem elevada resistência ambiental, esses ovos
podem permanecer viáveis por período superior a 365 dias. Em contato com a água
ocorre a eclosão das larvas de primeiro ínstar, com cerca de 100 mm de comprimento,
denominadas L1. Durante um período de 6 a 8 dias as larvas sofrem três mudas, que
originam as larvas L2, L3 e L4. As larvas L4, com cerca de 650 mm, se transformam
em pupas das quais, após 2 dias, emergem os mosquitos alados. Os adultos vivem por
cerca de 35-40 dias e se alimentam de substâncias açucaradas, como néctar e seiva.
Após a cópula, a fêmea busca alimentação com sangue em humanos, indispensável para
a maturação de seus oocitos e produção dos ovos (Figura 1) (Forattini, 2002, Beserra &
Castro Jr, 2008).
Figura 1. Esquema do ciclo biológico de Aedes aegypti.
O combate ao A. aegypti foi sistematizado no Brasil a partir do século XX,
em razão das diversas epidemias de febre amarela urbana que levaram à morte milhares
de pessoas (Franco, 1969). Após bem sucedidas campanhas o vetor foi erradicado em
1955 e 1973 (Braga & Valle, 2007a). Em 1976, com origem em um foco em Salvador,
inicia-se a re-colonização, cujo combate esporádico e isolado permitiu a disseminação
desse inseto por todo o país (Marques, 1985; Braga & Valle, 2007a).
1.2 Viroses transmitidas pelo A. aegypti
1.2.1 Febre Amarela
A febre amarela é causada por vírus do gênero Flavivirus, família
Flaviviridae. Em cerca de 90% dos casos a doença se apresenta com formas clínicas
.
.
. .
.
Ovos
Ínstares larvais
Fêmea após repasto sanguíneo
Pupa
Adultos em cópula
cópulacópcópulaoem
copula
benignas que evoluem para a cura, enquanto 10% desenvolvem quadros dramáticos com
mortalidade em torno de 50% (Vasconcelos, 2003).
O vírus, também de origem africana, veio para o continente americano no
final do século XV junto com os A. aegypti, (Vasconcelos, 2003, Marcondes & Tauil,
2011). Com o estabelecimento dos programas de imunização, ocorreu considerável
redução na transmissão dessa arbovirose no Brasil e em outros países endêmicos, como
Bolívia, Colômbia, Equador, Peru e Venezuela, mas padrões epidêmicos têm
permanecido em alguns países da África (Sá et al., 2009), onde ainda se concentram
90% das notificações (Vasconcelos, 2003).
No Brasil o vírus conseguiu refúgio permanente nas áreas silvestres,
passando a ser transmitido entre primatas, utilizando como vetores Haemagogus de
várias espécies e alguns sabetinos (Sabethes sp.) (Marcondes & Tauil, 2011). Assim,
embora não existam notificações de febre amarela urbana desde 1942 (Franco, 1969), o
Brasil possui a maior área de transmissão de febre amarela silvestre do mundo,
existindo o risco de reurbanização dessa virose decorrente da possibilidade de pessoas
infectadas em ambiente silvestre infectarem o A. aegypti urbano (Carvalho et al., 2004;
Lima et al., 2006).
1.2.1 Febre do chikungunya
Febre do chikungunya é uma doença aguda, muito debilitante e ainda sem
tratamento, causada pelo vírus CHIKV, um membro do gênero Alphavirus, família
Togaviridae (Swaroop et al., 2007). Os pacientes tipicamente sofrem de febre, dor de
cabeça, náusea, vômitos, mialgia, rash cutâneo e severa artralgia. Em razão desses
sintomas serem frequentemente similares aos da dengue ou mesmo da malária, e pelo
fato do vírus circular em regiões endêmicas para essas duas enfermidades, a febre do
chikungunya tem sido sub diagnosticada e é ainda pouco conhecida (Weaver & Reisen,
2010). Além disso, há evidencia de que dengue e chikungunya podem ser transmitidas e
estabelecidas simultaneamente, complicando ainda mais o diagnóstico (Albuquerque et
al., 2012).
Surtos epidêmicos têm sido verificados na África e Ásia, mas casos em
viajantes europeus e americanos, inclusive em brasileiro, já foram identificados
(Weaver & Reisen, 2010; Albuquerque et al., 2012; Patil et al, 2013). Vários fatores
provavelmente se combinam para contribuir para a difusão dessa virose, por exemplo,
as altas taxas de ataque em cada surto, a alta viremia dos pacientes e a distribuição
global do vetor (Albuquerque et al., 2012).
1.2.3 Dengue
A dengue foi inicialmente descrita durante uma epidemia na Filadélfia em
1780 e, desde então, intermitentes pandemias tem afetado a Ásia, África e Américas
com intervalos de 10-30 anos (Omena et al., 2007). Em 2005 a dengue foi considerada a
arbovirose mais importante do mundo e estima-se que mais de 2,5 bilhões de pessoas
vivam hoje nas áreas com risco de transmissão (Thomé et al., 2010).
Epidemias de dengue ocorrerem repetidamente no Brasil desde a década de
1980, após o ressurgimento do vetor (Garcez et al., 2009). Casos da doença registrados
pelo Ministério da Saúde alcançaram 1.011.548 em 2010, 764.032 em 2011 e 589.591
em 2012 e 1.470.487 em 2013, totalizando 825 óbitos por febre hemorrágica e durante
esse período (http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/situacao-epidemiologica-dados-
dengue).
O agente infeccioso é o dengue vírus da família dos Flaviviridae. Quatro
sorótipos têm sido reconhecidos, denominados por DEN-I, DEN-II, DEN-III e DEN-IV.
A infecção por qualquer um dos sorotipos produz imunidade permanente a ele, mas
apenas imunidade cruzada temporária aos outros sorotipos (Thomé et al., 2010).
O vírus da dengue causa uma série de manifestações clínicas, incluindo
desde casos assintomáticas, dengue clássica (caracterizada por febre, cefaléia, dor retro-
orbital e mialgia) ou as formas graves, como a febre hemorrágica e a síndrome do
choque da dengue (Omena et al., 2007).
Entre os fatores associados à emergência da dengue nas Américas estão o
acelerado crescimento e urbanização populacional, associados à insuficiência no
controle do vetor e ao aumento do trânsito de pessoas entre os países. A urbanização
rápida e desordenada, associada a uma distribuição desequilibrada dos níveis de renda,
conduziu a uma proporção cada vez maior de pessoas vivendo em áreas onde o
abastecimento de água, esgotamento sanitário e a coleta de lixo são precários ou
inexistentes, favorecendo a proliferação do vetor nos depósitos domésticos de
armazenamento de água e nos recipientes temporários que acumulam água das chuvas,
frequentemente encontrados nos lixos (Claro et al., 2004; Câmara et al., 2007).
1.3 O controle da dengue
Como não há vacina para prevenir a infecção e nem drogas específicas para
combater o vírus nas pessoas infectadas, o controle do vetor é a solução mais
comumente disponível para reduzir a morbidade da dengue nas áreas endêmicas
(Chapagain et al., 2008; Sá et al., 2009).
Em 2002 o Ministério da Saúde estabeleceu o Programa Nacional de
Controle da Dengue (PNCD) (Brasil, 2002). O PNCD foi concebido numa perspectiva
de ações permanentes, por entender que a dengue não pode ser erradicada em curto
prazo, dada à ampla infestação domiciliar que o A. aegypti apresenta. O programa está
pautado em três objetivos básicos: redução da infestação pelo A. aegypti; redução da
incidência da dengue; e redução da letalidade por febre hemorrágica de dengue.
Para alcançar a redução da infestação predial, o Ministério da Saúde tem
lançado mão principalmente do uso de inseticidas químicos e muitos têm sido
desenvolvidos e empregados contra adultos e larvas de A. aegypti (Omena et al., 2007;
Govindarajan, 2009). Entre os mais usados atualmente estão os pertencentes aos grupos
dos organofosforados, carbamatos, organoclorados e piretróides sintéticos (Braga &
Valle, 2007b).
Entretanto, o controle químico não tem conseguido prevenir à ocorrência
cíclica das epidemias de dengues no Brasil (Silveira, 1998; Schatzmayr, 2000; Lima. et
al., 2005), seja pelas falhas operacionais das campanhas, seja pelo surgimento de
populações de insetos resistentes (Polanczk et al., 2003; Lima et al., 2006), que têm
sido registradas em diversos Estados da Federação (Carvalho et al., 2004; Lima et al.,
2006; Lima et al., 2011; Araújo et al., 2013), como também em outros países
(Rodrigues et al., 2001; Melo-Santos et al., 2010; Wan-Norafikah et al, 2010; Shafie
et al., 2012). Adicionalmente os inseticidas químicos não são seletivos e podem trazer
prejuízos diversos ao meio ambiente (Omena et al., 2007).
O controle efetivo dos vetores não pode depender de um só método. Ao
contrário, deve-se dispor de várias alternativas, adequadas à realidade local, que
permitam sua execução de forma integrada (Braga & Valle, 2007b). Os componentes
do controle integrado de vetores devem associar ao controle químico, o manejo
ambiental (para redução dos criadouros do inseto e impedir o contato homem-vetor), a
sensibilização e mobilização da população, além da identificação de inseticidas
alternativos para serem utilizados em alternância com os inseticidas químicos clássicos
para reduzir a incidência das resistências (Kaur et al., 2003, Braga & Valle, 2007;
Ferreira et al., 2009).
Entre os inseticidas alternativos mais utilizados atualmente no Brasil,
destaca-se o uso da bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis serovar
israelenses (Bti) e os reguladores de crescimento (Braga & Valle, 2007; Pluempanupat
et al., 2013).
O Bti é uma bactéria aeróbica formadora de esporos, capaz de produzir um
-endotoxina ou proteína cry que é produzida como cristais de inclusão durante a fase
de esporulação. Após ingestão, a proteína é clivada pelas proteases digestivas do
intestino do inseto, originando uma toxina que leva a formação de poros iônicos na
membrana epitelial, resultando em inchaço e morte (Fernández et al., 2008). O Bti é
uma alternativa efetiva, seletiva e não poluente, entretanto é mais cara que os inseticidas
sintéticos e sua efetividade é reduzida em regiões com incidência solar alta, o que é
observado na maior parte do território brasileiro (Ferré & Van Rie, 2002; Farias et al.,
2010). Adicionalmente, relatos tem sugerido resistência cruzada entre o temephos
(organofosforado) e o Bti (Boyer et al., 2006; Boyer et al., 2012).
Entre os reguladores de crescimento merecem destaque, os inibidores da
síntese de quitina e os análogos de hormônios juvenis (AHJ). Os pertencentes ao
primeiro grupo interferem nas mudas, como o diflubenzuron e navaluron. Os AJH
inibem a emergência dos adultos, como o methoprene e pyriproxifen. Todos esses
produtos têm sido recomendados para uso em água potável pela OMS (Chavasse &
Yap, 1997; WHO, 2006; Braga & Valle, 2007b).
Inovadoras pesquisas têm sugerido variadas ferramentas, como o
desenvolvimento de pequenos inibidores que bloqueiam o metabolismo sanguíneo,
reduzindo a fecundidade das fêmeas (Isoe et al., 2009a) e o desenvolvimento de
mosquitos geneticamente modificados, refratários a infecção/transmissão ou mesmo
estéreis (Thomé et al., 2010), que poderão no futuro próximo contribuir nos programas
de controle do A. aegypti.
1.4 Plantas no controle de insetos
Em resposta a herviboria excessivas de muitos insetos e ao ataque de
patógenos, as plantas desenvolveram diversas estratégias de proteção que permitiram
sua co-evolução junto a esses predadores. Esses mecanismos de defesa podem ser
classificados como físicos (espinhos, tegumentos, etc) ou químico. Os fitoquímicos
podem ser produzidos constitutivamente ou induzidos por agressões ou estímulos
ambientais e serem encontrados em toda a planta ou em órgãos específicos (Maffei et
al., 2007; Koul &Walia, 2009).
Não obstante as propriedades pesticidas das plantas já serem conhecidas a
milhares de anos, nos tempos recentes o interesse pela identificação de inseticidas
naturais tem crescido bastante, especialmente para utilização no controle de pragas
agrícola (Koul &Walia, 2009). Plantas também podem auxiliar na interrupção da
transmissão de doenças veiculadas por insetos, aumentando a oferta de produtos ativos
em programas de rotação de inseticidas (Luna et al., 2005; Patil et al., 2010; Pontual et
al., 2012).
As plantas podem ser utilizadas para a preparação de extratos, obtenção de
óleos essenciais ou terem um certo componente químico ativo identificado e purificado
para ser utilizado isoladamente (Koul &Walia, 2009).
A utilização de extratos pode ser vantajosa uma vez que eles, em geral,
possuem alto grau de biodegradação, resultando em baixo impacto ambiental, são
constituídos por diferentes moléculas, que atuando em mecanismos de ação diversos
podem retardar o surgimento de resistências, e possuem modo de preparo fácil com
baixo custo de produção (Koul & Walia, 2009; Govindarajan, 2009; Pontual et al.,
2012).
Diversos trabalhos tem sido realizados investigando a ação de plantas no
controle de A. aegypti e muitos extratos com propriedades larvicida (Murugan et al.,
2007; Chapagain et al., 2008; Coelho et al., 2009; Garcez et al., 2009; Patil et al.,
2010; Souza et al., 2011; Pontual et al., 2012; Patil et al., 2011; Pluempanupat et al.,
2013), pupicida (Murugan et al., 2007; Souza et al., 2011; Pluempanupat et al., 2013),
adulticida (Murugan et al., 2007; Ravindran et al., 2012), repelentes contra picadas
(Murugan et al., 2007; Govindarajan, et al., 2011), repelentes para a postura de ovos
(Coria et al., 2008; Gupta et al., 2011) ou inibidores do desenvolvimento (Coelho et al.,
2009; Chapagain et al., 2008; Patil et al., 2011; Rajasekaran & Duraikannan, 2012) já
foram identificados. Inclusive com plantas com propriedades medicinais diversas (Luna
et al., 2005; Omena et al., 2007).
Patil et al. (2011) demostrou recentemente que extratos de Plumbago
zeylanica e Cestrum nocturnum tiveram sua toxicidade contra as larvas de A. aegypti
positivamente influenciados pelo aumento da temperatura, o que seria de grande valia,
já que a transmissão da dengue ocorre especialmente em regiões de clima tropical
(Bhatt et al., 2013).
A toxicidade de um extrato não difere apenas entre os insetos, mas pode
variar significativamente dependendo do órgão ou da idade da planta, bem como do
solvente de extração utilizado (Luana et al., 2005; Patil et al., 2010).
Extratos ativos contra A. aegypti tem sido obtidos utilizando diferentes
partes das plantas, como folhas, raízes, caules, cascas, tubérculos e flores (Luana et al.,
2005, Murugan et al., 2007, Garcez et al., 2009; Patil et al., 2010; Govindarajan, 2009;
Govindarajan, et al., 2011; Patil et al., 2011; Napoleão et al., 2012; Ali et al., 2012;
Ravindran et al., 2012), mas poucos trabalhos tem explorado o potencial das sementes
(Farias et al., 2010; Souza et al., 2011).
As sementes são alvos interessantes para a pesquisa de moléculas bioativas,
pois como estruturas nas quais o embrião é disperso, elas são responsáveis tanto pelo
desenvolvimento inicial da nova planta, como também pela sua defesa contra patógenos
e predadores Além disso, as sementes são, em geral, de fácil obtenção e podem ser
armazenadas por longos períodos (Batista et al., 1996; Uchôa et al., 2009).
Como extratores tem sido utilizados principalmente solventes orgânicos
como etanol, metanol, hexano e cloroflórmio (Luana et al., 2005; Omena et al., 2007;
Murugan et al., 2007; Garcez et al., 2009; Patil et al., 2010; Govindarajan, et al., 2011;
Patil et al., 2011; Souza et al., 2011; Ali et al., 2012; Ravindran et al., 2012;
Pluempanupat et al., 2013) e poucos trabalhos tem utilizado água destilada (Coelho et
al., 2009; Farias et al., 2010; Pontual et al., 2012), ou soluções salinas que favorecem a
extração de proteínas globulínicas (Sá et al., 2009).
1.5 Proteínas como moléculas de defesa de plantas
Os compostos químicos oriundos das plantas podem ter natureza proteica ou
não proteica (Carlini & Grossi-de-Sá, 2002). Dentro dos reconhecidos como
pertencentes ao arsenal de defesa das plantas, os denominados de metabólitos
secundários, tais como terpenos, alcaloides, flavonoides, saponinas entre outros, têm
sido considerados os mais importantes (Koul & Walia, 2009) e diversos desses
compostos já foram isolados e sua eficácia demostrada contra o A. aegypti (Chapagain
et al., 2008; Souza et al., 2011; Pluempanupat et al., 2013).
Todavia, recentemente algumas proteínas têm sido reconhecidas como
moléculas de defesa das plantas, como por exemplo, as que atuam como inibidores de
enzimas digestivas (proteases e amilases) e as proteínas com capacidade de ligação à
quitina (Mota et al., 2003). Em 2009 Sá e colaboradores relataram pela primeira vez a
atividade larvicida contra A. aegypti de proteínas de origem vegetal.
1.5.1 Inibidores de enzimas digestivas
1.5.1.1 Proteases
As proteases (proteinases ou peptidases) são enzimas que realizam
proteólise, ou seja, hidrólise das ligações peptídicas que une os aminoácidos nas cadeias
polipeptídicas das proteínas. Essas enzimas são essenciais para a sobrevivência de todos
os seres vivos, pois controlam múltiplos processos biológicos (Rawlings et al., 2004;
López-Otín & Bond, 2008) e são reunidas em seis distintas classes, conforme seu
mecanismo de catálise: proteases de serina, proteases de treonina, proteases de cisteína,
proteases de ácido aspártico, proteases de ácido glutâmico e metaloproteases (Rawlings
et al. 2004; López-Otín & Bond, 2008).
As proteases de serina ou proteases serínicas são encontradas em todos os
reinos filogenéticos e até mesmo em vírus, e estão envolvidas em muitos processos
fisiológicos importantes como ativação de zimogênios, digestão dos alimentos, defesa
imunológica, reprodução, desenvolvimento, transdução de sinais e recuperação de
lesões (Hedstrom, 2002; Brackney et al., 2010).
As proteases serínicas que atuam como endopeptidase estão organizadas em
famílias e subfamílias. A subfamília SI.A inclui as tripsinas, quimotripsinas, elastases e
alguns colagenases serínicas recentemente identificadas. Estas enzimas contêm uma
tríade catalítica constituída de histidina (His), aspartato (Asp) e serina (Ser) e
estruturas tridimensionais semelhantes (Blow, 1997). Apesar das semelhanças, essas
enzimas tem um conjunto único de resíduos catalíticos acessórios que são pensados ser
importante na determinação da especificidade do substrato (Hedstrom , 2002; Brackney
et al. , 2010). Por exemplo, as tripsinas contem um resíduo de Asp que interagem
iônicamente com aminoácidos de carga negativa, por isso cliva especificamente as
ligações peptídicas com arginina (Arg) e lisina (Lys) na posição C-terminal. As
quimotripsinas clivam ligações peptídicas contendo resíduos de aminoácidos com
cadeias laterais hidrofóbicas como a fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) e triptofano (Trp)
em razão da presença de um bolsão apolar. Em contraste, as colagenases de serina têm
bolsos de especificidade do substrato menos definidos e, por conseguinte, apresentam
uma ampla gama de locais de clivagem nos substratos proteicos (Brackney et al., 2010;
Rascon Jr. et al., 2011).
1.5.1.1.1 Proteases digestivas de A. aegypti
A digestão de proteínas em A. aegypti é mediada pela robusta liberação de
endo e exoproteases (Isoe et al., 2009a). As exoproteases, tais como carboxipepetidases
e aminopeptidases são capazes de degradar proteínas a partir das suas regiões C- e N-
terminais, respectivamente. Todavia sua eficácia depende da atividade das
endopeptidases para gerar um numero suficiente de terminações num certo espaço de
tempo (Soares et al., 2011). Isoe et al. (2009b) caracterizou 18 genes de
carboxipepetidases presentes no intestino de A. aegypti.
As endoproteases dos mosquitos pertencem à classe das proteases serínicas
(Lopes et al., 2004). Centenas de genes de proteases serínicas têm sido identificados no
genoma do A. aegypti (Venancio et al., 2009), mas somente o produto de poucos deles
tem sido identificado no trato digestório, o que pode ser explicado pela diversidade
fisiológicas dessa enzimas, tornando-as críticas em diversos tecidos e não apenas no
tubo digestório (Brackney et al., 2010).
As proteases serínicas que participam da digestão nos insetos A. aegypti são
principalmente enzimas do tipo tripsinas, quimotripsinas e colagenases serínicas
(Brackney et al., 2010; Mesquita-Rodrigues et al., 2011). O número e tipo de enzima
vária de acordo com a fase do ciclo biológico do inseto, revelando uma adaptação ao
tipo de alimentação. Todavia as proteases do tipo tripsinas são as mais abundantes nas
diferentes fases do desenvolvimento desses insetos (Yang & Davis, 1971b; Borovsky &
Meola, 2004; Mesquita-Rodrigues et al., 2011). Pela análise de EST (marcador de
sequência genética, expressed sequence tag) Venancio et al. (2009) identificou 66
possíveis genes de tripsina, sendo alguns preferencialmente expressos nas larvas (12
genes), outros nos adultos (15 genes) e outros expressos e ambas as fases (39 genes).
Não obstante a constatação de que nas larvas a atividade das tripsinas seja
bem superior à atividade das quimotripsinas (Borovsky & Meola, 2004; Mesquita-
Rodrigues et al., 2011), acredita-se que os dois tipos de enzimas sejam importantes para
maximizar a digestão das partículas alimentares, já que muitas vezes a digestão deve
ocorrer mesmo em baixas temperaturas em razão das larvas se desenvolverem em
ambientes aquáticos (Yang & Davis, 1971b).
Pouco é conhecido sobre o número e quais as proteases serínicas que atuam
nas larvas (Souza et al., 2011). Kunz (1978) verificou a presença de pelo menos 12
proteinases serínicas nessa fase. Pela análise do zimograma do conteúdo intestinal
Mesquita-Rodrigues et al. (2011) identificaram 8 bandas com peso moléculas aparentes
de 20 a 250 KDa, ativas do pH 5,5 ao pH 10 e ótima atividade entre 37 OC e 60
OC.
Borovsky e colaboradores (citado por Borovsky & Meola, 2004) sequenciaram uma
quimotripsina e duas tripsinas nas larvas de A. aegypti (Genbank AF487334, AF487426
e AY198134).
Recentemente Soares et al. (2011) utilizando uma biblioteca de fragmentos
de tripsina, identificou e caracterizou uma enzima que é transcrita em todos os ínstares
larvais, mas não em adultos. Essa tripsina, que foi chamada de AAEL005607, teve sua
atividade fortemente reduzida por dois inibidores de tripsina, o HiTI (Inibidor de
tripsina de Haematobia irritans) e o AaTI (Inibidor de tripsina de A. aegypti), com
valores de IC50 de 230 pM e 19 pM, respectivamente.
A atividade das tripsinas e quimotripsinas aumentam com o
desenvolvimento das larvas (Borovsky & Meola, 2004), mas grande parte dessas
enzimas são excretadas durante a metamorfose para pupa (Yang & Davis, 1971a).
Mesmo assim Mesquita-Rodrigues et al. (2011) mostrou que as pupas ainda apresentam
uma atividade proteolítica residual complexa com a visualização de 11 bandas pelo
zimograma.
Nos adultos a atividade proteolítica permanece em baixos níveis após a
emergência, e nas fêmeas ela aumenta após o consumo de sangue (Yang & Davies,
1971a). Como as fêmeas podem consumir mais sangue que seu peso corporal durante
um repasto sanguíneo, cabe a essas enzimas rapidamente digiram os componentes
sanguíneos, sendo que as tripsinas podem responder por 90% da atividade proteolítica
intestinal (Borovsky & Schlein 1988; Borovsky & Meola, 2004; Brackney et al., 2010).
A expressão das tripsinas é regulada transcricionalmente, ocorrendo de forma bifásica,
caracterizando a digestão recente e a tardia. A digestão recente tem seu pico de 1-6h
após a refeição, enquanto que a tardia alcança seu pico de 18-14h após o repasto (Isoé
et al., 2009). A digestão dos componentes sanguíneos não é necessária para a
sobrevivência dos adultos, mas é fundamental para a maturação dos oócitos e produção
dos ovos pelas fêmeas (Isoe et al., 2009a).
1.5.1.2 Amilases
As amilases são enzimas que digerem amido liberando glicose. Essas
enzimas são produzidas nas glândulas salivares que nos insetos ficam localizadas no
tórax, onde também são produzidas outras enzimas que participam do metabolismo dos
carboidratos, como as α-glucosidases e maltases (Barreau et al., 1999). O açúcar é
utilizado como fonte de energia para a sobrevivência, locomoção e reprodução dos
insetos (Marinotti & James, 1990).
Embora existam vários estudos sobre as funções da saliva, pouco é
conhecido sobre as amilase presentes em A. aegypti e os estudos existentes se
concentram na identificação das enzimas expressas nas fêmeas adultas (Marinotti &
James, 1990; James et al., 1991; Grossman et al., 1993; Grossman et al., 1997; Juhn et
al., 2011). Todavia sabe-se que a atividade amilásica é muito elevada nas larvas,
fortemente reduzida nas pupas, já que muitas amilases são excretadas durante esse
estágio, e é constitutiva na fase adulta (Yang & Davis, 1971a; McGeachin et al., 1972).
1.5.1.3 Inibidores proteicos
Os inibidores se ligam precisamente ao sitio ativo das enzimas (proteases
ou amilases) de um modo semelhante ao substrato, entretanto o complexo resultante é
bem mais estável do que o observado entre enzima - substrato e enzima - produto (Oliva
et al., 2010).
Nas plantas os inibidores exercem diversas funções fisiológicas,
especialmente na resposta a fatores abióticos, no estresse biótico e na defesa contra
ataque de insetos pragas (Gomes et al., 2005). E têm sido identificados particularmente
nos tecidos de estoque, tais como frutos, tubérculos e sementes (Cruz et al., 2013).
Quando ingeridos esses inibidores podem comprometer a digestão e
absorção dos nutrientes essenciais, interferindo no crescimento e desenvolvimento do
inseto, ou mesmo ocasionando-lhe a morte (Macedo et al., 2004; Gomes et al., 2005;
Oliveira et al., 2007; Oliveira et al., 2009; Oliva et al., 2010, Cruz et al., 2013). Dessa
forma podem atuar como uma poderosa e útil ferramenta no controle de insetos (Carlini
& Grossi-de-Sá, 2002; Soares et al., 2011).
A defensiva função dos inibidores de proteases parece não estar restrita a
inibição das enzimas digestivas, uma vez que as proteases atuam em diversos outros
processos importantes como, por exemplo, a oogênese e metamorfose (Mesquita-
Rodrigues et al., 2011). Sumikawa et al. (2010) sugeriram que a presença de domínios
funcionais nos inibidores pode resultar em diferentes sinalizações que ocasionam a
morte do predador, como estratégia para ultrapassar a inativação adquirida pelas
enzimas dos insetos.
Os inibidores de proteases serínicos são provavelmente as proteínas de
sementes de plantas mais intensamente investigadas (Batista et al., 2001). Eles são
agrupadas em famílias, conhecidas como: Kunitz, Bowman-Birk, batata I, batata II,
abóbora, cevada, cistatinas e miscelânea (Rawlings et al., 2004; Nakahata et al., 2011).
Os inibidores tipo Kunitz são amplamente encontrados em sementes. Eles possuem peso
molecular de cerca de 20 kDa, estrutura primária com cerca de 180 resíduos de
aminoácidos, pontes dissulfetos entre os resíduos de cisteinas e um ou dois sítios
reativos que são responsáveis por sua atividade inibitória (Batista et al., 2001; Zhou et
al., 2013).
Recentemente Grupta et al. (2011) demostraram atividade larvicida e
adulticida de um inibidor proteico de α-amilase purificado de sementes de
Macrotyloma uniflorum. Em ensaios in vitro os autores demostraram que o inibidor se
ligou as α-amilases das larvas por um mecanismo não-competitivo. Posteriomente
Pontual et al. (2012) atribuiu a atividade larvicida do extrato de folhas de Moringa
oleifera à presença de inibidores proteicos, pois em ensaios in vivo (98,6% de
inibição) e in vitro (Ki = 0,6 nM) foi constatada forte inibição das tripsinas presentes
no intestino das larvas. A atividade inibitória e larvicida desse extrato foram perdidas
após tratamento térmico.
1.5.2 Proteinas ligantes à quitina
Muitas proteínas que se ligam à quitina podem também atuar na defesa das
plantas contra os organismos que contêm este polissacarídeo. A quitina é encontrada
naturalmente na parede celular de fungos, no exoesqueleto de invertebrados e no
intestino médio de insetos e outros invertebrados, constituindo a membrana peritrófica.
Essa membrana é uma estrutura essencial para a fisiologia do intestino, pois protege o
epitélio da abrasão das partículas alimentares, da ação das enzimas digestivas e do
ataque dos patógenos, além de facilitar a reciclagem das enzimas digestivas, regular a
taxa de digestão, entre outras funções (Mota et al., 2003; Villalon et al., 2003; Uchôa
et al., 2009). Assim, proteínas que se ligam à membrana peritrófica com capacidade de
alterar sua arquitetura e permeabilidade podem ocasionar morte de insetos (Mota et al.,
2003).
1.5.2.1 Lectinas
Lectinas são proteínas amplamente encontradas nas plantas. As lectinas que
se ligam aos carboidratos das membranas plasmáticas promovem a formação de uma
rede de eritrócitos responsável pelo fenômeno da hemaglutinação (Sá et al., 2009).
O mecanismo de ação das lectinas inseticidas não é totalmente
compreendido, mas tem sido sugerido que lectinas com afinidade à quitina podem
reconhecer os resíduos de N-acetilglicosamina da membrana peritrófica e alterar sua
arquitetura e função (Macedo et al., 2007; Coelho et al., 2009). Adicionalmente
lectinas também podem se ligar as porções glicosadas das enzimas digestivas, alterando
suas funções (Paiva et al., 2013) e/ou atravessar a barreira epitelial e comprometer a
função de órgãos extra-intestinais (Fitches et al., 2001). Lectinas com atividade
entomotóxica para vários grupos de insetos têm sido identificadas (Macedo et al., 2003;
Macedo et al., 2004; Kaur et al., 2006; Macedo et al., 2007).
Recentemente alguns estudos comprovaram o efeito deletério de lectinas de
origem vegetal para A. aegypti. Sá et al. (2009) verificou atividade larvicida de duas
lectinas ligantes à quitina de Myracrodruon urundeuva (uma planta abundante na
Caatinga com propriedade mediciais), uma obtida do cerne (MuHL, heartwood lectin) e
outra da casca (MuBL, bark lectin) e ainda demostrou que a atividade dessas proteínas é
mantida mesmo após exposição a luz solar. Posteriomente Napoleão et al. (2012)
também verificou óbito das larvas alimentadas com uma outra lectina ligantes à quitina
obtida das folhas de M. urundeuva (MuLL, leaf lectin). Adicionalmente esses autores
constataram que a MuLL resiste à proteólise e interfere na digestão, inibindo a atividade
das proteases e estimulando a atividade amilásica.
Coelho et al. (2009) constatou que a lectina ligante à quitina das sementes
de Moringa oleifera (WSMoL) além de interferir na sobrevivência das larvas, causa
importantes alterações morfológica nos intestinos desses insetos. Agra-Neto et al.,
(2014) verificaram que WSMoL estimula a atividade das proteases e inibe a atividade
amilásica, mas que não causa morte nas larvas de A. aegypti resistentes a
organofosforados. Em adição Santos et al. (2012) demostraram que a presença dessa
lectina é capaz de atrair as fêmeas de A. aegypti para a postura e ocasionar a
inviabilidade dos ovos resultantes.
1.5.2.2 Vicilinas
As vicilinas estão entre os mais recentes membros do grupo de defesa das
plantas, tendo sido estudada inicialmente na cultivar africana IT81D-1045 de Vigna
unguiculata resistentes ao coleóptero Callosobruchus maculatus (Macedo et al., 1993).
Posteriormente a atividade inseticida de vicilinas de outras fontes foram comprovadas
para outros coleópteros (Sales et al., 2005; Moura et al., 2007; Paes et al., 2008),
lepidópteros (Mota et al., 2003; Amorim et al., 2008) e dípteros (Macedo et al., 2008).
As vicilinas possuem natureza globulínicas e são classificadas como 7S, de
acordo com os seus coeficientes de sedimentação. Embora sejam primordialmente
proteínas de reserva, combinações de vários genes estruturais e os extensivos
processamentos pós-translacional ocasionam um elevado grau de polimorfismo para
estas proteínas, explicando sua multifuncionalidade (Mota et al , 2003; Moura et al.,
2007).
1.6 Estudos toxicológicos de plantas inseticidas
Embora se espere que os extratos oriundos de plantas sejam biodegradáveis
e ofereçam baixo risco para mamíferos, se faz indispensável a confirmação desse
afirmação com testes específicos. Entre as metodologias usadas tem se destacado a os
ensaios de toxicidade aguda com camundongos (Farias et al., 2010; Souza et al., 2011)
e os que utilizam organismos não alvo, como o peixe Poecilia reticulata (Patil et al.,
2011). Todavia o organismo mais usado tem sido o pequeno crustáceo Artemia salina,
já que seus ensaios de letalidade tem boa correlação com citotóxica atividade contra
alguns tumores sólidos de humanos e com atividade pesticida (Souza et al., 2011, Luana
et al., 2005.). Entretanto recentes estudos têm classificado as Artemia como espécies
pouco sensíveis para estudos de ecotoxicidade, quando comparada com outros
organismo nas mesmas condições experimentais (Nunes et al., 2006), como por
exemplo o cladocera Ceriodaphnia dubia que tem sido usada amplamente como um
organismo bioindicador da presença de contaminates químicos, especialmente
inseticidas em água de rios e solos (Shen et al., 2012).
1.7 Nordeste brasileiro como fonte de plantas para o controle do A. aegypti
O Brasil é considerado o país com a maior biodiversidade do mundo. O
número total de espécies encontradas nesse país é ainda desconhecido, mas estima-se
que hospede cerca de 20 % de todas as plantas do mundo com alto grau de endemismo
(Pessoa et al., 2006).
A maior parte do Nordeste brasileiro (aproximadamente 70%) é recoberto
por uma vegetação típica, com florística variável e padrão fisionômico peculiar,
chamada de Caatinga. A Caatinga é um exclusivo ecossistema brasileiro caracterizado
por uma vegetação xerófila decídua na qual a produção de folhas e flores é dependente
das chuvas que são muito mal distribuídas em termos de volume e distribuição ao longo
do ano (Araujos et al., 2007; Albuquerque et al., 2007; Araujo et al., 2008). Não
obstante o fato de recobrir vasta área do território brasileiro, a Caatinga é fonte de
poucos estudos por produtos naturais (Albuquerque et al., 2007).
O Nordeste brasileiro é também uma área de elevada endemicidade para a
dengue. Nos anos de 2012 e 2013 foram notificados 375.379 casos com 250 óbtidos. A
incidência dos casos em 2012 (45,6 casos por 1.000 habitantes) foi superior à média
nacional (36,3 casos/ 1.000 habitantes)
(http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/situacao-epidemiologica-dados-dengue).
Como grande parte da população que habita essa área de risco sofre de
vários graus de pobreza, a descoberta de produtos derivados de plantas obtidos
localmente, com preparo simples e baixo custo, seria de grande valor para auxiliar no
controle local dessa enfermidade (Luna et al., 2005).
Poucos estudos têm sido realizados para identificar plantas do Nordeste com
atividade inseticida contra A. aegypti, mesmo assim algumas publicações indicam o
potencial promissor desse ecossistema. Luna et al. (2005) preparam 23 extratos
etanólicos utilizando diversas partes de 16 plantas medicinais do Nordeste e verificaram
100% de mortalidade das larvas utilizando os extratos das folhas de Annona muricata,
caule de Bauhinia cheilantha e tubérculos de Operculina macrocarpa. Farias et al.
(2010) constataram toxicidade para A. aegypti de 15 extratos aquosos de sementes de
leguminosas da Caatinga, sendo que os extratos de Amburana cearensis,
Anadenanthera macrocarpa, Dioclea megacarpa, Enterolobium contortisiliquum e
Piptadenia moniliformis causaram 100% de mortalidade das larvas. Além de
constituintes do metabolismo secundários os extratos obtidos possuiam elevados
conteúdos de proteínas solúveis, lectinas e atividade inibitória para tripsina. Também
Souza et al., (2012) prepararam 21 extratos etanólicos com sementes de plantas do
Nordeste e verificaram atividade larvicida contra cepas de A. aegypti resistentes ao
temephos em 15 extratos e 100% de mortalidade para as larvas incubadas com os
extratos de Myracrodruon urundeuva e Schinopsis brasiliensis.
Nesse contexto foram preparados 21 extratos salinos utilizando sementes de
plantas oriundas da Caatinga, os quais foram testados em diferentes fases de
desenvolvimento dos insetos A. aegypti. Adicionalmente foi investigada a participação
de proteínas com atividades distintas, inibidores de tripsina e vicilinas ligantes à quitina,
na atividade inseticida do extrato de Enterolobium contortisiliquum.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Analisar as atividades biológicas de extratos salinos de plantas da Caatinga
sobre diferentes aspectos do ciclo de desenvolvimentos dos insetos Aedes aegypti e
investigar a participação de proteínas bioativas nessas atividades.
2.2 Objetivos Específicos
Obter um raqueamento dos diferentes extratos, conforme suas eficácias nos ensaios
biológicos, para tornar possível a identificação dos extratos mais eficázes contra os
insetos A. aegypti.
Verificar a toxicidade celular e ambiental dos extratos salinos de sementes de
plantas da Caatinga;
Caracterizar parcialmente os extratos salinos de sementes de plantas da Caatinga
com atividade inseticida contra A. aegypti, com ênfase na identificação de proteínas
com potencial inseticida;
Verificar a participação de um inibidor de tripsina e de proteínas vicilinas na
atividade inseticida de um dos extratos salinos com destacada atividade biológica
contra os insetos A. aegypti.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Os insetos
3.1.1 A colônia de A. aegypti
Todos os espécimes de Aedes aegypti utilizados nos ensaios foram oriundos
de uma colônia de procriação (Figura 2) mantida no Laboratório de Entomologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (LABENT-UFRN), com temperatura
constante de 28 oC e fotoperíodo natural.
.
Figura 2. Colônia de A. aegypti. A. Gaiolas de procriação; B. Bandejas de eclosão das
larvas; C. Gaiolas para emergências dos adultos.
Para montagem da colônia, ovitrampas foram colocadas em diversos pontos
no Campus Universitário da UFRN entre junho e setembro de 2009. Semanalmente as
palhetas foram trazidas para o laboratório e submersas em bandejas plásticas contendo
água limpa e ração para roedores autoclavada para a eclosão das larvas. Em seguida as
palhetas foram removidas e as larvas monitoradas até a formação das pupas. As pupas
foram transferidas para gaiolas de emergência dos adultos. Os adultos foram capturados
com aspirador manual de castro, anestesiados com refrigeração e os identificados como
A. aegypti foram destinados para as gaiolas de procriação.
Nas gaiolas de procriação os adultos foram alimentados com uma solução
açucarada (10%). Para o repasto sanguíneo das fêmeas, a cada 48 h um hamster da
espécie Mesocricetus auratus foi colocado dentro da gaiola num contensor de plástico
vazado por 2 h. Ovitrampas foram colocadas e substituídas semanalmente para
recolhimento dos ovos.
Somente após um ano de procriação, os ovos recolhidos nas ovitrampas
foram utilizados para obtenção de larvas, pupas e adultos que foram utilizados nos
ensaios biológicos. Esse tempo foi estipulado para que os testes fossem realizados com
uma população de insetos que não estava sob os efeitos dos inseticidas utilizados nas
campanhas públicas de controle de A. aegypti.
3.1.2 Dissecação dos intestinos das larvas de A. aegypti
Para obtenção dos intestinos íntegros, larvas do quarto estádio (L4) foram
transferidas para uma placa de petri resfriada contendo tampão fosfato de sódio 50 mM
pH 8,0. Após a redução dos movimentos das larvas, os apêndices terminais foram
removidos com um bisturi. Em seguida as cabeças foram cortadas e, com o auxílio de
uma pinça entomológica, os intestinos foram exteriorizados e transferidos para tubos
tipo eppendorfs contendo tampão fosfato de sódio ou tris-HCl 50 mM pH 8,0 e
armazenados a -20oC (Figura 3)
3.1.3 Obtenção do homogenato intestinal das larvas (HIL) de A. aegypti
O homogenato intestinal das larvas (HIL) de A. aegypti foi preparado
seguindo a metodologia estabelecida por TERRA et al. (1977), com algumas
modificações. Um total de 100 intestinos íntegros das larvas L4 foi transferido para tubo
tipo eppendorf com 1000µL de tampão fosfato de sódio ou tris-HCl 50 mM pH 8,0. Os
intestinos foram macerados com o auxílio de pistilo em banho de gelo. Em seguida os
tubos foram centrifugados (10.000 x g, 10 minutos, 4 oC) e o sobrenadante recolhido e
identificado como HIL, o qual foi armazenado a -20 ºC até sua utilização.
3.1.3.1 Caracterização do HIL de A. aegypti
O HIL de A. aegypti foi caracterizado quanto ao seu teor proteico,
atividade proteolítica em diferentes pH e temperaturas e determinação das classes
mecanisticas das enzimas presentes.
Para verificar o efeito do pH e da temperatura sobre a atividade proteolítica
do HIL, ensaios enzimáticos foram realizados utilizando diferentes tampões (acetato de
sódio/ ácido acético 0,1 M pH 4,0; acetato de sódio/ ácido acético 0,1 M pH 5,0; ácido
cítrico/ citrato de sódio 0,1 M pH 6,0 Tris-HCl 0,05 M pH 7,0, Tris-HCl 0,05 M pH 8,0,
Tris-HCl 0,05 M pH 9,0, glicina-NaOH 0,1 M pH 10,0 e bicarbonato de sódio/NaOH
0,1 M pH 11) e em diferentes temperaturas (5 °C, 10 °C, 20 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C,
60 °C, 70 °C, 80°C e 90 °C).
Para confirmação da classe mecanística das enzimas digestivas, o HIL foi
previamente incubado com inibidores de proteases serínicas (inibidor de tripsina de
soja (SBTI) 1mM, fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) 1mM, tosil-L-fenilalanina
clorofenilcetona (TPCK) 0,1mM e N-p-tosil-lisina clorometilcetona (TLCK) 0,1mM);
inibidores de proteases cisteínicas (L-trans-epoxisulfonilfluoreto (E-64) 0,01mM e
iodoacetamina (IA) 0,1mM) e inibidores de metaloproteinases (ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,01M e 1,10-fenantrolina (FENA) 0,1mM).
3.1.4 Detecção da quitina no intestino das larvas de A. aegypti
A presença de quitina no intestino das larvas L4 foi confirmada pelo teste de
Von Wisselinght (Roger & Perkins, 1968). Um total de 700 larvas foram dissecados à
frio como descrito anteriormente. Em seguida os intestinos foram tratados com NaOH e
lavados com concentrações crescentes de álcool etílico. A presença da quitina foi
revelada pela adição de lugol e ácido sulfúrico 1%. Controle positivo foi feito com
quitina de lagosta e o negativo com celulose.
3.1.5 Obtenção do homogenato dos adultos (HA) de A. aegypti
Em razão da dificuldade de obtenção dos intestinos íntegros, para os adultos
foi preparado um homogenato com o corpo dos insetos como descrito a seguir.
Adultos, macho e fêmeas, foram anestesiados com o frio. Em seguida eles
foram transferidos para uma placa de petri resfriada, contendo tampão fosfato de sódio
50 mM pH 8,0 e, com o auxílio de pinça entomológica e bisturi, tiveram a cabeça, asas
e patas removidas (Figura 4). Um total de 400 corpos (tronco e abdômen) foram
transferidos para tubo tipo eppendorf com 1000 µL de fosfato de sódio 50 mM pH 8,0,
onde foram macerados em banho de gelo. Em seguida os tubos foram centrifugados
(10.000 x g, 10 minutos, 4 oC) e o sobrenadante recolhido e identificado como HA que
foi armazenado a -20 ºC até sua utilização.
Figura 3. Etapas para retiradas dos intestinos das larvas L4 de A. aegypti. A.
Transferência das larvas para placas resfriadas; B. Imobilização das larvas; C.
Retiradas dos apêndices terminais ; D. Retirada da cabeça; E. Exteriorização do
intestino; F. Intestino e corpo separados.
Figura 4. Adulto de A. aegypti imobilizado para obtenção do homogenato dos adultos
(H). As retas indicam as partes que foram removidas: cabeça (azul), patas (verde) e asas
(vermelho).
3.2 Os extratos de plantas
3.2.1 As sementes
Foram utilizadas sementes de 21 espécies (Tabela 1, Figura 5) gentilmente
doadas pelo banco de sementes da Caatinga do ICMBio/MMA (Instituto Chico Mendes
de Conservação da Biodiversidade/ Ministério do Meio Ambiente) situado na Floresta
Nacional (Flona) de Nísia Floresta, Rio Grande do Norte, Brasil.
Além de pertencerem ao bioma Caatinga, foram utilizados como critério de
inclusão das espécies no estudo, a dispobilidade das sementes em quantidades
abundantes (3 Kg) e a facilidade de manipulação, uma vez que algumas sementes foram
descartadas já que sua dureza dificultava a etapa de trituração para obtenção da farinha.
Tabela 1. Família, nomes científicos e nomes vulgares das plantas cujas sementes foram
utilizadas nesse estudo.
Família Espéceis Nome vulgar
Anacardiaceae Myracrodruon urundeuva (Engl.) Fr. All Aroeira
Schinopsis brasilienis Engl Braúna
Euphorbiaceae
Cnidoscolus phyllanthus (Mull. Arg.) Pax & L. Hoffm Favela
Croton Sonderianus Mull. Arg. Marmeleiro
Ricinus communis L. Carrapateira
Fabaceae
Amburana cearenses (Fr. Allem.) A. C. Sm., Cumaru
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan Angicos
Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud Mororó
Caesalpinia ferrea Mart. Jucá
Caesalpinia pyramidalis Tul. Catingueira
Crotalaria retusa L. Crotalária
Diocleia grandiflora Mart Diocléia
Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong Tamboril
Erythrina velutina Willd Mulungu
Mimosa caesalpiniifolia Benth Sabiá
Mimosa regnellii Benth Juquiri
Piptadenia moniliformis Benth Catanduva
Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke Jurema branca
Piptadenia viridiflora (Kunth) Benth Jurema jucuri
Senna spectabilis (DC.) H.S. Irwin &Barneby Canafístula
Rubiaceae Genipa americana L. Jenipapo
Figura 5. Sementes de plantas da Caatinga utilizadas no presente estudo.
3.2.2 Obtenção dos extratos brutos
Para obtenção dos extratos brutos (EB) as sementes de A. columbina, A.
cearenses, D. grandiglora, E. contortisiliquum e E. velutina foram descascadas, mas as
demais foram utilizadas junto com o tegumento em razão da dificuldade de retirá-lo ou
pelo pequeno tamanho. Em seguida as sementes foram trituradas em moinho refrigerado
para obtenção de uma farinha de fina granulação (Figura 6).
Figura 6. Farinha das sementes de plantas da Caatinga utilizadas no presente estudo
1A- M. urundeuva; 2A- S. brasiliensi; 3A- C. phyllanthus; 4A- C. sonderianus; 5A- R.
communis; 6A- A. cearenses; 1B- A. colubrina; 2B- B. cheilantha; 3B- C. ferrea; 4B- C.
pyramidalis; 5B- C. retusa; 6B- D. grandiflora; 1C- E. contortisiliquum;2C- E. vetulina; 3C- M. caesalpiniifolia; 4C- M. regnelli; 5C- P. moniliformis; 6C- P. stipulacea; 1D- P. viridiflora;
2D- S. spectabilis; 3D- G. americana.
Os extratos brutos foram obtidos após homogeneização sob agitação
constante das farinhas com o tampão fosfato de sódio 50 mM pH 8,0, na proporção de
1:10 (m/v), por 3 h e em temperatura ambiente. O tampão fosfato de sódio foi escolhido
como extrator após confirmação de que o mesmo não apresentava toxicidade para os A.
aegypti, diferente dos tampões tris-HCl e bórax que foram larvicidas (Anexo 1). Em
seguida a suspensão foi centrifugada a 10000 x g por 30 minutos a 4 oC. O precipitado
foi descartado e o sobrenadante foi denominado de EB e armazenado a -20 oC até ser
utilizado nos ensaios biológicos.
Nos ensaios biológicos os EB foram utilizados na sua forma líquida natural
e diluídos em tampão, para que não houvesse perda de nenhum composto nos processos
de desidratação.
3.3 Ensaios biológicos com Aedes aegypti
3.3.1 Ensaios larvicidas
Os ensaios larvicidas foram realizados utilizando larvas de primeiro (L1) e
último ínstar (L4). Para os ensaios com as larvas L1 adaptou-se a metodologia descrita
por Konishi et al. (2008). Um total de 20 larvas recém eclodidas (máximo de 4 h)
foram transferidas para cada um dos poços de uma placas de células de 24 poços, com
volume final de 2 mL (Figura 7A). Os ensaios larvicidas com L4 foram realizados
adaptando-se a metodologia da WHO (2005). Um total de 20 larvas foi transferido para
cada recipientes plásticos com volume final de 20 mL (Figura 7B).
As larvas foram monitoradas após um período de 24 h e 48 h e foram
consideradas mortas as que não responderam aos estímulos mecânicos. A mortalidade
foi definida pela média de três experimentos, cada um realizado em triplicata. Controles
negativos foram realizados com água destilada e tampão fosfato de sódio 50 mM pH
8,0.
Diferentes concentrações de EB foram usadas para obtenção da CL50 e
CL90, ou seja, a concentração de EB capaz de matar 50% e 90% dos insetos,
respectivamente, expressa em mg/mL de peso seco.
3.3.2 Ensaios pupicidas
Para os ensaios pupicidas, 10 pupas foram transferidas para recipientes de
vidro contendo 20 mL de água destilada, tampão fosfato de sódio (controles negativos)
ou EB. Foram realizados três experimentos cada um em triplicatas.
As pupas foram declaradas mortas quando não respoderam aos estímulos
mecânicos após um período de incubação de 24 h. Para os extratos que apresentaram
mortalidade superior a 80%, ensaios adicionais foram realizados com diferentes
concentrações dos EB para obtenção da CL50 (Figura 8).
3.3.3 Ensaios de repelência/atratibilidade de postura
Foi verificado se a adição dos EB das sementes nas ovitrampas seria capaz
de repelir ou atrair as fêmeas de A. aegypti para a postura dos ovos. Nesse ensaio 100
insetos, sendo aproximadamente 80 fêmeas e 20 machos, foram transferidos para
gaiolas com dimensões de 50 cm x 50 m x 50 cm, contendo ovitrampas com água
destilada ou EB nas concentrações de 2,5%, 5%, 10%, 15% e 20% (v/v), distribuídas
aleatoriamente na base da gaiola (Figura 9). As ovitrampas foram renovadas a cada 48h
e o ensaio teve a duração de 10 dias.
Os ensaios foram realizados em triplicatas e para cada concentração foi
calculado o índice de repelência efetiva (IRE), seguindo a fórmula abaixo, proposta por
Quiroz-Martínez et al. (2012), com modificações:
Onde:
Nt é o número total de ovos depositados nas ovitrampas teste
Nc é o número total de ovos depositados nas ovitrampas controle.
O índice obtido é interpretado como uma correlação, com intervalo de -100
a +100, sendo que os valores negativos representam atração e os positivos, repelência.
IRE = Nc– Nt x 100,
Nt + Nc
Figura 7. Ensaios larvicida. A. Ensaio larvicida com L1 em placa de células com 24
poços contendo 20 larvas com volume final de 2 mL; B ensaio larvicida com L4 em
recipientes plásticos de 50 ml contendo 20 larvas e com volume final de 20 mL.
Figura 8. Ensaio pupicida. Recipientes de vidro contendo 10 pupas e volume final de 20
mL
Figura 9. Esquema de realização dos ensaios de atratibilidade/repelência. Vista frontal
(A) e superior (B) e uma gaiola mostrando a disposição das ovitrampas na base.
3.3.4 Ensaios adulticidas
Para os ensaios adulticidas 30 insetos, machos e fêmeas, com idade de 1-4
dias foram transferidos para gaiolas metálicas revestidas com malha fina e com
dimensões de 25,5 cm x 25,5 cm x 25,5 cm. Em cada gaiola foi adicionado um chumaço
de algodão embebido com solução açucarada 10% preparada com água destilada ou
com os EB das sementes (Figura 10). A cada 48 h os tratamentos foram renovados e o
número de insetos mortos foi contabilizado após 10 dias.
Para os extratos que apresentaram mortalidade superior a 80%, ensaios
adicionais foram realizados, utilizando diferentes concentrações dos EB para obtenção
da CL50 em mg/mL de peso seco.
3.3.5 Ensaios de interferência de postura
Nos ensaios cujos EB não ocasionaram mortalidade significativa dos
adultos, dentro das gaiolas foram adicionadas ovitrampas e no 4º, 6º e 8º dia do
experimento um hamster foi colocado para repasto das fêmeas. No 10º dia as
ovitrampas foram recolhidas para contagem do número de ovos depositados pelo
número de fêmeas ingurgitadas. Todos os ensaios foram realizados em triplicatas.
3.4 Ensaios de toxicidade
3.4.1 Ensaios de ecotoxicidade aguda com Ceriodaphinia dubia
Os ensaios de ecotoxicidade foram realizados com o microcrustáceo
Ceriodaphinia dubia Richard, 1894 (Crustacea, Cladocera) (Figura 11). O cultivo de C.
dubia foi feito conforme as normas da ABNT NBR 13373 (2005). Num aquário de
1.000 mL de volume foram colocados cerca de 60 indivíduos adultos, os quais foram
mantidos em temperatura ambiente e em fotoperíodos controlados de 12 h(claro) /12 h
(escuro). Diariamente foi ofertada uma ração de Tetramin – Tetra ® (10 mg de ração
A
B
moída e homogeneizada com 1.000 mL de água destilada) e algas e realizada a retirada
dos filhotes (Figura 11A).
Para os ensaios de toxicidade aguda, 10 filhotes com idade de 1 dia foram
transferidos para recipientes plásticos e incubados com um volume de 100 mL de água
destilada (controle negativo) ou com concentrações crescentes dos EB para o cálculo da
CL50. A mortalidade foi determinada após um período de 48h, pela ausência de
respostas a estímulos mecânicos. Os ensaios foram realizados em quadruplicatas (Figura
11B).
3.4.2 Ensaios de toxicidade celular
Fibroblastos de camundongos da linhagem celular 3T3 (CCL-163) foram
obtidas do American Type Culture Colletion (ATCC, Rockville, MD, USA). As células
cresceram em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino 10%, contendo
estreptomicina (5000 mg/mL) e penicilina (5000 IU), em meio estéril a 37ºC, com 5%
de CO2 e em uma atmosfera humidificada.
As células foram distribuídas em placas de 96 poços de fundo plano
(produtos TPP, Suiça) com uma densidade de 5 x 103 células / poço. As células foram
incubadas por 72 h com os EB nas concentrações correspondentes a CL50 e CL90
obtidas nos ensaios larvicida com L4 (48h). O efeito da incubação com os EB na
proliferação das células foi determinada utilizando o ensaio de MTT (Mosmann, 1983).
A mensuração da inibição da proliferação celular foi conduzida comparando os
resultados testes com o controle, utilizando a fórmula abaixo:
Figura 10. Ensaios adulticida e de interferência na postura das fêmêas. A. Gaiolas
utilizadas nos ensaios. B. Detalhe de uma gaiola para visualização dos adultos. C.
Tratamento oferecido para alimentação dos insetos adultos.
Figura 11. Ensaios de ecotoxicidade
com C. dubia. A. Cultivo de C. dubia.
Ensaios com filhotes de 1 dia; C.
Exemplar de C. dubia
3.5. Caracterização parcial dos extratos de sementes de plantas da Caatinga
3.5.1 Determinação do peso seco
A determinação do peso seco dos EB foi realizada após pesagem dos
extratos sumetidos a prévia liofilização e expressa em mg/mL.
3.5.2.Dosagem de proteína
As concentrações proteicas foram determinadas pelo método colorimétrico
de Bradford (1976), utilizando uma curva padrão de albumina sérica bovina.
3.5.3 Dosagem de carboidratos totais
A dosagem dos carboidratos totais foi realizada pelo método colorimétrico
de Dubois et al.(1956), utilizando uma curva padrão de D-(+) glicose 1% .
3.5.4 Dosagem de compostos fenólicos totais
A dosagem dos compostos fenólicos totais foi realizada conforme
metodologia descrita por Correia et al. (2004), com curva padrão de ácido gálico.
3.5.5 Detecção e dosagem de proteínas ligante a quitina
Para detecção de proteínas com capacidade de ligação à quitina, o volume
de EB correspondente a 15 mg de proteínas foi submetido a uma cromatografia de
afinidade utilizando quitina (Sigma C9213) como fase estacionária (20 mL). As colunas
foram equilibradas com fosfato de sódio 50 mM pH8,0 e as proteínas adsorvidas foram
eluídas com HCl 100 mM. A absorbância foi acompanhada a 280 nm. As protéinas que
ficaram retidas na quitina foram reunidas e dosadas para determinação dos teores de
proteínas ligantes à quitina em mg/mL.
3.5.6 Detecção de componentes do metabolismo secundário
Para identificar a presença de metabólitos secundários, os extratos foram
liofilizados, diluídos em metanol e aplicados sucessivamente em cromoplacas de CCD,
com as seguintes especificações: sílica gel 60 F254 20X20 cm (Fertigfolien Alugram ®
Sil G/UV254).
As cromoplacas foram visualizadas após exposição aos seguintes
reveladores: vanilina sulfúrica; reagente natural A (difenilboriloxietilamina 0,5% em
metanol); cloreto férrico, dragendorff e ninidrina.
3.5.7 Perfil eletroforético
O perfil eletroforético foi obtido após submissão de 15 µg de proteína de
cada extratos a uma SDS-PAGE, com gel de concentração de 12%, de acordo com
método desenvolvido por Laemmli (1970) e corado com azul de CooMASSIE.
3.5.8 Detecção de lectinas
A detecção de lectinas foi realizada pela visualização direta de aglutinação
na suspensão de eritrócitos (hematócrito 4%), após incubação por 1 h com os extratos
(em diluição seriada) na temperatura ambiente.
Foram utilizados sangues do tipo A, B e O, doados pelos autores do
trabalho, previamente tratados ou não com as enzimas tripsina (1 mg/mL) e papaína (1
mg/mL) na proporção de 1:1 (v/v).
Os resultados positivos foram expressos em atividade hemaglutinante, que
corresponde à unidade de hemaglutinação (UH), dividida pela quantidade de proteína do
ensaio. A UH corresponde ao inverso da maior diluição da amostra que apresentou
nítida aglutinação.
3.5.9 Detecção de lectinas ligantes à quitina
Para verificar a existência de lectinas ligantes a quitina, foram realizados
ensaios de hemaglutinação (item 3.5.8), com as frações dos extratos que exibiram
afinidade para a quitina (item 3.5.5). Os resultados positivos foram expressos em
atividade hemaglutinante (AH).
3.5.10 Detecção de inibidores de proteases serínicas
A identificação de inibidores de proteases serínicas nos EB foi realizada
utilizando enzimas comerciais (tripsina (EC 3.4.21.4, tipo III, 10.600 u/mg proteína,
Sigma) e quimotripsina do pâncreas bovino (tipo VI tratada com TLCK, 67u/mg
proteina, Sigma), mas também as enzimas digestivas de A. aegypti, presente no HIL.
Os ensaios foram realizados utilizando o volume de EB corresponde a 200
µg de proteínas. Todos os ensaios foram realizados em quadruplicatas com controles
negativos e positivos. A unidade de inibição (UI) foi sempre de 0,01 e como atividade
específica foi considerada a relação entre a UI e a quantidade de proteína utilizada no
ensaio.
3.5.10.1 Ensaios de inibição de tripsina
Para identificar a presença de inibidores de tripsinas nos EB, solução de
tripsina bovina (0,3 mg/mL) foi pré-incubada com HCl 2,5 mM (solução ativadora) e
incubada com BApNA (substrato) na ausência (controle negativo) e na presença de
alíquotas dos EB, durante 15 minutos a 37 °C. Em seguida a reação foi interrompida
com a adição de ácido acético e a quebra do substrato foi constatada em
espectrofotômetro a 410 nm.
A identificação de inibidores das tripsinas digestivas das larvas de A.
aegypti nos extratos foi realizada se forma semelhante, mas sem adição da solução
ativadora e substituindo a tripsina bovina pelo HIL.
3.5.10.2 Ensaios de inibição de quimotripsina
Para identificar a presença de inibidores de quimotripsina nos extratos,
solução de quimotripsina bovina (0,2 mg/mL) foi pré-incubada com o tampão tris-HCl
50 mM + CaCl2 20 mM e incubada com azocaseína 1% (substrato) na ausência
(controle negativo) e na presença de alíquotas dos extratos, durante 30 minutos a 37 °C.
Em seguida a reação foi interrompida com a adição de ácido TCA 20%, centrifugada a
12.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporção
de 1:1. A quebra do substrato foi medida em espectrofotômetro a 440 nm.
3.5.10.3 Ensaios de inibição das proteases do HIL
Para identificar a presença de inibidores das proteases digestivas das larvas
de A. aegypti, o HIL foi incubado com azocaseína 1% (substrato) na ausência (controle
negativo) e na presença dos extratos, durante 30 minutos a 37 °C. Em seguida a reação
foi interrompida com a adição de ácido TCA 20%, centrifugada a 12.000 x g por 10
minutos e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporção de 1:1. A quebra
do substrato foi medida em espectrofotômetro a 440 nm.
3.5.11Detecção de inibidores de amilases
A identificação de inibidores de amilases nos extratos foi realizada
utilizando as amilases do pâncreas suíno (tipo VI – B A31761MU, 25 units/mg solidos,
Sigma), mas também as enzimas digestivas amilásicas de A. aegypti, oriundas do HIL
e do HA.
Os ensaios foram realizados em quadruplicatas com controles negativos e
positivos, utilizando o volume de EB corresponde a 200µg de proteínas.
3.5.11.1 Ensaios de inibição das amilases
A atividade anti-amilásica foi realizada pelo método do ácido dinitro-
salicílico (Ali et al., 2006), utilizando amido 0,5% como substrato e uma curva padrão
de maltose (0 - 0,1% p/v).
3.6 Ensaios com as frações proteicas de E. contortisiliquum
3.6.1 Obtenção das frações proteicas de E. contortisiliquum
O EB de E. contortisiliquum foi selecionado para ser fracionado com sulfato
de amônio em três etapas de concentração: 0-30%, 30-60% e 60-90%, resultando nas
frações F1, F2 e F3, respectivamente. Após cada etapa de fracionamento a solução
permaneceu a 4 oC em repouso, sendo em seguida centrifugada a 10000 x g por 30
minutos a 4 oC. Os precipitados resultantes de cada etapa foram ressuspensos em
tampão fosfato de sódio 50 mM pH 8,0 e submetidos a diálise para remoção do excesso
salino e, em seguida. armazenado a -20oC até sua utilização.
3.6.2 Ensaios larvicida e pupicida com as frações proteicas de E. contortisiliquum
As frações F1, F2 e F3 foram utilizadas em ensaios larvicida e pupicidas
como descrito nos itens 3.3.1 e 3.3.2.
3.6.3 Caracterização das frações proteicas de E. contortisiliquum
As frações de E. contortisiliquum foram caracterizadas quanto aos seus
teores de peso seco, proteínas, carboidratos totais, compostos fenólicos totais, lectinas,
lectinas ligantes à quitina, perfil eletroforético, presença de constituintes do
metabolismo secundário e de inibores de proteases e amilase, como descrito nos itens
3.5.1 a 3.5.10.
Adicionalmente o EB e as frações F1, F2 e F3 de E. contortisiliquum foram
submetidas a cromatografia em camada delgada utilizando como fase fixa: sílica gel 60
F254 e como fases móveis: butanol: ácido acético: água (3: 1: 1, v/v/v) e tolueno: ácido
fórmico (5: 0,5, v/v) para investigar com mais precisão a presença de componentes do
metabolismo secundário. Após a eluição, as cromatoplacas foram reveladas com
vanilina sulfúrica, dragendorff, cloreto férrico e reagente natural A.
3.6.4 Detecção in vivo da inibição das proteases digestivas das larvas de A. aegypti
alimentadas com EB e as frações proteicas de E. contortisiliquum
Ensaios larvicidas foram realizados utilizando 200 larvas L4 em 200 mL de
água destilada ou com EB, F1, F2 ou F3 de E. contortisiliquum nas concentrações
correspondes as CL50 (48h). Nos tempos de 0 h, 6 h, 24 h, 36 h e 48 h, 50 larvas vivas
foram dissecadas para obtenção do HIL dos diferentes tempos (500 µL), como descrito
nos itens 3.1.2 e 3.1.3.
Para verificar o efeito da alimentação com EB e com as frações de E.
contortisiliquum sobre a atividade proteolítica das larvas, os HIL foram submetidos a
ensaios enzimáticos como descrito a seguir: O HIL foi incubado com azocaseína 1% e
após 30 minutos a reação foi interrompida com a adição do TCA 20%. A mistura foi
centrifugada a 12.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2
N na proporção de 1:1. A absorbância foi medida em espectrofotômetro a 440 nm.
3.6.5 Obtenção das frações de E. contortisiliquum com e sem inibidor de tripsina
As frações F1, F2 e F3 foram dialisadas contra o tampão tris-HCl 0,05 M
pH 8,0 e em seguida aplicadas separadamente numa coluna de afinidade de tripsina-
sepharose (GE HealthCare, Waukesha, Estados Unidos) previamente equilibrada com
tampão mencionado.
O perfil de eluição foi verificado na absorbância de 280 nm. As moléculas
não adsorvidas foram eluídas com tampão de equilíbrio e reunidas sob as denominações
de não retido de tripsina da fração F1 (NRTF1), não retido de tripsina da fração F2
(NRTF2) e não retido de tripsina da fração F3 (NRTF3), que foram destinados a
ensaios larvicida.
Os retidos foram eluídos com HCl 0,005 M e denominados de RTF1, RTF2
e RTF3, conforme a fração de origem. Após se constatar a semelhança desses retidos
por eletroforese, RTF1, RTF2 e RTF3 foram reunidos sob a denominação de RTEc
(retido de tripsina de E. contortisiliquum) que também foi destinado a ensaios larvicida
em diferentes concentrações (0,05 mg/mL, 0,125 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL,
0,75 mg/mL, 1 mg/mL de proteína).
3.6.6 Obtenção do inibidor de tripsina de E. contortisiliquum (ITEc)
O RTF2 foi submetido a uma cromatografia liquida de exclusão molecular
em Superdex 75 Tricorn (GE Healthcare) em sistema FPLC/AKTA. A coluna foi
previamente equilibrada com tampão tris-HCl 0,02 M pH 8,0 + 0,15 M NaCl com fluxo
de 0,5 mL/minuto durante 100 minutos. Os picos obtidos foram submetidos a ensaios de
inibição de tripsina. Os tubos contendo o inibidor de tripsina foram reunidos e
denominado de inibidor de tripsina da semente de E. contortisiliquum (ITEc). O ITEc
foi submetido a ensaios de hemaglutinação, inibição amilásica e cromatografia em
camada delgada para descartar a presença de lectinas, inibidores de amilase e
constituintes do metabolismo secundários.
3.6.6.1 Constatação in vitro e in vivo da atividade do inibidor de tripsina de E.
contortisiliquum sobre as larvas de A. aegypti
3.6.6.1.1.Curva e constante de inibição do ITEc
Concentrações crescentes do ITEc foram incubadas com o HIL utilizando
BApNa (0,00125 M) e azocaseina 1% como substratos, para obtenção das curvas de
inibição e das concentrações de inibição 50% (IC50).
A análise de Dixon foi empregada para determinar a constante de inibição
(Ki). A inibição enzimática foi realizada usando duas diferentes concentrações de
BApNA (0,00125 M e 0,0025 M) e azocaseina (1% e 2%). A velocidade da reação foi
determinada para cada concentração de inibição. A plotagem de Dixon foi gerada
usando o inverso da velocidade (1/v) verso a concentração da inibição. A intercessão
das duas linhas de regressão correspondeu a Ki.
3.6.6.1.2 Zimograma
O zimograma foi realizado conforme descrito por García-Carreño & Haard
(1993), para constatar a inibição in vivo das enzimas tripsinas das larvas alimentadas
com o RTEc.
Ao término dos ensaios larvicida com o RTEc as larvas que permaneceram
vivas foram dissecadas para obtenção do HIL. 5µL dos HIL foram submetidos a corrida
eletroforética, realizada a 4oC. Ao término da corrida o gel de poliacrilamida foi lavado
com triton x-100 2,5% para retirada do SDS e imerso em azocaseina 2,5% 4 oC por 1h.
Em seguida o gel foi incubado com o tampão tris-HCl 0,005 M pH 8,0 40 oC por 45
minutos, lavado e corado com azul de CooMASSIE.
3.6.7 Obtenção das frações com e sem vicilina de E. contortisiliquum
A fração F3 (100 mg de proteína) foi submetida a uma cromotografia de
afinidade em matriz de quitina previamente equilibrada com tampão tris-HCl 0,05 M
pH 8,0. A absorbância foi acompanhada a 280 nm. As moléculas não adsorvidas foram
eluídas com tampão de equilíbrio e reunidas sob a denominação de não retido de quitina
da fração F3 (NRQF3).
As moléculas que ficaram retidas foram eluídas com tampão glicina 0,1 M
pH 2,0 e reunidas com a denominação de RQF3 (retido de quitina da fração F3), que
após dialise foi submetidos a ensaios de hemaglutinação, inibição enzimática e
cromatografia em camada delgada para descartar a presença de lectinas, inibidores de
tripsina, quimotripsina e amilase e constituintes do metabolismo secundários. O RQF3
foi submetido a corrida eletroforética que evidenciou a presença de duas bandas de 66 e
64 KDa compatíveis com vicilinas de E. contortisiliquum (EcV).
Após dosagem dos teores de proteínas, o NRQF3 e o RQF3 foram
destinados a ensaios larvicida, e o RQF3 também a ensaios adulticidas.
3.7 Análise dos dados
Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão, os quais forma
calculados usando o software GraphPad Prism versão 4.0 for Windows (GraphPad
Software, San Diego, CA). O software StatPlus 2009 (Analyst Soft Canada) foi usado
para calcular as concentrações requeridas para matar 50% (LC50) e 90% (LC90) dos
insetos por meio da análise do probit com intervalo de confiança de 95%. O software
Origin 8,0 (Microcal, Northampton, USA) foi usado para obtenção das equações de
regressão (y= mortalidade; X= concentração) e dos coeficientes de regressão. As
diferenças entre as medias foi constatada por Student’s t-test e ANOVA (significância
de P < 0,05).
Para cada um dos ensaios biológicos os extratos foram ranqueados
conforme sua eficiência no ensaios e receberam uma pontuação em razão de sua
posição. Assim o extrato com melhor resultado num determinado ensaios recebeu a
pontuação 21 e o menos eficaz recebeu a pontuação 1 ou zero (sem eficácia). A
pontuação dos extratos para cada um dos testes biológicos foi somada para obtenção de
uma classificação final que permitiu identificar os extratos mais promissores,
considerando os diferentes ensaios realizados.
4 Resultados
4.1 Caracterização do homogenato intestinal e detecção de quitina nas larvas de A.
aegypti
O homogenato intestinal das larvas (HIL) apresentou teores proteicos de
1,12 (±0,19) mg/mL. A atividade proteolítica aumentou com o aumento do pH até o
pH10,0 (Figura 12A) e manteve-se constante no intervalo de 5 o
C a 60 oC,
apresentando declínio para valores superiores a esse intervalo (Figura 12B).
Figura 12. Atividade proteolítica do HIL de A. aegypti em diferentes pHs (A) e
temperaturas (B). As barras correspondem aos valores de desvio padrão.
Para determinar a classe mecanistica das enzimas presentes no HIL, ensaios
enzimáticos foram realizados após previa incubação do HIL com diferentes inibidores.
Verificou-se que a atividade proteolítica foi reduzida na presença de PMSF (6,73% ±
4,7) e SBTI (20,31% ± 11,0), indicando a presença de proteases serínicas da classe
Kunitz. A menor atividade proteolítica na presença do TLCK (34,93% ± 5,4), em
detrimento da observada na presença de TPCK (80,80% ± 8,31), evidenciou o
predomínio da atividade das enzimas tipo tripsina sobre as enzimas do tipo
quimotripsina. A ausência de inibição na presença de E-64 e Iodoacetamida e de EDTA
e Fenantrolina, revelou a ausência de proteases cisteínicas e de metaloproteases (Figura
13), respectivamente.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
4 5 6 7 8 9 10 11
UA
/in
test
ino
pH
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
UA
/in
test
ino
Temperatura
B
Figura 13. Atividade proteolítica do HIL de A. aegypti após previa incubação com
inibidores de proteases serínicas (PMSF, TLCK, SBTI, TPCK), cisteínicas (E-64 e IA)
e metaloproteases (IA e FENA). As letras diferentes indicam diferenças estatísticas.
Anova (P< 0,0 5).
4.2 Atividade biológica dos EB de sementes de plantas da Caatinga contra A.
aegypti
4.2.1 Atividade larvicida
Todos os extratos analisados apresentaram toxicidade para larvas L1 e L4 e,
conduziram ao óbito 100% das larvas após 48h de incubação, com exceção do EB de G.
americana (Tabela 2).
O aumento no tempo de incubação elevou a mortalidade das larvas, exceto
nos ensaios onde as larvas L1 foram incubadas com os extratos de C. retusa (CL50 14,51
mg/mL e CL50 14,10 mg/mL) e P. viridiflora (CL50 0,84 mg/mL e CL50 0,84 mg/mL),
e L4 foram incubadas com P. viridiflora (CL50 0,87 mg/mL e CL50 0,85 mg/mL), onde
não houve diferenças entre as CL50 obtidas em 24 h e 48 h.
Para a maior parte dos extratos brutos houve diferença na sensibilidade dos
ínstares larvais (Tabela 2). Nos ensaios com R. communis, A. cearenses, C. ferrea, C.
pyramidalis, C. retusa, D. grandiflora, E. contortisiliquum, E. velutina, P. moniliformis
e G. americana as larvas L1 foram mais susceptíveis aos extratos do que as larvas L4.
Entretanto para os EB de S.brasiliensis, C. phyllanthus, C. sonderianus, B. cheilantha,
M. caesalpiniifolia e S. spectabilis as L4 foram mais susceptíveis. Para os demais
extratos não houve diferença entre os íntares larvais.
Para identifcar os extratos com maiores potenciais larvicida, os extratos
foram ranqueados (de 1 a 21) e pontuados com base nos valores da CL50 (1- extrato com
a maior CL50; 21 – extrato com a menor CL50) para cada um dos testes larvicida (L1 em
24h, L1 em 48h, L4 em 24h e L4 em 48h) (Anexo 2) e uma classificação final foi obtida
levando em consideração os quatro ensaios (Tabela 3). Por essa classificação foi
verificado que os extratos de M. urundeuva, P. viridiflora, E. velutina, A. cearenses e
E. contortisiliquum foram os mais tóxicos para as larvas de A. aegypti.
Tabela 2. Atividade larvicida dos extratos brutos de sementes de plantas da Caatinga contra A. aegypti
Semente Nome vulgar
L1 L4
24 h 48 h 24 h 48 h
M a CL50
b M
a CL50
b M
a CL 50
b M
a CL 50
b CL 90
c
A. cearenses Cumaru 100 1,17 100 0,83 100 3,06 100 1,46 2,66
A. colubrina Angicos 100 2,41 100 1,99 100 2,90 100 2,15 3,83
B. cheilantha Mororó 100 11,55 100 6,06 80,5 14,36 100 0,94 8,78
C. ferrea Jucá 82,9 20,51 100 12,02 35,6 68,22 100 19,81 32,01
C. phyllanthus Favela 45,8 13,62 100 9,08 72,9 11,70 100 8,39 11,63
C. pyramidalis Catingueira 100 15,54 100 8,91 100 13,6 100 11,12 26,47
C. retusa Crotalária 100 14,51 100 14,10 26,4 132,44 100 23,34 40,06
C. sonderianus Marmeleiro 47,3 20,09 100 11,15 86,9 13,94 100 10,12 18,16
D. grandiflora Diocléia 100 7,53 100 4,60 15,9 115,93 100 9,20 22,35
E. contortisiliquum Tamboril 100 1,14 100 0,36 100 4,63 100 1,82 11,65
E. vetulina Mulungu 100 0,52 100 0,18 100 3,69 100 1,61 8,03
G. americana Jenipapo 10,0 159,22 54,5 23,56 3,3 29,78 54,8 25,53 35,91
M. caesalpiniifolia Sabiá 100 4,51 100 3,81 100 4,78 100 1,53 2,45
M. regnelli Juquiri 100 3,01 100 0,52 100 6,83 100 0,61 6,42
M. urundeuva Aroeira 100 0,33 100 0,24 100 1,33 100 0,37 1,54
P. moniliformis Catanduva 100 3,07 100 2,83 80,8 35,44 100 7,37 12,64
P. stipulacea Jurema branca 100 2,76 100 1,67 100 2,13 100 1,61 7,42
P. viridiflora Jurema jucuri 100 0,84 100 0,84 100 0,87 100 0,85 3,35
R. communis Carrapateira 100 3,12 100 2,35 100 8,36 100 6,58 26,13
S. brasiliensis Braúna 100 6,01 100 5,00 100 6,14 100 1,00 10,37
S. spectabilis Canafístula 100 20,86 100 9,29 51,3 33,30 100 3,69 22,77 a. Percentual de larvas mortas b. Concentração de EB em mg/mL necessária para matar 50% das larvas de A. aegypti c. Concentração de EB em mg/mL necessária para matar 90% das larvas de A. aegypti
Tabela 3. Pontuação dos extratos brutos (EB) de semente de plantas da Caatinga nos ensaios biológicos
a Para cada ensaio biológico realizado, os EB foram classificados e pontuados, sendo que as maiores pontuações correspondem aos extratos mais
eficazes nos respectivos testes.
b Somatório das pontuações obtidas nos ensaios biológicos
Semente Nome vulgar
Ensaios biológicos a
Total b
Larvicida Pupicida Repelência
efetiva
Atratividade e
larvicida Adulticida Postura
Toxicidade
celular
Toxicidade
ambiental
A. cearenses Cumaru 18 21 3 21 18 0 20 17 118
P. viridiflora Jurema jucuri 20 20 8 0 21 0 16 9 94
E. contortisiliquum Tamboril 17 0 10 20 19 0 19 7 92
S. brasiliensis Braúna 12 17 9 0 0 21 12 20 91
E. velutina Mulungu 19 19 7 0 20 0 21 3 89
M. urundeuva Aroeira 21 18 16 0 0 0 15 11 81
R. communis Carrapateira 11 0 11 0 0 19 7 13 61
P. stipulacea Jurema branca 15 0 18 0 0 0 18 9 60
C. sonderianus Marmeleiro 4 0 15 0 0 20 2 18 59
A. colubrina Angicos 14 0 13 0 17 0 9 6 59
B. cheilantha Mororó 10 0 21 0 15 0 3 5 54
M. regnellii Juquiri 16 0 12 0 12 0 10 1 51
G. americana Jenipapo 1 0 14 0 11 0 4 21 51
C. pyramidalis Catingueira 6 0 6 0 13 0 13 10 48
D. grandiflora Diocléia 8 0 2 0 16 0 6 14 46
P. moniliformis Catanduva 7 0 20 0 0 0 4 15 46
C. phyllanthus Favela 9 0 5 0 0 0 11 19 44
M. caesalpiniifolia Sabiá 13 0 19 0 0 0 8 4 44
S. spectabilis Canafístula 5 0 17 0 14 0 1 2 39
C. ferrea Jucá 3 0 1 0 0 0 17 16 37
C. retusa Crotalária 2 0 4 0 0 0 14 12 32
4.2.2 Atividade pupicida
Uma vez que as pupas de A. aegypti não se alimentam, ensaios pupicidas
foram realizados para identificar quais extratos apresentaram toxicidade por contato
(extratos larvicida e pupicidas) e quais extratos foram tóxicos por ingestão (extratos
larvicida e não pupicidas).
Foi verificada atividade pupicida em cincos extratos (Figura 14). A
mortalidade foi elevada nas pupas incubadas com extratos de A. cearenses (93,3% ±
11,5) e P. viridiflora (83,3%± 10.0), sendo as CL50, respectivamente, 19,48 mg/mL e
20,20 mg/mL. Os EB de E. velutina, M. urundeuva e S. brasiliensis também foram
responsáveis pela morte de 76,6% (±5,7), 66,6% (± 5,3) e 46,6%(± 7,91) das pupas,
respectivamente.
Figura 14. Mortalidade das pupas de A. aegypti incubadas por 24 h com EB de
sementes de plantas da Caatinga. Diferentes letras indicam diferenças estatísticas entre
os tratamentos. ANOVA (p<0,05).
Extratos
4.2.3 Atratibilidade/repelência para a postura das fêmeas de A. aegypti
Foi verificado se a adição dos EB nas ovitrampas era capaz de repelir ou
atrair as fêmeas grávidas de A. aegypti para a postura dos ovos.
Verificou-se que todos os extratos foram repelentes (Tabela 4). Os extratos
de B. cheilantha (63,72%), P. moniliformis (54,43%) e M. caesalpiniifolia (51,85%)
apresentaram os maiores IRE na concentração de 2,5% (v/v), enquanto que os extratos
de E. contortisiliquum, P. stipulacea, M. urundeuva, B. cheilantha e P. moniliformis
apresentaram IRE superiores a 90% na concentração de 20% (99,54%, 99,42%, 98,47%,
96,51% e 91,52%, respectivamente).
Tabela 4. Índece de repelência efetiva (IRE) para à posturas das fêmeas de extrato
salinos de sementes de plantas da Caatinga
Extratos Concentrações (v/v)
2,5% 5% 10% 15 % 20%
M. urundeuva 27,78 71,42 78,67 82,44 98,47
S. brasiliensis 25,44 27,48 32,34 37,35 51,10
C. phyllanthus 10,26 14,15 21,88 24,66 41,32
C. sonderianus 34,37 37,35 61,27 79,53 84,86
R. communis 32,96 36,79 49,88 71,14 72,30
A. cearenses 26,65 34,81 41,89
A. colubrina 30,03 64,89 85,21 88,31 88,65
B. cheilantha 63,72 73,63 82,59 94,01 96,51
C. ferrea 3,44 6,11
C. pyramidalis 17,33 22,12 22,45 37,24 50,79
C. retusa 12,13
D. grandiflora 1,55 9,69 18,73 21,06
E. contortisiliquum 36,54 82,99 96,05 99,54
E. velutina 7,33 5,84 9,77 17,80 64,04
M. caesalpiniifolia 51,85 72,80 76,49 88,89 92,09
M. regnellii 31,78 35,24 47,09 61,66 80,55
P. moniliformis 54,43 68,94 79,12 84,26 95,13
P. stipulacea 28,60 58,27 76,86 94,35 99,42
P. viridiflora 25,44 28,74 43,78 50,18 57,26
S. spectabilis 37,73 58,82 56,26 80,77 91,52
G. americana 50,86 53,91 58,78 75,74 78,36
Para o ranqueamento e pontuação dos EB nesses ensaios, foram levadas em
consideração os valores de IRE na menor (2,5%) e maior concentração (20%) (Anexo
2). Considerando as duas concentrações os extratos de B. cheilantha, P. moniliformis e
M. caesalpiniifolia foram os mais repelentes para a postura das fêmeas.
Alguns extratos apresentaram efeito duplo, ou seja, foram atrativos em
concentrações baixas e passaram a repelir com o aumento da concentração. Os extratos
de D. grandiflora e E. contortisiliquum foram atrativos na concentração de 2,5% (que
corresponde a 0,97 mg/mL e 0,94mg/mL de peso seco, respectivamente), enquanto que
os extratos de A. cearenses, C. ferrea e C. retusa atraíram as fêmeas para a postura até
as concentrações de 5% (2,58 mg/mL), 10% (4,54 mg/mL) e 15% (6,92 mg/mL),
respectivamente (Figura 15).
Figura 15 . Índice de repelência efetiva (IRE) dos extratos brutos de sementes de plantas
da Caatinga com efeito duplo (atrativo e repelente) para as fêmeas grávidas de A.
aegypti
-40
-20
0
20
40
60
80
100
IRE
(%
)
Extratos
2,5% 5% 10% 15% 20%
Comparando as concentrações de EB capazes de atraírem as fêmeas para a
postura e mortalidade das larvas L1, verificamos que até a concentração atrativa de 15%
(6,92 mg/mL) o EB de C. retusa não foi capaz de ocasionar morte das larvas L1. Por
suas vez as concentrações atrativas dos extratos de D. grandiflora (0,97 mg/mL) e C.
ferrea (4,54 mg/mL) ocasionaram a morte de um pequenos percentual de larvas L1 após
48h de exposição (13,4% e 21,2%, respectivamente) (Figura 16A e 16B).
Figura 16 . Mortalidade das larvas L1 de A. aegypti incubadas com EB de sementes de
plantas da Caatinga com atividade atrativa para a postura das fêmeas. As linha
pontilhadas indicam as concentrações de EB capazes de atrair as fêmeas para a posturas
dos ovo.
y = 10,376x + 3,3333 R² = 0,9803
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Mo
rtal
idad
e d
e L
1 (%
) 48
h
Concentração do EB de D. grandiflora (mg/mL)
A y = 4,1415x + 3,3333
R² = 0,9643
0
20
40
60
80
100
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Mo
rtal
idad
e d
e L1
(%
) 48
h
Concentração do EB de C. ferrea (mg/mL)
B
y = 14,785x + 39 R² = 0,9725
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4
Mo
rtal
idad
e d
e L1
(%
) 48
h
Concentração do EB de E. contortisiliquum (mg/mL)
C
y = 39,924x + 3,4553 R² = 0,9796
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4
Mo
rtal
idad
e d
e L1
(%
) 24h
Concentração do EB de A. cearenses (mg/ml)
D
Apenas os extratos de E. contortisiliquum e A. cearenses apresentaram
concentrações atrativas superiores a CL50 das larvas L1 (Tabela 2). Na concentração de
2,5% (0,935 mg/mL), o EB de E. contortisiliquum ocasionou a morte de 52,82% das
larvas em 48 h (Figura 16C). Por sua vez, o EB de A. cearenses na concentração atrativa
de 5% (2,58 mg/mL) ocasionou a morte de 100% das larvas L1, já nas primeiras 24 h de
exposição (Figura 16D).
4.2.4 Atividade adulticida
Ensaios adulticidas foram realizados por meio da oferta dos extratos para
alimentação dos insetos adultos.
Constatou-se que onze extratos (52,3%) foram adulticidas (Figura 17),
sendo a mortalidade elevada para os insetos que se alimentaram dos extratos de P.
viridiflora (100%), E. velutina (100%), E. contortisiliquum (100%), A. cearenses
(95,6% ± 3,50) e A. colubrina (94,6% ± 4,64), cujas CL50 foram, respectivamente,
5,89mg/mL, 12,08mg/, 13,53 mg/mL, 5,71 mg/mL, e 13,26 mg/mL. Outros extratos
com atividade adulticida foram D. grandiflora (78,4% ± 2,4), B. cheilantha (69,0% ±
7,7), S. spectabilis (67,2% ± 0,5), C. pyramidalis (46,6% ± 16,3), M. regnelli
(44,6% ±11,9) e G. americana (38,7%± 12,1).
Figura 17. Mortalidade dos adultos de A. aegypti alimentados com extrato bruto de
sementes de plantas da Caatinga. Diferentes letras indicam diferenças estatísticas entre
os tratamentos. ANOVA (p < 0,05).
4.2.5 Interferência na postura das fêmeas
Nos ensaios adulticidas cujos extratos não causaram morte nos adultos, para
as fêmeas foi possibilitado o repasto sanguíneo e foi verificado se a ingestão dos EB
seria capaz de interferir na postura das fêmeas.
Constatou-se significativa redução na postura dos ovos nas fêmeas que
foram alimentadas com os extratos de R. communis, C. sonderianus e S. brasiliensis
(Figura 18).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100M
ort
ali
dad
e (%
)
Extratos
a a a
b
c c d
a a
b b
c
d
Figura 17. Número de ovos/ fêmea ingurgitada de A. aegypti alimentada com extrato
bruto de sementes de plantas da caatinga. Diferentes letras indicam diferenças
estatísticas entre os tratamentos. ANOVA (p < 0,05).
4.3 Toxicidades dos EB de sementes de plantas da Caatinga
4.3.1 Toxicidade para C. dubia
Os EB também foram testados contra organismos não-alvos (os
microcrustáceo C. dubia) como parâmetro de segurança ambiental.
Todos os EB foram tóxicos para C. dubia. Os EB de G. americana (4,12
mg/mL), seguido dos EB de S. brasiliensis (1,91 mg/mL), C. phyllanthus (1,82
mg/mL), C. sonderianus (1,57 mg/mL) e A. cearenses (1,25 mg/mL) apresentaram as
maiores CL50 (Tabela 5). Utilizando os valores da CL50 os EB foram pontuados
(Tabela 3)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Nú
mer
o d
e ovos
Extratos
c c c
ab
a a a a
ab ab
b
Tabela 5. Ecotoxicidade para C. dubia dos EB de sementes de plantas da Caatinga
Semente C. dubia CL50a
M. urundeuva 0,19
S. brasiliensis 1,91
C. phyllanthus 1,82
C. sonderianus 1,57
R. communis 0,30
A. cearenses 1,25
A. colubrina 0,06
B. cheilantha 0,04
C. ferrea 0,52
C. pyramidalis 0,16
C. retusa 0,28
D. grandiflora 0,41
E. contortisiliquum 0,10
E. velutina 0,03
M. caesalpiniifolia 0,04
M. regnellii 0,01
P. moniliformis 0,46
P. stipulacea 0,16
P. viridiflora 0,12
S. spectabilis 0,02
G. americana 4,12 a. Concentração de extrato bruto em mg/mL necessária para matar 50% dos
Ceriodaphinia dubia
4.3.2 Toxicidade para fibroblastos de camundongos 3T3
Os ensaios de citotoxicidade celular foram realizados incubando-se
fibroblastos com os extratos nas concentrações correspondentes a CL50 e CL90 das
larvas L4 por 48h. Constatou-se que os EB de E. velutina, A. cearenses, E.
contortisiliquum e P. stipulacea apresentaram baixa toxicidade celular na concentração
referente a CL50 e que a viabilidade dos fibroblastos foi mantida mesmo com o
aumento da concentração dos EB de E. velutina e E. contortisiliquum para os valores da
CL90 (Figura 19, Anexo 2, Tabela 3).
4.4 Ranque dos EB de sementes de plantas da Caatinga
Considerando os resultados obtidos em todos os ensaios biológicos (com A.
aegypti e toxicidade), os extratos foram classificados com o intuito de identificar os
extratos mais promissores para estudos futuros no controle do A. aegypti.
Assim os extratos de A. cearenses, P. viridiflora, E. contortisiliquum, S.
brasiliensis, E. velutina e M. urundeuva obtiveram as melhores pontuações (Tabela 3),
sendo que todos esses extratos, com exceção do S. brasiliensis, foram também os
extratos mais promissores nos ensaios larvicida.
Figura 19. Viabilidade celular dos fibroblastos de camundongos 3T3 após incubação com extratos brutos de sementes de plantas da Caatinga nas
concentrações referentes a CL50 e CL90 das larvas L4 de A. aegypti
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2V
iabil
idad
e ce
lula
r (O
D 5
70 n
m)
Extratos
CL50
CL90
4.5 Composição química parcial dos EB de sementes de plantas da Caatinga
Foram determinados os teores de peso seco, carboidratos totais e compostos
fenólicos totais (Tabela 6) e revelado o perfil eletroforético (Figura 20 e Figura 21) de
todos os EB que foram utilizados nos ensaios biológicos.
A presença de componentes do metabolismo secundário foi constatada em
todos os extratos e em 15 deles foi confirmada a presença de flavonoides, terpenos e/ou
alacaloides.
Os teores de proteínas dos EB variaram de 0,62 (± 0,01)mg/mL (C.
phyllanthus) a 22,01 (± 0,01) mg/mL (E. contortisiliquum). Em todos os extratos foi
verificada a presença de proteínas ligantes à quitina. Em doze extratos foi identificada a
presença de lectinas (Anexo 3), e nos EB de D. grandiflora, C. ferrea e E. velutina
foram identificadas lectinas ligantes à quitina (Tabela 6).
4.5.1 Detecção de inibidores
A presença de inibidores enzimáticos foi realizada sob duas perspectivas: a)
identificação de inibidores utilizando enzimas comerciais (tripsina bovina,
quimotripsina bovina e amilase suína); b) identificação de inibidores específicos para as
enzimas digestivas de A. aegypti, presentes no homogenato intestinal das larvas L4
(HIL) e/ou no homogenato dos adultos (HA). Nos ensaios com HA foi realizada apenas
a pesquisa de inibidores de amilases nos extratos com atividade adulticida.
Em todos os extratos foi identificada a presença de inibidores enzimáticos
(Tabela 5). Inibidores de tripsina só não foram identificados nos extratos de B.
cheilantha, M. regnellii, P. stipulacea e S. spectabilis. Inibidores de amilase estavam
ausentes apenas nos extratos de C. sonderianus, A. colubrina, C. ferrea e M.
caesalpiniifolia. Nos extratos com atividade adulticida, inibidores de amilase só não
foram encontrados no extrato de A. colubrina.
Para alguns extratos foi verificado diferenças na resposta inibitória em razão
da origem das enzimas utilizadas nos ensaios. Embora com atividade inibitória para as
tripsinas bovinas, os extratos de S. brasiliensis e P. viridiflora não inibiram as tripsina
do HIL, e o inverso foi observado para o extrato de C. sonderianus. No mesmo sentido,
os extratos de P. moniliformis e A. cearenses apresentaram atividade inibitória para as
amilase do HIL, mas não inibiram as amilases suína (Tabela 7).
Para os extratos que se destacaram nos ensaios biológicos, foi constatada
elevada atividade inibitória para tripsinas (bovina e do HIL) no extrato de A. cearenses;
tripsinas (bovinas e HIL) e amilases (bovina e HIL) para o extrato de M. urundeuva;
tripsina bovina, quimotripsina, proteases do HIL e amilase suína para E. velutina; e
tripsinas (bovinas e HIL), quimotripsina bovina e amilases (suína e do HA) para E.
contortisiliquum. Nos extratos de S. brasiliensis e P. viridiflora não foram identificados
inibidores para tripsinas do HIL.
Tabela 6. Caracterização parcial dos extratos de sementes de plantas da Caatinga
Sementes Peso seco
(mg/mL±dp)
Carboidratos
totais
(mg/m ± dp)
Compostos
fenólicos
totais
(mg/mL ±dp)
Metabólitos
secundários
Proteínas
(mg/mL±dp)
Proteínas
ligantes à
quitina
(mg/mL±dp)
Lectinas
(AH)
Lectinas
ligantes
à quitina FL TT AL
A. cearenses 51,58±7,84 18,75± 4,11 0,50 ± 0,01 + ND ND 10,89±0,04 0,228 ND ND
B. cheilantha 27,11±1,07 1,96 ± 0,23 0,17 ± 0,02 + ND ND 0,72±0,01 0,014 55,18 ND
C. ferrea 45,42±1,87 12,88 ± 4,61 0,68 ± 0,01 + ND ND 17,34±0,71 1,289 2,31 800
C. phyllanthus 13,61±0,30 6,28 ± 1,34 0,09 ± 0,01 ND ND ND 0,63±0,01 0,019 ND ND
C. pyramidalis 42,98±12,85 14,21 ± 1,66 1,32 ± 0,02 + ND ND 12,99±0,25 1,536 ND ND
C. retusa 46,16±0,05 13,68 ± 2,99 0,57 ± 0,01 + ND + 13,37±0,30 0,290 12255,43 ND
C. sonderianus 20,26±0,75 10,91 ± 0,64 0,20 ± 0,01 ND ND ND 1,41±0,01 0,037 ND ND
A. colubrina 61,83±21,01 40,96 ± 6,55 3,46 ± 0,11 + + + 4,68±0,13 0,162 ND ND
D. grandiflora 38,87±0,70 14,21 ± 3,83 0,29 ± 0,12 ND ND + 3,30±0,071 0,105 396373,79 819200
E. contortisiliquum 37,40±4,6 8,75±0,99 6,81± 0,45 ND + ND 22,01±0,01 0,048 27,03 ND
E. velutina 71,41±1,00 22,82 ± 14,8 0,48 ± 0,06 ND ND + 7,48±0,26 0,317 10941,50 800
G. americana 25,52±0,81 1,224 ± 0,02 9,43 ± 0,23 ND + ND 1,22±0,02 0,013 32,72 ND
M. caesalpiniifolia 51,88±0,54 9,82 ± 1,95 0,63 ± 0,02 ND ND ND 10,16±0,14 0,024 ND ND
M. regnellii 31,33±0,19 13,72± 2,02 0,75 ± 0,09 + ND + 1,24±0,02 0,046 32,18 ND
M. urundeuva 44,89±3,67 6,87± 0,22 1,46 ± 0,21 + ND ND 0,76±0,01 0,009 833,69 ND
P. moniliformis 47,12±0,58 22,69 ± 7,15 0,77 ± 0,04 ND ND ND 5,06±0,07 0,024 ND ND
P. stipulacea 44,89±13,67 13,96 ± 1,48 0,86 ± 0,02 ND ND ND 8,31±0,40 0,193 38,48 ND
P. viridiflora 30,97±0,77 1,90 ± 0,40 0,40 ± 0,03 + ND ND 2,49±0,43 0,042 8212,46 ND
R. communis 14,05±0,69 3,85 ± 1,77 0,05 ± 0,01 ND ND ND 0,88±0,02 0,003 ND ND
S. brasiliensis 14,63±2,60 4,68 ± 0,17 0,39 ± 0,01 + ND ND 0,62±0,01 0,088 ND ND
S. spectabilis 35,84±1,14 28,84 ± 1,83 0,17 ± 0,05 + ND + 1,51±0,01 0,032 27041,92 ND
Dp= desvio padrão; AH = Atividade hemaglutinante; FL =Flavonoides, TT= Terpenos, AL= Alcaloides; ND = Não detectado; + = Presente.
Sobreamento destaca os EB com maiores pontuações nos ensaios biológicos. Nas caixas os valores mais elevados para cada parâmetro.
Figura 20. SDS-PAGE (12%) dos EB das sementes de plantas da caatinga.
Mu: M. urundeuva; Sb: S. brasiliensis; Cp: C. phyllanthus; Cs: C. sonderianus; Rc: R.
communis; Ac: A. cearenses; Aco: A. colubrina; Bc: B. cheilantha; Cf: C. férrea; Cp:
C. pyramidalis; Cr: C. retusa; Dg: D. grandiflora; Ev: E. velutina; Mc: M.
caesalpiniifolia; Mr: M. regnellii; Pm: P. moniliformis; Ps: P. stipulacea; Pv: P.
viridiflora; Ss: S. spectabilis; Tb: G. america. Marcadores de peso molecular:
fosforilase b (97 kDa), soroalbumina bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), anidrase
carbônica (30 kDa), inibidor da tripsina (20,1 kDa) e α- lactalbumina (14,1 kDa).
Figura 21. SDS-PAGE (12%) do extrato bruto (EB) e das frações proteicas de E.
contortisiliquum. M: marcadores de peso molecular; F1: fração 0-30%, F2: fração 30-
60%, F3: fração 60-90%, RTF1: retido de tripsina de F1, RTF2: retido de tripsina de F2;
RTF3: retido de tripsina de F3 dos extratos.
Tabela 7. Atividade inibitória (AI) dos extratos brutos de sementes de plantas da Caatinga
Sementes
Enzimas
Tripsina Tripsina HIL
Quimotripsina Proteases HIL
Amilase Amilase HIL
Amilase HA
AI ± dp AI ± dp AI ± dp AI ± dp AI ± dp AI ± dp AI ± dp
A. cearenses 307,0 ±5,81 191,42±3,51 87,00±6,87 147,67±4,16 ND 71,67±14,46 49,25±16,59
B. cheilantha ND ND 84,75±10,11 201,17±13,27 58,77±11,75 40,75±11,66 76,08±8,61
C. ferrea 313,17 ±1,61 199,33±0,58 31,42±3,01 141,42±5,58 ND ND NR
C. phyllanthus 51,17 ±15,14 167,42±22,68 48,75±2,00 138,92±23,71 27,17±2,75 219,83±12,00 NR
C. pyramidalis 209,00 ±6,76 120,58±5,06 109,83±0,29 220,42±2,36 5,50±4,82 56,33±25,76 96,75±32,04
C. retusa 104,67 ±52,35 113,93±8,10 49,58±7,42 64,67±7,52 23,60±7,25 47,17±32,70 NR
C. sonderianus ND 86,92±6,17 72,75±7,94 150,08±3,88 ND ND NR
B. colubrina 161,0 ±30,90 22,33±18,45 27,75±3,00 132,08±31,79 ND ND ND
D. grandiflora 55,00±37,72 128,00±2,65 38,25±9,99 125,08±21,10 55,22±11,81 78,33±20,82 84,42±24,08
E. contotisiliquum 314,83±0,29 202,67±04 111,33±0,76 209,5±34 245±25,06 82,67±15,81 69,85±22,12
E. velutina 223,00 ±41,50 169,83±5,20 108,0±3,46 229,50±0,50 151,10±11,17 103,5±43,30 51,33±22,37
G. americana 137,50±49,34 185,92±17,06 53,58±14,63 207,83±9,28 40,85±12,75 27,50±19,97 38,00±8,94
M. caesalpiniifolia 59,75±41,01 110,42±5,69 31,83±11,06 86,25±5,63 ND ND NR
M. regnellii ND ND 90,75±3,12 227,50±1,73 32,30±9,50 116,17±47,55 31,75±18,74
M. urundeuva 278,25 ±30,25 200,46±28,97 75,58±11,36 146,33±2,75 126,97±17,28 289,17±10,52 NR
P. moniliformis 214,42±29,04 115,42±28,44 104,83±5,51 211,25±8,23 ND 49,33±16,63 NR
P. stipulacea ND ND 102,75±4,44 228,08±0,29 152,10±14,55 78,67±20,40 NR
P. viridiflora 49,75 ±0,01 ND 83,92±2,36 225,0±6,38 28,10±10,50 116,50±47,15 45,92±12,41
R. communis 85,75±4,25 183,92±4,04 14,33±4,65 151,92±8,10 66,43±7,18 104,0±29,46 NR
S. brasiliensis 282,33 ±173,52 ND 90,42±6,25 141,17±10,25 26,50±3,97 218,17±98,88 NR
S. spectabilis ND ND 92,50±5,41 180,0±4,75 126,97±14,02 55,67±17,13 83,58±40,70
AI = Atividade inibitória (Unidade de inibição divida pela quantidade de proteína utilizada nos ensaios);
dp = desvio padrão; ND= não detectado; NR= Não realizado;
Sobreamento destaca os EB com maiores pontuações nos ensaios biológicos. Nas caixas os valores mais elevados para cada parâmetro.
4.6 Seleção e fracionamento do extrato de E. contortisiliquum
Entre os extratos que se destacaram nos ensaios biológicos, o de E.
contortisiliquum foi o único que não ocasionou a morte das pupas, mas ocasionou
morte das larvas e adultos, indicando a existências de um mecanismos de ação
dependentes da ingestão de moléculas tóxicas.
Adicionalmente o extrato de E. contortisiliquum apresentou a maior
dosagem de proteínas (22 mg/mL), elevada atividade inibitória para as proteases do HIL
e para as quimotripsinas e tripsinas bovina, bem como a maior atividade inibitórias para
as tripsinas do HIL. Por essas razões o EB de E. contortisiliquum foi submetido a um
fracionamento com sulfato de amônio, resultando nas frações denominadas de F1, F2 e
F3.
4.6.1 Atividade larvicida das frações proteicas de E. contortisiliquum
As frações de E. contortisiliquum foram utilizadas nos testes larvicidas e
pupicidas com A. aegypti. Como verificada para o EB, todas as frações mantiveram a
atividade larvicida e o aumento no tempo de exposição (48h) favoreceu a mortalidade
das larvas (Tabela 8). Exceto nos ensaios com F1, verificou-se que as larvas L1 foram
mais susceptíveis as frações do que as larvas L4.
Considerando os ensaios com L4 com duração de 48 h, percebe-se que F1 e
F2 foram mais eficazes (CL50= 0,67mg/mL e CL50= 2,14 mg/mL, respectivamente) do
que F3 (CL50= 40,01 mg/mL), indicando maior concentração das substâncias ativas
naquelas frações. Por sua vez a ausência de atividade pupicidas em todas as frações
confirma a necessidade de ingestão do extrato de E. contortisiliquum para obtenção dos
efeitos inseticidas.
Tabela 8. Atividade larvicida das frações proteicas de E. contortisiliquum
Tempo 24h 48h
Ínstar L1 L4 L1 L4
Amostras CL50a CL50
a CL50
a CL50
a
F1 5,71 3,87 0,58 0,37
F2 1,97 2,97 0,56 1,19
F3 47,83 58,72 17,42 22,23 a
Concentração necessária para matar 50% das larvas de A. aegypti
4.6.2 Caracterização parcial das frações proteicas de E. contortisiliquum
As frações proteicas de E. contortisiliquum foram também submetidas a
uma caracterização parcial (Tabela 9). Embora as frações tenham apresentado
composição semelhante, a maior concentração de compostos fenólicos e a presença de
terpenóide foram verificados em F1 (0,014 mg/mL). Em F2 foi verificada a maior
concentração de lectinas. Lectinas ligantes a quitina não foram identificadas em
nenhuma fração, enquanto que vicilinas e os maiores teores de carboidratos totais foram
identificados em F3. Inibidores de proteases e de amilase foram identificados em todas
as frações de E. contortisiliquum (Tabelela 10), enquanto que a SDS-PAGE revelou que
as frações são constituídas por proteínas de diferentes pesos moleculares (Figura 21).
Nos ensaios com C. dubia, verificou-se que F2 (CL50 = 0,24 mg/mL) e F3
(CL50 = 0,41 mg/mL) foram menos tóxica do que o EB (CL50 = 0,1 mg/mL) e F1
(CL50= 0,02 mg/mL) (Tabela 2 e Tabela 8).
Tabela 9. Caracterização parcial das frações protéicas de E. contortisiliquum
Frações PSa PT
a CT
a CFT
a T Lectinas
b LLQ V
CL50c
C. dubia
F1 22,66 5,4 1,92 0,014 + 62,81 ND NP 0,02
F2 25,84 15,56 2,70 0,008 ND 137,49 ND NP 0,24
F3 37,06 17,86 8,52 0,003 ND 2,56 ND + 0,41
PS = Peso seco, PT, proteínas totais, CT = Carboidratos totais, Terpenoides, LLQ =
Lectinas ligantes á quitina, V = vicilinas, ND = Não detectado; NP = Não pesquisado; +
= presente a = Em mg/mL
b = Em atividade hemaglutinante
c = Concentração necessária para matar 50% das C. dubias,
Tabela 10. Atividade inibitória (AI) das frações protéicas de E. contortisiliquum
Frações
Enzimas
Tripsinas Quimotripsinas Proteases HIL
Amilases
Bovina HIL
Suina HIL
F1 313,43 223,54 114,95 206,67 260,33 83,84
F2 356,01 231,08 119,56 229,23 241,83 56,52
F3 224,78 189,06 100,37 187,49 148,00 48,04
AI= Unidade de inibição dividida pela quantidade de proteína do ensaio)
4.6.3 Atividade inibitória in vivo do extrato bruto e das frações proteicas de E.
contortisiliquum
Larvas L4 foram incubadas com o extrato e as frações protéicas de E.
contortisiliquum nas concentrações referente a CL50 em 48 h. Em tempos definidos (0
h, 6 h, 24 h 36 h e 48 h) larvas vivas foram dissecadas para exame da atividade
proteolítica dos HIL.
Foi constatado que a ingestão do EB e das frações foi capaz de reduzir in
vivo a atividade proteolítica das larvas de A. aegypti (Figura 22). O aumento no tempo
de exposição reduziu a atividade proteolítica que alcançou os menores valores em todos
os tratamentos nos tempos de 24 h e 36 h, seguida de elevação no tempo final dos
ensaios (48 h).
Figura 22. Atividade proteolítica do HIL de A. aegypti alimentados com a CL50 de EB
e das frações proteicas (F1, F2 e F3) de E. contortisiliquum em diferentes tempos.
Diferentes letras indicam diferenças estatística entre os tratamentos. ANOVA (p<0,05).
4.6.4 Contribuição dos inibidores de tripsina na atividade larvicida do extrato e
das frações de E. contortisiliquum
Para confirmar se inibidores de tripsina presente no EB e nas frações seriam
os responsáveis pela atividade larvicida das sementes de E. contortisiliquum, F1, F2 e
F3 foram submetidos a cromatografias de afinidade de tripsina para obtenção das
frações não retidas (NRTF1, NRTF2 e NRTF3, respectivamente) e das frações retidas
(RTF1, RTF2 e RTF3).
A análise das frações que ficaram retidas na cromotografia de afinidade de
tripsina revelou ausência de lectinas, inibidores de amilase e metabólitos secundários,
enquanto que ensaios inibitórios confirmaram atividade para tripsina, quimotripsina e
para as enzimas do HIL (Figura 23). O perfil eletroforético das porções retidas mostrou
grande semelhança, sugerindo que o mesmo inibidor proteico com massa molecular de
20KDa estava presente nas três frações (Figura 21), por isso os retidos foram reunidos
com a denominação de RTEc.
Figura 23. Perfil de eluição da fração F2 (20mg de proteína) da semente de E.
contortisiliquum em cromatografia de afinidade de Tripsina-Sepharose. Tubos com
volumes de 2,5 mL.
Não foi verificado atividade larvicida do RTEc nas concentração de 0,05
mg/mL a 1mg/mL. Todavia a análise do HIL das larvas alimentadas com o RTEc
revelou elevada inibição das enzimas proteolíticas (63,15% a 81,47%), especificamente
das tripsina (87,91% a 98,98%) (Figura 24A). O zimograma confirmou nítida redução
na atividade das enzimas visualizadas (Figura 24B).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 5 10 15 20
Inib
ição (
%)
Ab
s (n
m)
Tubos
Abs
Tripsina
HIL
Quimotripsina
Figura 24. Atividade proteolitica do HIL de A. aegypti alimentadas com quantidades
crescentes do retido de tripsina de E. contortisiliquum (RTEc). (A) Atividade
proteolítica do HIL pós 24h. Diferentes letras entre colunas indicam diferenças
significativas. (B) Zimograma do HIL das larvas alimentadas com diferentes
concentrações de RTEc (5 µL), utilizando azocaseina 2,5% como substrato. As setas
indicas enzimas azocaseinílitas do HIL de A. aegypti.
As CL50 obtidas com as frações de E. contortisiliquum que não ficaram
retidas na cromatografia de afinidade de de tripsina (NRTF1, NRTF2 e NRTF3), foram
superiores as CL50 obtidas com as frações íntegras (F1, F2 e F3) (Tabela 11 ).
Tabela 11. Atividade larvicida das frações proteicas que não ficaram retidas na
cromatografia de afinidadede E. contortisiliquum
Tempo 24h 48h
Ínstar L1 L4 L1 L4
Amostras CL50a CL50
a CL50
a CL50
a
NRTF1b
7,55 12,15 4,03 4,34
NRTF2b
6,45 9,00 3,12 4,35
NRTF3b
67,20 76,35 30,83 42,87 a
Concentração necessária para matar 50% das larvas de A. aegypti em mg/mL b Frações não retidas nas cromatografias na afinidade de tripsina de F1 (NRTF1), F2
(NRTF2) e F3 (NRTF3)
B
4.6.4 1 Ensaios in vitro com o inibidor de tripsina de E. contortisiliquum (ITEc)
O RTF2 foi submetido a uma cromatografia de exclusão molecular
Superdex 75 Tricorn em sistema FPLC/AKTA para aumentar purificação dos inibidores
de tripsina de E. contortisiliquum (Figura 25). No maior pico foi constatada atividade
inibitória para tripsina, mas não foi verificada inibição para amilase e nem presença de
lectinas e componentes do metabolismo secundário. Assim sendo, o pico foi reunido e
denominado de inibidor de tripsina de E. contortisiliquum (ITEc).
Figura 25. Perfil de eluição do RTF2 (1mg de proteína) em cromatografia de exclusão
molecular Superdex 75 Tricorn em sistema FPLC/AKTA. O pico com atividade
inibitória foi denominado de inibidor de tripsina de E. contortisiliquum (ITEc). Tubos
com volumes de 2,5 mL.
Ensaios in vitro com o ITEc, foram realizados para a construção da curva
de inibição e determinação da IC50 (Figura 26A e 26B) e da Ki (Figura 27A e 27B)
para as enzimas serínicas e tripsínicas do HIL.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 20 40 60 80 100
Inib
ição (
%)
mA
U
Tempo (minutos)
mAU
B
ITEc
Figura 26. Curva de inibição e concentração de inibição 50% (IC50) do HIL de A.
aegypti incubado com o inibidor de E. contortisiliquum utilizando BApNa 1,25 mM
(A) e azocaseina 1% (B) como substratos.
Figura 27. Constante de Inibição (Ki) do ITEc sobre o HIL de A. aegypti utilizando
BApNa (A) e azocaseina (B) como substratos.
4.6.5 Contribuição das vicilinas na atividade larvicida de E. contortisiliquum
Atividade larvicida e adulticida não foi verificada nos ensaios com o RQF3
(nas concentrações de 0,05 mg/mL a 1mg/mL), obtido após cromatografia de afinidade
a quitina (Figura 28A), não obstante a confirmação da presença de quitina no intestino
y = 3,065x R² = 0,9685
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 10 20 30
Inib
ição
(%)
Concentração de proteína (nM)
IC 50= 16,31 nM
A y = 77,868x R² = 0,8174
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 0,5 1 1,5
Inib
ição
(%
)
Concentração de proteína (mM)
IC 50= 642 mM
B
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
-10 0 10 20 30
1/v
Concentração de proteína (nM)
BApNA 1,25mM
BApNA 2,5 mM
Ki = 1,2 nM
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
-40 -20 0 20 40 60
1/v
Concentração de proteína (nM)
Azocasein 1%
Azocasein 2%
Ki = 12,8 nM
das larvas. A análise do RQF3 não identificou a presença de lectinas, inibidores de
amilase, inibidores serínicos e terpenóides nessa fração, mas o perfil da SDS-PAGE
sugeriu trata-se de uma fração rica em vicilina (Figura 28B). Todavia as CL50 obtidas
com o NRQF3 nos ensaios larvicida foram semelhantes as encontradas com a F3 íntegra
(Tabela 12).
Figura 28. Obtenção do retido de quitina da fração F3 (RQF3).
(A) Perfil de eluição da fração F3 da semente de E. contortisiliquum em cromatografia de
afinidade de quitina. (B) SDS-PAGE (12%) do EB, F3 e fração retida na quitina (RQ) de
semente de E. contortisiliquum
Tabela 12. Atividade larvicida da fração proteica de E. contortisiliquum não retida na
cromatografia de afinidade de quitina
Tempo 24h 48h
Ínstar L1 L4 L1 L4
Amostras CL50a CL50
a CL50
a CL50
a
NRQF3b 47,32 59,24 18,12 23,76
a Concentração necessária para matar 50% das larvas de A. aegypti em mg/mL
b Fração não retida na cromatografia de afinidade de quitina de F3 (NRQF3)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
85 90 95 100 105
Ab
s (n
m)
Tubos
Ab…A B
5 Discussão
As plantas tem se mostrado fontes promissoras para obtenção de inseticidas
e muitos compostos de origem vegetal já foram identificados e comercializados, tais
como azadiractina, piretrinas, rotenonas, nicotinas e tosendanina (Koul & Walia, 2009;
Pluempanupat et al., 2013). Apesar do uso extensivo para combater pestes agrícolas,
inseticidas oriundos de plantas ainda participam de forma limitada do controle de
insetos vetores (Rajasekaran & Duraikannan, 2012).
Na pesquisa por compostos ativos, diversas partes de uma planta podem ser
utilizadas. A opção por sementes da Caatinga fundamentou-se na possibilidade de
obtenção da matéria-prima dentro de uma importante área endêmica para dengue. Além
disso, sementes podem ser armazenadas por longos períodos e a preparação dos extratos
é fácil e pouco dispendiosa, o que também pode contribui para sua adoção. Embora
poucos estudos tenham investigado a atividade inseticidas de extratos de sementes
contra A. aegypti (Farias et al., 2010; Souza et al., 2011), a constatação de que todos os
extratos analisados apresentaram atividade larvicida, reforça o potencial dos produtos
oriundos de sementes no controle de insetos transmissores de doenças.
Além da parte da planta, a composição de um extrato depende de vários
outros fatores como, por exemplo, o tipo de solvente extrator. Entre os mais usados
estão os solventes orgânicos que favorecem a solubilização de compostos do
metabolismo secundário e óleos essenciais, vários do quais tem ação comprovada contra
os A. aegypti (Silva et al., 2008; Chapagain et al., 2008; Araujo et al., 2008; Souza et
al., 2012; Pluempanupat et al., 2013). Outros autores têm utilizado como extrator a
água destilada (Coelho et al., 2009; Farias et al., 2010, Pontual et al., 2012), em razão
da facilidade de obtenção dos extrato e sua segurança ambiental. No presente trabalho
optou-se por uma extração com tampão salino, objetivando favorecer a solubilização de
proteínas (Macedo et al., 2007; Moura et al., 2007; Sá et al., 2009; Cruz et al., 2013).
Os extratos salinos preparados solubilizaram proteínas com teores que
variaram de 0,62 (±0,01) mg/mL (S. brasiliensis) a 22,01 mg/mL (E. contortisiliquum)
e em todos os extratos foram identificadas pelo menos duas proteínas com potencial
inseticida (inibidores de proteases, inibidores de amilase, proteínas ligantes à quitina e
lectinas). Comparando com os extratos aquosos obtidos por Farias et al., (2010),
percebe-se que a utilização do tampão salino realmente elevou os teores de proteína dos
extratos de semente de C. ferrea, A. cearenses e E. contortisiliquum (de 1,40 mg/mL,
0,98 mg/mL e 3,13 mg/mL para 17,34 mg/mL, 10,89 mg/mL e 22,01 mg/mL,
respectivamente). Adicionalmente os extratos obtidos exibiram uma variada
composição química, pois além de proteínas foram identificados carboidratos,
compostos fenólicos e componentes do metabolismo secundário.
A extração salina foi eficaz para solubilizar moléculas bioativas, pois todos
os extratos, com exceção do extrato de G. americana, ocasionaram óbito de 100% das
larvas L1 e L4 em 48 h. O extrato aquoso das sementes de Moringa oleifera levou ao
óbito 45% larvas após 72h de incubação, valor inferior ao observado para todos os
extratos utilizados no presente trabalho (Coelho et al., 2009). Farias et al., (2010)
testando 17 sementes de leguminosas da Caatinga, constataram que apenas cinco
extratos alcançaram 100% de mortalidade e os valores da CL50 dos extratos aquosos de
P. moniliformis A. cearensis e E. contortisiliquum foram inferiores aos obtidos com o
extrator salino. Também Souza et al. (2011) testaram 21 extratos etanólicos de planta do
Nordeste brasileiro e constataram que apenas os extratos de M. urundeuva e S.
brasiliensis alcançaram 100% de mortalidade das larvas após 24h. A mortalidade obtida
com os extratos etílicos de A. cearenses e P. moniliformis foi inferior (25,0% e 47,5%,
respectivamente) a obtida com os extratos salinos (100% e 100%, respectivamente).
Os ensaios larvicidas foram realizados com larvas L1 e L4 e foi constatado
que para 16 extratos houve diferença na susceptibilidade do ínstar larval. Em geral, as
larvas L1 foram mais susceptíveis, como também foi constatato por Murugan et al.
(2007), Coelho et al. (2009), Grupta et al. (2011) e Patil et al. (2011). Mas o inverso
também foi observado, como também relatado por Pontual et al. (2012). Todavia não
foi verificado diferença na toxicidade do extrato para o ínstar larval. Assim tanto larvas
L1 quanto L4 podem ser utilizadas em ensaios larvicida, cada uma com suas vantagens.
No primeiro caso, tornando possível ensaios que dispendem pouco espaço e material
(volume final de 2 mL) (Konishi et al., 2008) e, no segundo caso, utilizando um inseto
cujas dimensões facilitam a realização de dissecações e estudos de impactos
morfológicas (Coelho et al., 2009).
Pela análise das CL50 obtidas, os extratos de M. urundeuva, P. viridiflora, E.
velutina, A. cearenses e E. contortisiliquum apresentaram as maiores atividades
larvicida dentre os extratos estudados. Trabalhos anteriores já tinham constatado a
atividade larvicida de extratos obtidos com cerne (Sá et al., 2009) e folhas de M.
urundeuva (Napoleão et al., 2012), uma planta amplamente encontrada no Nordeste
brasileiro e com diversas utilizações medicinais (Sá et al., 2009). Nos estudos citados
também se utilizou uma extração salina (com NaCl) e como matéria prima foram
utilizados a casca, o cerne (Sá et al., 2009 ) e as folhas (Napoleão et al., 2012),
entretanto a atividade larvicida foi inferior a observada no presente trabalho utilizando
sementes.
Nos trabalhos com extratos da casca, cerne e folhas de M. urundeuva o
potencial larvicida dos extratos foi atribuído a presença de lectinas com afinidade a
quitina, as quais foram purificadas e utilizadas em testes larvicida. Coelho et al., (2009)
também constatou que uma lectina solúvel em água de Moringa olifera (WSMol),
também com afinidade à quitina, ocasionou morte das larvas de A. aegypti. No extrato
das sementes de M. urundeuva também foram encontradas lectinas, bem como nos
extratos de B. cheilantha, C. ferrea, C. retusa, D. grandiflora, E. contortisiliquum, E.
velutina, M. regnellii, P. stipulacea, P. viridiflora, S. spectabilis e G. americana.
Todavia, diferente das lectinas encontradas na casca, cerne e folhas, as lectinas das
sementes de M. urundeuva não demostraram afinidade à quitina, mas lectinas com
afinidade a quitina foram identificadas nos extratos das sementes de E. velutina, C.
ferrea e D. grandiflora.
Além das lectinas outras proteínas oriundas de plantas podem possuir
afinidade à quitina e comprometerem a integridade da membrana peritrófica como, por
exemplos, arcelins, WGA, heveína, amilases, quitinases e vicilinas (Sales et al., 2001;
Moura et al., 2007; Macedo et al., 2008; Uchôa et al., 2009). Proteínas com afinidade a
quitina foram encontradas em todos os extratos das sementes estudados. Também
lectinas com afinidade a outros carboidratos, que não a quitina, podem apresentar
atividade inseticida ao interagirem com proteínas glicosiladas da matriz peritrófica ou
com enzimas digestivas (Carlini & Grossi-de-Sá, 2002; Macedo et al., 2007).
Recentemente Pontual et al., (2012) demostraram atividade larvicida do
extrato aquoso da flor de Moringa oleifera e, pela análise da SDS-PAGE, visualizou
um único componente de natureza proteica, identificado como MoFTI, o qual foi capaz
de inibir as enzimas digestivas das larvas de A. aegypti de forma dose dependente,
alcançando mais de 70% de inibição das enzimas tipo tripsina na concentração de
2,9nM. De forma contrária, no presente trabalho o perfil eletroforético dos extratos
revelou que todos os extratos são constituídos por vários componentes proteicos, mas
também, inibidores enzimáticos capazes de interfer na atividade proteolítica foram
identificadas em todos os extratos.
Como as larvas de A. aegypti se alimentam constantemente, a inibição das
enzimas digestivas presentes nesse estágio de vida pode representar uma estratégia
promissora no controle desse inseto (Soares et al., 2011; Soares et al., 2013; Venancio
et al., 2009). Na caracterização do HIL identificou-se a presença de proteases serínicas
da classe Kunitz, do tipo tripsina e quimotripsina com predomínio das primeiras, como
também encontrado por Borovsky & Meola, (2004), Mesquita-Rodrigues et al. (2011) e
Soares et al. (2013). Essas enzimas apresentam grande versatilidade funcional, pois a
atividade proteolítica é mantida, mesmo com ampla variação no pH e na temperatura,
como também observado por Mesquita-Rodrigues et al. (2011).
Inibidores de tripsina foram encontrados em 17 extratos, com destaque para
as elevadas atividades inibitórias observadas em E. contortisiliquum, A. cearenses e M.
urundeuva, todos com elevada atividade larvicida. Entretanto alguns ensaios de inibição
mostraram resultados contraditórios na detecção desses inibidores quando comparados
os resultados obtidos com os homogenatos do inseto e os obtidos com as enzimas
comerciais. A constatação de que inibidores de origem diferentes exercem diferentes
efeitos em enzimas de origem diferente, tem sido também constatada por outros
autores. Pontual et al. (2012) verificaram que o SBTI e o inibidor do ovo branco
também não inibem as tripsinas do HIL de A. aegypti, embora inibam com eficiência as
tripsinas de origem bovina. Dessa forma a realização de ensaios de inibição utilizando
as enzimas dos próprios A. aegypti presentes no HIL e HA, tornam os ensaios de
detecção de inibidores mais específicos.
Observou-se também que o aumento no tempo de exposição ao extrato
elevou a mortalidade das larvas, exceto para os extratos de C. retusa e P. viridiflora.
Considerando a ausência de inibidores de tripsina do HIL no extrato de P. viridiflora,
mas a abundancia de inibidores enzimáticos nos demais extratos com elevado potencial
larvicida, sugere-se que a presença de inibidores enzimáticos tenha contribuído de
forma decisiva na mortalidade das larvas, já que inibidores proteicos normalmente não
causam toxicidade aguda para insetos (Pontual et al., 2012). Vale ainda ressaltar que
componentes do metabolismo secundário e lectinas podem causar inibição enzimática,
atuando em sinergismo com inibidores enzimáticos (Maliar et al., 2004; Napoleão et al.,
2012; Agra-Neto et al., 2014).
No controle do A. aegypti as larvas são os principais alvos dos inseticidas, já
que nessa fase o inseto fica restrito aos criadouros aquáticos encontrado no ambiente
doméstico e peridoméstico (Gupta et al., 2011). Todavia quando um inseticida consegue
atingir seu o alvo em diferentes estágios de vida (por ex. larvas X pupas ou larvas X
adultos), seu uso alternado pode retardar o desenvolvimento de resistência (Wirth,
2010). Assim sendo, foi verificado se os extratos salinos das sementes da Caatinga
tinham propriedades adicionais que pudessem contribuir no controle da população do A.
aegypti.
Assim como as larvas, as pupas também ficam restritas aos criadouros
aquáticos, onde podem ser atingidas por inseticidas. Nesse sentido constatou-se que
além de larvicidas os extratos de A. cearenses P. viridiflora, E. velutina, M. urundeuva
e S. brasiliensis podem também reduzir a sobrevivência das pupas.
Uma vez que as pupas não se alimentam, a comparação entre os resultados
obtidos nos ensaios larvicida e pupicidas pode indicar se a ação do extrato necessita da
ingestão dos componentes ativos (larvicida e não pupicida), ou se resulta da absorção
dos compostos tóxicos através da superfície corporal (pupicida e larvicida) (Grupta et
al., 2011; Souza et al., 2011). Os achados de que apenas cinco extratos larvicida foram
pupicidas e que as CL50 obtidas nos ensaios larvicida foram bem inferiores as
encontradas nos ensaios pupicidas, reforçam o entendimento de que os mecanismos de
ação desses extratos ocorre devido, principalmente, a ingestão de compostos ativos.
Souza et al. (2011) também identificou atividade pupicida para os extratos
etanólicos das sementes de A. cearenses, M. urundeuva e S. brasiliensis, mas superior a
que foi observada para os extratos salinos e constatou ainda elevada mortalidade para o
extrato de Piptadenia moniliformis (100%), o que não foi verificado no presente
estudo.
Foi também constatada morte de adultos que se alimentaram com os EB de
P. viridiflora, E. velutina, E. contortisiliquum, A. cearenses, A. colubrina, D.
grandiflora, B. cheilantha, S. spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli e G. americana.
A abordagem utilizada nos ensaios adulticida não apresenta viabilidade para uso em
campanha de controle populacional dos A. aegypti, pois depende da ingestão dos
extratos pelos insetos adultos, uma variável de difícil controle. Entretanto, como nos
ensaios pupicidas, a análise dos resultados obtidos pode fornecer evidências sobre o
mecanismo de ação dos extratos.
Como verificado nos ensaios pupicidas, nem todos os extratos larvicida
foram também adulticidas. Adicionalmente, as CL50 dos ensaios adulticidas foram
também inferiores às obtidas nos ensaios larvicida. A maior eficácia dos extratos para as
larvas, em detrimento dos adultos, indica que inibidores de proteases devem contribuir
de forma importante na atividade larvicida dos extratos, uma vez que a inibição dessas
enzimas não ocasiona morte dos adultos, apenas pode reduzir a fecundidade das fêmeas,
como observado em 30% dos extratos analisados (Isoe, et al., 2009a; Soares et al.,
2011). Todavia outras moléculas capazes de atuarem no inseto em diferentes fases de
desenvolvimento, como moléculas ligantes à quitina, devem contribuir para as
propriedades inseticidas dos extratos, uma vez que a membrana peritrófica é
importantes em ambas as fases de desenvolvimento.
Diferentes dos ensaios adulticidas, o tratamento de ovitrampas pode ser
uma estratégia interessante para uso em campo, pois pode reduzir a quantidade de inseto
em uma área, repelindo especificamente a postura das fêmeas grávidas e diminuido o
número de ovos nos criadouros (Kaur et al., 2003). Todos os extratos analisados
repeliram a postura das fêmeas quando adicionados nas ovitrampas, como também
encontrado por Coria et al. (2008), Grupta et al. (2011) e Kumar et al. (2011).
Diversos fatores podem interferir na escolha da fêmea pelo local da postura,
tais como fatores visuais, tácteis e ofatórios (Quiroz-Martinez et al., 2012), além da
familiaridade da fêmea com o tipo de criadouro (Kaur et al., 2003) e sua capacidade de
avaliação do risco de sobrevivência das larvas, seja pela identificação da presença de
predadores ou da abundância de recursos alimentares (Albeny-Simoes et al., 2014).
Interessantemente, os extratos de D. grandiflora, E. contortisiliquum, A.
cearenses, C. ferrea e C. retusa foram também capazes de atraírem as fêmeas para a
posturas, quando adicionados nas ovitrampas em baixas concentrações. Entre os
extratos com potencial atrativo, os de E. contortisiliquum e A. cearenses foram capazes
de ocasionar a morte de mais da metade (E. contortisiliquum), ou mesmo de todas as
larvas L1 (A. cearenses), que eclodiram dos ovos postos.
Esses resultados tornam esses dois extratos excelentes candidatos a
larvicida, pois um larvicida não deve afungentar as fêmeas, o que causaria dispersão dos
insetos e falha no controle, e quando é capaz de atraí-las, aumenta consideravelmente a
eficácia do tratamento (Canyon & Muller, 2013). De modo semelhante Quiroz-Martinez
et al. (2012) comparando a posturas em ovitrampas contendo spinosad (um inseticida
obtido das bactérias Saccharopolyspora spinosa) e temephos (organofosforado),
verificou que o produto natural agiu como um atrativo, enquanto que o sintético foi
repelente. É valido salientar que os extratos de E. contortisiliquum e A. cearenses
apresentaram elevados teores protéicos e que Santos et al. (2012) constataram que
proteínas não voláteis podem atuar como estimulantes de postura para fêmeas de A.
aegypti.
A utilização de um extrato como larvicida ou como repelente de postura
requer sua adição nos criadouros artificiais, cujo conteúdo poderia posteriormente ser
consumido por outros mamíferos ou despejado em criadouros naturias habitados por
outros seres aquáticos. Embora extratos oriundos de plantas sejam biodegradáveis, a
análise de sua toxicidade para organismos não-alvos deve sempre preceder sua
indicação.
No presente trabalho a toxicidade dos extratos foi analisada em duas
abordagens: toxicidade celular, em ensaio utilizando fibroblastos de camundongos, e
ensaios de ecotoxicidade. Nos ensaios de ecotoxicidade o organismo mais usado tem
sido o pequeno crustáceo Artemia salina (Souza et al., 2011, Luana et al., 2005).
Todavia estudos recentes indicam que o cladocera Ceriodaphnia dubia apresenta maior
sensibilidade aos contaminantes químicos, além de serem encontrados na água doce,
enquanto que as Artemia vivem em ambiente salino (Nunes et al., 2006, Shen et al.,
2012).
Como esperado C. dubia foi mais sensível aos diferentes extratos do que as
larvas de A. aegypti. Todavia C. dubia é encontrada em lagos, lagoas e pântanos de
água doce e caso os extratos atinjam esses ecossistemas sem terem sido ainda
totalmente degradados, eles serão diluídos nas águas fluviais. Nesse contexto
observamos que uma diluição de 1:5 é suficiente para que o extratos de M. urundeuva,
A. cearenses e E. contortisiliquum, detentores de elevado potencial larvicida,
apresentem CL50 para C. dubia superior a CL50 para larvas de A. aegypti. Por sua vez
dos três extratos mencionados, o de E. contortisiliquum não interferiu na viabilidade
dos fibroblastos.
A favor da segurança dos extratos da Caatinga, vale salientar que estudos
têm indicado que a maioria das plantas investigadas (M. urundeuva, S. brasiliensis, C.
phyllacanthus , C. sonderianus, R. communis, A. cearenses, A. colubrina, B.
cheilantha, C. ferrea , C. pyramidalis, D. grandiflora, E. velutina, M. caesalpiniifolia,
P. viridiflora, P. stipulacea, S. spectabilis e G. americana) têm sido utilizadas pela
população local por suas propriedades mediciais (Luana et al., 2005; Albuquerque et
al., 2007; Araujo et al., 2008; De Almeida et al., 2010; Cartaxo et al., 2010; Trentin et
al., 2011), possuindo algumas até propriedades anticancerígenas (Pessoa, et al., 2006;
Ferreira et al., 2011).
Do exposto podemos concluir que as sementes de plantas da Caatinga
possuem enorme potencial para serem exploradas no controle de inseto vetores, como o
A. aegypti, uma vez que todas as vinte uma plantas estudadas atuaram como larvicida e
repelente de postura e que 15 foram capazes de atuar em mais de um momento do ciclo
do inseto (larva, pupa, adulto ou postura). Todavia considerando o ranque total,
estabelecido com os resultados de todos os ensaios biológicos, os extratos de A.
cearenses, P. viridiflora, E. contortisiliquum, S. brasiliensis, E. velutina e M. urundeuva
foram considerados os mais promissores e devem ser investigados em estudos
seguintes.
Dos extratos considerados mais promissores, apenas o E. contotisiliquum
não ocasionou a morte das pupas, indicando que seu mecanismo de ação está
relacionado exclusivamente à ingestão dos componentes ativos das sementes. A análise
do extrato de E. contotisiliquum revelou ainda que o extrato dessa semente detém o
maior conteúdo protéico e a maior atividade inibitória para as tripsinas do HIL, entre os
extratos analisados. Assim esse extrato foi fracionado, resultando nas frações F1, F2 e
F3.
Como observado para o EB, a incubação com as frações proteicas de E.
contortisiliquum também resultou na morte de todas as larvas, mas não das pupas. As
frações F1 e F2 apresentaram capacidade larvicida superior ao EB, e a obtenção de F2
reduziu a toxicidade das sementes de E. contortisiliquum para C. dubia.
A caracterização parcial revelou presença de inibidores de proteases e
amilase em todas as frações de E. contortisiliquum e, apenas em F3 não foram
identificados compostos do metabolismo secundário. Como essa fração apresentou
atividade larvicida, se conclui que os terpenoides não são fundamentais para a atividade
larvicida do EB.
Diversas proteínas têm sido purificadas das sementes de E. contortisiliquum,
incluindo enzimas, inibidores de proteases e vicilinas (Oliva et al.,1988; De Sousa &
Morhy, 1989; Moura et al., 2007). Entre os inibidores um membro da família Kunitz, o
inibidor de trispina de E. contortisiliquum (ITEc) com 20kDa, foi previamente
purificado e sequenciado (Batista et al., 1996) e sua estrutura cristalina foi determinada
(Batista et al., 2001; Zhou et al., 2013). Também foi constatado que a atividade desse
inibidor é mantida e uma ampla faixa de temperatura (até 60 oC) e de pH (até pH 12),
(Batista et al., 1996), versatilidade comparável a observadas com as enzimas digestivas
das larvas de A. aegypti, além de atividade inibitória adicional também contra enzimas
do tipo quimotripsina (Batista et al., 1996; Nakahata et al., 2011). Estudos mostraram
que o ITEC não afeta a viabilidade de fibroblastos e células troncos mesenquimais, e é
capaz de reduzir seletivamente a viabilidade e invasão de células tumorais (De Paula et
al., 2012; Nakahata et al., 2011).
Este inibidor foi identificado nas três frações de E. contortisiliquum,
sugerindo a existência de várias isoformas (Batista et al., 2001). Entretanto a atividade
larvicida não foi mantida quando se elevou o grau de purificação do ITEc. Todavia foi
demostrado que a ingestão desse inibidor na concentração de 1mg/mL é capaz de
reduzir em 99% a atividade tripsínica das larvas, e estudos cinéticos tenham chegado a
valores de Ki em nanomolares. Esses resultados estão de acordo com os obtidos por
Pontual et al. (2012), que também não constataram morte das larvas de A. aegypti
alimentadas com o SBTI e inibidor do ovo branco. Mas são contrários aos encontrados
por Borovsky e Meola (2004) que verificaram morte das larvas alimentadas com o
TMOF (trypsin modulating oostatic fator), um decapeptídeo (YDPAPPPPPP) que
previne a biosíntese de tripsina, indicando que a atividades das enzimas do tipo tripsina
é vital para os insetos imaturos (Lopes et al., 2004).
A superação da inibição enzimática por um inseto pode ocorrer pela super
expressão de proteinases nativas, expressão de novas proteinases resistentes ou por
proteolítica inativação dos inibidores (Lopes et al., 2004; Pontual et al., 2012). A
redução da atividade proteolítica das larvas alimentadas com o EB e as frações proteicas
de E. contortisiliquum até os tempos de 24 h e 36 h, seguida de um aumento no tempo
de 48 h é um indicador dessa adaptação. Todavia, embora não seja suficiente para
ocasionar a morte das larvas de A. aegypti, o ITEc se mostrou um componente bioativo
importante, pois sua ausência reduziu a eficácia das frações proteicas de E.
contortisiliquum.
Também não foi verificada atividade larcivicida e adulticida das vicilinas, e
nem evidências da participação dessas proteínas na atividade inseticida do EB e fração
F3 de E. contosiliquum.
Vicilinas das sementes de E. contosiliquum (EcV) foram purificadas por
Moura et al. (2007) que atribuíram seus efeitos negativos contra o fungo fitopatogênio
Fusarium solani e as larvas dos coleópteros C. maculatus e Zabrotes subfasciatus a
capacidade dessas proteínas de resistir a proteólise e se ligarem a membrana peritrófica.
Também frações ricas em vicilinas de outras sementes adulticidas como A. colubrina e
E. velutina, bem como de Vigna unguiculata foram obtidas (Anexos 4-6), mas não
ocasionaram a morte das larvas L4 (dados não mostrados).
A caracterização parcial do EB e de F2 evidenciou a presença de outras
substâncias importantes como inibidores de amilase e lectinas não ligantes á quitina.
Ensaios adicionais são sugeridos para verificar o papel desses outros componentes nas
atividades inseticidas do EB e de F2, todavia em se tratando de um inseto com elevada
plasticidade genética (Venancio et al., 2009) e históricos de resistência a diferentes
compostos químicos (Fonseca-Gonzalez et al., 2011; Lima et al., 2011; Shafie et al.,
2012) como é o A. aegypti, é provável que a eficácia do EB e das frações de E.
contortisiliquum tenha sido resultante da ação conjunta dos diferentes compostos ativos
existentes, que atuando em diferentes mecanismos de ação e/ou contribuindo para a
redução da proteólise tenham sido capazes de causar a morte dos insetos e impedir sua
rápida adaptação (Regnault-Roger et al., 2004; Patil et al., 2010).
Assim o EB de E. contortisiliquum e sua fração F2 mostraram elevado
potencial larvicida contra os A. aegypti e ensaios adicionais deverão ser realizados para
verificar sua viabilidade para uso em campo.
Estes resultados encorajam a busca de novos compostos naturais ativos em
sementes de plantas locais, que ofereçam uma alternativa para os inseticidas sintéticos
utilizados no controle do A. aegypti.
6. CONCLUSÕES
Todos os extratos de sementes de plantas da Caatinga analisados
apresentaram atividade larvicida contra A. aegypti, o que pode estar relacionado à
presença de proteínas com propriedades inseticidas;
Todos os extratos analisados foram capazes de repelir a postura das fêmeas
grávidas de A. aegypti e a maioria (71,4%) também ocasionou morte desse inseto em
outra fase de desenvolvimento (pupa e/ou adultos);
Os extratos de D. grandiflora, E. contortisiliquum, A. cearenses, C. ferrea e
C. retusa, quando em baixas concentrações, atraíram as fêmeas de A. aegypti para a
posturas. Adicionalmente os EB de E. contortisiliquum e A. cearenses foram capazes de
ocasionar elevada mortalidade das larvas L1 resultantes, o que os tornam excelentes
candidatos a larvicida;
Todos os extratos apresentaram toxicidade para o cladócero C. dubia, mas o
EB de E. velutina e E. contortisiliquum não interferiram na viabilidade dos fibroblastos;
Considerando todos os ensaios biológicos realizados, os extratos de A.
cearenses, P. viridiflora, E. contortisiliquum, S. brasiliensis, E. velutina e M. urundeuva
foram considerados os mais promissores para serem investigados em estudos futuros;
Entre os cinco extratos considerados mais promissores o extratos de E.
contortisiliquum foi o único que apresentou atividade larvicida e adulticida, mas não
pupicida, indicando que sua ação inseticida depende da ingestão de compostos tóxicos
pelos insetos;
A obtenção da fração F2 elevou a atividade larvicida e reduziu a toxicidade
ambiental do extrato da semente de E. contortisiliquum;
O ITEc é capaz de reduzir a atividade proteolíticas das larvas, contribuindo
para a atividade larvicida do EB de E. contortisiliquum. Entretanto não foi verificada
evidências da contribuição das vicilinas na atividade inseticida desse extrato;
Os resultados indicam o potencial dos extratos de sementes de planta da
Caatinga como fonte de moléculas ativas, especialmente de natureza protéica, que
atuando em mecanismos diversos podem retardar o surgimento de resistências e auxiliar
no controle populacional dos insetos A. aegypti nas áreas de transmissão ativa da
dengue.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8. ANEXOS
Anexo 1.
Figura. Teste larvicida com L4 utilizando diferentes tampões em diferentes
concentrações. Água destilada foi utilizada como controle negativo
0
20
40
60
80
100
50 mM 40 mM 30 mM 20 mM 15 mM 10 mM
Mo
rtal
idad
e d
as la
rvas
L4
(%)
48 h
Concentração
Bórax
Tris-HCl
Fosfato de Sódio
H2O
Anexo 2.
Tabela. Ranking parcial dos ensaios biológicos
Família Semente Nome vulgar
Larvicida Repelência Toxicidade celular
L1 L4 Total 2,5% 20% Total LC50 LC90 Total
24 h 48 h 24 h 48 h
Anacardiaceae M. urundeuva Aroeira 21 20 20 21 21 11 19 16 16 12 15
S. brasiliensis Braúna 10 9 13 17 12 10 7 9 8 15 12
Euphorbiaceae
C. phyllanthus Favela 7 6 10 7 9 7 4 5 9 13 11
C. sonderianus Marmeleiro 4 4 8 5 4 16 13 15 2 2 2
R. communis Carrapateira 12 13 11 9 11 15 10 11 5 11 7
Fabaceae
A. cearenses Cumaru 17 17 17 16 18 1 5 3 20 19 20
A. colubrina Angicos 16 14 18 11 14 13 14 13 12 8 9
B. cheilantha Mororó 8 8 7 18 10 21 18 21 3 3 3
C. ferrea Jucá 3 3 3 3 3 2 1 1 13 19 17
C. pyramidalis Catingueira 5 7 9 4 6 8 6 6 14 10 13
C. retusa Crotalária 6 2 1 2 2 5 2 4 11 17 14
D. grandiflora Diocléia 9 10 2 6 8 3 3 2 6 6 6
E. contortisiliquum Tamboril 18 19 15 12 17 4 21 10 19 20 19
E. velutina Mulungu 20 21 16 14 19 6 9 7 21 21 21
M. caesalpiniifolia Sabiá 11 11 14 15 13 19 16 19 10 9 8
M. regnellii Juquiri 14 18 12 20 16 14 12 12 17 4 10
P. moniliformis Catanduva 13 1 4 8 7 20 17 20 7 5 4
P. stipulacea Jurema branca 15 15 19 13 15 12 20 18 18 16 18
P. viridiflora Jurema jucuri 19 16 21 19 20 9 8 8 15 14 16
S. spectabilis Canafístula 2 5 5 10 5 17 15 17 1 1 1
Rubiaceae G. americana Jenipapo 1 1 6 1 1 18 11 14 4 7 4
Anexo 3.
Tabela. Tipos sanguíneos nos quais foram identificadas a presença de letinas por meio
de ensaios de hamglutinação
O Tipo sangúneo em negrito onde foi identificada a maior atividade hamaglutinante
Família Semente Nome vulgar
Sangue
Anacardiaceae M. urundeuva Aroeira A, AP,AT,OT
S. brasiliensis Braúna ND
Euphorbiaceae
C. phyllanthus Favela ND
C. sonderianus Marmeleiro ND
R. communis Carrapateira ND
Fabaceae
A. cearenses Cumaru ND
A. colubrina Angicos ND
B. cheilantha Mororó OT
C. ferrea Jucá A,B,BP,BT,O,OT
C. pyramidalis Catingueira ND
C. retusa Crotalária AP,AT,BT,OT
D. grandiflora Diocléia A,AP,AT,B,BT,O,OP,
OT
E. contortisiliquum Tamboril AP,AT,B,BP,BT,O,OP
,OT
F1 A,B,OP,OT
F2 A,AT,B,BP,BT,OP,OT
F3 AP,BT,O
E. velutina Mulungu ND
M. caesalpiniifolia Sabiá OT
M. regnellii Juquiri ND
P. moniliformis Catanduva A,B,O
P. stipulacea Jurema branca A,AP,AT,B,BP,BT,O,
OP,OT
P. viridiflora Jurema jucuri AP,B,O,OT
S. spectabilis Canafístula A,B,BP,OP
Rubiaceae G. americana Jenipapo A,B,OP
Anexo 4.
Figura. Obtenção da fração rica em vicilina de A. colubrina. A. Perfil de eluição da
fração 70-90% de semente de A. colubrina retida em coluna de afinidade de quitina. A
coluna foi previamente equilibrada com tampão Tris-Hcl 0,05M, pH7,5. As proteínas
adsorvidas foram eluidas com glicina 0,1M e as frações protéicas (4ml/tubo) foram
monitoradas a 280nm. B. SDS-PAGE (12%) do EB, fração 70-90% e retido de quitina
(RT) oriundos de sementes de A. colubrina. Marcadores de massa molecular: B-
galactosidade (116,0 KDa); albumina sérica bovina (66,2 kDa), ovoalbumina
(45,0KDa), lactato desidrogenase (35,0 kDa), enzima de restrinção Bsp98 (25,0 kDa),
b-lactoalbumina (18,4 kDa), lisozima (14,4 kDa).
Anexo 5.
Figura . Obtenção da fração rica em vicilina de E. velutina. A. Perfil de eluição da
fração 70-90% de semente de E. velutina retida em coluna de afinidade de quitina. A
coluna foi previamente equilibrada com tampão Tris-Hcl 0,05M, pH7,5. As proteínas
adsorvidas foram eluidas com glicina 0,1M e as frações protéicas (4ml/tubo) foram
monitoradas a 280nm. RQM, retido na quitina de mulungu; B. SDS-PAGE (15%) do
EB, fração 70-90% e retido de quitina (RT) oriundos de sementes de E. velutina.
Glicina 0,1M
B
B
Anexo 6
Figura . Obtenção da fração rica em vicilina de V. ungliculata. A. Perfil de eluição da
fração 70-90 de semente de V. ungliculata. retida em coluna de afinidade de quitina. A
coluna foi previamente equilibrada com tampão Tris-Hcl 0,05M, pH7,5. As proteínas
adsorvidas foram eluidas com glicina 0,1M e as frações protéicas (4ml/tubo) foram
monitoradas a 280nm. RQF, Retido quitina P. vulgaris. B.6. SDS-PAGE (12%) do
extrato bruto (EB), fração 70-90 e retido de quitina (RT) oriundos de sementes de V.
ungliculata..
B
Anexo 7 Artigo aceito para publicação no periódico Parasitology Research em
27/06/2014
Fator de Impacto: 2,85
Evaluation of seed extracts from plants found in the Caatinga biome for
the control of Aedes aegypti
Patrícia Batista Barra Medeiros Barbosa, Julliete Medeiros de Oliveira, Juliana Macêdo Chagas, Luciana
Maria Araujo Rabelo, Guilherme Fulgênio de Medeiros, Raquel Brant Giodani, Elizeu Antunes da Silva,
Adriana Ferreira Uchôa, Maria de Fátima de Freire Melo Ximenes
P. B. B. M. Barbosa; J. M. de Oliveira; L. M. A. Rabelo; E. A. da Silva, A. F. Uchôa Department of Biochemistry, University Federal of Rio Grande do Norte (UFRN).
3000 Avenida Senador Salgado Filho ave , Lagoa Nova, Zip code: 59078 970, Natal, RN, Brazil
P. B. B. M. Barbosa
Department of Biomedical Sciences, Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN).
Rua Atirador Miguel Antônio da Silva Neto st, Aeroporto, Zip code: 59607-360, Mossoró, RN,
Brazil
J. M. Chagas; M. F. F. M. Ximenes * (corresponding author)
Department of Microbiology and Parasitology, UFRN
Telefone: 3215 3126, fax numbers: [email protected]
G. F. de Medeiros
Department of Oceanography and Limnology, UFRN.
Avenida Via Costeira ave, Praia de Mãe Luiza, Zip code: 59014-010, Natal, RN, Brazil
R. B. Giodani
Department of Pharmacy, UFRN
Rua General Gustavo Cordeiro de Farias st, Petrópolis, Zip code: 59010-180, Natal, RN, Brazil
Abstract
Dengue fever, currently the most important arbovirus, is transmitted by the bite of the Aedes aegypti
mosquito. Given the absence of a prophylactic vaccine, the disease can only be controlled by combating
the vector insect. However, increasing reports of resistance and environmental damage caused by
insecticides have led to the urgent search for new safer alternatives. In this regard, plants stand out as a
source of easy-to-obtain biodegradable insecticide molecules. Twenty (20) plant seed extracts from the
Caatinga, an exclusively Brazilian biome, were prepared. Sodium phosphate (50mM pH 8.0) was used as
extractor. The extracts were used in bioassays and submitted to partial characterization. A probit analysis
o insecticides was carried out and intergroup di erences were veri ied by the Student’s t-test and
ANOVA. All the extracts exhibited larvicidal and ovipositional deterrence activity. The extracts of A.
cearenses, P. viridiflora, E. velutina, M. urundeuva and S. brasiliensis were also pupicides, while
extracts of P. viridiflora, E. velutina, A. cearenses, A. colubrina, D. grandiflora, B. cheilantha, S.
spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli and G. americana displayed adulticidal activity. Egg laying was
compromised when females were fed extracts of R. communis, C. sonderianus and S. brasiliensis. At least
two proteins with insecticidal activity were found in all the extracts, Phenol compounds were identified in
all the extracts, and flavonoids, triterpenes or alkaloids in 14 of them. The results show the potential of
plant seed extracts from the Caatinga as a source of active molecules against A. aegypti mosquitos.
Keywords: Larvicide, Pupicide, Adulticide, Ovipositional Deterrence Activity, Gut Homogenate,
Enzyme Inhibitors
Introduction
The Aedes aegypti mosquito (Diptera: Culicidae) is the vector for the etiologic agents of
yellow fever, chikungunya and dengue fever (Chhabra et al. 2008). Immunisation programs have reduced
the risk of yellow fever transmission in endemic countries such as Brazil, although epidemic patterns
have remained in a number of African countries (Vasconcelos 2003; Sá et al. 2009). Chikungunya fever,
although still little known, is a dangerous reemerging arbovirus that can be confused with dengue fever or
malaria. Epidemic outbreaks have occurred in Africa, India and Southeast Asia, but cases in European
and Americans travellers have also been recorded (Weaver and Reisen 2010; Albuquerque et al. 2012).
Dengue fever is currently considered the most important viral vector borne disease. It is
estimated that more than 2.5 billion people live in transmission risk areas (WHO 2013). Dengue fever
was initially described during an epidemic in Philadelphia in 1780 and since then, intermittent pandemics
have affected Asia, Africa and the Americas at 10-30-year intervals (Omena et al. 2007). Outbreaks of
dengue fever have repeatedly occurred in Brazil since the 1980s, after the resurgence of the dengue virus
in the country (Garcez et al. 2009). A total of 1,011,548, 764,032 and 591,384 cases were registered in
2010, 2011 and 2012 respectively, resulting in 1,421 deaths (http://portal.saude.gov.br). The infective
agent is the dengue virus of the family Flaviviridae. Four serotypes have been recognized, denoted DEN-
I, DEN-II, DEN-III, and DEN-IV. Since there is neither a vaccine to prevent infection nor specific drugs
to combat the virus in infected persons, vector control is the most widely used solution for reducing
morbidity (Sá et al. 2009; Chapagain et al. 2008)
The most common accepted method for controlling disease-transmitting insects is the
application of chemical insecticides. Many of these have been successful against both larvae and adult A.
aegypti. Organophosphate, organochlorine and synthetic pyrethroid insecticides are being used in public
health control measures (Patil et al. 2010; Govindarajan et al. 2011; Napoleão et al. 2012). However,
chemical insecticides are not selective and can damage the environment. Moreover, reports of resistance
in different areas worldwide have discouraged their use and spurred efforts to search for new alternatives
to control A. aegypi (Wan-Norafikah et al. 2010; Melo-Santos et al. 2010; Shafie et al. 2012). In this
respect, controlling larvae with natural predators, insect growth regulators and Bacillus thuringiensis
serovar israelenses (Bti) has been suggested and encouraged (Cavalcanti et al. 2007; Fernández et al.
2008; Vasugi et al. 2013). The use of B. thuringiensis is an effective alternative since it involves a non-
polluting biodegradable compound with selective toxicity for invertebrates. However, it is more costly
than synthetic insecticides and its effectiveness is lower in regions with intense sunlight, as observed in a
large part of Brazil (Fernández et al. 2008; Farias et al. 2010).
In recent years interest in identifying plants with insecticidal properties has grown. In
response to excessive herbivory in many insects, plants have developed different protection strategies that
allow their coevolution with predators. These defense mechanisms can be classified as physical (thorns,
teguments, etc) or chemical and may be associated with the presence of constitutive compounds or those
induced by aggression or environmental stimuli (Maffei et al. 2007). Phytochemicals include proteins,
such as lectins, vicilins and enzyme inhibitors (Carlini and Grossi-de-Sá 2002), and non-proteins, such
as lipids and components of the secondary metabolism (alkaloids, flavonoids, saponins, among others)
(Luna et al. 2005; Patil et al. 2011; Rajasekaran and Duraikannan 2012). Several of these molecules have
been isolated and their insecticidal properties have been determined in a number of insects (Macedo et al.
2003; Macedo et al. 2007; Moura et al. 2007; Cruz et al. 2013), including A. aegypti (Chapagain et al.
2008; Sá et al. 2009; Pluempanupat et al. 2013). However, most studies that investigated the action of
plants in controlling A. aegypti used extracts due to low production costs, high biodegradability, and the
different active principles that delay the development of resistance in insects, given that different
compounds could act through different action mechanisms (Luna et al. 2005; Omena et al. 2007; Patil et
al. 2012; Govindarajan et al. 2011; Pontual et al. 2012).
The toxic level of the insecticidal ingredients of each plant extract differs not only between
insects, but can also vary significantly depending on the plant part used, age of the plant and extraction
solvent selected (Luna et al. 2005; Patil et al. 2010). Active extracts against A. aegypti have been
obtained using different plant parts (Luna et al. 2005; Garcez et al. 2009; Govindarajan et al. 2011; Patil
et al. 2010; Medeiros et al. 2013), but few studies have explored the potential of seeds (Farias et al. 2010;
Souza et al. 2011). Organic solvents (Omena et al. 2007; Murugan et al. 2007; Ali et al. 2012; Ravindran
et al. 2012) or even distilled water (Farias et al.2010) have been the main extractors used, but few assays
have used salt as extracting solution (Sá et al. 2009; Napoleão et al. 2012).
Brazil has the greatest biodiversity in the world. The number of species in Brazilian
biomes is still unknown. In relation to higher plants, Brazil is host to about 22% o the world’s species,
with a high degree of endemism (Pessoa et al. 2006). Approximately 70% of northeastern Brazil is
covered by typical vegetation, with a variable floristic and physiognomic pattern known as the Caatinga.
The Caatinga is characterized by xerophytic and deciduous vegetation in which leaf and flower
production is dependent on rainfall, which is very uneven throughout the year, both in terms of volume
and distribution (Araujo et al. 2007; Araujo et al. 2008). However, due to its vast extent, the Caatinga is
home to many little studied natural resources (Albuquerque et al. 2007).
The present study used the seed extracts of 20 Caatinga plants, which were tested for
different aspects of the biological cycle of A. aegypti (larval, pupal and adult survival, egg production and
ovipositional deterrence activity), as well as their environmental toxicity, in assays with Ceriodaphnia
dubia, and cell toxicity in assays with fibroblasts. Finally, the extracts were chemically and biochemically
characterized in order to identify possible active principles.
Methods
Insects
The A. aegypti mosquitos were obtained from a colony housed in the Entomology
Laboratory of the Universidade Federal do Rio Grande do Norte (LABENT-UFRN). To obtain the eggs,
ovitraps were placed in adult breeding cages and after counting, the eggs were submerged in distilled
water, with autoclaved ground rodent ration, in order for them to hatch and obtain larvae and pupae. To
obtain adults, pupae were transferred to roofed cages and after emergence the insects were fed with a
sugar solution (10%). For the blood meal of females, a restrained hamster (Mesocricetus auratus) was
placed in the cage every 48 h for a period of 2 h.
Seeds and crude extracts
The seeds used were donated by Seed Bank of Caatinga, located in the National Forest
(National Forest) Nísia Forest, Nísia Forest City, Rio Grande do Norte (RN), Brazil. The FLONA is one
of environmental conservation units Belonging to Chico Mendes Institute for Biodiversity Conservation
(ICMBio), a municipality of the Brazilian federal government.
This bank receives seeds of other protected areas located in the Brazilian Northeast and
for the conservation of areas of Caatinga. The selected seeds were obtained from two protected areas: the
Esec Seridó, Serra Negra do Norte, RN and Flona Acu, Acu, RN. For seed selection the following
criteria were used to belong to the Caatinga, availability for donation 3kg, ease of handling (some seeds
discarded because its so difficult to crushing hardness).
Twenty seeds were used, two from the family Anacardiaceae (Myracrodruon urundeuva
(Engl.) Fr. All. and Schinopsis brasilienis Engl.), three from the family Euphorbiaceae (Cnidoscolus
phyllanthus (Mull. Arg.) Pax and L. Hoffm, Croton Sonderianus Mull. Arg., and Ricinus communis L.),
fourteen from the family Fabaceae (Amburana cearenses (Fr. Allem.) A. C. Sm., Anadenanthera
colubrina (Vell.) Brenan, Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud, Caesalpinia ferrea Mart., Caesalpinia
pyramidalis Tul., Crotalaria retusa L., Diocleia grandiflora Mart., Erythrina vetulina Willd, Mimosa
caesalpiniifolia Benth., Mimosa regnellii Benth., Piptadenia moniliformis Benth., Piptadenia stipulacea
(Benth.) Ducke, Piptadenia viridiflora (Kunth) Benth., Senna spectabilis (DC.) H.S. Irwin &Barneby and
one from the family Rubiaceae (Genipa americana L.).
Whenever possible, seeds were dehusked and cold milled to obtain finely granulated flour.
Small seeds were ground with the tegument. Crude extract (CE) was obtained after homogenisation under
constant agitation of the flour with 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0, at a ratio of 1:10 (m/v) for 3
h at ambient temperature (27oC). The suspension was then centrifuged at 10,000 x g for 30 minutes at 4
oC. The precipitate was discarded and the CE was identified and used in the assays or stored at -20 oC.
Larvicidal and pupicidal assays
Larvicidal assays were conducted using L1 and L4 larvae. For assays with L1 larvae the
method described by Konishi et al. (2008) was adapted. A total of 20 recently-hatched larvae (maximum
of 4 h) were placed in 24-well cell culture plates with a final volume of 2 mL of distilled water (control)
or CE. Assays with L4 larvae were conducted using adapted WHO (2005) methodology. A total of 20
larvae were transferred to plastic receptacles with a final volume of 20 mL. In both of these assays the
larvae were monitored after 24 and 48 h. Different concentrations of CE were used to obtain LC50 and
LC90 , that is, the CE concentration capable of killing 50% and 90% of insects, respectively, expressed in
mg/mL of dry weight.
For pupicidal assays, 10 pupae were transferred to glass receptacles containing 20 mL of
distilled water (control) or CE and the dead pupae were counted after 24 h. For extracts with more than
80% mortality, additional assays were carried out with different concentrations in order to obtain LC50,
expressed in mg/mL. The insects were considered dead and removed from the assays when they did not
respond to mechanical stimuli. All assays were performed in quadruplicate.
Oviposition deterrence assays
A total of 100 insects, approximately 80 females and 20 males, were transferred to cages
measuring 50 cm (H) x 57 cm (W) x 50cm (D), containing ovitraps with distilled water (control) or CE at
concentrations of 2.5%, 5%, 10%, 15% and 20% (v/v), randomly distributed on the floor of the cage. The
ovitraps were removed every 48 h during the 10-day assay. Assays were performed in triplicate and the
oviposition deterrence index (ODI), calculated for each concentration using the equation below, adapted
from the formulas proposed by Grupta et al. (2011) and Quiroz-Martínez et al. (2012):
where: Nc is the total number of eggs in ovitraps control and Nt is the total number of eggs in ovitraps
test. The index obtained is interpreted as a correlation with a ranger of -100 to +100, with the negative
value representing an attraction and positive value representing repellency or deterrence.
Adulticidal and interference assays in egg laying
For adulticidal assays 30 adult insects (males and females) aged between 1 and 4 days were
transferred to metallic cages (25.5 cm x 25.5 cm x 25.5 cm) covered with a thin wire mesh. A cotton ball
soaked in a 10% sugar solution prepared with distilled water (control) or CE was placed in each cage. The
treatments were repeated every 48h and after 10 days the number of dead insects was counted. For
extracts that resulted in mortality rates above 80%, additional assays were conducted at different extract
concentrations in order to obtain LC50 expressed in mg/mL.
In assays whose extracts do not cause significant adult mortality, a hamster was used as
blood meal for females on the 4th, 6th and 8th day of the experiment. On the 10th day ovitraps were
collected for egg counting and the value was divided by the number of ingurgitated females. All the
assays were performed in triplicate.
Acute ecotoxicity assays with Ceriodaphinia dubia
Ecotoxicity assays were carried out with the microcrustacean Ceriodaphinia dubia
Richard, 1894 (Crustacea, Cladocera). C. dubia was cultured according to ABNT (2005) guidelines .
Around 60 adults were placed into a 1000 mL aquarium, kept under ambient temperature and a controlled
photoperiod regime of 12 h light-12 h dark. They received a daily ration of Tetramin – Tetra ® (10 mg of
ground ration homogenised with 1000 mL of distilled water) and algae and the offspring were removed.
For the assays, 10 one-day-old offspring were transferred to the plastic receptacle
containing 100 mL of distilled water (negative control) or different concentrations of CE. Mortality was
determined after 48 h and confirmed by the lack of response to mechanical stimuli. The assays were
performed in quadruplicate and LC50 was expressed in mg/mL.
Cell toxicity assay
The mouse fibroblast 3T3 cell line (CCL-163) was obtained from the American Type
Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). It was grown in DMEM medium (Dulbecco's
Modified Eagle's Medium), supplemented with 10% fetal calf serum, and streptomycin (5000 mg/mL)/
penicillin (5000 IU) and kept in a sterile environment at 37 ºC with 5% CO2 in a humidified atmosphere.
The cell line was dispensed in 96-well flat-bottomed microtiter plates (TPP products, Switzerland) at a
density of 5 x 103 cells/well. Cells were incubated for 72 h with CE at LC50 concentrations obtained in
larvicidal assays with L4 larvae for 48h. The effect on cell proliferation was determined using the MTT
assay with a plate reader (Mosmann 1983).
Partial characterisation of extracts
To determine total soluble solutes, 15 mL test tubes were weighed and filled with 5 mL of
CE. After lyophilisation, the tubes were weighed again and the difference in weights represented total
soluble solutes in mg/mL. The Bradford (1976) assay, was used to measure protein dosage in 96-well
microplates, absorbance was read at 595 nm, and a standard curve was generated using albumin bovine
serum (Sigma). Total carbohydrate dose was estimated by the Dubois et al. (1956) method in 96-well
microplates, absorbance was read at 490 nm and a standard curve of D-(+) glucose (Sigma) was used.
The dose of total phenolic compounds was calculated in accordance with methodology described by
Correia et al. (2004), absorbance was read at 765 nm and a standard curve was generated using gallic acid
monohydrate (Sigma).
To detect chitin-binding proteins, 15 mg of protein extract was submitted to affinity
chromatography using chitin (Sigma C9213) as stationary phase (20 mL). The columns were balanced
with 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0, and the adsorbed proteins were eluted with 100 mM HCl.
Absorbance was read at 280 nm. Peaks with absorbance above 0.300 nm were dyalised and measured to
determine the contents of chitin-binding proteins in mg/mL of CE.
To identify the presence of secondary metabolites, the extracts were lyophilised, diluted in
methanol and successively applied to TLC (thin-layer chromatography) chromoplates with the following
specifications: silica gel 60 F254, 20X20 cm (Fertigfolien Alugram ® Sil G/UV254). Each of the
chromoplates was revealed with one of the following reagents: sulphuric vanillin, Dragendorff, ferric
chloride, natural reagent A (0.5% diphnylboryloxyethylamine in methanol), ninhydrin and 10% sulphuric
acid. All the plates, except the one developed by reagent A, were visualised after heating. The plate with
reagent A was visualised under UV-365 light.
SDS-PAGE
The protein profile of CE was obtained by electrophoresis in in the presence of
sodiumdodecyl sulphate (SDS-PAGE) and was performed on 12% (w/v) gel in accordance with the
Laemmli (1970) method.
Haemagglutination assays
Haemagglutination assays were conducted with the CE and adsorbed proteins by chitin
affinity chromatography. Blood types A, B and O, donated by the authors of the study, were previously
treated or not with trypsin enzymes (1 mg/mL) and papain (1 mg/mL) at a ratio of 1:1 (v/v). The tests
were carried out by serial dilution in 96-well V-bottom microplates. Each well was added with 25 µL of
CE and 25 µL of erythrocyte suspension at a final haematocrit of 4%. The negative control was
performed with a 15 mM saline solution. The plate was incubated for 1 h at 27 oC. The presence of
agglutination was determined by direct visualisation and expressed as haemagglutinating activity, which
corresponds to haemagglutination units (HU), divided by the amount of protein in the assay. The HU
corresponds to the inverse of the highest dilution in the sample that exhibited a clear agglutination pattern.
Inhibitory assays
Digestive enzyme inhibitors were identified using the following enzymes: trypsin from
bovine pancreas (EC 3.4.21.4, type III, 10,600 U/mg protein, Sigma), chymotrypsin from bovine pancreas
(TLCK treated, typo VI, 67 U/mg protein, Sigma), amylase from porcine pancreas (type: VI – B
A31761MU, 25 U/mg solid, Sigma), and specific digestive enzymes from A. aegypti, originating in the
intestinal homogenate from L4 larvae (IHL) and intestinal homogenate from adults (IHA).
The IHL and IHA were prepared according to methodology established by Terra et al.
(1977) with modifications. To obtain IHL, we used 100 intestines from L4 larvae/mL of 50 mM sodium
phosphate buffer, pH 8.0 and for IHA, 500 intestines from adult males or females/mL of buffer. Assays
were conducted in quadruplicate with negative and positive controls, using 200 µg of proteins CE. The
inhibitor unit (IU) was always 0.01 and since specific activity was considered the relationship between
the IU and the amount of protein used in the assay.
Antitryptic activity was determined using BApNA (Nα-benzoyl-DL-arginine4-nitroanilide
hydrochloride (EC 213-011-2, Sigma) as substrate. The trypsin bovine solution (0.3 mg/mL) was pre-
incubated for 10 minutes at 37 °C, with 120 µL of 2.5 mM HCL, 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5 and
aliquots of CE. Next, 200 µL of substrate was added, and after 15 minutes the reaction was interrupted,
adding 300 µL of 30% acetic acid. Absorbance was measured in a spectrophotometer at 410 nm.
Antitryptic activity from IHL was similarly analyzed, but without adding the activation solution
containing 2.5 mM HCL and using 50 mM sodium phosphate, pH 8.0, as buffer.
Antichymotrypsin activity was determined using 1% azocasein (Sigma) as substrate. The
solution of chymotrypsin bovine (0.2 mg/mL) was pre-incubated with 50 mM Tris-HCL + 20 mM CaCl2
buffer and with aliquots of CE for 15 minutes at 37 °C. The enzymatic substrate was then added and after
30 minutes the reaction was interrupted, adding 300 µL of 20% TCA solution. The reaction mixture was
centrifuged at 12,000 x g for 10 minutes and the supernatant was alkalinised with NaOH 2N at a ratio of
1:1. Absorbance was measured in a spectrophotometer at 440 nm. IHL Antiprotease activity from IHL
was similarly analyzed, but using 50mM sodium phosphate, pH 8.0, as buffer.
Antiamylase activity was conducted applying the dinitrosalysilic acid method (Ali et al.
2006), using 0.5% starch as substrate and a maltose standard curve (0 – 0.1% p/v).
Data analysis
The results were expressed as mean ± standard deviation. StatPlus 2009 software
(Analyst Soft Canada) was used for statistical analysis of larvicidal, adulticidal and pupicidal assay data.
The CE concentration required to kill 50% (LC50) and 90% (LC90) of insects in mg/mL of dry weight was
calculated by probit analysis with a 95% confidence interval (Finney 1971). Origin 8.0 software
(Microcal, Northampton, USA) was used to obtain regression equations (y= mortality; X= concentration)
and regression coefficients. A significant intergroup difference was detected by the Student’s t-test and
ANOVA (P < 0.05). For each of the biological assays, extracts were ranked (1-20) according to their
efficacy in the respective test. The rankings of all the tests were compared to obtain a final classification
that allowed us to identify the extracts with the greatest potential for controlling A. aegypti, considering
the different parameters analysed.
Results
All the CEs showed larvicidal activity (Table 1). For CEs of C. phyllanthus, C. sonderianus
and C. ferrea all L1 and L4 larvae died only after 48 h of exposure. Although the CEs of B. cheilantha, C.
retusa, D. grandiflora, P. moniliformis and S. spectabilis killed all L1 larvae after 24 h, they only killed
100% of L4 larvae after 48 h of exposure. Only the CE of G. americana did not kill all the larvae, even
after 48 h of exposure.
The susceptibility of the larval stage depended on the CEs used (Table 1). In assays with R.
communis, A. cearenses, C. ferrea, C. pyramidalis, C. retusa, D. grandiflora, E. vetulina and P.
moniliformis, L1 larvae were more susceptible than L4 larvae after 48 h of exposure. However, for CEs of
S. brasiliensis, B. cheilantha, M. caesalpiniifolia and S. spectabilis, L4 larvae were more susceptible. The
other CEs showed no significant difference in susceptibility in the larval stage. Considering the results of
all tests larvicides (L1 in 24h and 48h, L4 in 24h and 48h) it was found that the extracts of M.
urundeuva, P. viridiflora, E. vetulina, and A. cearenses were the most promising whereas extracts of C.
ferrea, C. retusa and G. americana had lower scores (Table 2).
The extracts were also analysed for their capacity to inhibit pregnant A. aegypti from laying
eggs in the ovitraps when these extracts were diluted in water at different concentrations and offered
simultaneously. It was found that all the extracts were dose-dependent repellents. The ODI values (Table
1) at the concentration of 2.5% showed that B. cheilantha and P. moniliformis extracts reached the highest
IOD. At the concentration of 20% with P. stipulacea, M. urundeuva, B. cheilantha, P. moniliformis, M.
caesalpiniifolia and S. spectabilis indices greater than 90% were obtained.
Some of the extracts displayed two behaviours, that is, they were attractive at low
concentrations and began to inhibit with an increase in concentration. Extracts of D. grandiflora, A.
cearenses, C. ferrea and C. retusa were attractive up to concentrations of 2.5%, 5%, 10% and 15%,
respectively (Fig. 1). Attractability and mortality values of L1 larvae show that up to an attractive
concentration, C. retusa (6,92 mg/mL) does not cause death in L1 larvae (Fig. 2a). The attractive
concentrations of D. grandiflora (0,97 mg/mL) and C. ferrea (4,54 mg/mL) extracts led to death in
13.4% and 21.2% of L1 larvae respectively (Fig. 2b e Fig. 2c), after 48h of exposure, while CE of A.
cearenses at an attractive concentration of 5% (2,58 mg/mL) can kill 100% of L1 larvae in the first 24h
of exposure (Fig. 2d).
Pupicidal activity was observed in five of the twenty extracts tested (Fig. 3). Mortality was
elevated in pupae incubated with A. cearenses (93.3% ± 11.5) and P. viridiflora extracts (83.3% ± 10.0),
whose LC50 was 19.48 mg/mL and 20.20 mg/mL respectively. The CEs of E. velutina, M. urundeuva and
S. brasiliensis were also responsible for the death of 76.6% (± 5.7), 66.6% (± 5.3) and 46.6% (± 7.91) of
pupae respectively.
In assays with adults, it was found that ten extracts were adulticidal (Fig. 4), and mortality
was high for insects that feed on extracts of P. viridiflora (100%), E. velutina (100%), A. cearenses
(95.6% ± 3.50) and A. colubrina (94.6% ± 4.64), whose LC50 was 5.89 mg/mL (±1.02), 12.08 mg/mL
(±0.98), 5.71mg/mL (±0.79) and 13.26 mg/mL (±2.67) respectively. Other extracts with adulticidal
activity were D. grandiflora (78.4% ± 2.4), B. cheilantha (69.0% ± 7.7), S. spectabilis (67.2% ± 0.5), C.
pyramidalis (46.6% ± 16.3), M. regnelli (44.6% ± 11.9) and G. americana (38.7% ± 12.1). Extracts
that did not cause death in adults were tested to determine their effects on egg laying in females
previously fed the extracts. A significant reduction was observed in the egg production of females fed R.
communis, C. sonderianus and S. brasiliensis extracts (Fig. 5).
The toxicity of CEs was analysed in ecotoxicity assays using C. dubia and cell toxicity
using fibroblasts. In assays with C. dubia all the CEs were toxic for microcrustaceans, with the CEs of G.
americana (4.12mg/mL), S. brasiliensis (1.91mg/mL), C phyllanthus (1.82mg/mL), C. sonderianus
(1.57mg/mL) and A. cearenses (1.25mg/mL) exhibiting the highest CL50 values, whereas the CEs of
Mimosa regnelli (0.01mg/mL), S. spectabilis (0.02mg/mL), E. vetulina (0.03mg/mL), R. communis
(0.03mg/mL) B. cheilantha (0.04mg/ml) and M. caesalpiniifolia (0.04mg/mL) were the most toxic
(Table 1). In cell cytotoxicity assays it was found that the CEs of E. velutina, A. cearenses and P.
stipulacea did not interfere in fibroblast viability (Fig. 6).
Considering the results obtained in all the biological tests it was found that extracts A.
cearenses, P. viridiflora, S. brasiliensis, E. vetulina and M. urundeuva were the most promising whereas
extracts of S. spectabilis, C. ferrea, and C. retusa scored lower (Table 2).
The extracts tested were partially characterised in terms of their soluble solutes, protein,
carbohydrate and phenolic compound content (Table 3) and electrophoretic profile (Fig. 7). Moreover, 14
of the extracts exhibited some of the secondary metabolites: flavonoids, triterpenes, and/or alkaloids
(Table 2) and all contained protein with insecticidal potential, either chitin-binding proteins, lectins and/or
digestive protease inhibitors (Tables 3 and Table 4).
All the extracts showed the presence of chitin-binding proteins, such as C. pyramidalis
(1.536mg/mL) and C. ferrea extracts (1.289mg/mL), followed by extracts of E. vetulina (0.317mg/mL),
C. retusa (0.290 mg/mL), A. cearenses (0.228 mg/mL), P. stipulacea (0.193 mg/mL), A. colubrina (0.162
mg/mL) and D. grandiflora (0.105 mg/mL), with levels above 100µg/mL. Extracts of R. communis (0.003
mg/mL), M. urundeuva (0.009 mg/mL), G. americana (0.013 mg/mL), B. cheilantha (0.014 mg/mL) and
C. phyllanthus (0.019 mg/mL) exhibited values below 20µg/mL. Lectins were identified in eleven
extracts (Table 2), with the highest haemagglutination activities observed in extracts of D. grandiflora
(blood group B treated with trypsin), S. spectabilis (blood group A treated with papain), C. retusa (blood
group A treated with papain and trypsin) and E. vetulina (blood groups A and P treated with papain and B
and O treated with trypsin). In extracts of D. grandiflora (blood groups A, B and O not treated and A and
O treated with papain and trypsin and B treated with trypsin), C. ferrea (blood group B treated with
papain) and E. vetulina (blood group O treated with papain) chitin-binding lectins were identified.
All extracts contained some type of enzymatic inhibitor (Table 4). Bovine pancreatic
trypsin and IHL trypsin inhibitors were not identified in extracts of B. cheilantha, M. regnellii, P.
stipulacea and S. spectabilis. Despite inhibitory activity for bovine trypsin, extracts of S. brasiliensis and
P. viridiflora did not inhibit IHL trypsin, while the inverse was observed for C. sonderianus extract. IHL
inhibitions greater than 80% (Fig. 8a) were observed in extracts of M. urundeuva (99.71% ± 0.29), C.
ferrea (97.70% ± 3.28), A. cearenses, (96.31% ± 1.76), G. americana, (93.94% ± 8.53), R. communis
(93.08% ± 2.02), E. velutina (87.02% ± 2.60) and C. phyllanthus (85.99% ± 11.34).
Bovine chymotrypsin and IHL protease inhibitors were identified in all the extracts, with
higher specific activity for IHL proteases than for commercial chymotrypsin (Table 4). Extracts with
greater inhibitory activity for IHL, using azocasein as substrate (Fig. 8b) were E. vetulina (98.71% ±
0.22), P. stipulacea (98.10% ± 0.12), M. regnellii (97.85% ± 0.74), P. viridiflora (96.77% ± 2.75), C.
pyramidalis (94.80% ± 1.02), P. moniliformis (90.86% ± 3.54), G. americana (89.39% ± 3.99), and B.
cheilantha (86.52% ± 5.71).
With respect to amylase inhibitors, it was found that they were absent only in extracts of C.
sonderianus, A. colubrina, C. ferrea and M. caesalpiniifolia, and, although they did not exhibit inhibitory
activity for swine amylase, P. moniliformis, and A. cearenses extracts were capable of inhibiting IHL
amylase. Inhibition of IHL amylase was less than that observed for serine proteases, and only extracts of
M. urundeuva, C. phyllanthus and S. brasiliensis showed inhibition above 50% (Fig. 8c). Inhibition of
IHA was only studied in extracts with adulticidal activity, which was not found only in A. colubrine
extract. However, in none of the extracts was inhibition higher than 50% (Fig. 8d).
Discussion
The use of naturally occurring compounds from plant sources has shown promising
potential for commercial insecticides (Pluempanupat et al. 2013). However, insecticides of plant origin
have been extensively used on agricultural pests and to a very limited extent, against insect vectors of
public health importance (Rajasekaran and Duraikannan 2012).
The CEs of Caatinga plants were prepared using seeds as raw material. Although they have
been little investigated, seeds are specialised in accumulating molecules that ensure development and,
consequently, defend the embryo against different types of aggression, such as insect pest attack (Farias et
al. 2010; Souza et al. 2011). Furthermore, seeds are generally easy to obtain and can be stored for long
periods.
The sodium phosphate buffer was used as extractor in order to favor solubilisation of
globulin proteins, such as lectins, vicilins and protease inhibitors, many of which has recently been
recognized as important molecules for plant defense (Mota et al. 2003; Sá et al. 2009; Moura et al. 2007).
The buffer was selected after it was shown not to be toxic to A. aegypti in any of its development stages,
in contrast to that observed for Borax and Tris-HCl buffers, which were larvicidal (data not shown). The
CEs solubilised proteins with contents varying between 0.62 mg/mL (S. brasiliensis) and 17.34 mg/mL
(C. ferrea) and all the CEs contained proteins with insecticidal potential. In comparison with the CEs
obtained with distilled water (Farias et al. 2010), the use of a buffer raised protein contents for the CEs of
C. ferrea and A. cearenses seeds. Furthermore, extraction with the buffer also allowed solubilisation of
secondary metabolism compounds, since all the extracts exhibited phenolic compounds, while flavonoids,
triterpenes or alkaloids were identified in 70% of them.
Larvicidal assays, conducted with first (L1) and last-stage (L4) larvae, showed a difference
in larval stage susceptibility. Although L1 has been more susceptible in most assays (Murugan et al.
2007; Coelho et al. 2009; Patil et al. 2011; Gupta et al. 2011), they were more resistant in a few of them
(Pontual et al. 2012). All the extracts analysed were larvicidal and, except for the G. americana extract,
resulted in a 100% death rate in some of the stages under study. The aqueous extract of Moringa oleifera
seeds killed 45% of A. aegypti larvae after 72h incubation (Coelho et al. 2009), a value below that
observed for all the extracts used in the present investigation. In a study with water extracts of Caatinga
leguminous seeds, larvicidal activity was found in 16 extracts, but only five achieved 100% mortality
(Farias et al. 2010). As observed in the present study, water extracts of P. moniliformis, A. cearenses and
C. ferrea caused death in 100%, 100% and 85.9% of A. aegypti larvae, respectively. However, water
extracts of E. velutina (75.1% mortality) were less efficient (Farias et al. 2010) than the CE obtained
with sodium phosphate buffer (100% mortality). In another study with 21 ethanolic seed extracts of plants
from northeastern Brazil, only M. urundeuva and S. brasiliensis extracts achieved 100% mortality after
24h and those of A. cearenses and P. moniliformis killed 25.0% and 47.5% of larvae respectively (Souza
et al. 2011), whereas in the present study this CE killed 100% in the same period.
The extracts with the greatest larvicidal potential were the CEs of M. urundeuva, P.
viridiflora, E. vetulina, A. cearenses and M. regnellii. Earlier studies found larvicidal activity in M.
urundeuva, a plant with a number of medicinal uses widely found in northeastern Brazil. These studies
were carried out using extracts prepared with NaCl, and bark (CL50, 8.81mg/mL of protein), heartwood
(CL50, 14.86 mg/mL of protein) (Sá et al. 2009) and leaves (CL50, 10mg/mL of protein) (Napoleão et al.
2012) as raw materials, but exhibiting higher CL50 than that obtained in the present research. The
larvicidal potential of bark, heartwood and leaf extracts of M. urundeuva was attributed to the presence of
lectins with chitin affinity, also identified in the CE of E. vetulina, C. ferrea and D. grandiflora. Lectins
are haemagglutination proteins widely found in plants and, although their action mechanism is not fully
understood, it has been suggested that lectins with affinity for chitin could recognise residues from
acetylglucosamine in the peritrophic membrane, compromising its integrity and resulting in the insect’s
death (Macedo et al. 2007; Coelho et al. 2009). Lectins with entomotoxic activity for several groups of
insects have been isolated (Macedo et al. 2003; Macedo et al. 2004; Kaur et al. 2006; Macedo et al.
2007). In addition to lectins, other entomotoxic proteins with affinity for chitin, such as vicilins, have
been described (Sales et al. 2001; Macedo et al. 2008). Proteins with affinity for chitin were found in all
the CEs of the seeds investigated in this study.
However, in contrast to the lectins found in bark, heartwood and leaves of M. urundeuva,
lectins from M. urundeuva seeds, as well as those found in B. cheilantha, C. ferrea, C. retusa, D.
grandiflora, E. vetulina, M. regnellii, P. stipulacea, P. viridiflora, S. spectabilis and G. americana
showed no affinity for chitin. Lectins with affinity for other carbohydrates can also exhibit insecticidal
activity by resisting proteolysis and binding to glycosylated proteins in the peritrophic matrix or digestive
enzymes (Carlini and Grossi-de-Sá 2002; Macedo et al. 2007]. Lectins from the M. urundeuva leaf
reduced the trypsin-like enzyme activity of A. aegypti larvae (Napoleão et al. 2012).
Larvicidal activity for A. aegypti of aqueous extract from the Moringa oleifera flower was
recently demonstrated (Pontual et al. 2012). SDS-PAGE confirmed the presence of a single protein
component in this extract that was able to inhibit more than 70% of the trypsin enzymes in IHL. Unlike
that observed in the extract of the M. oleifera flower, the electrophoretic profiles of the extracts obtained
here revealed that all, except for the extract of M. urundeuva, contained a number of protein components,
and all were capable of interfering (in vitro) in the digestive process of A. aegypti larvae. Several A.
aegypti larva digestive enzymes have been identified, including endoproteases or serine proteases, which
comprise trypsin enzymes, the most abundant, and chymotrypsins (Mesquita-Rodrigues et al. 2011), in
addition to exopeptidases (Isoe et al. 2009b) and amylases (Grupta et al. 2011). These enzymes act in the
digestive process, as well as in oogenesis and metamorphosis (Mesquita-Rodrigues et al. 2011).
Moreover, it has been previously documented that protein inhibitors have a detrimental effect on insect
development and larval survival, functioning as a powerful and useful tool in insect control (Carlini and
Grossi-de-Sá 2002; Sumikawa et al. 2010;Souza et al. 2011).
In the present study we identified enzymatic inhibitors from two perspectives. We
conducted inhibitory assays using commercial enzymes (bovine trypsin, bovine and swine amylase), and
others using a pool of digestive enzymes from A. aegypti larvae, since a same inhibitor has been shown to
have different effects on enzymes of varying origin (Pontual et al. 2012). In assays with commercial
enzymes we found that the CE of C. sonderianus only inhibited one type of enzyme (chymotrypsin),
whereas the other 19 extracts exhibited at least two different inhibitory activities. This finding is quite
relevant, since the use of proteinaceous inhibitors has limitations because insects are capable of
modifying their digestive enzymes in response to the antimetabolic effects of these molecules. However,
regulatory imbalance of protease activity can guarantee the insect’s death if several enzymes were to be
inhibited at the same time (Pontual et al. 2012), as may have occurred with some of the proposed extracts.
In inhibitory assays with specific digestive enzymes of A. aegypti larvae, all the extracts
reduced proteolytic activity of IHL between 27.8 and 98.7% and 14 extracts (70%) inhibited trypsin
enzymes by 23.5 to 99.7%, while extracts of M. urundeuva C. ferrea, A. cearenses G. americana, R
communis E. vetulina C. phyllanthus exhibited inhibitory activity of more than 70%. Amylase inhibitors
were found in 16 (80%) extracts; however, only M. urundeuva, C. phyllanthus and S. brasiliensis extracts
inhibited more than 70% of IHL enzymes. Larvicidal activity has been demonstrated for a purified α-
amilase inhibitor of Macrotyloma uniflorum seeds (Grupta et al. 2011).
We observed that an increase in exposure time raised larval mortality. This fact, associated
with the abundant presence of inhibitors in the seeds, suggests that enzyme inhibitors significantly
contributed to larval mortality, given that proteinaceous inhibitors usually do not cause acute toxicity in
insects (Carlini and Grossi-de-Sá 2002; Pontual et al. 2012). It is important to underscore that secondary
metabolism components, including triterpenes and phenolic compounds, such as flavonoids, present in a
number of extracts, can also act as enzyme inhibitors in synergy with protein inhibitors (Maliar et al.
2004).
Larvae are the primary targets of insecticides because insects in this phase are restricted to
domestic breeders. However, control of A. aegypti can be increased using strategies that also have an
impact on other development phases, given that if an insecticide reaches its target at different life stages
(for ex. larvae X pupae or larvae X adults), its alternate use may delay resistance (Grupta et al. 2011;
Wirth 2010). As such, we also investigated whether the extracts of the seeds analysed had additional
properties that could contribute to reducing the number of insects. In addition to larvicides, extracts of A.
cearenses, P. viridiflora, E. velutina, M. urundeuva and S. brasiliensis can also reduce the number of
pupae. Since pupae do not feed, the action mode of a pupicidal substance is due to absorption of toxic
compounds through the body surface or damage to respiratory trumpets (Souza et al. 2011; Grupta et al.
2011). Pupicidal activity was also reported for ethanolic seed extracts of A. cearenses, S. brasiliensis,
M. urundeuva and P. moniliformis (Souza et al. 2011).
Elevated mortality was also observed when adult A. aegypti were fed extracts of P.
viridiflora (100%), E. velutina (100%) and A. cearenses (95.6% ± 3.50), indicating that these CEs contain
different action mechanisms, that is, both contact and ingestion toxicity. Furthermore, extracts of A.
colubrina, D. grandiflora, B. cheilantha, S. spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli, and G. americana
were also adulticidal.
Since inhibition of serine proteases did not significantly contribute to adult mortality,
although it may compromise the reproductive process by reducing female fecundity (Isoe et al. 2009a;
Soares et al. 2011), amylase inhibition assays for IHA were conducted only in CEs with adulticidal
properties. The results obtained show amylase inhibition in all the CEs tested, except A. colubrine extract,
varying between 9.2% and 35.7%, and lower than that observed for larvae (Grupta et al. 2011).
Although extracts of R. communis, C. sonderianus and S. brasiliensis did not interfere in
insect validity, they resulted in a reduction of egg production in ingurgitated females, a strategy that may
also contribute to reducing the insect population.
We found that all extracts exhibited dose-dependent ovipositional deterrence activity when
added to ovitraps as also observed by Coria et al. (2011). However, CE of A. cearenses at low
concentrations, may entice females to lay in the ovitraps, and kill emerging L1 larvae in the first 24h of
exposure.
Although it is expected that plant extracts are biodegradable and pose low risk to other
living beings, toxicity tests must always be conducted in order to guarantee the safety of the proposed
products. Two approaches were used in the present study, one related to environmental safety, with
survival of another aquatic species as criterion (assays with C. dubia), and the other related to mammal
safety (cell toxicity assay with fibroblasts). For the first assay C. dubia was selected for its higher
sensitivity to a range of compounds compared to other aquatic invertebrates, including Artemia.
Moreover, it has also been used worldwide as a bioindicator organism for the presence of chemical
contaminants, especially insecticides, in river waters and soils (Shen et al. 2012). As expected, C. dubia
was more sensitive to different extracts than A. aegypti larvae. However, C. dubia and A. egypti inhabit
different environments. Whereas A. aegypti larvae procreate in artificial breeders, generally with small
amounts of water, C. dubia is found in lakes, ponds and freshwater marshes, and if the CEs reach these
ecosystems without being totally degraded, they will be diluted in fluvial waters. In this respect a 1:10
dilution is enough for extracts of A. cearenses, P. viridiflora and M. urundeuva to exhibit higher LC50 for
C. dubia than for A. aegypti larvae. In turn, LC50 for the CE of E. velutina, A. cearenses and P. stipulacea
for A. aegypti larvae did not interfere in fibroblast viability.
Conclusions
The sodium phosphate buffer was effective extractor and all extracts prepared with
Caatinga plant seeds showed potential in controlling A. aegypti, given that all act as larvicides and egg-
laying inhibitors in ovitraps. More than half of the extracts studied were also capable of acting in other
insect development phases (pupa, adult, egg laying). Noteworthy CEs among the twenty analysed were
extracts of A. cearenses, P. viridiflora, S. brasiliensis, E. velutina and M. urundeuva. Particularly
prominent was A. cearenses extract, which, in addition to elevated larvicidal, pupicidal, adulticidal and
dose-dependent attractive/ deterrence activity, exhibited no cell toxicity and low environmental toxicity.
Additional field tests are being carried out to determine the efficacy of this CE.
The CEs also contained a wide variety of proteins with insecticidal potential, such as chitin-
binding proteins, lectins and enzyme inhibitors. Further assays are being conducted to isolate and confirm
the insecticidal properties of these isolated or conjugated molecules.
Acknowledgements
We are grateful to the team from the Floresta Nacional de Nisia Floresta, Rio Grande do Norte, Brazil, a
Federal Conservation Unit managed by the ICMBio - Chico Mendes Unit for Biodiversity Conservation,
for donating and identifying the seeds.
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Figures
Fig. 1 oviposition deterrence index (OID) for pregnant A. aegypti of crude extracts of plant seeds
Caatinga in different concentrations (v / v)
Fig..2 Mortality of L1 larvae A. aegypti incubated with crude extracts (CE) seeds of C. retusa (a) D.
grandiflora (b) C. ferrea (c) and A. cearenses (d) which showed attractive activity for posture
females. The dotted line indicates the concentrations of CE able to attract females for egg positions.
Fig. 3 Mortality of A. aegypti pupae incubated with crude seed extracts for 24h. . Different letters
indicate significant differences between treatments. ANOVA (P <0.05).
Fig. 4 Mortality of A. aegypti adults fed for 10 days with crude seeds extract of Caatinga plants .
Different letters indicate significant differences between treatments. ANOVA (P <0.05).
Fig. 5 Number of eggs per female A. aegypti fed with crude seeds extracts of Caatinga plants (10
days), devoid of adulticide properties. Different letters indicate significant differences between
treatments. ANOVA (P <0.05).
Fig. 6 Cell viability of mouse 3T3 fibroblast after incubation for 72 h with CE at LC50 obtained in
larvicidal assays with L4 larvae for 48h. The effect on cell proliferation was determined using the
MTT
Fig. 7 SDS-PAGE (12%) of CEs from Caatinga plant seeds
Mu= M. urundeuva; Sb= S. brasiliensis; Cp= C. phyllanthus; Cs= C. sonderianus; Rc= R.
communis; Ac= A. cearenses; Aco= A. colubrina; Bc= B. cheilantha; Cf= C. ferrea; Cp= C.
pyramidalis; Cr= C. retusa; Dg= D. grandiflora; Ev= E. vetulina; Mc= M. caesalpiniifolia; Mr= M.
regnellii; Pm= P. moniliformis; Ps= P. stipulacea; Pv= P. viridiflora; Ss= S. spectabilis; Ga= G.
america. Low Weight molecular-marker: Fosforilase B (97 kDa), Soroalbumina bovina (66 kDa),
Ovalbumina (45 kDa), Anidrase carbônica (30 kDa), Inibidor da tripsina (20.1 kDa) e α-
Lactalbumina (14.1kDa).
Fig. 8 Inhibition of the proteolytic activity of intestinal homogenate of larvae (IHL) and intestinal
homogenate of adults (IHA) after incubation with crude seed extract. The tests were performed using
200 mg of proteins.
Table 1. Larvicidal and oviposition deterrence activity (ODI) of Caatinga crude seed extracts against A. aegypti
Family Seeds Common
name
L1 L4
ODI2,5% ODI20% 24 h 48 h 24 h 48 h
M LC50 M LC50
M LC 50
M LC 50 LC 90
Anacardiaceae M. urundeuva Aroeira 100 0.33 100 0.24 100 1.33 100 0.37 1.54 27.78 98.47
S. brasiliensis Brauna 100 6.01 100 5.00 100 6.14 100 1.00 10.37 25.44 51.10
Euphorbiaceae
C. phyllanthus Favela 45.8 13.62 100 9.08 72.9 11.70 100 8.39 11.63 10.26 41.32
C. sonderianus Marmeleiro 47.3 20.09 100 11.15 86.9 13.94 100 12.12 18.16 34.37 84.86
R. communis Carrapateira 100 3.12 100 2.35 100 8.36 100 6.58 26.13 32.96 72.30
Fabaceae
A. cearenses Cumaru 100 1.17 100 0.83 100 3.06 100 1.46 2.66 -33.99 41.89
A. colubrina Angicos 100 2.41 100 1.99 100 2.90 100 2.15 3.83 30.03 88.65
B. cheilantha Mororó 100 11.55 100 6.06 80.5 14.36 100 0.94 8.78 63.72 96.51
C. ferrea Jucá 82.9 20.51 100 12.02 35.6 68.22 100 19.81 32.01 -26.70 6.11
C. pyramidalis Catingueira 100 15.54 100 8.91 100 12.60 100 12,64 26.47 17.33 50.79
C. retusa Crotalaria 100 14.51 100 14.10 26.4 132.44 100 23.34 40.06 -11.29 12.13
D. grandiflora Diocléia 100 7.53 100 4.60 15.9 115.93 100 9.20 22.35 -18.56 21.06
E. vetulina Mulungu 100 0.52 100 0.18 100 3.69 100 1.61 8.03 7.33 64.04
M. caesalpiniifolia Sabiá 100 4.51 100 3.81 100 4.78 100 1.53 2.45 51.85 92.09
M. regnelli Juquiri 100 3.01 100 0.52 100 6.83 100 0.61 6.42 31.78 80.55
P. moniliformis Catanduva 100 3.07 100 2.83 80.8 35.44 100 7.37 12.64 54.43 95.13
P. stipulacea Jurema branca 100 2.76 100 1.67 100 2.13 100 1.61 7.42 28.60 99.42
P. viridiflora Jurema jucuri 100 0.84 100 0.84 100 0.87 100 0.75 3.35 25.44 57.26
S. spectabilis Canafístula 100 20.86 100 9.29 51.3 33.30 100 3.69 22.77 37.73 91.52
Rubiaceae G. americana Jenipapo 10.0 159.22 54.5 23.56 3.3 29.78 54.8 25.53 35.91 50.86 78.36
M Percentage of dead larvae after exposure to CE, LC50 CE concentration in mg/mL needed to kill 50% of the larvae of A. aegypti, LC90 CE concentration in mg/mL needed to
kill 50% of the larvae of A. aegypt
Table 2. Ranking of crude seed extracts of plants of Caatinga in biological assays
Larvicidal
ODI Attraction of
female and larval death
Pupicidal Adulticidal Egg
laying
Cell toxicity Ecotoxicity
for C. dubia
L1 L4
Total Semente 24 h 48 h 24 h 48 h Total 2,5% 20% Total LC50 LC90 Total
M. urundeuva 20 19 19 20 20 10 19 15 0 17 0 0 16 12 15 10 77
S. brasiliensis 10 9 13 16 12 9 7 9 0 16 0 20 8 15 12 19 88
C. phyllanthus 7 6 10 7 8 6 4 5 0 0 0 0 9 13 11 18 42
C. sonderianus 4 4 8 5 4 15 13 14 0 0 0 19 2 2 2 17 56
R. communis 12 13 11 9 11 14 10 10 0 0 0 18 5 11 7 12 58
A. cearenses 17 17 16 15 17 1 5 4 20 20 18 0 19 19 19 16 114
A. colubrina 16 14 17 11 14 12 14 12 0 0 17 0 12 8 9 6 58
B. cheilantha 8 8 7 17 10 20 18 20 0 0 15 0 3 3 3 5 53
C. ferrea 3 3 3 3 3 2 1 1 0 0 0 0 13 19 17 15 36
C. pyramidalis 5 7 9 4 6 7 6 6 0 0 13 0 14 10 13 9 47
C. retusa 6 2 1 2 2 4 2 3 0 0 0 0 11 17 14 11 30
D. grandiflora 9 10 2 6 7 3 3 2 0 0 16 0 6 6 6 13 44
E. vetulina 19 20 15 13 18 5 9 7 0 18 19 0 20 20 20 3 85
M. caesalpiniifolia 11 11 14 14 13 18 16 18 0 0 0 0 10 9 8 4 43
M. regnellii 14 18 12 19 16 13 12 11 0 0 12 0 17 4 10 1 50
P. moniliformis 13 12 4 8 9 19 17 19 0 0 0 0 7 5 5 14 47
P. stipulacea 15 15 18 12 15 11 20 17 0 0 0 0 18 16 18 7 57
P. viridiflora 18 16 20 18 19 8 8 8 0 19 20 0 15 14 16 8 90
S. spectabilis 2 5 5 10 5 16 15 16 0 0 14 0 1 1 1 2 38
G. americana 1 1 6 1 1 17 11 13 0 0 11 0 4 7 4 20 49
ODI oviposition deterrence activity
Table 3 Partial characterisation of Caatinga crude seed extracts
Seeds Soluble solutes
(mg/mL ± sd)
Proteins
(mg/mL ± sd)
TC
(mg/mL ± sd)
CBP
(mg/mL ± sd)
TPC
(mg/mL ±sd) FL TT AL
Lectins
(HA) CBL C. dubia
LC50
M. urundeuva 44.89±3.67 0.76±0.01 6.87± 0.22 0.009 1.46 ± 0.21 + ND ND 833.69 ND 0.19
S. brasiliensis 14.63±2.60 0.62±0.01 4.68 ± 0.17 0.088 0.39 ± 0.01 + ND ND ND ND 1.91
C. phyllanthus 13.61±0.30 0.63±0.01 6.28 ± 1.34 0.019 0.09 ± 0.01 ND ND ND ND ND 1.82
C. sonderianus 20.26±0.75 1.41±0.01 10.91 ± 0.64 0.037 0.20 ± 0.01 ND ND ND ND ND 1.57
R. communis 14.05±0.69 0.88±0.02 3.85 ± 1.77 0.003 0.05 ± 0.01 ND ND ND ND ND 0.30
A. cearenses 51.58±7.84 10.89±0.04 18.75± 4.11 0.228 0.50 ± 0.01 + ND ND ND ND 1.25
C. colubrina 61.83±21.01 4.68±0.13 40.96 ± 6.55 0.162 3.46 ± 0.11 + + + ND ND 0.06
B. cheilantha 27.11±1.07 0.72±0.01 1.96 ± 0.23 0.014 0.17 ± 0.02 + ND ND 55.18 ND 0.04
C. ferrea 45.42±1.87 17.34±0.71 12.88 ± 4.61 1.289 0.68 ± 0.01 + ND ND 2.31 800 0.52
C. pyramidalis 42.98±12.85 12.99±0.25 14.21 ± 1.66 1.536 1.32 ± 0.02 + ND ND ND ND 0.16
C. retusa 46.16±0.05 13.37±0.30 13.68 ± 2.99 0.290 0.57 ± 0.01 + ND + 12255.43 ND 0.28
D. grandiflora 38.87±0.70 3.30±0.071 14.21 ± 3.83 0.105 0.29 ± 0.12 ND ND + 396373.79 819200 0.12
E. vetulina 71.41±1.00 7.48±0.26 22.82 ± 14.8 0.317 0.48 ± 0.06 ND ND + 10941.50 800 0.03
M. caesalpiniifolia 51.88±0.54 10.16±0.14 9.82 ± 1.95 0.024 0.63 ± 0.02 ND ND ND ND ND 0.04
M. regnellii 31.33±0.19 1.24±0.02 13.72± 2.02 0.046 0.75 ± 0.09 + ND + 32.18 ND 0.01
P. moniliformis 47.12±0.58 5.06±0.07 22.69 ± 7.15 0.024 0.77 ± 0.04 ND ND ND ND ND 0.46
P. stipulacea 44.89±13.67 8.31±0.40 13.96 ± 1.48 0.193 0.86 ± 0.02 ND ND ND 38.48 ND 0.16
P. viridiflora 30.97±0.77 2.49±0.43 1.90 ± 0.40 0.042 0.40 ± 0.03 + ND ND 8212.46 ND 0.41
S. spectabilis 35.84±1.14 1.51±0.01 28.84 ± 1.83 0.032 0.17 ± 0.05 + ND + 27041.92 ND 0.02
G. americana 25.52±0.81 1.22±0.02 9.34 ± 0.23 0.013 0.16 ± 0.01 ND + ND 32.72 ND 4.12
HA Haemagglutinating activity, LC50 CE concentration in mg/mL needed to kill 50% of Ceriodaphinia dubia, TC Total carbohydrate, CBP Chitin-binding
proteins, TPC Total phenolic compounds, FL Flavonoids, TT Triterpenes, AL Alkaloids, CBL Chitin-binding lectins, ND Not detected, + Present
Table 4. Enzymatic inhibitory activity of Caatinga crude seed extracts
Seeds
Enzymes
Trypsin Trypsin IHL Chymotrypsin Proteases IHL Amylase Amylase IHL Amylase IHA
SIA ± sd SIA ± sd SIA ± sd SIA ± sd SIA ± sd SIA ± sd SIA ± sd
M. urundeuva 278.25 ± 30.25 300.46 ± 28.97 75.58 ± 11.36 146.33 ± 2.75 126.97 ± 17.28 289.17 ± 10.52 NR
S. brasiliensis 282.33 ± 173.52 ND 90.42 ± 6.25 141.17 ± 10.25 26.50 ± 3.97 218.17 ± 98.88 NR
C. phyllanthus 51.17 ± 15.14 167.42 ± 22.68 48.75 ± 2.00 138.92 ± 23.71 27.17 ± 2.75 219.83 ± 12.00 NR
C. sonderianus ND 86.92 ± 6.17 72.75 ± 7.94 150.08 ± 3.88 ND ND NR
R. communis 85.75 ± 4.25 183.92 ± 4.04 14.33 ± 4.65 151.92 ± 8.10 66.43 ± 7.18 104.0 ± 29.46 NR
A. cearenses 307.0 ± 5.81 191.42 ± 3.51 87.00 ± 6.87 147.67 ± 4.16 ND 71.67 ± 14.46 49.25 ± 16.59
D. colubrina 161.0 ± 30.90 22.33 ± 18.45 27.75 ± 3.00 132.08 ± 31.79 ND ND ND
B. cheilantha ND ND 84.75 ± 10.11 201.17 ± 13.27 58.77 ± 11.75 40.75 ± 11.66 76.08 ± 8.61
C. ferrea 313.17 ± 1.61 199.33 ± 0.58 31.42 ± 3.01 141.42 ± 5.58 ND ND NR
C. pyramidalis 209.00 ± 6.76 120.58 ± 5.06 109.83 ± 0.29 220.42 ± 2.36 5.50 ± 4.82 56.33 ± 25.76 96.75 ± 32.04
C. retusa 104.67 ± 52.35 113.93 ± 8.10 49.58 ± 7.42 64.67 ± 7.52 23.60 ± 7.25 47.17 ± 32.70 NR
D. grandiflora 55.00 ± 37.72 128.00 ± 2.65 38.25 ± 9.99 125.08 ± 21.10 55.22 ± 11.81 78.33 ± 20.82 84.42 ± 24.08
E. vetulina 223.00 ± 41.50 169.83 ± 5.20 108.0 ± 3.46 229.50 ± 0.50 151.10 ± 11.17 103.5 ± 43.30 51.33 ± 22.37
M. caesalpiniifolia 59.75 ± 41.01 110.42 ± 5.69 31.83 ± 11.06 86.25 ± 5.63 ND ND NR
M. regnellii ND ND 90.75 ± 3.12 227.50 ± 1.73 32.30 ± 9.50 116.17 ± 47.55 31.75 ± 18.74
P. moniliformis 214.42 ± 29.04 115.42 ± 28.44 104.83 ± 5.51 211.25 ± 8.23 ND 49.33 ± 16.63 NR
P. stipulacea ND ND 102.75 ± 4.44 228.08 ± 0.29 152.10 ± 14.55 78.67 ± 20.40 NR
P. viridiflora 49.75 ± 0.01 ND 83.92 ± 2.36 225.0 ± 6.38 28.10 ± 10.50 116.50 ± 47.15 45.92 ± 12.41
S. spectabilis ND ND 92.50 ± 5.41 180.0 ± 4.75 126.97± 14.02 55.67 ± 17.13 83.58 ± 40.70
G. americana 137.50 ± 49.34 185.92 ± 17.06 53.58 ± 14.63 207.83 ± 9.28 40.85 ± 12.75 27.50 ± 19.97 38.00 ± 8.94
IHL Intestinal homogenate from L4 larvae of A. aegypti, IHA Intestinal homogenate from adults of A. aegypti, SIA Specific Inhibitory activity, ND Not detected,
NR Unrealized
Anexo 8 – Artigo submetido para publicação
Potential of extract seeds of E. contortisiliquum in the control of Aedes aegypti:
evidence for the involvement of inhibiting proteolytic activity
P. B. B. M. BARBOSA, 1, 2, R. L. N. GODONE1, J. A. N. C. RIBEIRO 3, J. M. DE OLIVEIRA
1, V. P. M. SILVA 1, G. F. DE MEDEIROS 4, E. A. DOS SANTOS 1, A. F. UCHÔA 1and M.
F. F. M. XIMENES, 5 1. Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Mossoró,
Brazil
2. Departamento de Ciências Biomédicas, Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN),
Natal, Brazil
3. Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal,
Brazil
4. Departamento de Oceanografia e Limnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN), Natal, Brazil
5. Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN), Natal, Brazil
Abstract
Since they are constantly subjected to attacks from pests and pathogens, plants have
accumulated an arsenal of chemical compounds over the course of their evolution. In
addition to protecting them, these compounds may also serve as a source of natural
insecticides. Ground seeds of Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong (Fabales:
Fabaceae) were used to obtain a crude saline extract and three ammonium sulphate
fractions (F1, F2 and F3) with high protein content. The extract and the fractions
exhibited larvicidal, but not pupicidal activity against Aedes aegypti (L.) (Diptera:
Culicidae). None of the samples were toxic to fibroblasts and F2 showed less
environmental toxicity. Reduced protolytic activity in larvae fed with the extract and the
fractions suggests that the E. contortisiliquum trypsin inhibitor (EcTI) is important in
larvicidal activity. However, EcTI is unable to cause the death of larvae by itself. Other
proteins such as amylase and lectin inhibitors have also been identified and act in
conjunction with EcTI. Moreover, the extract also exhibited adulticidal activity and the
ability to attract or impede oviposition in pregnant females depending on the dose. The
extract of E. contortisiliquum proved to be promising for the control of A. aegypti.
Keywords: adulticide, enzyme inhibitors, intestinal homogenate from larvae, larvicide,
mosquito vector control, ovipositional deterrence activity, plant extract, pupicide,
vicilin.
