PATRÍCIA CARIOLANO DE OLIVEIRA - repositorio.ufpe.br · das trevas para o reino do seu filho...

PADRÃO TAXONÔMICO, QUIMIOTIPAGEM E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN

VITRO DE ANFOTERICINA B, CICLOPIROX OLAMINA E ß-LAPACHONA EM

AMOSTRAS DE CRYPTOCOCCUS

PATRÍCIA CARIOLANO DE OLIVEIRA

RECIFE

OUTUBRO/2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS




Aluna: Patrícia Cariolano de Oliveira Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia de Fungos da

Universidade Federal de Pernambuco, como

requisito para obtenção do grau de mestre em

Biologia de Fungos.

Área de concentração:

Fungos de Interesse Médico

Orientador:

Profᵃ Dra. Rejane Pereira Neves

Colaboradoras:

Drª Maria Taciana L.A. Correia

Drª Solange Dornelas Mesquita

RECIFE

OUTUBRO/2011

Oliveira, Patrícia Cariolano de

Padrão taxonômico, quimiotipagem e atividade antifúngica in vitro de Anfotericina B, Ciclopirox Olamina e β-Lapachona em amostras de Cryptococcus / Patrícia Cariolano de Oliveira. – Recife: O Autor, 2011. 62 folhas : fig.

Orientadora: Rejane Pereira Neves Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco.

CCB. Biologia de Fungos, 2011.

Inclui bibliografia

1. Fungos 2. Diagnóstico micológico I. Título.




PATRÍCIA CARIOLANO DE OLIVEIRA

Data da defesa: 16 de Fevereiro de 2009

COMISSÃO EXAMINADORA

MEMBROS TITULARES

Orientadora: Dra. Rejane Pereira Neves (Orientadora)

Universidade Federal de Pernambuco

Dra. Oliane Maria Correia Magalhães


Dra. Ana Beatriz Sotero Siqueira


“Quando o homem explorar

intensamente o pequeno átomo e o

imenso espaço e disser que domina o

mundo; quando conquistar as mais

complexas tecnologias e disser que sabe

tudo, então ele terá tempo para se voltar

para dentro de si mesmo. Neste

momento descobrirá que cometeu um

erro grave. Compreenderá que dominou

o mundo de fora, mas não dominou o

mundo de dentro, os imensos territórios

de sua alma. Descobrirá que se tornou

um gigante na ciência, mas que é um

frágil menino que não sabe navegar nas

águas da emoção e que desconhece os

segredos que tecem a colcha de retalhos

de sua inteligência”

Augusto Cury

DEDICO

Ao meu amado, precioso e único Senhor da minha vida, Jesus Cristo,

por todo Seu suprimento, amor, ensinamentos, direção e principalmente por

permanecer fiel, até mesmo quando eu sou infiel.

Aos meus pais: Oliveira e Valda, meus grandes amores.

AGRADECIMENTOS

Ao meu Senhor e Salvador Jesus Cristo, autor da minha vida, que me transportou

das trevas para o reino do seu filho amado; escolheu-me, amou-me com amor eterno e é o

grande responsável por todas as minhas conquistas. A Ele, eu declaro todo o meu amor e toda

a minha gratidão para sempre!

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a

Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos da UFPE nas

pessoas da Coordenadora Leonor Maia, da secretária Giovana e das Professoras Norma

Gusmão e Elaine Malosso.

Ao prof. Armando Marsden, chefe do laboratório de Micologia Médica, pelo seu

bom-humor, profissionalismo e ética, que fazem dele um biomédico reconhecido, admirado e

acima de tudo, respeitado.

Às doutoras Taciana Antunes e Solange Mesquita por terem gentilmente cedido as

amostras de LCR para o desenvolvimento da minha pesquisa e em especial, às funcionárias do

laboratório Cibele, Solange, Thayanna e Alcione pelo apoio e simpatia. Muito obrigada

meninas!!! Foi um prazer ter conhecido vocês!

À minha ETERNA orientadora Rejane Pereira Neves por sua orientação maravilhosa

e por ter me apoiado e estado ao meu lado nessa e em todas as fases importantes de minha

vida acadêmica.

À professora Oliane Maria Correia Magalhães, por ser um exemplo para todos nós.

Aos meus colegas da Micologia, em especial a Carol, Suanni, Dani, Regi,

Andrezinho, Vanessa, Aline, Fabíola, Ana Maria, pelo apoio e momentos de descontração.

Aos meus pais (Oliveira e Valda), meus amores, que sempre me deram o apoio

necessário para que eu conseguisse vencer todas as dificuldades.

A todas as pessoas, mais próximas ou distantes, que torceram junto a mim pela

conclusão de mais uma etapa da minha vida.

RESUMO

A criptococose é uma infecção fúngica causada por Cryptococcus neoformans, que possui

tropismo pelo sistema nervoso central. O propósito deste estudo foi diagnosticar criptococose,

identificar variedades de C. neoformans e avaliar a suscetibilidade a anfotericina B, ciclopirox

olamina e β-lapachona em amostras da Micoteca URM-UFPE e recém isoladas de Líquor de

imunocomprometidos de ambos os sexos atendidos em hospitais de Recife-PE, Brasil. Para o

diagnóstico de criptococose, exame direto foi realizado com tinta da China e o semeio em

ágar Sabouraud. As variedades foram detectadas com meio L-Canavanina-azul bromotimol. A

concentração inibitória seguiu o Clinical and Laboratory Standards Institute. Dezenove casos

de criptococose foram diagnosticados com obtenção de 16 culturas. Da Micoteca, foram

obtidas 14 amostras de C. neoformans. O exame direto mostrou leveduras capsuladas. C.

neoformans var. neoformans ocorreu em 50% dos casos. O CIM (µg/mL) desta variedade foi

0,25 - 4 (anfotericina B), 0,125 - 1 (ciclopirox olamina), 4 e 8 (β-lapachona). Os isolados de

C. gattii apresentaram-se 0,25 - 4 (anfotericina B), 0,25-1 (ciclopirox olamina), 4 e 8 (β-

lapachona). A concentração fungicida da β-lapachona foi 64 µg/mL. Criptococose

predominou no sexo masculino com faixa etária de 25-46 anos e apresentando AIDS como

fator de risco predominante. Detectaram-se 4 isolados resistentes a anfotericina B (3 isolados

de C. gattii e 1 isolado de C. neoformans var. neoformans). A eficácia do ciclopirox olamina

e da β-lapachona, comparada a resistência a anfotericina B, mostra a importância da

susceptibilidade associados à variedade para monitorar desenvolvimento de resistência

possibilitando descoberta de novas alternativas terapêuticas para criptococose.

Palavras chave: Cryptococcus neoformans var. neoformans. Cryptococcus gattii.

Suscetibilidade. Agentes antifúngicos. Criptococose.

ABSTRACT

Cryptococcosis is a fungal infection, predominantly opportunistic, caused by Cryptococcus

neoformans, which it has tropism particularly for the central nervous. The purposes of this

study was diagnose cryptococcosis, identify varieties of C. neoformans and evaluate the

susceptibility to amphotericin B, ciclopirox olamine and β-lapachone in samples stored in the

Micoteca URM-UFPE and newly isolated from Cerebrospinal fluid of immunocompromised

patients from both sex treated in public hospitals in Recife-PE, Brazil. To diagnose

cryptococcosis, direct examination was realized with ink staining and culture in Sabouraud

agar. The species were detected through L-canavanine-glycine-bromotimol blue agar medium.

The minimum inhibited concentration (MIC) was set up in accordance with the Clinical and

Laboratory Standards Institute. Nineteen cryptococcosis cases were diagnosed with 16

obtained cultures. From Micoteca, were obtained 14 samples of Cryptococcus neoformans.

Encapsulated cells were observed in direct examination. Cryptococcus neoformans var.

neoformans was identified in 50% of all samples. The MIC (µg/mL) of var. neoformans

isolates ranged from 0.25 - 4 (amphotericin B), 0.125 - 1 (ciclopirox olamine), 4 and 8 (β-

lapachone). C. gattii isolates showed MIC values ranged from 0.25 - 4 (amphotericin B),

0.25-1 (ciclopirox olamine), 4-8 (β-lapachone). The minimal fungicide concentration of β-

lapachone was 64 µg/mL. In this study, cryptococcosis predominated in male sex patients,

with age between 25-46 and with AIDS. Three var. gattii and one var. neoformans isolates

were resistant to amphotericin B. The antifungal efficacy of ciclopirox olamine and β-

lapachone, compared to the resistance to amphotericin B, shows the importance of

susceptibility tests associated with varieties monitoring the development of resistance and the

discovery of new therapeutic alternatives for cryptococcosis.

Keywords: Cryptococcus neoformans var. neoformans. Cryptococcus neoformans var. gattii.

Susceptibility test. Antifungal agents. Cryptococosis.

LISTA DE FIGURAS

Página

Figure 1 Determination of the minimum inhibitory concentration of ciclopirox

olamine, amphotericin B and fluconazole against Cryptococcus spp. (▲) ciclopirox

olamine, (♦) amphotericin B, (■) fluconazole.

42

Figure 2 Determination of the minimum fungicide concentration of ciclopirox

olamine and amphotericin B against Cryptococcus spp. (♦) ciclopirox olamine, (■ )

amphotericin B.

42

Figure 3 Average of growth inhibition from ciclopirox olamine (a), amphotericin B

(b) and fluconazole (c) against Cryptococcus spp. 43

SUMÁRIO

Páginas

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUÇÃO GERAL 11

1.1 Histórico de Cryptococcus neoformans 11

1.2 Aspectos taxonômicos de Cryptococcus neoformans var. neoformans e C. gattii 13

1.3 Vias de infecção e manifestações clínicas da criptococose 13

1.4 Diagnóstico da criptococose 15

1.5 Quimiotipagem e epidemiologia 16

1.6 Drogas antifúngicas 20

1.6.1 Ciclopirox olamina 22

1.6.2 Fitoterapia: β-lapachona 24

2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 27

3 CICLOPIROX OLAMINE: AN ANTIFUNGAL ALTERNATIVE

AGAINST CRYPTOCOCCOSIS

36

4 IN VITRO ANTIFUNGAL ACTIVITY OF THE NAPHTOQUINONE Β-

LAPACHONE AGAINST CLINICAL ISOLATES OF CRYPTOCOCCUS

NEOFORMANS.

47

5 CONCLUSÕES GERAIS 62

11

Oliveira, P.C. Padrão taxonômico, quimiotipagem e atividade antifúngica...

1 INTRODUÇÃO GERAL

1.1 Histórico de Cryptococcus neoformans

Em 1894 o pesquisador Francesco Sanfelice, estudando “blastomicetos” do suco de

algumas frutas, isolou a partir do suco de pêssego um microrganismo com estrutura

semelhante a uma levedura encapsulada, o qual denominou de Saccharomyces neoformans. O

referido isolado foi inoculado experimentalmente em animais, sendo capaz de produzir lesões.

Este trabalho, publicado pela Revista do Instituto de Higiene da Universidade de Cagliari

(Itália), foi o marco inicial para outros estudos (MITCHELL; PERFECT, 1995; SIDRIM;

ROCHA, 2004; BIVANCO et al., 2006).

Na mesma época, Otto Busse, um patologista, e Abraham Buschke, um clínico,

relataram separadamente o isolamento de um fungo com as mesmas características,

proveniente de uma lesão na tíbia, semelhante a um sarcoma, de uma mulher com 31 anos.

Busse descreveu o organismo como fungo, resistente ao tratamento com hidróxido de sódio e

o denominou Saccharomyces sp. Buschke, um ano depois, ainda descreve o caso e o

organismo, independente do feito de Busse (LACAZ et al., 2002a; SIDRIM; ROCHA, 2004;

BIVANCO et al., 2006).

Na Itália, outro organismo similar à levedura obtida por Bushcke foi isolado por

Sanfelice (1895), desta vez a partir de um linfonodo de um boi, o qual nomeou S. lithogenes.

Curtis (1896) descreveu um caso similar ao relatado por Busse e Buschke, isolando o agente a

partir de uma lesão tumoral no quadril, o qual foi denominado S. subcutaneus tumefasciens.

Constantin, em 1901, considerou essa espécie como S. hominis, agente da chamada

blastomicose européia (RIPPON, 1982; LACAZ et al., 2002a; SIDRIM; ROCHA, 2004).

Em 1902, Frothingam reconheceu a mesma espécie em uma lesão pulmonar em um

cavalo, em Massachussetts. Estes últimos achados estabeleceram o fato de que a doença

acomete tanto animais quanto humanos (RIPPON, 1982; MITCHELL; PERFECT, 1995).

Após examinar as várias culturas isoladas, o micologista francês Vuillemin (1901) não

visualizou ascosporos, característicos do gênero Saccharomyces e as transferiu para o gênero

Cryptococcus, previamente estabelecido por Kutzing (1833), ao demonstrar que o termo

anterior era inadequado, sendo considerados, então, como C. hominis os isolados de Busse e

Buschke e C. neoformans, o de Sanfelice (RIPPON, 1982; SIDRIM; ROCHA, 2004).

Von Hansemann (1905) é citado como o primeiro a observar a levedura causando

meningite, e esta forma clínica da micose não era diagnosticada ante mortem até Verse relatar

um caso em 1914 (RIPPON, 1982; MITCHELL; PERFECT, 1995).

12


Em 1916, nos Estados Unidos, Stoddard e Cutler observaram alguns casos de

blastomicose com lesões cutâneas e sistêmicas, de onde isolaram uma levedura por estes

denominada Torula histolytica e a doença torulose. Os autores evidenciaram retração da

cápsula da levedura em meio às lesões tissulares e interpretaram erroneamente como uma lise

celular causada pelo fungo no tecido hospedeiro (RIPPON, 1982; LACAZ et al., 2002;

SIDRIM; ROCHA, 2004).

Rhoda Benham (1935) revisou os isolados identificados como Saccharomyces,

Cryptococcus e Torula, analisando morfologia, patogenicidade e reatividade frente a fatores

séricos, concluindo que todos pertenciam a um só gênero. Em 1950, essa mesma autora

propôs a designação C. neoformans (Sanfelice) Vuillemin 1901, que se tornou definitiva,

sendo esta espécie, o principal agente etiológico da criptococose (RIPPON, 1982; SIDRIM;

ROCHA, 2004).

Outros autores, embora indicando C. neoformans como agente etiológico

predominante na criptococose, também relatam a ocorrência de outras espécies como C.

laurentii e C. albidus, porém em menor freqüência (MCCURDY; MORROW, 2001;

AVERBUCH et al., 2002; LEE et al., 2004).

Em 1951, Emmons relatou pela primeira vez a fonte de infecção, afirmando a presença

da levedura no solo. Após quatro anos, o mesmo autor detectou cepas virulentas de C.

neoformans em excretas e ninhos de pombos e observou quadros de pneumonia grave da

criptococose em trabalhadores que demoliam prédios antigos (EHRENSING; SAAG, 2001).

Em 1978, Kwon-Chung propôs o gênero Filobasidiella para a fase sexual com duas

variedades F. neoformans var. neoformans (sorotipos A, D e A/D), sendo descrita como

teleomorfo de C. neoformans var. neoformans e F. neoformans var. bacillispora (sorotipos

B e C), correspondendo ao teleomorfo de C. neoformans var. gattii (ZAITZ et al., 1998). As

duas variedades eram as únicas reconhecidas para C. neoformans até que Franzot et al. (1999)

identificaram uma terceira variedade denominada C. neoformans var. grubii.

Em 2002, avanços nas pesquisas envolvendo a ecologia, epidemiologia, fisiologia e

genética de C. neoformans permitiram que Kwon-Chung e colaboradores elevassem C.

neoformans var gattii a uma nova espécie: Cryptococcus gattii. Com base nestas informações,

as antigas variedades são reconhecidas atualmente por vários autores como espécie e

variedades do complexo C. neoformans, as quais correspondem Cryptococcus neoformans

var. neoformans, C. gattiii e C. neoformans var. grubii. (EDMOND et al., 2010; GUPTA;

FRIES, 2010). Porém, a última, ainda não se apresenta bem caracterizada sorotipicamente e

molecularmente (LENGELER et al., 2001; BOEKHOUT et al., 2001).

13


1.2 Aspectos taxonômicos de Cryptococcus neoformans var. neoformans e C. gattii

O gênero Cryptococcus reúne aproximadamente 34 espécies de leveduras, fungos

unicelulares, que se reproduzem predominantemente por brotação e caracterizam-se, em geral,

por apresentar cápsula mucopolissacarídica, colônia mucóide, capacidade assimilativa a várias

fontes de carbono, ausência de capacidade fermentativa e sensibilidade a cicloheximida

(BARNETT et al., 2000; HOOG et al., 2000; IKEDA et al., 2002).

Cryptococcus neoformans var. neoformans e C. gattii desenvolvem-se in vitro entre 48

e 72h, produzindo colônias mucóides, lisas, de coloração branca a creme, sendo o grau de

mucosidade da colônia dependente da formação da cápsula mucopolissacarídica

(ZARAGOSA et al., 2006).

A presença da cápsula mucopolissacarídea é uma característica distinta entre as

espécies, sendo considerada importante fator de virulência, antifagocítico e imunodepressor.

Aproximadamente 90% da cápsula é constituída pelos polissacarídeos glucuronoxilomanana,

galactoxilomanana e manoproteína (CASALI et al., 2001; NISHIKAWA et al., 2003).

Segundo Zaragosa et al. (2006), a diferença na estrutura das glucuronoxilomananas da

parede celular permitiu a identificação dos cinco sorotipos conhecidos atualmente. O tamanho

da cápsula é determinado pelo genótipo e condições de crescimento, apresentando a levedura

pequenas cápsulas quando no ambiente e cápsulas espessas durante a infecção.

No aspecto micromorfológico, observa-se células de leveduras globosas ou alongadas,

com ou sem brotamento. Pseudohifas estão ausentes ou são rudimentares (REOLON et al.,

2004; BIVANCO et al., 2006). Este patógeno oportunista é detectado em indivíduos

imunocompetentes e imunologicamente comprometidos, bem como em detritos de origem

vegetal, frutas, pele de animais, e principalmente em excretas de pombos e outras aves, onde

pode permanecer viável por mais de dois anos (NELSON; COUTO, 2001; LARSSON et al.,

2003; PEREIRA; COUTINHO, 2003; TABOADA, 2004).

1.3 Vias de infecção e manifestações clínicas da criptococose

De acordo com Honsho et al. (2003) e Kommers et al. (2005), a primo infecção por C.

neoformans var. neoformans e C. gattii é pulmonar, seguida de disseminação. A alta

prevalência da levedura em isolados ambientais, aliada a rara transmissão homem-homem ou

animal-animal, indica que a infecção é adquirida através de fontes ambientais do fungo,

especialmente a partir de inalação de estruturas viáveis oriundas de excretas de aves. Porém, a

criptococose pulmonar não possui características específicas, logo, o diagnóstico diferencial

14


torna-se difícil. Esta ausência de sintomas proporciona o aumento de casos subdiagnosticados

de criptococose, principalmente em pacientes imunocompetentes (ZHU et al., 2002).

De acordo com Hull; Heitman (2002) e Abegg et al. (2006), algumas evidências

corroboram com o fato da infecção primária ser nos pulmões como a identificação de excretas

de aves como reservatório ambiental e a descoberta, de partículas infecciosas com tamanho

compatível com a deposição alveolar. Associado a isto, estão o reconhecimento de pneumonia

criptococócica e a descrição de nódulos subpleurais.

Segundo Núñez et al. (2000), a infecção pulmonar primária no imunocompetente é, na

maioria das vezes, assintomática e regressiva, com resposta imunológica e evolução para cura.

Entretanto, de acordo com Vilchez et al. (2002) e Casali et al. (2003), a partir de uma lesão

pulmonar no imunodeprimido, pode haver progressão, com disseminação por via linfo-

hematogênica, para outros sistemas, em especial para o sistema nervoso central (SNC). Neste

órgão, meningoencefalite fúngica é a forma clínica mais freqüente com 75% dos casos.

No sistema nervoso central, além da meningoencefalite criptococócica, podem ocorrer

quadros de meningite e encefalite. A sintomatologia inclui cefaléia e mudança

comportamental, podendo evoluir para sinais de irritação meníngea e vômitos. Em casos mais

graves, verifica-se confusão mental, apatia e edema papilar. Observada sob a forma de

meningoencefalite, pode ter curso fulminante e de outra forma, pode representar uma

reativação de foco latente ou eclodir em virtude de reinfecção por nova exposição ao agente

(CASALI et al., 2001; PAPPALARDO; MELHEM, 2003).

Bivanco et al. (2006) e Dilhuydy et al. (2007) afirmam que além de acometer os

sistemas respiratório e nervoso, a criptococose pode manifestar-se através de lesões cutâneas

acometendo principalmente a face sendo representada por mácula avermelhada, pápulas,

pústulas, nódulos ou úlceras. Em indivíduos que fazem uso de corticosteróides é observado

celulite com eritema e endurecimento. Porém, Martinez et al. (2001), afirmam que este tipo de

manifestação clínica da criptococose é menos comum, mais prevalente no norte da Europa, e

atinge cerca de 10% a 15% dos pacientes.

Em humanos, a criptococose é mais freqüente em adultos, mas apesar de rara, pode

afetar crianças. Esta micose é comumente diagnosticada em pacientes com imunodepressão

celular, como os soropositivos para o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Nos últimos

anos, o aumento do número de casos da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) foi

acompanhado pelo aumento da incidência de criptococose (PAPPALARDO; MELHEM,

2003). Dessa forma, esta micose atualmente é considerada a doença oportunista com alto

índice de morbidade e mortalidade (IDNURM et al., 2005; DINATO et al., 2006).

15


De acordo com Reolon et al. (2004); Núñez et al. (2000); Moreira et al. (2006) e Lin;

Heitman (2006), os primeiros relatos da infecção revelam imunodepressão celular em função

do uso de corticóides, diabetes mellitus, linfoma e lúpus eritematoso sistêmico. Além disso,

soma-se a esses grupos de risco, indivíduos sob antibioticoterapia, leucêmicos, transplantados

e portadores de tumores, alterando dessa forma o perfil epidemiológico para a patologia.

1.4 Diagnóstico da criptococose

Segundo Bivanco et al. (2006) e Queiroz et al. (2008), o diagnóstico atual da

criptococose é baseado em três fundamentos: a demonstração do agente etiológico no material

clínico através de exame direto; o isolamento em cultura seguido de provas bioquímicas para

identificação da espécie e a pesquisa de antígenos circulantes através de reação de aglutinação

em partículas de látex.

Larsson et al. (2003); Bivanco et al. (2006) e Queiroz et al. (2008) afirmam que vários

espécimes como escarro, lavado brônquico, líquor, secreção de lesões cutaneomucosas, urina,

macerados de tecidos obtidos por biópsia e sangue periférico, podem ser utilizados para a

pesquisa direta da levedura. Porém, segundo Corrêa et al. (2002), o líquido céfalo raquidiano

(LCR) representa a amostra ideal, tendo em vista que o principal agente etiológico apresenta

tropismo pelo sistema nervoso central causando meningoencefalite.

De acordo com Severo et al. (1998), a preferência pelo SNC se deve à alta

concentração, no liquor, de nutrientes como tiamina, ácido glutâmico, glutamina, carboidratos

e minerais assimiláveis pelo fungo; ausência de atividade do complemento e a fraca ou

ausente resposta inflamatória no tecido cerebral.

Kommers et al. (2005), afirmam que a observação microscópica de C. neoformans

através da tinha da China, contribue para um diagnóstico rápido e barato, sendo importante

especialmente na suspeita de meningite criptococócica. A base para a visualização das

leveduras por este método é que a cápsula afasta as partículas da tinta, formando um halo

claro ao redor da mesma. Contudo, o diagnóstico de criptococose torna-se mais difícil quando

se trata de células acapsuladas.

Moreira et al. (2006) afirmam que para o diagnóstico laboratorial da criptococose, a

pesquisa direta demonstrou a presença do microrganismo em 98,3% das amostras, ocorrendo

100% do isolamento da levedura. Além do LCR, os pesquisadores utilizaram sangue

periférico como amostra clínica e relataram que houve falha na detecção do antígeno

polissacarídico capsular do fungo em amostra da corrente sanguínea.

16


A cultura é indispensável para o padrão ouro dos métodos de diagnóstico laboratorial

micológico, incluindo a criptococose (LACAZ et al., 2002b; QUEIROZ et al., 2008). De

acordo com Casadevall; Perfect (1998), em certas ocasiões, como por exemplo, na meningite

criptococócica crônica, o liquor pode resultar em culturas negativas devido à pequena

concentração de leveduras viáveis ao nível lombar. A baixa concentração é devido a

tratamento prévio e torna-se um problema no monitoramento dos pacientes crônicos. As

preparações com tinta da China, por sua vez, permanecem positivas por meses após o

tratamento e recuperação desse grupo de pacientes.

Segundo Bivanco et al. (2006) e Queiroz et al. (2008), o teste de aglutinação em

partículas de látex representa outra ferramenta importante no diagnóstico da criptococose.

Esta prova geralmente produz alta sensibilidade e especificidade, e consiste na detecção de

polissacarídeos capsulares solubilizados nos fluidos corporais e que reagem com

imunoglobulinas específicas de coelho conjugadas a partículas de látex. Em estudo

desenvolvido com 96 pacientes, foi observado que o diagnóstico através da reação de

aglutinação com partículas de látex mostrou positividade em 38 (97,4%) de 39 amostras, com

um título variando de 1:2 a 1:32 (MOREIRA et al., 2006).

Pesquisas apontam que o uso de testes de aglutinação em látex para o

acompanhamento da evolução do tratamento requer a utilização de um kit originário de um

único fabricante como o CALAS® “Cryptocococcal Antigen Latex Agglutination System”

(Meridian, Bioscience, Inc.), uma vez que há diferenças na sensibilidade dos reagentes

empregados. Além disso, a utilização desses testes para triagem, embora controverso, tem se

justificado pelo número de casos com evolução para a criptococose após ocorrer aglutinação,

sem qualquer achado em lâmina ou cultura (BIVANCO et al., 2006).

Da mesma forma, para um diagnóstico de criptococose preciso e completo, é

importante adicionar à pesquisa direta, cultura e aglutinação em látex, a realização da

quimiotipagem na detecção de C. neoformans var. neoformans e C. gattii. Este método é

muito utilizado para fins epidemiológicos e acompanhamento da resposta terapêutica

(QUEIROZ et al., 2008).

1.5 Quimiotipagem e epidemiologia

A quimiotipagem foi realizada pela primeira vez por Kwon-Chung et al. (1978) ao

descreverem uma técnica rápida, simples e eficaz para diferenciar as espécies de C.

neoformans em meio de cultura contendo inicialmente creatinina, dextrose e azul de

bromotimol como indicador (Ágar CDB). Porém, devido aos resultados falso negativos,

17


tornava-se óbvio a necessidade de um método mais efetivo (KWON-CHUNG et al., 1978;

MELO et al., 1993).

Em 1982, um novo método foi proposto por Salkin e Hurd para diferenciar as espécies

com base na mudança de cor do meio de cultura, composto por glicina, cicloheximida e

substituindo o indicador pelo vermelho de fenol (Ágar GCP). No entanto, a susceptibilidade à

cicloheximida pelas duas variedades não era significativamente distinta. Em estudos

comparativos, o meio de Salkin e Hurd fornecia resultados menos ambíguos quando

comparados àqueles do meio CDB. Porém, a porcentagem de falso-negativos permanecia

elevada (SALKIN; HURD, 1982; MELO et al., 1993).

Kwon-Chung e colaboradores (1982), relataram outro meio à base de L- canavanina,

glicina e azul de bromotimol (Meio CGB) que eliminou efetivamente as reações falso-

positivas e falso-negativas pelas espécies de C. neoformans, sendo este meio mais eficaz que

os anteriormente propostos.

A criptococose por C. neoformans, representa a quarta causa mais freqüente de

infecção oportunista em pacientes com AIDS. Dentre as infecções fúngicas, esta micose é a

principal responsável pela morbidade e mortalidade desses pacientes. Na maioria dos países, a

prevalência da infecção em pacientes com AIDS tem se mantido na faixa de 5 a 10%,

enquanto que este índice chega a 15-50% em países africanos (DUIN et al., 2002; SIDRIM;

ROCHA , 2004; JAIN et al., 2005).

Apesar da doença ser geralmente decorrente de uma única amostra de Cryptococcus

spp. (BRANDT et al., 1996; FRANZOT et al., 1997; MEYER et al., 1999; LITVINTSEVA et

al., 2005), a infecção por mais de uma variedade do fungo no mesmo paciente foi relatada por

Igreja et al. (2004) e Litvintseva et al. (2005).

No Brasil, pesquisas mostram que 4,5% das infecções oportunistas associadas a

pacientes portadores de HIV são causadas predominantemente por C. neoformans var.

neoformans. Além disso, a mortalidade em pacientes com criptococose, com ou sem doença

predisponente, fica em torno de 40 a 66% (CORRÊA et al., 1999; DARZÉ et al., 2000;

PAPPALARDO; MELHEM, 2003; JANBON, 2004).

Fernandes et al. (2000), realizaram estudo sobre a prevalência da meningoencefalite

criptococócica em 50 pacientes com AIDS provenientes do Hospital de Doenças Tropicais de

Goiânia e relataram que todos apresentaram as manifestações clínicas características de

criptococose meningoencefálica como cefaléia, vômito e ocasionalmente febre. As amostras

foram submetidas ao exame direto com tinta da China e as variedades detectadas através do

meio CGB, com percentagem de 94% de C. neoformans var. neoformans. De acordo com os

18


autores, a identificação de C. gattii em três casos (6%), foi considerado de grande

importância, visto que mesmo em regiões endêmicas de criptococose, onde C. gattii é mais

freqüente, este agente tem sido raramente correlacionado com criptococose do SNC em

portadores do vírus da imunodeficiência adquirida.

Da mesma forma, Silva et al. (2008), utilizando meio CGB para a detecção de C.

neoformans var. neoformans e C. gattii isoladas de 35 pacientes com criptococose atendidos

no Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo (HE-UFTM), verificaram que C.

neoformans var. neoformans foi prevalente, encontrada em 88,6% dos casos. A maioria dos

pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino, correspondendo a 85,7% dos

casos (n=30), sendo 42,8% na faixa etária entre 30 e 40 anos. Com relação à sorologia para

HIV, 85,7% dos pacientes tinham sorologia positiva.

Moreira et al. (2006), afirmam que a maioria dos estudos envolvendo espécies de

Cryptococcus e criptococose, ressaltam mais os aspectos clínicos e terapêuticos, contudo, a

epidemiologia e caracterização das espécies do complexo C. neoformans também são

importantes para um melhor prognósticos dos pacientes. Os autores realizaram um estudo

prospectivo de 96 pacientes, enfocando aspectos clínico-epidemiológico e laboratorial das

espécies da levedura no período de 1996-2003.

Segundo Casali et al. (2001) e Igreja et al. (2004), a recorrência da infecção por

Cryptococcus spp. em pacientes com AIDS, sendo esta, resultante da reativação da infecção,

ou causada por linhagens novas, é um problema crescente. Segundo Rozenbaum e Gonçalves

(1994), 15 a 25% dos pacientes sem AIDS e aproximadamente 50% dos pacientes

soropositivos para o vírus (HIV) podem apresentar recorrência da infecção.

Quanto à predisposição etária e sexual, a doença é mais comum em homens adultos

(DARZÉ et al., 2000; FERNANDES et al., 2003; MEYER et al., 2003; PAPPALARDO;

MELHEM, 2003; LITVINTSEVA et al., 2005). Por razões desconhecidas, Fernandes et al.

(2000) afirmam que a incidência da doença em crianças é baixa. Entretanto, no Brasil, houve

um incremento nos relatos da criptococose nessa faixa etária (CORRÊA et al., 1999), estando

esse ligado à migração da população da área urbana para a área rural, desnutrição ou ao

aumento do número de crianças imunocomprometidas. Rozenbaum e Gonçalves (1994)

afirmam que a exposição ao agente ocorre quando os indivíduos ainda são jovens, havendo

reativação da infecção latente na idade adulta.

Segundo Reolon et al. (2004) e Nielsen et al. (2007), C. neoformans var. neoformans

possui distribuição cosmopolita e tem sido isolado de várias fontes na natureza principalmente

a partir de excretas de pombos e outras aves. Parece não infectar as aves devido a sua

19


temperatura média corporal (42°C) e é capaz de sobreviver à passagem pelo trato

gastrointestinal desses animais que constituem vetores da micose. Outras fontes ambientais

são vegetais em decomposição, laticínios, solo e ocos de árvores. C. neoformans var.

neoformans também é o agente da maioria das infecções criptococócicas em pacientes

imunocomprometidos, mesmo em regiões onde a prevalência da C. gattii é notória.

Vários autores descreveram a identificação de Cryptococcus spp. em fezes e ambientes

freqüentados por pombos. Segundo Bernardo et al. (2001) e Baroni et al. (2006), excretas de

pombos (Columbia lívia) são de maior interesse em saúde pública. Esta ave exótica de origem

européia foi introduzida no Brasil no século XVI. É encontrada em grande número nos

centros urbanos devido a diversos fatores como facilidade de encontrar abrigo e alimento. De

acordo com os autores, além da grande capacidade de adaptação e de sua proliferação, o

principal problema é que o fungo permanece viável nas fezes secas dessa ave durante muitos

anos, tornando-se um reservatório de partículas infectantes passíveis de inalação.

Filiú et al. (2002) descreveram o surto de contaminação de aves de cativeiro por C.

neoformans var. neoformans com repercussão na saúde pública. Foram observadas elevadas

concentrações de até 46.000 propágulos viáveis do fungo por grama de material seco na

cidade de Campo Grande, Mato Grosso do Sul. Segundo os autores, o nível de contaminação

observado pode estar relacionado à movimentação das aves nas gaiolas, bem como a presença

de substrato para o crescimento do fungo como sementes de Níger, alpiste e girassol.

Reolon et al. (2004), analisando 88 amostras de excreta de aves oriundas de cinco

praças de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, verificaram que todas as amostras foram positivas

para C. neoformans var. neoformans nos cinco ambientes estudados pelos autores. A presença

de 10 mil unidades formadoras de colônias por grama de material confirma a existência de

fontes ambientais do fungo. Os autores afirmam que esta observação possibilita a dispersão e

inalação de grande quantidade de propágulos, o que pode determinar a doença em

imunocompetentes e imunodeprimidos.

Queiroz et al. (2008) relatam que além de fezes de pombos, C. neoformans var.

neoformans e C. gattii podem ser encontrados em fezes de morcego e restos de colméia de

vespas comunitária (Polybia occidentalis), como o constatado no Uruguai.

No que diz respeito a C. gattii, Melo et al. (1993); Mcdougall; Fyfe (2006) e Queiroz

et al. (2008) relatam que esta espécie apresenta distribuição geográfica mais restrita do que C.

neoformans var. neoformans, e teria alcançado várias partes do mundo através de sementes do

Eucaliptus camaldulenses oriundos da Austrália. Nesse país, C. gattii foi isolado a partir de

folhas, sementes e cascas de eucalipto. O principal propágulo responsável pela infecção

20


corresponde aos basidiosporos encontrados nas flores dessa árvore e que funcionaria como

hospedeiro para o fungo em uma associação biotrófica. No entanto, de acordo com Fernandes

et al. (2000), o relato da presença de da levedura em ocos de diferentes aves como Cassia

grandis, Senna multijuga, e Ficus microcarpa, independente de sua espécie, indica novas

fontes naturais desse fungo. Dessa forma, pode não haver uma relação definida entre o fungo

e um tipo específico de habitat (LAZERA et al., 1998).

Casali et al. (2003) e Abbeg et al. (2006) confirmaram a não especificidade de habitats

pelas variedades, ao realizarem no Rio Grande do Sul um estudo com 93 isolados clínicos e

ambientais. Entre os isolados ambientais, os nove provenientes de eucaliptos foram

identificados como C. neoformans var. neoformans (sorotipo D) e nenhum isolado de C. gattii

foi obtido do ambiente. Outro estudo do mesmo grupo obteve 38 isolados de excretas de aves,

e destes, 33 foram identificados como C. neoformans var. neoformans e cinco como C. gattii

(sorotipo B), sugerindo excretas de aves pelo sorotipo B neste estado.

Em Vancouver, onde recentemente houve um surto de criptococose causado por

Cryptococcus gattii (MACDOUGALL; FYFE, 2006), a incidência de infecção por esta

variedade, entre 1999-2003, esteve entre 8,5 e 37 casos por milhões de residentes por ano

(KIDD et al., 2004). Na Austrália, esta taxa foi citada por Sorrel (2001) como sendo 8,5 casos

por milhão de habitantes/ano descrito, sendo maior do que a taxa total no mesmo país entre

1994 e 1997, que foi de 6,6 por milhão de habitantes/ano.

Por razões desconhecidas, C. gattii raramente acomete pacientes com HIV e

indivíduos imunossuprimidos. Pacientes infectados com esta variedade usualmente são

imunocompetentes e respondem lentamente ao tratamento antifúngico (PAPPALARDO;

MELHEM, 2003; DIAZ; FELL, 2005; NIELSEN et al., 2007).

1.6 Drogas antifúngicas

Atualmente, os antimicóticos disponíveis constituem um pequeno grupo de fármacos

distribuídos entre poliênos, azólicos e alilaminas, que não atingem os resultados esperados

(WALSH et al, 2000; WEIG et al, 2001; NUCCI; MARR, 2005).

Segundo File (2000), esta vertente na pesquisa de novos compostos com ação

antimicótica tem levado a comunidade científica a investigar a corrida medicamento versus

microrganismos. Desde o início dos anos 80, o número de fármacos em fase de

desenvolvimento diminuiu consideravelmente enquanto que a resistência dos patógenos aos

mesmos tem crescido, porque estes estão cada vez mais desenvolvendo uma série de novos

mecanismos de resistência.

21


De acordo Zanini et al. (2001) e Lacaz et al. (2002a), as principais drogas citadas para

o tratamento da criptococose são anfotericina B, associada ou não a 5-flucitosina e fluconazol,

podendo ser administradas via endovenosa e/ou oral. Segundo os autores, há relatos de

tratamento de criptococose cutânea (primária e secundária), com fluconazol inicialmente

endovenoso (200 mg a cada 12 h por 14 dias) e após manutenção com a droga via oral (400

mg/dia) por no mínimo 45 dias com cura das lesões.

No caso da criptococose pulmonar ou disseminada com comprometimento de SNC, a

droga de escolha é a anfotericina B (0,7-1 mg/kg/dia, início com 5 mg/dia, com diminuição

progressiva até 0,5 a 1-2 mg/dia) associada ou não com 5-fluocitosina (100-150mg/kg/dia via

oral ou endovenoso, por duas a três semanas, seguido pela consolidação da terapia com

fluconazol (200-400 mg/dia via oral ou endovenosa) por 10 a 12 semanas e manutenção com

a mesma droga (200 mg/dia via oral) por toda vida. Outros antifúngicos como o itraconazol

também é citado como alternativa para o tratamento da criptococose, porém em menor

frequência (BIVANCO et al., 2006).

Filippin; Souza (2006) e Luisi et al. (2008) afirmam que a anfotericina B é um poliêno

produzido naturalmente pelo actinomiceto Streptomyces nodosus, sendo inicialmente obtida

em meados de 1955 (VANDEPUTTE et al., 1956). No final dos anos 1950, a anfotericina B

era utilizada em alguns casos clínicos e em 1965 foi o primeiro agente antifúngico a ser

aprovado pela “U.S. Food and Drug Administration” (FDA) (WU, 1994; DISMUKES, 2000).

Este fármaco é um dos antifúngicos mais antigos e considerado a droga de referência

para o tratamento da maioria das infecções fúngicas mesmo com elevada toxicidade e a

introdução de antimicóticos azólicos sistêmicos na década de 1980. Seu efeito antifúngico se

dá mediante a interação direta com o ergosterol da membrana celular fúngica não interferindo

na síntese da membrana, mas sim desestabilizando e facilitando a formação de fendas que

permitem a perda de íons e componentes celulares (DISMUKES, 2000; FICA, 2004).

Com relação ao fluconazol, Santos-Jr et al. (2005) afirmam que este antifúngico é o

composto triazólico mais conhecido, usado de forma isolada ou em combinação com outras

drogas no tratamento de infecções fúngicas cutâneas e sistêmicas como a criptococose. Seu

mecanismo de ação consiste na inibição da enzima lanosterol 14--dimetilase no complexo

citocromo P-450 dos fungos. O resultado é a inibição da conversão lanosterol em ergosterol,

acumulação de precursores e perda da integridade da membrana fúngica.

Contudo, após anos de eficácia terapêutica, Lozano-Chiu et al. (1998); Cuenca-

Estrella et al. (2001); Sar et al. (2004) apontam o aparecimento de patógenos como espécies

de Cryptococcus resistentes a anfotericina B associado a casos de resistência aos azoles,

22


particularmente quando há resistência cruzada a outros triazoles e intolerância aos seus

componentes, o que caracteriza grave problema para a sobrevida dos pacientes afetados pela

criptococose.

Em vista da resistência verificada, torna-se importante a descoberta de novas

alternativas para tratamento de infecções sistêmicas como a criptococose, aliada a realização

de testes de susceptibilidade aos antifúngicos para o monitoramento de resistência e

acompanhamento da resposta terapêutica (REX et al., 2001; PFALLER, 2002).

Em 2002, foi aprovado o documento M27-A2 pelo “National Committee for Clinical

Laboratory Standards” (NCCLS), atual “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI).

Este documento descreve metodologia padronizada para avaliação in vitro da sensibilidade

aos agentes antifúngicos por leveduras que causam infecções fúngicas invasivas, incluindo C.

neoformans (NCCLS, 2002).

Além disso, essa padronização está relacionada com meios de cultura utilizados para

crescimento do fungo e para o teste de susceptibilidade; temperatura de incubação,

determinação da concentração inibitória mínima, leitura e interpretação dos resultados. Por ser

padronizado, este teste apresenta reprodutibilidade e confiabilidade na determinação da

concentração inibitória mínima (CIM) dos antifúngicos testados por este método (CLSI,

2005).

Até o momento, a resposta clínica na criptococose não é satisfatória, tornando-se

indispensável à busca de drogas mais efetivas e menos tóxicas, como ciclopirox olamina e β-

lapachona, que possam ser alternativas eficazes.

1.6.1 Ciclopirox olamina

De acordo com Niewerth et al. (2003), ciclopirox olamina (originalmente HOE 296)

teve seu primeiro relato como agente antifúngico em 1973. Este fármaco é utilizado no

tratamento de micoses superficiais e está disponível em diferentes formulações farmacêuticas

como gel, solução, creme, shampoo e esmalte terapêutico, sendo administrado topicamente

(JUE et al., 1985; GUPTA, 2001a,c; STAROVA; ALY, 2005; GUPTA, 2005; GUPTA et al.,

2005; ROSEN; LINGAPPAN, 2006).

Segundo Niewerth et al. (2003); Walash et al. (2006), esta droga é um agente

fungicida com amplo espectro de ação antimicrobiano e anti-inflamatório, demonstrando

excelente atividade fungicida contra fungos de interesse médico como dermatófitos e

leveduras, incluindo aquelas resistentes aos azoles.

23


Gupta (2001b) e Gupta; Plott (2004) afirmam que a atividade anti-inflamatória

inerente ao ciclopirox olamina representa um fator importante nas infecções fúngicas, uma

vez que estas podem ser complicadas na presença de processos inflamatórios.

Dentre as espécies de dermatófitos que são inibidas pelo ciclopirox, destacam-se

Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes e T. rubrum.

Entre as leveduras, destacam-se espécies de Malassezia como M. restricta, M. globosa e M.

furfur e espécies de Candida como C. glabrata, C. krusei e C. guilliermondii (NIEWERTH et

al., 2003; WALASH et al., 2006). Hannel et al. (1988) demonstraram a ação fungicida de

ciclopirox olamina em quatro isolados de Cryptococcus neoformans que apresentaram MIC

de 6 µg/mL. Contudo, o método utilizado não foi padronizado, com número de isolados

insuficiente para avaliação da ação antifúngica da droga. Até o momento, pesquisas

envolvendo testes padronizados de susceptibilidade in vitro de ciclopirox olamina frente

amostras de Cryptococcus spp., ainda não foram relatadas.

Para a maioria dos dermatófitos e leveduras, a concentração mínima fungicida se

encontra dentro da faixa de 0,9 a 3,9 µg/mL quando estes microrganismos estão cultivados em

meio ágar Sabouraud-dextrose (ABRAMS et al., 1992).

Gupta; Kholi (2003) testando a atividade antifúngica in vitro de ciclopirox olamina

contra dermatófitos e outros fungos filamentosos, verificaram a excelente atividade da droga

isolada e quando associada à terbinafina, cetoconazol e itraconazol. A concentração mínima

inibitória do ciclopirox olamina ficou entre 0,015µg/mL e 0,125 µg/mL para dermatófitos e

0,03 µg/mL a 8 µg/mL para os outros fungos.

Além dos fungos, o ciclopirox olamina possui comprovada atividade in vitro contra

várias bactérias como Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e

espécies de Staphylococcus e Streptococcus (BOHR; KRAEMER, 2000; GUPTA, 2001;

GUPTA; KOHLI, 2003; NIEWERTH et al.,2003).

Desde que ciclopirox foi introduzido na terapêutica clínica, há mais de 20 anos, vários

estudos enfocando o mecanismo de ação da droga foram publicados. Segundo Gupta (2001),

quando sua utilização tornou-se mais frequente, os resultados de várias investigações e

comparações da sua eficácia com outros agentes antimicrobianos foram relatados.

Iwata; Yamaguchi (1981); Urbani et al. (1995) e Gupta (2001) descreveram que

diferentemente da maioria dos agentes antifúngicos, o ciclopirox olamina não exerce efeitos

sobre a biossíntece do esterol e seu mecanismos de ação é complexo, interferindo em vários

processos metabólicos da célula fúngica.

24


Estudos realizados por Abrams et al. (1992); Gupa (2001) e Niewerth et al. (2003),

demonstraram que o mecanismo de atuação dessa droga consiste na interferência na

recaptação e acumulação de precursores da síntese de macromoléculas da célula fúngica como

aminoácidos, além de interferir na biossíntese de ácido ribonucléico (RNA) e ácido

desoxirribonucléico (DNA) destes microrganismos.

Além desses mecanismos, Bohr; Kraemer (2000); Gupta (2001); Kokjohn et al. (2003)

descrevem que ciclopirox olamina atua na quelação de metais trivalentes como o Fe3+

, por

quem tem alta afinidade. Este mecanismo inibe enzimas dependentes do Fe3+

como catalase e

peroxidase, as quais são importantes na degradação de peróxidos tóxicos e,

consequentemente, contribuem para a integridade da célula fúngica.

Segundo Niewerth et al. (2003), a CIM de ciclopirox aumenta efetivamente quando

são usados meios contendo tioglicolato. Os sais de ferro presentes nesse meio antagonizam o

efeito inibitório pela formação de complexos com o antifúngico.

Com base nos estudos de Bohr; Kramer (2000), a complexidade do mecanismo de

ação do ciclopirox olamina pode gerar uma diminuição na ocorrência de resistência, quando

comparado a outros agentes antifúngicos. Comprovando esta afirmação, verifica-se que

mesmo após ser introduzido na terapia clínica há mais de 20 anos, ainda não foi constatado

resistência fúngica (NIEWERTH et al., 2003).

Com relação à segurança do fármaco, pesquisas confirmam que os efeitos adversos

são raros e limitam-se a reações locais após aplicação tópica. A toxicidade da droga foi

testada em vários modelos animais, assim como a sua carcinogenicidade e mutagenicidade,

para os quais não foi demonstrada potencialidade em nenhum dos efeitos testados (GUPTA;

SKINNER, 2003).

1.6.2 Fitoterapia: β-lapachona

Segundo Brandão et al. (2001), a fitoterapia consiste no conjunto de técnicas de

utilização de vegetais no tratamento de doenças e na recuperação da saúde. Comporta

numerosos grupos de pesquisadores que estudam e empregam as plantas medicinais, das mais

simples e empíricas, as científicas e experimentais.

Dez anos atrás, Ferreira (1998) mencionava que a indústria dos medicamentos

derivados de plantas seria promissora devido ao crescente interesse do consumidor em

produtos naturais e por este motivo, as indústrias farmacêuticas estariam ampliando a adição

de ingredientes botânicos. Segundo o autor, estas plantas podem representar uma base de

25


novas moléculas biologicamente ativas, quando exploradas dentro de um programa voltado

para a pesquisa, desenvolvimento e produção de novos fármacos.

Antunes et al. (2006) reforçando a importância da utilização de compostos naturais,

realizaram uma investigação antimicrobiana e determinação da CIM de fitoconstituintes,

observando sua excelente ação frente a microrganismos patogênicos.

Neste contexto, encontra-se a β-lapachona, um composto vegetal facilmente

sintetizado a partir do lapachol. Este fitofármaco foi descrito pela primeira vez por Paternò em

1882, tendo sua estrutura química estabelecida desde 1896 por Hooker e sua síntese realizada

por Fieser em 1927. O lapachol foi extraído pela primeira vez do lenho da árvore argentina

“Lapacho” Tabebuia avellanedae Lorentz ex. Griseb, da família Bignoneaceae. No Brasil, a

árvore argentina é conhecida popularmente como ipê-roxo ou simplesmente ipê, ocorrendo

em todo território nacional, principalmente nas regiões Norte e Nordeste (ARAÚJO et al.,

2002; SCHMEDA-HIRSCHANN; PAPASTERGIOU, 2003; FONSECA et al., 2004;

CUNHA-FILHO et al., 2007).

Conforme Silva et al. (2003), um dos principais derivados do lapachol são as

naftoquinonas, representadas pela β-lapachona, as quais representam uma ampla e variada

família de metabólitos de distribuição natural. Nos últimos anos intensificou-se o interesse

nessas substâncias, não só devido a sua importância nos processos bioquímicos vitais, como

também ao destaque cada vez maior que apresentam nos estudos farmacológicos.

Segundo Miranda et al. (2001); Silva et al. (2002); Sperandeo (2004); Antunes et al.

(2006) e Cunha-Filho et al. (2007), nos últimos anos tem sido atribuídas várias atividades

farmacológicas a β-lapachona, tais como atividade antiviral, anti-inflamatória, anti-psoriática,

antifúngica e anti-parasitária. No entanto, a maioria dos estudos atuais envolvendo a β-

lapachona enfocam a sua ação sobre o Trypanossoma cruzi, agente etiológico da doenças de

Chagas e sua eficácia no tratamento de neoplasias (LI et al., 2000; LI et al., 2003; PARK et

al., 2005; CHOI et al., 2007; CUNHA-FILHO et al., 2007; SALAS et al., 2008; SONG et al.,

2008).

Com relação a sua atividade antifúngica, Guiraud et al. (1994), utilizando meio líquido

sintético (asparargina 1,5g, L-histidina 100 mg, metionina 20mg, triptofano 20mg, sulfato de

amônio 3,5 g, glicose 10 g, fosfato de potássio 1 g, sulfato de magnésio 0,5 g, cloreto de sódio

0,1 g, biotina 10-8

mol/L, tiamina 10-6

mol/L, piridoxina 10-6

mol/L, ácido nítrico 10-6

mol/L,

inositol 10-5

mol/L) fizeram um estudo comparativo entre as atividades antibacteriana e

antifúngica do lapachol e β-lapachona. Os autores constataram que os fungos foram mais

sensíveis do que as bactérias, particularmente à β-lapachona. Dentre isolados fúngicos

26


testados pelos autores, destaca-se C. neoformans o qual foi inibido frente a β-lapachona, o que

não ocorreu com o lapachol. A CIM foi de 0,02 µg/mL e a fungicida foi de 1 µg/mL.

Tandon et al. (2004) sintetizaram 10 compostos derivados de naftoquinonas e testaram

suas atividades antiviral, anticancer e antifúngica. Os autores analisaram tanto fungos

filamentosos quanto leveduras, as quais destacam-se Candida albicans e Cryptococcus

neoformans. Os compostos que apresentaram uma CIM ≤ 50 µg/mL foram considerados

ativos pelos pesquisadores. A atividade dos compostos foi comparada a drogas de referência

como anfotericina B, miconazol e nistatina.

Em outro estudo, utilizando para a determinação da CIM as normas do NCCLS

(2002), os autores evidenciaram atividade antifúngica da β-lapachona frente a uma cepa de

Saccharomyces cerevisiae, com CIM de 100 µg/mL (ANTUNES et al., 2006).

Atualmente, há grande interesse pela farmacologia e mecanismo de ação da β-

lapachona. Os testes in vitro podem contribuir para o esclarecimento em maior profundidade

dos mecanismos de atividade dos fitofármacos e, em conseqüência, para o planejamento de

novos medicamentos comerciais. Estudos recentes mostram que os mecanismos de

citoxicidade da β-lapachona ainda não foram completamente esclarecidos (SILVA et al.,

2002; MENACHO-MARQUÉS; MURGUIA, 2006).

27


REFERÊNCIAS

Abbeg, M.A.; Cella, F.L.; Faganello, J.; Valente, P.; Shrank, A.; Vainstein, M.H. 2006.

Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii isolated from the excreta of

Psittaciformes in a Southern Brazilian Zoological Garden. Mycopathologia 161:83-91.

Abrams, B.B; Hanel, H.; Hoehler, T. 1992. Ciclopirox olamine: a hidroxypyridone antifungal

agent. Clinics in Dermatology 9:471-477.

Antunes, R.M.P; et al. 2006. Atividade antimicrobiana in vitro e determinação da

concentração inibitória mínima (CIM) de fitoconstituintes e produtos sintéticos sobre

bactérias e fungos leveduriformes. Braz J Pharmacogn 16(4):517-524.

Araújo, E.L.; Alencar, J.R.B.; Neto, P.J.R. Lapachol: segurança e eficácia na terapêutica.

2002. Rev Bras Farmacogn 12:57-59.

Averbuch, D.; et al. 2002. Fungemia in a cancer patient caused by fluconazole-resistant

Cryptococcus laurentii. Med Mycol 40(5):479-484.

Barnett, J.A.; Payne, R.W.; Yarrow, D. Yeast: characteristics and identification. 2000. 3 ed.

Cambridge: University press, 1139p.

Baroni, F.A.; et al. 2006. Cryptococcus neoformans strains islated from church towers in Rio

de Janeiro city, RJ, Brazil. Rev Inst Med Trop 48(2):71-75.

Bernardo, F.M.; Martins, H.M.; Martins, M.L. 2001. Urban sources of Cryptococcus sp.-

Lisbon (Portugal). RPCV 96:157-160.

Bivanco, F.C.; Machado, C.A.S., Martins, E.L. Cutaneous cryptococcosis. 2006. Arq Med

ABC 31(2):102-109.

Boekhout, T.; et al. 2001. Hybrid genotypes in the pathogenic yeast Cryptococcus

neoformans. Microbiology 147:891-907.

Bohr, M.; Kraemer, K.T. 2000. Dermatopharmacology of Ciclopirox nail lacquer topical

solution 8% in the treatment of onychomycosis. JAAD 43(4):57-69.

Brandão, M.G.L.; Moreira, R.A.; Acúrcio, F.A. 2001. Interesse dos estudantes de Farmácia e

Biologia por plantas medicinais e fitoterapia. Braz J Pharmacogn 11(2):71-76.

Brandt, M.E.; et al. 1996. Molecular subtype distribution of Cryptococcus neoformans in four

areas of the United States. Cryptococcal Disease Active Surveillance Group. J Clin

Microbiol 34(4):912-7.

Casadevall, A.; Perfect, J. R. 1998. Cryptococcus neoformans. Washington, DC: American

Society for Microbiology Press, 541 p.

Casali, A.K.; et al. 2003. Molecular typing of clinical and environmental Cryptococcus

neoformans in the Brazilian state Rio Grande do Sul. FEMS Yeast Res 3:405-415.

28


Casali, A.K.; et al. 2001. Cryptococccus neoformans: aspectos moleculares e

epidemiológicos. J Clin Microbiol 20:34-37.

Choi, E.K.; et al. 2007. Upregulation of NAD(P):Quinone oxidoredustase by radiation

potentiates the effect of bioreductive β-lapachone on cancer cells. Neoplasia 9(8):634-642.

Clinical and Laboratory Standards Institute. 2005. Reference method for broth dilution testing

of yeasts: Approved standard-second edition M27-A2. CLSI, Wayne, PA, U.S.A.

Corrêa, M.P.S.C.; et al. 1999. Criptococose em crianças no estado do Pará, Brasil. Rev Soc

Bras Med Trop 32(5):505-8.

Corrêa, M.P.S.C.; et al. 2002. The spectrum of computerized tomography (CT) findings in

cerebral nervous system (CNS) infection due to Cryptococcus neoformans var. gattii in

immunocompetent children. Rev Inst Med Trop 44(5):283-287.

Cuenca-Estrella, M.; et al. 2001. Flucytosine primary resistance in Candida species and

Cryptococcus neoformans. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 20:276-279.

Cunha-filho, M.S.S.; et al. 2007. Characterization of β-Lapachone and Methylated β-

Cyclodextrin Solid-state System. AAPS PharmSciTech 8:E1-10.

Darzé, C.; et al. 2000. Características clínicas laboratoriais de 104 casos de meningoencefalite

criptocócica. Rev Soc Bras Med Trop 33(1): 21-6.

Diaz, M.R.; Fell, J.M. 2005. Use of a suspension array for rapid identification of the varieties

and genotypes of the Cryptococcus neoformans species complex. J Clin Microbiol

43(8):3662-3672.

Dilhuydy, M.S.; et al. 2007. Cutaneous cryptococosis with alemtuzumab in a patient treated

for chonic lymphocytic leukaemia. British J Haematol 137:490.

Dinato, S.L.M; et al. 2006. Disseminated cutaneous cryptococcosis in a patient with AIDS.

Rev Inst Med Trop 48(6):353-358.

Dismukes, W.E. 2000. Introdution to antifungical drugs. Clin Infect Dis 30:653-657.

Duin, D.V.; Casadevall, A.; Nosanchuk, J.D. 2002. Melanization of Cryptococcus

neoformans and Histoplasma capsulatum Reduces Their Susceptibilities to Amphotericin

B and Caspofungin. Antimicrob Agents Chemother 46(11):3394-3400.

Byrnes, E.J.; et al. 2010. Emergence and Pathogenicity of Highly Virulent Cryptococcus

gattii Genotypes in the Northwest United States. PLoS Pathog 6(4): e1000850.

Ehrensing, E.R.; Saag, M.S. Criptococose. 2001. In: SAROSI, G.A.; DAVIES, S.F. Doenças

fúngicas do pulmão. 3ed. Rio de Janeiro: Revinter, cap 7, 89-101.

Fernandes, O.F.L.; et al. 2000. Cryptococcus neoformans in patients with AIDS. Rev Soc Bras

Med Trop 33(11):75-78.

29


Fernandes, O.F.L.; et al. 2003. In vitro susceptibility characteristics of Cryptococcus

neoformans varieties from AIDS patients in Goiânia, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz

98(6): 839-41.

Ferreira, H.S. 1998. Medicamentos a partir de plantas medicinais no Brasil. Rio de Janeiro:

Acad Bras de Cienc, 132p.

Fica, C.A. 2004. Tratamiento de infecciones fúngicas sistêmicas. III parte: anfotericina B,

aspectos farmacoeconómicos y decisiones terapéuticas. Rev Chil Infect 21:317-26.

File, JTM. Visão geral sobre resitência antimicrobiana nos anos 90. Ple Chest 2:3-8, 2000.

Filippin, F.B.; Souza, L.C. 2006. Eficiência terapêutica das formulações lipídicas de

anfotericina B. Braz J Pharm Sci 42(2):167-194.

Filiú, W.F.O.; et al. 2002. Cativeiro de aves como fonte de Cryptococcus neoformans na Cida

de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil. Rev Soc Bras Med Trop 35(6):591-595.

Fonseca, S.G.C.; et al. 2004. Validação de metodologia analítica para doseamento de soluções

de Lapachol por CLAE. Química nova 27(1):157-159.

Franzot, S.P.; et al. 1997. Molecular epidemiology of Cryptococcus neoformans in Brazil and

the United States: evidence for both local genetic differences and a global clonal

population structure. J Clin Microbiol 35(9):2243-51.

Guiraud, P.; et al. 1994. Comparasion of antibacterial and antifungal activities of lapachol and

beta-lapachone. Planta Med 60:373-374.

Gupta AK. 2001a. Ciclopirox nail lacquer: a brush with onychomycosis. Cutis 68(2):13-6.

Gupta, A.K. 2001b. Ciclopirox olamina: an overview. Inter J Dermatol 40:305-310.

Gupta AK. 2005c. Ciclopirox topical solution, 8% combined with oral terbinafine to treat

onychomycosis: a randomized, evalutor-blinded study. J Drugs Dermatol 4(4):481-5,

2005c.

Gupta, A.K., Schouten, J.R.; Lynch, L.E. 2005. Ciclopirox nail lacquer 8% for the treatment

of onychomycosis: a Canadian perspective. Skin Therapy Lett 10(7):1-3.

Gupta, A.K.; Kohli, Y. 2003. In vitro susceptibility testing of ciclopirox, terbinafine,

ketoconazole and itraconazole against dermatophytes and non dermatophytes, and in vitro

evaluation of combination antifungal activity. British J Dermatol 149:296-305.

Gupta, G.; Fries, B.C. 2010. Variability of phenotypic traits in Cryptococcus varieties and

species and the resulting implications for pathogenesis. Future Microbiol 5:775-787.

Gupta, A.K.; Skinner, A.R. 2003. Ciclopirox for the treatment of superficial fungal infections:

a review. Inter J Dermatol 42:3-9.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Gupta+AK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Lynch+LE%22%5BAuthor%5D

30


Gupta, A.K; Plott, T. 2004. Ciclopirox: abroad-spectrum with antibacterial and anti-

inflammatory properties. Inter J Dermatol 43:3-8.

Hannel, H.; Roether, W.; Dittmar, W. 1988. Evoluation of the fungicidal action of in vitro and

in a skin model considering the influence of penetration kinetics on various standards

antimycotics. J NY Acad Sci 544:329-337.

Honsho,C.S.; et al. 2003. Generalized systemic cryptococosis in a dog after

immunossupressive corticotheray. Arq Bras Med Vet Zootec 55(2):155-159.

Hoog, G.S. et al. 2000. Atlas of Clinical Fungi. 2 ed. Centraalbureau voor Schimmelcultures:

Universitat Rovira i Virgili, 1126p.

Hull, C.M.; Heitman, J. 2002. Genetics of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Genet

36:557-615.

Idnurm, A.; 2005. Deciphering the Model Pathogenic Fungus Cryptococcus neoformans. Nat

Rev Microbiol 3:753-764.

Igreja, R.P.; et al. 2004. Molecular epidemiology of Cryptococcus neoformans isolates from

AIDS patients of the Brazilian city, Rio de Janeiro. Med Mycol 42:229-38.

Ikeda, R.; et al. 2002. Laccase and melanization in clinically important Cryptococcus species

other than Cryptococcus neoformans. J Clin Microbiol 40(4):1214-8.

Iwata, K.; yamaguchi, H. 1981. Studies on the mechanism of antifungal action of ciclopirox

olamine. Drug Res 31:1323-1327.

Jain, N.; et al. 2005. Molecular epidemiology of clinical Cryptococcus neoformans strains

from India. J Clin Microbiol 43(11):5733-5742.

Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule biosynthesis and regulation. 2004. FEMS Yeast

Res 4(8):765-771.

Jue, S.G.; Dawson, G.W.; Brogden, R.N. Ciclopirox olamine 1% cream. 1985. A preliminary

review if its antimicrobial activity and therapeutic use. Drugs 29:330-341.

Kidd, S.E.; et al. 2004. A rare genotype of Cryptococcus gattii caused the cryptococosis

outbreak on Vancouver Island (British, Columbia, Canada). Proc Natl Acad Sci USA

101:17258-17263.

Kokjohn, K.; Bradley, M.; Griffiths, B. 2003. Evaluation of in vitro activity of ciclopirox

olamine, butenafine HCL and Econazole nitrate against dermatophtoses, yeasts and

bacteria. Inter J Dermatol 42:11-17.

Kommers, G.D.; et al. 2005. Granulomatous cryptococcal pneumonia in a hose. Cienc Rural,

35(4):938-940.

Kwon-Chung, K.J.; Bennett, J.E.; Theodore, T.S. 1978. Cryptococcus bacillisporus sp. nov.:

serotype B-C of Cryptococcus neoformans. Inst J Syst Bacteriol 28:616-620.

31


Kwon-Chung, K.J.; Polacheck, I.; Bennett, J.E. 1982. Improved diagnostic medium for

separation of Cryptococcus neoformans var. neoformans (serotypes A and D) and

Cryptococcus neoformans var. gatti (serotypes B and C). J Clin Microbiol 15:535-537.

Lacaz, C.S.; et al. 2002a. Tratado de Micologia Médica. 9 ed. São Paulo: Sarvier, 1104p.

Lacaz. C.S., et al. 2002b. Primary cutaneous cryptococcosis due to Cryptococcus neformans

var gattii serotype B, in an immunocompetent patient. Rev Inst Med Trop 44(4):225-8.

Larsson, C.E.; et al. 2003. Canine ocular cryptococosis: a case report. Arq Bras Med Vet

Zootec, 55(5):533-538.

Lazera, M.S.; et al. 1998. Cryptococcus neoformans var. gattii evidence for a natural habitat

related to decaying wood in pottery tree hollow. Med Mycol 36:119-122.

Lee, Y.A. et al. 2004. First report of Cryptococcus albidus – induced disseminated

cryptococcosis in a renal transplante recipient. Korean J Intern Med, 19:53-57.

Lengeler, K.B.; Cox, G.M.; Heitman, J. 2001. Serotype AD strains of Cryptococcus

neoformans are diploid or aneuploid and are heterozygous at the mating-type locus. Infect

Immun 69:115-22.

Li, Y.; et al. 2000. Potent induction of apoptosis by β-lapachone in human multiple myeloma

cell lines and patient cells. Trends Mol Med 6(12):1008-1015.

Li, Y.; et al. 2003. Selective killing of cancer cells by b-lapachone: direct checkpoint

activation as a strategy against cancer. Proc Natl Acad Sci USA 100:2674-2678.

Lin, X.; Heitman, J. 2006. The biology of the Cryptococcus neoformans species complex.

Microbiology 60:69-105.

Litvintseva, A.P.; et al. 2005. Comparative analysis of environmental and clinical populations

of Cryptococcus neoformans. J Clin Microbiol 43(2):556-64.

Lozano-Chiu, M.; et al. 1998. Detection of resistance to amphotericin B among Cryptococcus

neoformans clinical islates: performances of three different media assessed by using E-test

and National Committee for Clinical Laboratory Standards M27-A methodologies. J Clin

Microbiol 36:2817-2822.

Luisi, S.B.; et al. 2008. Use of amphotericin B as antifungal agent in a culture medium for

human dental pulp cells. Rev Odonto Ciênc 23(1):58-62.

Macdougall, L.M.; Fyfe, M. 2006. Emergence of Cryptococcus gattii in a novel enviroment

provides clues to its incubation period. J Clin Microbiol 44(5):1851-1852.

Martinez, L.R.; Garcia-Rivera, J.; Casadevall, A. 2001. Cryptococcus neoformans var.

neoformans (serotype D) strains are more susceptible to heat than Cryptococcus

neoformans var. gattii (serotype A) strains. J Clin Microbiol 39(9):3365-3367.

32


Mccurdy, L.H.; Morrow, J.D. 2001. Ventriculitis due to Cryptococcus uniguttulatus. South

Med J 94(1):65-66.

Melo N.T., et al. 1993. Quimiotipagem do Criptococcus neoformans. Revisão de Literatura.

Novos dados epidemiológicos sobre a criptococose. Nossa experiência com o emprego do

meio C.G.B. no estudo daquela levedura. Rev Inst Med Trop 35(5):469-478.

Menacho-Márquez, M.; Murguía, J.R. 2006. β-lapachone Activates a Mre11p-Tel1p G1/S

Checkpoint in Budding Yeast. Cell Cycle 5(21):2509-2516.

Meyer, W.; et al. 2003. Molecular typing of IberoAmerican Cryptococcus neoformans

isolates. Emerging Infect Dis 9(2):189-95.

Meyer, W.; et al. 1999. Molecular typing of global isolates of Cryptococcus neoformans var.

neoformans by polymerase chain reaction fingerprinting and randomly amplified

polymorphic DNA – a pilot study to standardize techniques on which to base a detailed

epidemiological survey. Electrophoresis 20:1790-9.

Miranda, F.; et al. 2001. Antinociceptive and antiedematogenic properties and acute toxicity

of Tabebuia avellanedae Lor. Ex. Griseb. Inner bark aqueous extract. BMC Pharmacology

1:6-11.

Mitchell, T.G.; Perfect, J.R. 1995. Cryptococcosis in the Era of AIDS – 100 Years after the

Discovery of Cryptococcus neoformans. Rev Clin Microbiol 8(4):515-548.

Moreira, T.A.; Ferreira, R.M.R.; Borges, A.S. 2006. Cryptococosis: clinical epidemiologycal

laboratorial study and fungi varieties in 96 patients. Rev Soc Bras Med Trop 39:255-258.

National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). 2002. Reference method for

broth dilution testing of yeasts: Approved standard-second edition M27-A2. Wayne, PA.

Nelson, R.W.; Couto, C.G. 2001. Doenças micóticas polissistêmicas. Medicina interna de

pequenos animais. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 1023-1030.

Nielsen K.; Obaldia, A. L.; Heitman, J. 2007. Cryptococcus neoformans Mates on Pigeon

Guano: Implications for the Realized Ecological Niche and Globalization. Eukaryotic Cell

6(6):949–959.

Niewerth, M; et al. 2003. Ciclopirox Olamine treatment affects the expression pattern of

Candida albicans genes encoding virulence factors, iron metabolism proteins, and drug

resistance factors. Antimicrob Agents Chemother 47:1805-1817.

Nishikawa, M.M.; et al. 2003. Serotyping of 467 Cryptococcus neoformans Isolates from

Clinical and Environmental Sources in Brazil: Analysis of Host and Regional Patterns. J

Clin Microbiol 41:73–77.

Nucci, M.; Marr, K.A. 2005. Emerging fungal diseases. Clin Infect Dis 41:521-526.

33


Núñez, M.; et al. 2000. Pulmonary Cryptococcosis in the Immunocompetent Host : therapy

with fluconazole: a report of four cases and a review of the literature. American College of

Chest Physicians 118:527-534.

Pappalardo, M.C.S.M.; Melhem, M.S.C. 2003. Cryptococcosis: a review of the Brazilian

experience for the disease. Rev Inst Med Trop 45:299-305.

Park, H.J.; et al. 2005. Heat-induced up-regulation of NAD(P):H: Quinone Oxidoreductase

potentiates anticancer effects of β-lapachone. Clin Cancer Res 11(24):8866-8871.

Pereira, A.P.C.; Coutinho, S.D.A. 2003. Criptococose em cães e gatos- revisão. Rev Clin Vet

8(45):24-32.

PFALLER, M. Aet al. 2002. Clinical evaluation of a frozen commercially prepared

microdilution panel for antifungal susceptibility testing of seven antifungal agents,

including the new triazoles posaconazole, ravuconazole, and voriconazole. J Clin

Microbiol 40:1694-1697.

Queiroz, J.P.A.F.; et al. 2008. Criptococose- uma revisão bibliográfica. Acta Vet Bras

2(2):32-38.

Reolon, A.; Perez, L.R.R.; Mezzari, A. 2004. Prevalência de Cryptococcus neoformans nos

pombos urbanos da cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. J Bras Patol Med Lab

40(5):293-298.

Rex, J. H.; et al. 2001. Antifungal susceptibility testing: practical aspects and current

challenges. Rev Clin Microbiol 14:643-658.

Rippon, J.W. 1982. Medical mycology: the pathogenic fungi and the pathogenic

actinomycetes. 2.ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company, 842p.

Rosen, T., Lingappan, A. 2006. Rapid treatment of tinea nigra palmaris with ciclopirox

olamine gel, 0.77%. Skinmed 5(4):201-3.

Rozenbaum, R.; Gonçalves, A.J. 1994. Clinical epidemiological study of 171 cases of

cryptococcosis. Clin Infec Dis 18(3):369-80.

Salas, C.; et al. 2008. Trypanosoma cruzi: activities of lapachol and alpha- and beta-lapachone

derivatives against epimastigote and trypomastigote forms. Bioorg Med Chem 16(2):668-

74.

Salkin, I.F.; Hurd, N.J. 1982. New medium for differentiation of Cryptococcus neoformans

serotype pairs. J Clin Microbiol 15(1):169-171.

Santos-Jr, I.D.; et al. 2005. Características gerias da ação, do tratamento e da resistência

fúngica ao fluconazol. Sc Me 15(3):189-197.

Sar, B.; et al. 2004. Increasing in vitro resistance to fluconazole in Cryptococcus neoformans

Cambodian isolates. J Antimicrob Chemother 54:563-565.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Rosen+T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Lingappan+A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Salas%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

34


Schmeda-Hirschann, G; Papastergiou, F. 2003. Naphtoquinone derivates and lignans from the

Paraguayan crude drug “tayipytá” (Tabebuia heptaphylla, Bignoniaceae). Z Naturforsch

58:495-501.

Severo, L.C.; Oliveira, F.M.; Silva, V.B. 1998. Diferenças clínicas, epidemiológicas, e

ecológicas entre as duas variedades de Cryptococcus neoformans. Rev Med St Casa Porto

Alegre 9(16):1672-1686.

Sidrim, J.J.C; Rocha, M.F.G. 2004. Micologia médica à luz de autores contemporâneos. Rio

de Janeiro: Guanabara Koogan, 388p.

Silva, A.J.M.; et al. 2002. Synthesis and preliminary pharmacological evaluation of new 1,4

naphthoquinones structurally related to lapachol. Bioorg Med Chemistry 10:2731-2738.

Silva, M.N.; Ferreira, V.F.; Souza, M.C.B.V. 2003. Um panorama atual da química e da

farmacologia de naftoquinonas, com ênfase na β-lapachona e derivados. Química nova

26(3):407-416.

Silva, P.R.; et al. 2008. Susceptibility to antifungal agents among Cryptococcus neoformans

varieties isolated from patients at a university hospital. Rev Soc Bras Med Trop 41(2):158-

162.

Song, C.W.; et al. 2008. Anti-cancer effect of bio-reductive drug beta-lapachone is enhanced

by activating NQO1 with heat shock. Int J Hyperthermia 24(2):161-9.

Sperandeo, N.R. 2004. Synthesis, antiprotozoal, cytotoxic activities of new N-(3,4-dimethyl-

5-isoxazolyl)-1,2-naphthoquinone-4-amino derivates. IL Farmaco 59:431-435.

Sorrel, T.C. 2001. Cryptococcus neoformans var. gattii. Med Mycol, 39:155-168.

Starova, A.; Aly, R. 2005. The safety and efficacy of ciclopirox olamine for the treatment of

seborrheic dermatitis. Expert Opin Drug Saf. 4(2):235-9.

Taboada, J. 2004. Systemic Mycoses. Rev Med Trop 47:31-36.

Tandon, V.K.; Singh, R.V.; Yadav, D.B. 2004. Synthesis and evaluation of novel 1,4-

naphthoquinone deriates as antiviral, antifungal and anticancer agents. Bioorg Med Chem

Lett 14:2901-2904.

Urbani, L.; Sherwood, S.W.; Schimke, R.T. 1995. Dissociation of nuclear and cytoplasmic

cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Exp Cell Res 219:159-

168.

Vandeputte, J.; Wachtel, J.L.; Stiller, E.T. 1956. Amphotericin A and B antifungal antibiotics

produced by a Streptomycete. II The isolation and properties of the crystalline

amphotericins. Antibiot Annu 1955-1956:587-591.

Vilchez, R.A.; Fung, J.; Kusne, S. 2002. Cryptococosis in a organ transplant recipients: an

overview. Am J Tranplant 2:575-580.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Song%20CW%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

35


Walash, M.I.; et al. 2006. Spectrofluorimetric determination of ciclopirox olamine via ternary

complex with Tb(III) and EDTA. Acta Pharm 56:431–440.

Walsh, T.J.; et al. 2000. Correlation between in vitro and in vivo antifungal activities in

experimental fluconazole-resistant oropharyngeal and esophageal candidiasis. J Clin

Microbiol 38(6):2369-2373.

Weig, M.; Reichard, U.; Grob, U. 2001. Aspergillus fumigatus-virulence and opportunism.

Mycoses 44:351-355.

Wu, T.C. 1994. On the development of antifungal agents: perspective of the U.S. Food and

Drug Administration. Clin Infect Dis 19:54-58.

Zanini, M., Martins, E.L., Lacaz, C.S. 2001. Úlcera como primeira manifestação de

criptococose sistêmica em paciente aidético. Med Cutan Iber Lat Am 29(3):92-6.

Zaragosa O. et al. 2006. The polysaccharide capsule of the pathogenic fungus Cryptococcus

neoformans enlarges by distal growth and is rearranged during budding. Mol Microbiol

59(1):67-83.

Zaitz, C.; et al. 1998. Compêndio de Micologia Médica. 1.ed. Rio de Janeiro: Medsi Editora

Médica e Científica, 434p.

Zhu, L.P.; et al. 2002. Case reports. Pulmonary Cryptococcosis associated with cryptococcal

meningitis in non- AIDS Patients. Mycoses 45:111-117.

36


2 CICLOPIROX OLAMINE: AN ANTIFUNGAL ALTERNATIVE AGAINST

CRYPTOCOCCOSIS

P.C. Oliveira, C.S.Q. Medeiros, D.P.C. Macêdo, S.L. Andrade, M.T.A.L. Correia, S.D.

Mesquita, R.G. Lima-Neto and R.P. Neves

ABSTRACT

Aims: The in vitro activity of ciclopirox olamine was evaluated against Cryptococcus spp.

obtained from the cerebrospinal fluid (CSF) of immunocompromised patients. Methods and

Results: The antifungal activity of ciclopirox olamine was tested against Cryptococcus spp.

obtained from the CSF of immunocompromised patients, using amphotericin B and

fluconazole as controls. The minimal inhibitory concentration was determined following the

microdilution method indicated by the Clinical and Laboratory Standards Institute. The

minimal fungicide concentration was determined by the absence of growth on Sabouraud

dextrose agar. The data obtained showed that antifungal activity of ciclopirox olamine ranged

from 0.25 to 1 µg ml-1

). Conclusions: This paper underscores the importance of the antifungal

potential of ciclopirox olamine against Cryptococcus spp. as an alternative treatment against

systemic cryptococosis. In vivo experiments are essential for future medical use. Significance

and Impact of the Study: This was the first time that ciclopirox olamine was tested against

Cryptococcus spp. using the reference method. The antifungal activity of this drug against this

species suggests an applicable potential for systemic cryptococcosis therapy.

Keywords: antifungal activity, ciclopirox olamine, Cryptococcus spp., susceptibility.

Artigo publicado na revista Letters in Applied Microbiology, 2010.

37


Introduction

Despite the widespread prophylactic use of agents with antifungal properties,

infections caused by Cryptococcus spp. are causing increasing mortality and morbidity in a

variety of immunocompromised patients. High rates of fungal persistence and recurrence have

sparked growing concern among clinicians regarding the potential emergence of resistance

among these capsulated yeasts (Cowen and Steinbach 2008).

Amphotericin B, 5-flucytosine and fluconazole have been used to treat cryptococcosis,

but they are frequently unsuccessful and also can cause drug-related toxicity from hazardous

drug–drug interactions, pharmacokinetic problems and the development of resistance (Perfect

and Cox 1999). Therefore, it is imperative to find alternative antifungal agents for

cryptococcosis treatment with no toxicity to mammalian cells (Souza et al. 2005; Mattos et al.

2006; Sabatelli et al. 2006).

CPO is a synthetic antifungal agent currently used for the topical treatment of fungal

infections (Gupta and Skinner 2003). In addition, it has a broad spectrum against species of

bacteria and fungi, inhibiting nearly all clinically relevant dermatophytes and yeasts,

including Malassezia species and the frequently azole-resistant Candida isolates (Niewerth et

al. 2003; Walash et al. 2006). Furthermore, it has demonstrated others benefits, such as anti-

inflammatory and anti-tumour activities (Niewerth et al. 2003). However, in vitro tests of the

effectiveness of ciclopirox olamine against Cryptococcus spp. strains based on reference

method have not been performed yet.

The aim of this study was to evaluate the in vitroantifungal properties of ciclopirox

olamine against 16 Cryptococcus neoformans isolates obtained from the cerebrospinal fluid

(CSF) of immunocompromised patients.

38


Materials and Methods

Fungal strains

Sixteen strains of Cryptococcus spp. obtained from the CSF of immunocompromised

patients were analysed in this study. Lumbar punctures were carried out at the Pernambuco

Neurological Diagnosis Service, and clinical samples were processed for mycological

diagnosis using standard methods (direct examination and isolation in culture) at the Medical

Mycology Laboratory, Federal University of Pernambuco (UFPE). Direct examination was

performed with India ink staining. Cultures were prepared using Sabouraud dextrose agar

(SDA) (Difco) with chloramphenicol (50 mg ml-1

) and incubated at 30 and 35_C in an aerobic

atmosphere for 5 days. Pure cultures were transferred onto the surface of SDA for taxonomic

identification (Barnett et al. 2000; De Hoog et al. 2000). All tested strains are preserved under

mineral oil (Sherf 1943) in the URM Culture Collection-UFPE. Candida parapsilosis (ATTC

22019) and Candida krusei (ATCC 6528) strains were used as quality controls.

Antifungal activity

The method used followed the conditions reported in M27-A3 (CLSI, 2008a,b). The

culture medium used during the experiments was RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, USA) with l-

lutamine and without sodium bicarbonate, pH 7.0 ± 0.1, with morpholine-propanesulfonic

acid (MOPS; 0.165 mol-1

; Sigma-Aldrich). The medium was filter-sterilized in 0.22µm

membranes (Millipore, Darmstadt, Germany). The commercial drugs used for comparison

were amphotericin B (AMB; Bristol-Myers Squibb, Princeton, USA) and fluconazole (FLZ;

Pfizer, New York, USA), prepared in dimethyl sulfoxide (DMSO; Gibco, Minas Gerais,

Brazil) and distilled water, respectively.

Ten different concentrations were used, ranging from 0.03 to 16 lg ml)1 for AMB and

from 0.125 to 64 µg ml-1

for FLZ. Ciclopirox olamine (CPO; Medley S.A., Campinas-Sao

Paulo, Brazil) was diluted in DMSO with stock solutions at concentrations of 1600 mg mL-1

.

The tested concentrations of CPO ranged from 0.0625 to 32 µg ml-1

. The Cryptococcus spp.

39


were maintained on SDA medium and incubated at 35°C. Suspensions of the isolates were

prepared, and their density was adjusted according to the 0.5 MacFarland standard for 90%

transmission using a spectrophotometer. The volume of the inoculums was adjusted to 5.0 ml

of sterilized saline and was further diluted in RPMI 1640 to a concentration of 2– 5 x 103 cells

ml-1

.

For the susceptibility tests, sterilized flat-bottomed 96 well microtitre plates (TPP;

Trasadingen, Switzerland) were used and the procedures followed CLSI (2008a,b). The

inoculum was added to the wells with the tested drugs, and the plates were incubated at 25°C

for 3 days before reading the results to determine the minimal inhibitory concentration (MIC)

of the CPO, AMB and FLZ. The growth inhibition was demonstrated by visual observation

and optical density at 492–630 nm using the Microplate Manager software, in a Thermo Plate

microplate reader (TP Reader NM).

The MICs for CPO and FLZ were the concentrations able to inhibit fungal growth

≥80% (CLSI, 2008a,b). For AMB, the MICs were determined to have 100% inhibition

relative to that of growth controls. To determine the minimal fungicide concentration (MFC)

of CPO and AMB, the content of the wells that showed 80 and 100% growth inhibition for

CPO and 100% for AMB was transferred onto SDA in Petri dishes. The dishes were then

incubated at 35°C for 3 days to determine the fungal viability. The MFC was confirmed by

the absence of fungal growth.

The CPO sensitivity was determined according to the document M27-A3 (CLSI,

2008a,b), based on the sensitivity range of AMB (≤ 1 mg ml)1), which is the drug of choice

for the treatment of cryptococcosis. In addition, the evaluation was also based on the new

document M38-A2 (CLSI, 2008a,b), which includes tests with CPO for dermatophytes,

suggesting that most MICs ≤1 µg ml-1

are considered susceptible. Each experiment was

performed in duplicate. The MIC and MFC for each antifungal were determined.

40


Results

The results of the antifungal activity measured visually are described in Figs 1 and 2.

The average growth inhibition of Cryptococcus spp. is presented in Fig. 3. All the analysed C.

neoformans strains were susceptible to CPO. CPO showed fungistatic activity in

concentrations ranging from 0.25 to 1 µg ml-1

and fungicidal activity in concentrations from

0.5 to 4 µg ml-1

.

Amphotericin B showed fungistatic activity in concentrations ranging from 0.03 to 1

µg ml-1

and fungicidal activity in concentrations from 0.03 to 2 µg ml-1

. The isolates

numbered 5816 and 5819 showed the same activity for fungistatic and fungicide

concentrations (0.06 and 0.03 ml-1

respectively) for AMB.

Regarding CPO, the 5820 isolate showed the same fungistatic and fungicide

concentrations (1 µg ml-1

). Fluconazole showed only fungistatic activity in concentrations

ranging from 2 to 32 µg ml-1

, and two isolates were dose dependent. The optical density

results were in accordance with those obtained by visual observation. The average growth

inhibition of C. neoformans is presented in Fig. 3.

41


Figure 1 Determination of the minimum inhibitory concentration of ciclopirox olamine,

amphotericin B and fluconazole against Cryptococcus spp. (▲) ciclopirox olamine, (♦)

amphotericin B, (■) fluconazole.

Figure 2 Determination of the minimum fungicide concentration of ciclopirox olamine and

amphotericin B against Cryptococcus spp. (♦) ciclopirox olamine, (■ ) amphotericin B.

42


Figure 3 Average of growth inhibition from ciclopirox olamine (a), amphotericin B (b) and

fluconazole (c) against Cryptococcus spp.

43


Discussion

It has been established that the in vitro activity of CPO occurs against a broad

spectrum of fungi, including pathogenic yeasts such as Candida and Malassezia species.

Furthermore, CPO can be considered both fungistatic and fungicidal, with MICs ranging from

0.9 ± 3.9 µg ml-1

(Gupta 2001; Niewerth et al. 2003; Figueiredo et al. 2007; Biancalana et al.

2008). Our data showed only fungicidal activity of CPO against Cryptococcus with MIC

values up to 1 µg ml-1

.

According to the reference method (CLSI, 2008a,b), dermatophytes are considered

sensitive to CPO when MICs are ≤1 µg ml-1

. Regarding Cryptococcus spp., there are no data

on the antifungal activity of this drug. All the 16 tested strains presented MICs ≤ 1 lg ml-1

and

were considered sensitive.

Our strains exhibited high sensitivity results when compared to those obtained by

Hannel et al. (1988), where the antifungal activity was around 6 µg ml-1

using another

method. The treatment of invasive fungal infections caused by Cryptococcus spp. using

commercially available drugs such as AMB and FLZ has been limited especially because of

their toxicity associated with the emergence of resistant isolates, although this problem is

considered uncommon (Joseph-Horne et al. 1996; Lozano-Chiu et al. 1998; Sar et al. 2004).

The results here showed a decreasing profile related to the number of colony-forming

units (CFU) in response to increasing drug concentrations. Both CPO and AMB demonstrated

more pronounced antifungal capacity than FLZ (Fig. 3a,b). These results were expected, since

AMB is considered fungicidal against pathogenic yeasts (Pfaller et al. 2004; Barchiesi et al.

2005). Fluconazole showed a discrete reduction in CFU density within the range of drug

concentrations tested, as shown in Fig. 3c. These findings were also expected because this

drug is considered to have fungistatic action (Vensel 2002).

Peaks outside the pattern probably occurred because of agglomeration of yeasts,

although the microtiter plates were vigorously homogenized. This fact did not compromise

our data analysis. According to Castellon-Vogel and Menawat (2008), aggregation of yeasts is

a problem in using turbidimetric methods. Jin and Speers (1998) explained that it can occur

because of many factors, such as lectin-like cell–cell interactions, electrostatic interactions of

the fungal components and the presence of cell wall proteins.

Antifungal susceptibility testing has evolved rapidly during the last decade and has

now become a relevant clinical tool. Although CPO has shown slightly higher MIC and MFC

values than AMB against Cryptococcus spp., the absence of toxic effects and resistance

44


(Gupta and Skinner 2003; Myoung and Choi 2003; Niewerth et al. 2003) suggest its

pharmacological value. Although CPO exhibited excellent in vitro results, further in vivo

experiments are still required to consider this drug as a new and promising treatment option

for systemic mycoses such as cryptococcosis. These tests are being performed by our research

group.

Acknowledgements

We thank the National Scientific and Technological Development Council (CNPq) for

granting the fellowship, as well Federal University of Pernambuco (UFPE) for providing the

infrastructure to make this study possible.

References

Barchiesi, F., Spreghini, E., Tomassetti, S., Arzeni, D., Giannin, D. and Scalise, G. (2005)

Comparison of the fungicidal activities of caspofungin and amphotericin B against Candida

glabrata. Antimicrob Agents Chemother 49, 4989–4992.

Barnett, J.A., Paine, R.W. and Yarrow, D. (2000) Yeasts: Characteristics and Identification, 3

edn. Cambridge: Cambridge- University Press.

Biancalana, F.S.C., Telles, P.F.G., Lyra, L. and Zaninelli, A. (2008) Preanalytical conditions

for broth microdilution antifungal susceptibility of Microsporum spp. Mycoses 51, 313–317.

Castellon-Vogel, M.A. and Menawat, A.S. (2008) A method to disperse aggregates of a

flocculent yeast for photometric analysis. Biotechnol Prog 6, 135–141.

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2008a) Reference Method for Broth

Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi: Approved Standard, 2nd

edn.

CLSI document M38-A2, Wayne, PA, USA: CLSI.

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2008b) Reference Method for Broth

Dilution Testing of Yeasts. Approved standard document M27-A3, Wayne, PA, USA: CLSI.

Cowen, L.E. and Steinbach, W.J. (2008) Minireviews: stress, drugs, and evolution: the role of

cellular signaling in fungal drug resistance. Eukaryot Cell 7, 747–764.

De Hoog, G.S., Guarro, J., Gene´, J. and Figueras, M.J. (2000) Atlas of Clinical Fungi. Reus,

Spain: Centraalbureau voor Schimmelcultures ⁄ Universitat Rovira I Virgili. p 1126.

45


Figueiredo, V.T., Santos, D.A., Resende, M.A. and Hamdan, J.S. (2007) Identification and in

vitro antifungal susceptibility testing of 200 clinical isolates of Candida spp. responsible for

fingernail infections. Mycopathologia 164, 27–33.

Gupta, A.K. (2001) Ciclopirox: an overview. Int J Dermatol 40, 305–310.

Gupta, A.K. and Skinner, A.R. (2003) Ciclopirox for the treatment of superficial fungal

infections: a review. Int J Dermatol 42, 3–9.

Hannel, H., Roether, W. and Dittmar, W. (1988) Evaluation of the fungicidal action of in vitro

and in a skin model considering the influence of penetration kinetics on various standards

antimycotics. Ann N Y Acad Sci 544, 329–337.

Jin, Y.-L. and Speers, R.A. (1998) Flocculation of Saccharomyces cerevisiae. Food Res Int

31, 421–440.

Joseph-Horne, T., Loeffler, R.S.T., Hollomon, D.W. and Kelly, S.L. (1996) Amphotericin B

resistant isolates of Cryptococcus neoformans without alteration in sterol biosynthesis. J med

vet Mycol 34, 223–225.

Lozano-Chiu, M., Paetznick, V.L., Ghannoum, M.A. and Rex, J.H. (1998) Detection of

resistance to amphotericin B among Cryptococcus neoformans clinical isolates: performances

of three different media assessed by using E-test and National Committee for Clinical

Laboratory Standards M27-A methodologies. J Clin Microbiol 36, 2817–2822.

Mattos, S.L., Mattos, M., Nakanishi, C.P., Almeida, J.R.P. and Romiti, N. (2006) Case report

disseminated cutaneous cryptococcosis in a patient with AIDS. Rev Inst Med Trop Sao Paulo

48, 353–358.

Myoung, Y. and Choi, H. (2003) Permeation of Ciclopirox across porcine hoof membrane:

effect of pressure sensitive adhesives and vehicles. Eur J Pharm Sci 20, 319–325.

Niewerth, M., Kunze, D., Seibold, M., Shaller, M., Korting, H.C. and Hubel, B. (2003)

Ciclopirox Olamine treatment affects the expression pattern of Candida albicans genes

encoding virulence factors, iron metabolism proteins, and drug resistance factors. Antimicrob

Agents Chemother 47, 1805–1817.

Perfect, J.R. and Cox, G.M. (1999) Drug resistance in Cryptococcus neoformans. Drug Resist

Updat 2, 259–269.

Pfaller, M.A., Sheehan, D.J. and Rex, J.H. (2004) Determination of fungicidal activities

against yeasts and molds: lessons learned from bactericidal testing and the need for

standardization. Clin Microbiol Rev 17, 268–280.

Sabatelli, F., Patel, R., Mann, P.A., Mendrick, C.A., Norris, C.C., Hare, R., Loebenberg, D.,

Black, T.A. et al. (2006) In vitro activities of posaconazole, Fluconazole, Itraconazole,

46


voriconazole, and amphotericin B against a large collection of clinically important molds and

yeast. Antimicrob Agents Chemother 50, 2009–2015.

Sar, B., Monchy, D., Vann, M., Keo, C., Sarthou, J.L. and Buisson, Y. (2004) Increasing in

vitro resistance to fluconazole in Cryptococcus neoformans Cambodian isolates. J Antimicrob

Chemother 54, 563–565.

Sherf, A.F. (1943) A method for maintaining Phytomonas sepedomica for long periods

without transferance. Phytopathology 3, 30–32.

Souza, L.K.H., Fernandes, O.F.L., Kobayashi, C.C.B.A., Passos, X.S., Costa, C.R., Lemos,

J.A., Souza- Junior, A.H. and Silva, M.R.R. (2005) Antifungal susceptibilities of clinical and

environmental isolates of Cryptococcus neoformans in Goiaˆnia city, Goia´ s, Brazil. Rev Inst

Med Trop Sao Paulo 47, 253–256.

Vensel, T.D.H. (2002) Fluconazole: a valuable fungistatic. Prim Care Update Ob Gyns 9,

181–183.

Walash, M.I., Rizk, M.S., Eid, M.B. and Fathy, M.S. (2006) Spectrofluorimetric

determination of ciclopirox olamine via ternary complex with Tb(III) and EDTA. Acta Pharm

56, 431–440.

47


3. In vitro antifungal activity of the naphtoquinone β-lapachone

against clinical isolates of Cryptococcus neoformans.

Patrícia C. Oliveiraa, Caroline S.Q. Medeiros

a, Henrique John Pereira Neves

d, *José V. Lima-

Filhob, Celso A. Camara

c, Reginaldo G. Lima-Neto

a, Danielle P. C. Macêdo

a and Rejane P.

Nevesa*

ABSTRACT

In order to evaluate new therapeutic options against cryptococcosis, the naphthoquinone beta-

lapachone was tested in vitro against sixteen isolates of Cryptococcus neoformans obtained

from immunocompromised patients. The antifungal activity of β-lapachone was tested

against Cryptococcus spp. obtained from the CSF of immunocompromised patients, using

amphotericin B and fluconazole as controls. The minimal inhibitory concentration was

determined following the microdilution method indicated by the Clinical and Laboratory

Standards Institute. The minimal fungicide concentration was determined by the absence of

growth on Sabouraud dextrose agar. The data obtained showed that antifungal activity of β-

lapachone ranged from 4 to 8 µg mL-1

whereas the MICs for Amphotericin B and Fluconazole

ranged from 0.06 to 1 µg mL-1

, and 0.5 to 32 µg mL-1

, respectively. Despite of some

variability in resistance among C. neoformans isolates is possibly according to fungal strain,

the present data suggest that smaller dosages of β-LAP could be quite effective on treatments

against the disease, and perhaps abrogate toxicity. The in vitro antifungal activity of β-

lapachone against Cryptococcus neoformans and its use as a novel antifungal drug is

discussed.

Keywords: antifungal susceptibility, Cryptococcus neoformans, β-lapachone, Tabebuia

impetiginosa.

Artigo a ser submetido a revista Journal of Microbiology, 2011

48


Introduction

The yeast Cryptococcus neoformans is recognized as the main etiological agent of human

cryptococcosis. Furthermore, the organism widespread is more common in

immunocompromissed hosts such as AIDS patients, whom disseminated cryptococcosis has

been increasingly reported (Bernal-Martinez et al., 2010). At the present time, treatment

against the disease is based on antifungal agents, for example amphotericin B associated or

not to flucytosine, followed by maintenance therapy with fluconazole, including long-term

and suppressive regimens (Almeida et al., 2007). However, in many developing countries like

Brazil, the unrestricted availability of antifungal agents besides blind empiric prescribing

practices contribute to spread of fungal resistance, and failure during treatment against

cryptococcosis, especially under fluconazole therapy (Archilbald et al., 2004; Kantarcioglu

and Yucel 2002; Chandenier et al., 2004; Pfaller et al., 2005). In addition, because of the high

cost of eligible new drugs, treatments based on folk medicine have increased in the last years.

β-lapachone (β-LAP) is a synthetic derivative from naturally occurring lapachol

obtained from the bark of lapacho tree (Tabebuia impetiginosa; Bignoniaceae family). This

naphtoquinone is known for more than 40 years and has been reported by its wide range of

pharmacological properties, including anticancer and anti-inflammatory properties (Cunha-

filho et al., 2005; Moon et al., 2007). Old studies have shown in vitro antifungal activity of β-

LAP against C. neoformans strains, but such assays were conducted by non-standardized

methods (D’Albuquerque 1968; Giraud et al. 1994). Recently we have shown daily i.v.

inoculums of β-LAP (10 mg/Kg) to dexamethasone-immunossupressed Swiss mice were not

remarkably toxic, and decreased the C. neoformans burden in lungs and in the brain, similarly

to amphotericin B, 14 days post-infection (Medeiros et al., 2010).

In the present study, the minimum inhibitory concentration of β-lapachone against

sixteen C. neoformans isolates obtained from the cerebrospinal fluid of immunocompromised

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bernal-Martinez%20L%22%5BAuthor%5D

49


patients was determinate through CLSI reference method. The potential of β-LAP on

management of cryptococcosis is discussed.

Materials and Methods

Yeast strains and inoculum preparation

Sixteen C. neoformans strains were obtained from the cerebrospinal fluid (CSF) of

immunocompromised patients. Pure cultures were identified taxonomically according to

Barnett et al. (2000) and De Hoog et al. (2000). The isolates were cultured on a tube

containing 20 mL of Sabouraud Dextrose Agar (SDA) plus chloramphenicol (50 mg ml-1

) at

30°C for two days. Then, suspensions of C. neoformans were prepared in sterile physiological

solution (0.85%), maintained at 35°C and then mixed in a rotator shaker for five minutes. The

inoculum was adjusted to 90% transmittance, which corresponds to 1–5 x 106 cels mL

-1

measured in spectrophotometer.

Antifungal agents

Beta-lapachone (β-LAP) was synthesized from lapachol derived from the bark of T.

impetiginosa using sulfuric acid, according to a method from Cavalcante et al. (2008). The

product was characterized by usual spectroscopic methods, including Hydrogen Nuclear

Magnetic Resonance (HNMR) and infrared spectroscopy (IR). The physicochemical

properties of beta-lapachone were evaluated chromatographically and through comparison of

the melting point of the product profile against a pure sample. The drug was dissolved in

dimethyl sulfoxide (DMSO; Gibco, Minas Gerais, Brazil) and stored at -20°C until use.

Amphotericin B (AMB; Bristol-Myers Squibb, Co., Brazil) and Fluconazole (FLZ; Pfizer,

Brasil) were used as comparator drugs. These drug solutions were prepared in DMSO and

distilled water, respectively.

50


In vitro antifungal susceptibility test

Antifungal susceptibility tests were carried out by the microdilution technique, and set up

according to Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) standard method (CLSI,

2008). Stock solutions of β-LAP were serially diluted in Roswell Park Memorial Institute

media (RPMI-1640) buffered with 4-Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) (Sigma-

Aldrich-USA).

The antifungal agent’s concentrations ranged from 0.125 μg mL-1

to 64 μg mL-1

for β-

LAP; 0.03 μg mL-1

to 16 μg mL-1

for AMB, and 0.125 μg mL-1

to 64 μg mL-1

for FLZ. The

microdilution plates were incubated at 35ºC and fungal growth was checked daily until 72h.

Candida parapsilosis ATTC 22019 and C. krusei ATCC 6528 were used as quality controls.

All tests were performed in duplicate. The endpoint readings were performed visually based

on comparison between fungal growth in wells containing β-LAP and growth in wells

containing no drugs or AMB and FLZ.

The MICs for AMB and FLZ were analyzed according to those concentrations able to

induce 100% and 50% of fungal growth inhibition, respectively (CLSI, 2008). The MIC for ß-

lapachone was defined by those concentrations able to induce 100% of fungal growth

inhibition.

Results

Our data showed β-LAP carries a good antifungal activity against C. neoformans strains with

MIC values ranging from 4 μg mL-1

and 8 μg mL-1

. In addition, most of yeast isolates were

inhibited at the lower concentration of 4 μg mL-1

whereas MIC values for AMB and FLZ

ranged from 0.06 μg mL-1

to 1μg mL-1

and 0.5 μg mL-1

to 32 μg mL-1

respectively. The

results of the antifungal activity measured visually are described in Fig. 4.

51


Figure 4. In vitro susceptibility of Cryptococcus neoformans to β-lapachone ( ) in

comparison to amphotericin B ( ) and fluconazole ( .)

Discussion

In contrast to the present data, previous reports showed MIC for β- LAP ranged from < 1 µg

mL-1

to ≤ 50 μg/mL against C. neoformans (Giraud et al., 1994; Tandon et al., 2004). On the

other hand, D'AIbuquerque reported β-LAP was inactive against Cryptococcus strains

(D’Albuquerque, 1968). Since these studies were conducted by non-reference methods, we

attribute such contradictory results to differences on experimental protocols, particularly the

media which could inactivate the assayed molecules.

Although the mechanisms of action of β-LAP against fungal cells remain unclear, its

effect as inhibitor of cell electron transport and DNA topoisomerase is well known (Howland,

1963). Beta-lapachone also induces an increase in contents of superoxide anions and

hydrogen peroxides promoting cytotoxicity to T. cruzi (Salas et al., 2008). However,

development of new antifungal drugs has been limited by toxicity, as observed for polyenes

used to treat invasive fungal infections (Moraes et al., 2003). Old studies have shown DL50 of

80 mg/kg for β-LAP in rats, but oral daily inoculums of 2 mg/Kg were not lethal to dogs

52


(Santana et al., 1968). Moreover, we have shown that β-LAP was not highly toxic to

immunossupressed Swiss mice at 10 mg/Kg and reduced the C. neoformans burden in target

organs (Medeiros et al., 2010).

In conclusion, despite of some variability in resistance among C. neoformans isolates

is possibly according to fungal strain, the present data suggest that smaller dosages of β-LAP

could be quite effective on treatments against the disease and perhaps abrogate toxicity

through nanoparticles formulations which provide excellent drug stability and effectiveness in

antifungal activity without relevant toxicity.

Acknowledgements

This work was funded by CNPq (Brazilian Council of Research) and RENNEBRA

(Collection Culture Net of North and Northeast regions of Brazil). Prof. Lima-Filho thank to

PET/MEC/SESu for Scholarship support.

References

Almeida, A.M.F., Matsumoto, M.T., Baeza, L.C., Silva, R.B.O., Kleiner, A.A.P., Melhem,

M.S.C. and Giannini, J.S.M. 2007. Molecular typing and antifungal susceptibility of

clinical sequential isolates of Cryptococcus neoformans from São Paulo State, Brazil.

FEMS Yeast Res 7, 152-164.

Archilbald, L.K., Tuohy, M.J., Wilson, D.A., Nwanyanwu, O., Kazembe, P.N.,

Tansuphasawadikul, S., Eampokalap, B., Chaovavanich, A., Reller, L.B., Jarvis, W.L.,

Hall JS and Procop GW. 2004. Antifungal susceptibilities of Cryptococcus neoformans.

Emerg Infect Dis 10, 143-145.

Barnett, J.A., Paine, R.W. and Yarrow, D. 2000. Yeasts: Characteristics and Identification. 3

edn. Cambridge: Cambridge University Press.

Bernal-Martinez, L., Gomez-Lopez, A., Castelli, M.V., Mesa-Arango, A.C., Zaragoza, O.,

Rodriguez-Tudela, J.L. and Cuenca-Estrella, M. 2010. Susceptibility profile of clinical

isolates of non-Cryptococcus neoformans/non-Cryptococcus gattii Cryptococcus species

and literature review. Med Mycol 48, 90-6.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nwanyanwu%20O%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kazembe%20PN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tansuphasawadikul%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Eampokalap%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chaovavanich%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bernal-Martinez%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gomez-Lopez%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Castelli%20MV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mesa-Arango%20AC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zaragoza%20O%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rodriguez-Tudela%20JL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cuenca-Estrella%20M%22%5BAuthor%5D

53


Cavalcante, F.A., Silva, J.L.V., Carvalho, V.M.N., Camara, C.A., Silva, T.M., Pinto, A.C.,

Vargas, M.D. and Silvia, B.A. 2008. Spasmolytic activity of lapachol and its derivatives,

alpha and beta-lapachone, on the guinea-pig ileum involves blockade of voltage-gated

calcium channels. Rev Bras Farm 18,183-189.

Chandenier, J., Adou-Bryn, K.D., Douchet, C., Sar, B., Kombila, M., Swinne, D., Thérizol-

Ferly, M., Buisson, Y., Richard-Lenoble, D. 2004. In vitro activity of amphotericin B,

fluconazole and voriconazole against 162 Cryptococcus neoformans isolates from África

and Cambodia. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 23, 506-508.

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Reference method for broth dilution

Antifungal susceptibility testing of yeasts: Approved standard 3rd edn M27-A3, CLSI,

Wayne, PA, USA, CLSI.

Cunha-Filho, M.S.S., Alves, F.C., Alves, G.M.C., Monteiro, D.B., Medeiros, F.P.M. and

Neto, P.J.R. 2005. Beta-lapachona: desenvolvimento e validação de metodologia analítica

para nova alternativa terapêutica antineoplásica. Rev Bras Farm 86, 39-43.

Cunha-Filho, M.S.S., Dacunha-Marinho, B., Torres-Labandeira, J.J., Martínez-Pacheco, R.

and Landín, M. 2007. Characterization of β-Lapachone and Methylated β-Cyclodextrin

Solid-state System. AAPS PharmSciTech 8, E1-10.

D’Albuquerque IL. (1968) Thermoreaction of 2-hydroxy-3-(methyl-2-butenyl)-1,4-

naphthoquinone. Rev Inst Antib 1968 8, 73-88.

De Hoog, G.S., Guarro, J., Gené, J. and Figueras, M.J. (2000) Atlas of Clinical Fungi.

Centraalbureau voor Schimmelcultures/ Universitat Rovira I Virgili,1126p.

Giraud, P., Steiman, R., Campos-Takaki, G.M., Seigle-Murandi, F. and Buochberg, M.S.

(1994) Comparasion of antibacterial and antifungal activities of lapachol and β-

lapachone. Planta Med 60, 373-374.

Howland JL. (1963) The reversibility of inhibition by 2-heptyl-4-hydroxyquinoline-n-oxide

and 2-hydroxy-3(3-methylbutyl)-1,4- naphthoquinone of succinate oxidation. Biochim

Biophys Acta 73, 665-667.

Kantarcioglu AS and Yucel A. (2002) A flucytosine-resitant Cryptococcus neoformans

(serotype D) strain isolated in Turkey from cutaneous lesions. Med Mycol 40, 519-523.

Medeiros, C.S.Q., Lima-Filho, J.V., Oliveira, P. C., Andrade, S.L., Leal, A.F.G., Camara,

C.A. and Neves, R. P. (2010) Antifungal activity of beta-lapachone against disseminated

infection by Cryptococcus neoformans var. neoformans strain 5811 on

immunosuppressed Swiss mice. Braz J Med Biol Res 43, 345-349.

http://www.springerlink.com/content/?Author=B.+Sar

http://www.springerlink.com/content/?Author=M.+Kombila

http://www.springerlink.com/content/?Author=D.+Swinne

http://www.springerlink.com/content/?Author=M.+Th%c3%a9rizol-Ferly

http://www.springerlink.com/content/?Author=M.+Th%c3%a9rizol-Ferly

54


Moon, D.O., Choi, Y.H., Kim, N.D., Park, Y.M. and Kim, G.Y. (2007)Anti-inflammatory

effects of beta-lapachone in lipopolysaccharidestimulated BV2 microglia. Int

Immunopharmacol 7, 506-514.

Moraes, E.M.P., Prímola, N.S. and Hamdan, J.S. (2003) Antifungal susceptibility of clinical

and environmental isolates of Cryptococcus neoformans to four antifungal drugs

determined by two techniques. Mycoses 46:164-168.

Pfaller, M.A., Messer, S.A., Boyken, L., Rice, C., Tendolkar, S., Hollis, R.J. Doern, G. V. and

Diekema D.J. (2005) Global trends in the antifungal susceptibility of Cryptococcus

neoformans (1990 to 2004). J Clin Microbiol 43, 2163-2167.

Salas, C., Tapia, R.A., Ciudad, K., Armstrong, V., Orellana, M., Kemmerling, U., Ferreira, J.,

Maya, J.D. et al. (2008) Trypanosoma cruzi: activities of lapachol and alpha- and beta-

lapachone derivatives against epimastigote and trypomastigote forms. Bioorg Med Chem

16, 668-674.

Santana, C.F., Lima, O.G., D’Albuquerque IL, Lacerda, A.L. and Martins, D.G. (1968)

Observações sobre as propriedades antitumorais e toxicológicas do extrato do líber e de

alguns componentes do cerne do Pau d’arco (Tabebuia avellanedae). Rev Inst Antib 8,

89-94.

Tandon, V.K., Singh, R.V. and Yadav, D.B. (2004) Synthesis and evaluation of novel 1,4-

naphthoquinone derivatives as antiviral, antifungal and anticancer agents. Bioorg Med

Chem Lett 14, 2901-2904.

http://www.ingentaconnect.com/content/bsc/myc;jsessionid=95q3jrsqrk1fc.alice

55


4. ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY PROFILE OF CRYPTOCOCCUS

NEOFORMANS VARIETIES

*Patrícia Cariolano de OLIVEIRA(1); Caroline Sanuzi Quirino de MEDEIROS(1); Reginaldo

Gonçalves de LIMA-NETO(1); Suanni Lemos de ANDRADE (1); Maria Taciana de Lima Antunes

CORREIA (2); Solange Dornelas MESQUITA(2) & Rejane Pereira NEVES(1)

SUMMARY

The in vitro susceptibility profiles of Cryptococcus neoformans varieties to amphotericin B

(control drug), ciclopirox olamine and β-lapachone were evaluated using microdilution

methods, according to recommendations of the Clinical and Laboratory Standards Institute

(CLSI). The identification of different varieties was performed using L-canavanine-glycine-

bromothymol blue agar (CGB) medium. C. neoformans var. neoformans was identified in

50% of the samples. The minimum inhibitory concentration (MIC) expressed in µg/mL

ranged from 0.25 - 4 for amphotericin B; 0.125 – 1 for ciclopirox olamine and 4 - 8 for β-

lapachone. In the case of C. neoformans var. gattii, MIC values ranged from 0.25 - 4 for

amphotericin B, 0.25-1 for ciclopirox olamine, and 4 - 8 for β-lapachone. The minimum

fungicidal concentration of β-lapachone was 64 µg/mL. Our study demonstrated that

Cryptococcus neoformans strains were especially sensitive to ciclopirox olamine and β-

lapachone. These antifungal agents appear to improve the management of resistant

cryptococcal infections.

KEYWORDS: Antifungal agents; Cryptococcus neoformans; Susceptibility; Varieties;

ciclopirox olamine; β-lapachone

Artigo a ser submetido à revista Memórias do Instituto Oswaldo Cruz

56


INTRODUCTION

There has been a significant increase in morbidity and mortality due to systemic

mycoses6,9,22

, a consequence of the immuno-suppression associated with AIDS, cytotoxic, and

chemotherapeutic treatment2,13,21

. In particular, infections due to Cryptococcus neoformans, a

yeast found in the soil, usually in association with bird droppings3, can be life-threatening.

The fungus has been identified as the main pathogen causing subacute or chronic meningitis,

encephalitis and meningoencephalitis14,19

and is thought to be acquired by inhalation of an

infectious propagule 11

.

The fungus occurs as C. neoformans var. neoformans and C. gatti. Based on the

antigenic specificity of the capsular polysaccharide these varieties can further be divided into

four serotypes, namely A, D and AD (C. neoformans var neoformans) and serotypes B and C

(C. gattii)13,16

. Clinical resistance in C. neoformans is becoming a serious problem, and

minimum inhibitory concentrations (MICs) for some isolates can be high10

. Antifungal

susceptibility testing is of great importance and can be used to direct future drug discovery

and epidemiological investigations15

. The purpose of this study was to characterize the

antifungal susceptibility profile of these different Cryptococcus strains.

MATHERIALS AND METHODS

Thirty C. neoformans strains stocked at the URM Culture Collection (Department of

Mycology, Federal University of Pernambuco, Brazil) were selected and included in this

study. The stock samples preserved in mineral oil were reactivated in glycoside broth and then

transferred to slants containing Sabouraud agar plus yeast extract.

The C. neoformans isolates were identified by their colonial and cellular morphologies

and by their physiological and biochemical characteristics according to BARNETT et al.1 and

HOOG et al.8. The different varieties were distinguished in canavanine-glycine-bromothymol

57


blue agar (CGB) as proposed by KWON-CHUNG et al 12

. These isolates were sub-cultured

on Sabouraud dextrose agar (Difco) contained in Petri dishes 72 h prior the test.

The standard broth microdillution method recommended by the Clinical and

Laboratory Standards Institute 4 was used. Amphotericin B (Fungizone, Squibb, USA) and β-

lapachone were dissolved in dimethyl sulfoxide and ciclopirox olamine was dissolved in

distilled water. Further dilutions of each antifungal agent were prepared with RPMI 1640

medium (Sigma) containing L-glutamine without sodium bicarbonate, and buffered to pH 7.0

with 0.165M morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) (Sigma). The suspension of yeast from

72-h-old cultures was prepared in sterile saline (0.85%) adjusted with a spectrophotometer to

a cell density of 0.5 McFarland standard at a wavelength of 530 nm. This suspension was

diluted at 1:50 followed by a 1:20 dilution in RPMI 1640 in order to obtain a final

concentration of 1 x 103 to 5 x 10

3 CFU/mL.

Microtitre plates were covered with 100 µL of different concentrations of the

antifungal agents and added to 100 µL of the yeast suspension. A final inoculum of 0.5 x 103

to 2.5 x 103 CFU/mL and the final concentrations of the antifungal agents ranged from 0.125

to 8 µg/mL for amphotericin B, 0.125 to 64 µg/mL for B-lapachone and 0.07 to 32 µg/mL for

ciclopirox olamine. These plates were incubated at 30ºC and read visually after 72 hours. The

MIC end points were defined for the tested drugs as the lowest concentration of drug which

resulted in a complete inhibition of visible growth, compared to that of a drug-free growth

control. All susceptibility tests were performed in triplicate by each antifungal agent.

Quality control organisms Candida parapsilosis ATCC 22019 and C. krusei 6528

were included on each day of testing to check the accuracy of the drug dilutions and the

reproducibility of the results. The purity and viability of all tested organisms were checked

sub-culturing the inoculum suspension in Sabouraud dextrose agar (Difco).

58


RESULTS AND DISCUSSION

The stocked yeasts strains at the URM Culture Collection were viable regardless their

length of preservation, presenting growth when transferred from glycoside broth to

Sabouraud agar plus yeast extract. All stocked yeasts strains had morphological features that

corresponded to the species previously identified.

C. neoformans var. neoformans was identified in 50% of the samples. The MIC

(µg/mL) ranged from 0.25 - 4 for amphotericin B; 0.125 - 1 for ciclopirox olamine and 4 - 8

for β-lapachone. C. gattii showed MIC values ranging from 0.25 - 4 (amphotericin B), 0.25-1

(ciclopirox olamine), and 4 - 8 (β-lapachone). The minimum fungicidal concentration of β-

lapachone was 64 µg/mL.

All the tested C. neoformans strains showed high sensitivity to ciclopirox olamine and

correspondingly lower MIC values in comparison with amphotericin B. The MIC values of β-

lapachone were higher than the other drugs. However, as the breakpoint susceptibility values

have not yet been proposed by the CLSI M27-A212

for C. neoformans, the sensitivity was

considered to be ≤ 64 µg/mL. Tandon et al20

observed C. neoformans strains sensitive to 1.4-

naphtoquinone derivatives that had MIC values ≤ 50 μg/mL. Others authors7 have reported

the susceptibility to β-lapachone as MIC ≤ 1 µg/mL, but they did not state a reference method.

Previous studies have demonstrated that most recurrences of cryptococcal meningitis

during therapy were due to persistence of the original infecting strains together with a

decrease in drug susceptibility18

. In this study, we detected four isolates resistant to

amphotericin B (three gattii variety isolates and one neoformans variety) which were still

sensitive to ciclopirox olamine .

The two varieties of C. neoformans have traditionally been recognized on the basis of

ecological, epidemiological, physiological, and genetic variabilities. However, recently, a

third variety, C. neoformans var. grubii, has been described among serotype A isolates.

59


Moreover, other molecular studies have suggested that serotype A comprises more than a

single variety 5,13

.

Although all the tested isolates were sensitive to antifungal agents, C. gattii isolates

exhibited relatively higher MIC values than C. neoformans var. neoformans. Interestingly,

infections due to C. gattii often require prolonged antifungal therapy17

.

The data presented in this study represent the first test to verify simultaneously the

effectiveness of amphotericin B, ciclopirox olamine and β-lapachone against C. neoformans

isolates. As noted, optimal results were obtained, particularly those with ciclopirox olamine,

using a reference method. However, β-lapachone showed good antifungal activity, confirming

this drug as a potent alternative against cryptococcosis.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was financially supported by CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico) and RENNEBRA (Rede de Coleções de Culturas de

Microrganismos do Norte e Nordeste do Brasil). The authors thanks Dr. David Busfield for

the careful reading and editing of the manuscript.

60


REFERENCES

1.BARNETT, J.A.; PAYNE, R.W. & YARROW, D. Yeast: characteristics and identification. 3 ed.

Cambridge: University Press, 2000, 1139p.

2.BOEKHOUT, T.; THEELAN, B.; DIAS, M.; FELL, J.W.; HOP, W.C.J.; ABELN, C.A.; DROMER,

F. & MEYER, W. Hybrid genotypes in the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans.

Microbiology, 147:891-907, 2001.

3.CASALI, A.K.; GOULART, L.; ROSA, L.K.S.; RIBEIRO, A.M.; AMARAL, A.A.; ALVES, S.H.;

SHRANK, A.; MEYER, W. & VAINSTEIN, M.H. Molecular typing of clinical and

environmental Cryptococcus neoformans in the Brazilian state Rio Grande do Sul. FEMS Yeast Res.,

3:405-415, 2003.

4.CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. Reference method for broth

dilution testing of yeasts: Approved standard-second edition M27-A2. CLSI, Wayne, PA, U.S.A.,

2005.

5.DIAZ, M.R.; BOEKHOUT, T.; THEELAN, B. & FELL, J.W. Molecular sequence analyses of the

intergenic spacer (IGS) associated with rDNA of two varieties of the pathogenic yeast Cryptococcus

neoformans. Syst. Appl. Microbiol., 23:535-545, 2000.

6.DINATO, S.L.M; DINATO, M.M.; NAKANISHI, C.P.; ALMEIDA, J.R.P. & ROMITI, N.

Disseminated cutaneous cryptococcosis in a patient with AIDS. Rev. Inst. Med. Trop., 48(6):353-

358, 2006.

7.GUIRAUD, P.; STEIMAN, R.; CAMPOS-TAKAKI, G.; SEIGLE-MURANDI, F. & SIMEON,

B.M. Comparasion of antibacterial and antifungal activities of lapachol and beta-lapachone. Planta

Med., 60:373-374, 1994.

8. HOOG, G.S., GUARRO, J., GENÉ, J. & FIGUERAS, M.J. Atlas of Clinical Fungi.

Centraalbureau voor Schimmelcultures/ Universitat Rovira I Virgili, 2000, 1126p.

9. JAIN, N.; WICKES, B.L.; KELLER, S.M.; FU, J.; CASADEVALL, A.; JAIN, P.; RAGAN, M.A.;

BANERJEE, U. & FRIES, C. Molecular epidemiology of clinical Cryptococcus neoformans strains

from India. J. Clin. Microbiol., 43(11):5733-5742, 2005.

10.KIRKPATRICK, W.R.; MCATEE, R.K.; REVANKAR, S.G.; FOTHERGILL, A.W.;

MCCARTHY, D.I.; RINALDI, M.G. & PATTERSON, T.F. Comparative evaluation of National

Committee for Clinical Laboratory Standards Broth Macrodilution and agar dilution screening

methods for testing fluconazole susceptibility of Cryptococcus neoformans. J. Clin. Microbiol, 36(5):

1330-1332, 1998.

11.KOMMERS, G.D.; SOUZA, T.M.; SOUTO, M.A.M.; CORTE, F.D. & BARROS, C.S.L.

Granulomatous cryptococcal pneumonia in a hose. Cienc. Rural, 35(4):938-940, 2005.

12.KWON-CHUNG, K.J.; POLACHECK, I. & BENNETT, J.E. Improved diagnostic medium for

separation of Cryptococcus neoformans var. neoformans (serotypes A and D) and Cryptococcus

neoformans var. gatti (serotypes B and C). J. Clin. Microbiol., 15:535-537, 1982.

13.NISHIKAWA, M.M.; LAZERA, M.S.; BARBOSA, G.G.; TRILLES, L.; BALASSIANO, B.R.;

MACEDO, R.C. L.; BEZERRA, C.C.F.; PEREZ, M.A.; CARDARELLI, P. & WANKE, B.

61


Serotyping of 467 Cryptococcus neoformans Isolates from Clinical and Environmental Sources in

Brazil: Analysis of Host and Regional Patterns. J. Clin. Microbiol., 41:73–77, 2003.

14.PAPPALARDO, M.C.S.M. & MELHEM, M.S.C. Cryptococcosis: a review of the Brazilian

experience for the disease. Rev. Inst. Med. Trop., 45:299-305, 2003.

15.REX, J.H.; PFALLER, M.A.; WALSH, T.J.; CHATURVEDI, V.; ESPINEL-INGROFF, A.;

GHANNOUM, M.A.; GOSEY, L.L.; ODDS, F.C.; RINALDI, M.G.; SHEEHAN, D.J. &

WARNOCK, D.W. Antifungal Susceptibility Testing: Practical Aspects and Current Challenges. Clin.

Microbiol. Rev., 14(4):643-658, 2001.

16.SILVA, P.R.; RABELO , R.A.S.; TERRA, A.P.S.; TEIXEIRA, D.N.S. Susceptibility to antifungal

agents among Cryptococcus neoformans varieties isolated from patients at a university hospital. Rev.

Soc. Bras. Med. Trop., 41(2):158-162, 2008.

17. SOARES, M.C.B.; PAULA, C.B; DIAS, A.L.T.; CASEIRO, M.M. & COSTA, S.O.P.

Environmental strains of Cryptococcus neoformans variety grubii in the city of Santos, SP, Brazil.

Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo, 47: 31-36, 2005.

18. SOUZA, L.K.H.; FERNANDES, O.F.L.; KOBAYASHI, C.C.B.A.; PASSOS, X.S.; COSTA, C.R.;

LEMOS, J.A.; SOUZA- JUNIOR, A.H. & SILVA, M..R.R. (2005). Antifungal susceptibilities of

clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans in Goiânia city, Goiás, Brazil. Rev.

Inst. Med. Trop., 47, 253-256, 2005.

19. SUBRAMANIAN, S. & MATHAI, D. Clinical manifestations and management of cryptococcal

infection. J. Postgrad. Med., 51(1): S21-6, 2005.

20. TANDON, V.K.; SINGH, R.V. & YADAV, D.B. Synthesis and evaluation of novel 1,4-

naphthoquinone derivatives as antiviral, antifungal and anticancer agents., 14:2901-2904, 2004.

21. URBINI, B.; CASTELLINI, C.; RONDELLI, R.; PRETE, A.; PIERINELLI, S. & PESSION, A.

Cryptococcal meningitis during front-line chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.

Haematologica 85:1103-1104, 2000.

22. VILCHEZ, R.A.; FUNG, J.; KUSNE, S. Cryptococosis in a organ transplant recipients: an

overview. Am. J. Tranplant., 2:575-580, 2002.

62


5 CONCLUSÕES GERAIS

Com base nos resultados obtidos foi possível concluir:

Culturas estocadas sob óleo mineral mantêm sua viabilidade e características

taxonômicas típicas.

O líquido cefalorraquidiano é uma amostra clínica ideal para o diagnóstico da

criptococose.

A pesquisa direta é indispensável no diagnóstico da criptococose.

O teste de aglutinação em partículas de látex auxilia no diagnóstico da criptococose.

Meningite por Cryptococcus neoformans ocorre na leucemia de células T do adulto

ocasionando óbito.

Na criptococose, há predominância do sexo masculino e da faixa etária de 25 a 46

anos.

Adulto jovem apresenta criptococose com mau prognóstico.

A AIDS é o fator de risco predominante para criptococose, a qual apresenta alta

morbidade e mortalidade.

Meningoencefalite é a principal manifestação clínica da criptococose

C. neoformans var. gatti apresenta maior resistência antifúngica e concentração

inibitória mínima que C. neoformans var. neoformans.

A utilização de um método padronizado e reprodutível facilita a comparação entre

diferentes antifúngicos testados e entre as diferentes concentrações inibitórias

mínimas.

Isolados de Cryptococcus neoformans apresentam resistência a anfotericina B;

Amostras recém isoladas e estocadas são sensíveis a ciclopirox olamina nas

concentrações de 0,125 µg/mL a 1 µg/mL.

Ciclopirox olamina é in vitro a droga mais efetiva contra C. neoformans do que β-

lapachona e anfotericina B.

β-lapachona é fungistática nas concentrações de 4 µg/mL e 8 µg/mL e fungicida na

concentração de 64 µg/mL.

Ciclopirox olamina e β-lapachona podem representar uma nova alternativa terapêutica

para criptococose.

Esta é a primeira vez que se faz relação simultânea entre a susceptibilidade

antifúngica de ciclopirox olamina, β-lapachona e anfotericina B.

PATRÍCIA CARIOLANO DE OLIVEIRA - repositorio.ufpe.br · das trevas para o reino do seu filho...

Documents

Transcript of PATRÍCIA CARIOLANO DE OLIVEIRA - repositorio.ufpe.br · das trevas para o reino do seu filho...